Zborník príspevkov z vedeckej konferencie - Department of ...

CHARAKTERIZÁCIA RP-HPLC FRAKCIONOVANÝCH HUMÍNOVÝCH KYSELÍN VYUŽITÍM
KOMBINÁCIE RP-HPLC METÓDY S ELÚCIOU SO SKOKOVÝM A LINEÁRNYM GRADIENTOM
ROHÁRIK PAVOL, GÓRA RÓBERT, HUTTA MILAN
Katedra Analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Mlynská dolina, 84215,
Bratislava, Slovensko,
roharik@fns.uniba.sk
1. Úvod
Humínové látky (HL) sú všadeprítomná prírodná hmota, ktorá sa vyskytuje vo väších množstvách v pôdach,
sedimentoch a prírodných vodách ako produkt chemickej a biologickej premeny živoíšnych a rastlinných zvyškov [1]. Sú to
amorfné, hydrofilné, polydisperzné, polyelektrolytové makromolekuly, z ktorých pravdepodobne žiadne dve nie sú identické.
Reverzno-fázová vysokoúinná kvapalinová chromatografia (RP-HPLC) je jednou z najpoužívanejších
chromatografickýhc metód, ale v oblasti analýzy a charakterizácie HL, dosiahla iba obmedzené využitie. Vo väšine
prípadov ako mobilnú fázu (MF) vedci používali zmesi klasických rozpúšadiel, používaných v RP-HPLC (metanol,
acetonitril) s deionizovanou vodou alebo vybraným tlmivým roztokom, vhodné na RP-HPLC analýzu diskrétnych molekúl,
o ale v prípade vzoriek typu HL neprinieslo preukázatený, výrazný výsledok [2-4].
V tejto práci bola aplikovaná kombinácia RP-HPLC metód s využitím skokovej a lineárnej gradientovej elúcie na
charakterizáciu vzoriek RP-HPLC frakcionovaných humínových kyselín [5,6]. Ako organický modifikátor mobilnej fázy bol
použitý N,N-dimetylformamid (DMF) a stacionárnou fázou kolóna s oktadecylsilikagélovou náplou s rozmermi pórov
(30nm).
2. Materiál a metódy
Na frakcionáciu HL bol použitý HPLC systém LaChrom (Merck-Hitachi, Darmstadt, Germany), pozostávajúci
zo štvorkanálovej pumpy L-7100 on-line spojená s vákuovým odplyovaom L-7612, automatického dávkovaa L-7200,
kolónového termostatu L-7300, v ktorom bola umiestnená chromatografická kolóna LiChrospher ODS WP 300 RP-18 (250 x
4) mm, (30nm) s predkolónou, spektrofotometrického detektora s poom diód (DAD) L-7450A, flourimetrického detektora
(FLD) L-7480. Komunikáciu medzi zariadením a riadiacím softvérom HSM verzia 4 bola zabezpeená fázovým rozhraním
D-7000.
Priebeh skokovej gradientovej elúcie bol nastavený miešaním roztokov A (1% DMF / 99% fosforenanový tlmivý
roztok (c = 5 mM, pH = 3.00) (v/v)) a B (99% DMF / 1% fosforenanový tlmivý roztok (c = 5 mM, pH = 3.00) (v/v))
nasledovne: od 0.0 po 3.6 minút izokratický úsek 0% (v/v) B v A, následne od 3.7 minút, bol nastavený každú 4 minútu skok
pozostávajúci z 10% (v/v) zvýšenia množstva B v A až po posledný skok pozostávajúci zo zvýšenia o 9% (v/v) a koniaci na
99%, (v/v) B v A a do 55 minút sa izokraticky udržiavalo 99% (v/v) množstvo B v A a od 55.1 minút do 60 minút pokraoval
lineárny úbytok z 99% (v/v) B v A do 0% (v/v) B v A. Medzi meraniami bol 10 minútový asový úsek na re-ekvilibráciu [5,6].
Priebeh lineárnej gradientovej elúcie bol nastavený nasledovne: od 0.0 po 5.0 minút izokratický úsek 0% (v/v) B
v A, následne od 5.1 do 35.0 minút lineárny nárast z 0% (v/v) B v A do 99% (v/v) B v A, od 35.1 do 40.0 min izokratické
udržiavanie 99% (v/v) B v A, od 40.1 do 45.0 min lineárny úbytok z 99% (v/v) B v A po 0% (v/v) B v A. Medzi meraniami
bol 10 minútový asový úsek na re-ekvilibráciu [5].
V práci boli použité 3 typy vzoriek humínových látok, komerne pripravený štandard humínových kyselín (HK) od
firmy Sigma – Aldrich (Aldrich) a humínové kyseliny izolované z pôdy (okolie Dunajskej Stredy (DS J)) použitím
modifikovanej IHSS fakcionanej schémy [7,8] a vzorka Ecohum. Všetky vzorky mali koncentráciu 3 mg/ml.
Zborník príspevkov
z 18. medzinárodnej vedeckej konferencie
"Analytické metódy a zdravie loveka", ISBN 978-80-969435-7-9
- 177 -
hotel Falkensteiner, Bratislava
11. - 14. 10. 2010