ENSÜÜMID JA BIOTEHNOLOOGIA
ENSÜÜMID JA BIOTEHNOLOOGIA
ENSÜÜMID JA BIOTEHNOLOOGIA
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
<strong>ENSÜÜMID</strong> <strong>JA</strong> <strong>BIOTEHNOLOOGIA</strong><br />
TÖÖSTUSLIKUD <strong>ENSÜÜMID</strong><br />
Käesolevaks ajaks on kirjeldatud kaugelt üle<br />
2000 ensüümi, siiski pole tööstuses<br />
rakendatavaid ensüüme eriti palju. Põhjused on<br />
järgmised: Ensüümid täidavad oma rolli in vivo<br />
kuid nende kasutamisel mitteoptimaalsetes<br />
tingimustes (mittefüsioloogilises keskkonnas<br />
näit. orgaanilised lahustid, kõrgendatud<br />
temperatuur, pH jne.) siis võivad nad<br />
denatureeruda ja kaotada oma aktiivsuse.<br />
Tööstuslike ensüümide puhul on põhieesmärk<br />
suurendada nende stabiilsust<br />
efektiivseks tööks nn. mittefüsioloogilistes<br />
tingimustes, luua ensüümid millel oleks<br />
tööstuslike protsesside tingimustes pikem<br />
“eluiga” ja leida võimalusi nende efektiivseks<br />
immobiliseerimiseks.<br />
Tööstuslike ensüümide jaoks on sageli tähtsam<br />
ensüümi pikaajaline stabiilsus kui suurendatud<br />
katalüütiline aktiivsus.<br />
75% kogu ensüümide tööstuslikust kasutamisest<br />
langeb:<br />
1. Detergentidele,<br />
2. Toidu- ja tärklisetööstusele.<br />
Senini on suurtööstuse jaoks toodetud esmajoones<br />
ekstratsellulaarseid ensüüme. Eelkõige<br />
hüdrolaasid: α-amülaasid, glükoamülaas,<br />
invertaas, laktaas, proteaasid, mikrobioloogiline<br />
laap, glükanaasid, lipaasid).<br />
Ca 90% praegu kasutatavatest ensüümidest on<br />
rekombinantsed.<br />
Samuti tõuseb mittehüdrolüütiliste ensüümide<br />
osakaal. Praegu moodustab see ca 10% kogu<br />
ensüümide turust. Siia kuuluvad eelkõige<br />
ensüümid, mida rakendatakse mitmesugustel<br />
diagnostilistel ja analüütilistel eesmärkidel ja<br />
farmaatsiatööstuses. Toiduainetetööstuse seisukohalt<br />
tähtsad mittehüdrolaassed ensüümid on:<br />
glükoosi oksüdaas ja glükoosi isomeraas<br />
(mõlemad reeglina intratsellulaarsed) samuti<br />
pektiin- ja pektaatlüaas (pektinolüütilised<br />
ensüümid).<br />
Pektinolüütilised ensüümid<br />
Puu- ja juurviljade pektiinse fraktsiooni lahustamiseks.<br />
Vastavalt kasutatavale tehnoloogiale<br />
võib saada väga erinevaid produkte. Näit. puu-<br />
ja juurvilja matseraadid, kus pektinaaside<br />
kasutamisel hüdrolüüsitakse osaliselt taimekoe<br />
kesklamell, nii et kude langeb rakususpensiooni,<br />
kuid nii rakukestad kui rakud ise jäävad<br />
terveks. Kui lõhkuda rakud täielikult, st.<br />
lüüsida ka rakukestad saadakse nn. hüdrolüsaadid<br />
(näit. puu- ja juurviljade veeldamine)<br />
Erinevad efektid ensüümide rakendamisel:<br />
1. Puuviljamahlade selitamine (näit. õunamahla<br />
depektiniseerimine enne kontsent-<br />
reerimist, pressimissaagise suurendamine<br />
(marjad, porgand)<br />
2. Matseraatide tootmine (nii joodavad<br />
suspensioonid, kui ka kuivproduktid)<br />
3. Puu- ja juurvilja totaalhüdrolüsaadid<br />
(jääkideta vedeldamine)<br />
4. Uued tooted (majoneesid, mehud,<br />
pulbrid)<br />
Totaalhüdrolüsaatide tootmisel kasutatakse<br />
lisaks pektinolüütilistele ensüümidele ka<br />
täiendavalt tsellulaase.<br />
Proteaasid<br />
Peptiidsidemete lõhkumisel valgumolekulis<br />
võib saavutada erinevaid toiduainete tehnoloogia<br />
ja toitumisfüsioloogia alaseid efekte .<br />
Nisujahu valk – gluteen moodustab tainas<br />
gluteenivõrgustiku, mis määrab taina edaspidised<br />
funktsionaalsed omadused (elastsus,<br />
plastilisus, sõtkutavus, gaasisisaldusvõime<br />
jne.) 1-2% valgu peptiidsidemete lõhkumine<br />
põhjustab juba jahususpensiooni omaduste<br />
tugevat muutumist.<br />
Hüdrolüüsides rohkem (10-25%) on võimalik<br />
kõiksugu tootmise kõrval- ja jääkproduktide<br />
ümbertöötamine toiduks või söödaks. Näit.<br />
kondijahus sisalduvad lihaosakesed lähevad<br />
lahusesse ja saab vürtsimaitsega produkti.<br />
Dieet- ja raviotstarbel kasutatakse ka valkude<br />
veel täielikumat hüdrolüüsi (30-40%). On<br />
teada, et näiteks aminohapped seoses madalmolekulaarsete<br />
pepetiididega (di- ja tripeptiidi)<br />
on vähemalt niisama hästi kui mitte isegi<br />
paremini absorbeeruvad kui vabad aminohapped.<br />
Kasutatakse teraapias. Puudus valguhüdrolüsaatide<br />
juures tekib kibedus niipea kui<br />
hüdrolüüsida rohkem kui 10%. See on nn.<br />
“off-flavour” aste. Kasutatakse maitset<br />
korrigeerivaid lisandeid.<br />
Tsellulaasse kompleksi ensüümide rakendamine<br />
tekstiilitööstuses – “kivipesu” teksad on<br />
bioloogiline mitte “geoloogiline” produkt.<br />
Trichoderma tsellulaasse kompleksi erinevate<br />
komponentide (endoglukanaaside, tsellobiohüdrolaaside<br />
ja glükosidaaside) kloonimine on<br />
võimaldanud paremini mõista tsellulaasse<br />
aktiivsuse olemust erinevate tselluloosi<br />
polümeeride suhtes. Selle baasil on välja<br />
arendatud “kivipesu” tehnoloogia.<br />
Vt: ülevaade ensüümide tööstusliku<br />
rakendamise kohta. Kirk et al., (2002)<br />
Industrial enzyme applications. Curr. Op. In<br />
Biotech. 13: 345-351.<br />
<strong>ENSÜÜMID</strong>E STRUKTUURI MUUT-<br />
MINE<br />
Põhiliseks meetodiks ensüümide struktuuri ja<br />
omaduste modifitseerimisel on suunatud<br />
1 http://www.biotech.ebc.ee/
mutagenees. Kuigi varem on kasutatud (ja<br />
kasutatakse osaliselt ka veel praegu) valkude<br />
keemilist modifitseerimst ja mitmesuguseid<br />
manipulatsioone lahustiga, pole need meetodid<br />
spetsiifilised ja on tihti liialt karmid. DNA<br />
tasemel on võimalik muuta spetsiifilisi aluseid<br />
teatud ensüümi kodeerivas geenis ja seeläbi<br />
asendada spetsiifilisi aminohappelisi järjestusi<br />
ensüümi polüpeptiidahelas teistega. Kasutades<br />
seejärel rekombinantsete DNA-de tehnoloogiat<br />
on võimalik saada suurtes kogustes<br />
modifitseeriud ensüümi.<br />
Suunad:<br />
1. Ensüümide katalüütilise aktiivsuse<br />
suurendamine ja substraadi afiinsuse<br />
tõstmine.<br />
2. Substraadispetsiifilisuse muutmine, konstrueerides<br />
eksisteerivatest ensüümidest uusi<br />
ensüüme (näiteks selliste ensüümide<br />
loomine, mida looduses ei leidu, et<br />
katalüüsida uusi reaktsioone)<br />
3. Muudetud pH profiiliga ensüümide<br />
loomine, et saada ensüüme, mis töötaksid<br />
mittefüsioloogiliste pH väärtuste juures.<br />
4. Ensüümide loomine, mis oleksid stabiilsed<br />
oksüdeerivate agensite suhtes; lihtsalt<br />
oksüdeeritavate aminohappejääkide Cys,<br />
Trp ja Met asendamine steeriliselt sarnaste<br />
mitteoksüdeeritavate aminohapetega nagu<br />
Ser, Phe, Glu (vastavalt). Näiteks taoliste<br />
pesupulbri ensüümide loomine, mis<br />
töötaksid pleegitaja juuresolekul.<br />
5. Stabiilsuse tõstmine raskemetallide suhtes<br />
asendades Cys ja Met jäägid ja eemaldades<br />
ensüümi pinnal olevad karboksüülrühmad.<br />
6. Proteolüütilise degradatsiooni resistentsete<br />
ensüümide loomine (Paljudes reaktsioonisegudes<br />
esineb proteinaasne saastus, mis<br />
võib meid huvitava(d) ensüümi(d)<br />
lõhkuda).<br />
7. Ensüümid, mis oleksid stabiilsed ka mitte<br />
vesikeskkonnas.<br />
8. Allosteeriliste saitide kõrvaldamine, mis<br />
osalevad feedback inhibitsioonil.<br />
9. Erinevate biokeemiliste radade ensüümide<br />
liitmine, nii et multi-ensümaatilist protsessi<br />
saaks läbi viia ühe valguga.<br />
Seega on eesmärgiks luua ensüümid, mis<br />
oleksid võimelised katalüüsima iga soovitud<br />
reaktsiooni kui vajalik ka ekstreemsetes<br />
tingimustes<br />
Probleemid:<br />
1. Röntgenkristallstruktuuride puudumine<br />
paljude ensüümide puhul, mistõttu pole<br />
teada ensüümide kolmedimensionaalne<br />
struktuur.<br />
2. Puudulikud teadmised ensüümi aktiivtsentris<br />
toimivate täpsete interaktsioonide<br />
kohta (vesiniksidemed, elektrostaatilised<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
sidemed ja hüdrofoobsed interaktsioonid).<br />
ensüümi ja substraadi vahel.<br />
3. Me ei tea täpseid faktoreid, mis osalevad<br />
valkude stabilisatsioonil.<br />
Kõik ensüümide insenergeneetikat puudutav<br />
on üle kantav ka muudele valkudele.<br />
Valkude insenergeneetika strateegiad:<br />
1. Ratsionaalne disain. Valkude insenergeneetika<br />
vanem suund, mida kasutatakse<br />
laialdaselt ka praegu soovitud omaduste<br />
viimiseks valkudesse.<br />
Põhineb valkude struktuuri ja funktsiooni<br />
seoste mõistmisel ja kasutamisel, sageli<br />
kasutatakse molekulaarset modelleerimist. Edu<br />
sõltub valkude struktuuri määramise meetodite<br />
arengust, arvutisimulatsioonide ja molekulaarse<br />
modelleerimise meetodite arengust ja<br />
uutest andmetest struktuuri ja funktsiooni<br />
vahelistes suhetes.<br />
Meetod eeldab tavaliselt sisestatud mutatsioonide<br />
kontrollimist sekveneerimisel ja<br />
samuti ka mutantse ensüümi puhastamist peale<br />
igat mutageneesi tsüklit, et mõõta ensüümi<br />
kineetilised ja funktsionaalsed omadused. See<br />
muudab kogu meetodi suhteliselt töömahukaks<br />
ja kalliks.<br />
3. Suunatud evolutsioon.<br />
Vt. Turner (2003) Directed evolution of<br />
enzymes for applied biocatalysis. Trends in<br />
Biotech. vol 21, No.11, pp.474-478.<br />
Selle meetodi puhul ei ole vaja teada eelnevat<br />
informatsiooni ensüümi struktuur ja<br />
funktsiooni seoste kohta. Paljude, eelkõige<br />
tööstuslike ensüümide osas on raske leida seost<br />
ensüümis soovitud omaduste ja tema disaini<br />
võimaluste vahel.<br />
Suunatud evolutsiooni nim. ka molekulaar<br />
evolutsiooniks ja in vitro evolutsiooniks<br />
Selle puhul valmistatakse valgu variandid<br />
geenifragmentide in vitro rekombineerimisel<br />
PCR-i abil; ekspresseeritakse ja selekteeritakse<br />
või skriinitakse muutunud omaduste<br />
osas.<br />
Suunatud evolutsioon on eriti kasulik kui on<br />
vaja ensüümi funktsiooni “timmida” (fine<br />
tuning), sest kui teatud aktiivsus on olemas,<br />
siis saab kombineerida omadusi mida üksikul<br />
kujul looduses ei esine.<br />
Meetodid:<br />
Single sequence shuffling. (JOONIS)<br />
Kui kasutada üht stardijärjestust, siis tuleneb<br />
fragmentide erinevus PCR-i käigus (“errorprone<br />
PCR”) DNA polümeraasi vigade tõttu<br />
sisseviidud juhuslikest punktmutatsioonidest.<br />
Kuna enamus punktmutatsioone on neutraalsed<br />
või kahjulikud, siis peab mutatsioonide hulk<br />
olema väike. Seetõttu on kasulike mutatsioonide<br />
kogunemise kiirus ja vajaliku tunnuse<br />
evolutsioon aeglased<br />
2 http://www.biotech.ebc.ee/
Sequence family shuffling. (JOONIS)<br />
Seetõttu on hoopis parem kasutada looduses<br />
esinevaid homoloogilisi järjestusi, mis on juba<br />
eelnevalt looduse poolt rikastatud kahjulike<br />
variantide välja selekteerimisel.<br />
Tsefalosporinaas C geeni näide Vt. Crameri et<br />
al,. (1998) DNA shuffling of a family of genes<br />
from diverse species accelerates directed<br />
evolution. Nature vol. 391 p.288-291.<br />
Neljast mikroobiliigist valitud geenid, järjestuse<br />
homoloogia DNA tasemel oli 58-82%.<br />
Originaalse DNA järjestuse alusel sünteesiti<br />
geenid sünteetilistest oligotest ja kasutati neid<br />
shufflinguks.<br />
Incremental Truncation for the Creation of<br />
Hybrid Enzymes (ITCHY) (JOONIS)<br />
Vt. Lutz & Benkovic (2000) Homology<br />
independent protein engineering. Curr. Op. in<br />
Biotech, vol 11, p.319-324.<br />
Eelpooltoodu tehnoloogia peamine puudus on<br />
sõltuvus DNA järjestuste homoloogiast.<br />
Seetõttu on tegeldud homoloogiast sõltumatute<br />
meetoditega. ITCHY meetodit on kasutatud<br />
kui shuffling ei ole võimalik madala<br />
homoloogia tõttu. Luuakse kombinatoorsed<br />
fusion klonoteegid erinevate amino- ja<br />
karboksüterminaalsete geenifragmentide vahel.<br />
TERMOSTABIILSED <strong>ENSÜÜMID</strong><br />
Termostabiilsust defineeritakse sageli kui<br />
temperatuuri, mille juures 50% vastava valgu<br />
struktuurist on denatureerunud; denaturatsiooni<br />
astet jälgitakse valgu tsirkulaarse dikroismi<br />
järgi lahuses.<br />
Eelised mida annab ensümaatiliste reaktsioonide<br />
läbiviimine kõrgemal temperatuuril<br />
võrreldes tavalisega.<br />
1. Vähenenud saastuse oht ja lahuste<br />
viskoosus (Sterilisatsioon)<br />
2. Ensüümide aktiivsuse ja ka reaktsioonikiiruse<br />
suurenemine vastavalt van’t Hoffi<br />
reeglile.<br />
3. Produktide saagise suurenemine kuna<br />
a) paljude substraatide lahustuvus on<br />
kõrgemal temperatuuril parem<br />
b) reaktsiooni termodünaamilise tasakaalu<br />
nihkumine produktide tekke suunas<br />
4. Suurenenud stabiilsus teiste denatureerivate<br />
tingimuste suhtes.<br />
5. Protsessi kulgu on kõrgemal temperatuuril<br />
suhteliselt lihtsam kontrollida. Näiteks<br />
protsessi katkestamine allajahutamisel.<br />
Toiduainete tööstuses rakendatakse tänapäeval<br />
laialdaselt ensüüme protsessides, mille temperatuur<br />
on 50-60°C (näit. glükoamülaas, glükoosi<br />
isomeraas) ja isegi 85-110°C (bakteriaalsed<br />
α-amülaasid) TABEL.<br />
Kõik ensüümid kaotavad temperatuuri<br />
tõstmisel oma katalüütilist aktiivsust.<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
Eristatakse pöörduvat ja pöördumatut<br />
termoinaktivatsiooni. Ensüüm võib olla kolmes<br />
vormis:<br />
Natiivne N – denatureeritud D – pöördumatult<br />
denatureeritud I<br />
N ↔ D → I<br />
Pöörduvad ja pöördumatud mehhanismid<br />
ensüümide denaturatsioonil<br />
Kuumutamisel toimivad konformatsioonilised<br />
ja kovalentsed protsessid.<br />
Konformatsioonilised protsessid<br />
Pöördumatu termoinaktivatsioon toimub isegi<br />
kontsentratsioonidel, millistel ei esine<br />
agregatsiooni.<br />
1. “Ebakorrektne “voltimine”, mis<br />
põhjustab “segiläinud” struktuuri. Esineb<br />
kõrgetel pH väärtustel lähenedes ensüümi<br />
(valgu) isoelektrilisele punktile. Näiteks<br />
lüsotsüüm (i.p 11) ja ribonukleaas (i.p. 9.6)<br />
pH 8 juures on inaktiivses struktuuris, kuid<br />
pH 4 ja 6 juures eriti ei mõju. Seega on<br />
tõenäoline, et ensüümi kogulaengu vähenemine<br />
soodustab ebakorrektse struktuuri<br />
moodustumist kuumutamisel.<br />
2. Mitmesuguste agregaatide teke.<br />
Agregatsiooni ja teisi bimolekulaarseid<br />
protsesse saab blokeerida elimineerides<br />
valgu difusiooni st. tuleb valk immobiliseerida.<br />
Kovalentsed protsessid<br />
1. Polüpeptiidahela hüdrolüüs vahetult<br />
aspartaathappe jäägi kõrvalt põhjustab<br />
pöördumatu termoinaktivatsiooni lüsotsüümil<br />
ja RNaasil pH-4 juures.<br />
Peptiidsideme hüdrolüüs toimub eelistatult<br />
aspartaathappe karboksü-terminuse juures.<br />
2. Disulfiidsillad ja nende lõhkumine<br />
aluselistes tingimustes. Intramolekulaarsete<br />
cross-linkide lõhkumine<br />
3. Asparagiini (ja võib-olla ka Glu)<br />
deamiinimine)<br />
Termostabiilsete ensüümide saamine<br />
1. Termofiilsetest organismidest kandes nende<br />
geenid insenergeneetiliselt üle mesofiilsetele<br />
organismidele. Kahjuks iga<br />
ensüümi termofiilidel ei ole. Raske on ka<br />
saavutada ensüümide üleproduktsiooni<br />
2. Vee eemaldamine süsteemist<br />
3. Protein engineeing<br />
Vee eemaldamine süsteemist.<br />
Kuna vesi on reagendiks peptiidide hüdrolüüsil<br />
ja deamiinimisel, mediaatoriks tsüsteiini ßeliminatsioonil<br />
ja lahustiks, mis hõlbustab<br />
liikuvust ja viib ebakorrektse struktuuri tekkele<br />
on loogiline, et vee asendamine mingi teise<br />
keskkonnaga mõjub ensüümile stabiliseerivalt.<br />
Näiteks lüsotsüüm, kus ensüümi t1/2 on<br />
3 http://www.biotech.ebc.ee/
võimalik tõsta paar suurusjärku kasutades vee<br />
asemel orgaanilisi lahusteid.<br />
Ka teised ensüümid: türosinaas, peroksidaas,<br />
kolesterooli oksüdaas omavad aktiivsust<br />
peaaegu veeta orgaanilises keskkonnas.<br />
Protein engineering<br />
1. Disulfiidsildade lisamine, stabiliseerib<br />
valgumolekuli kõrgendatud temperatuuridel.<br />
Lisaks sellele on taoliselt modifitseeritud<br />
ensüümid sageli ka resistentsed denaturatsioonile<br />
orgaaniliste lahustitega ja mittefüsioloogilistes<br />
tingimustes nagu näiteks<br />
ekstreemsetel pH väärtustel.<br />
2. Asparagiini asendamine teiste aminohapetega<br />
Kõrgel temperatuuril võib valgus toimuda<br />
asparagiini (ja glutamiini) jääkide deamiinimine,<br />
st. reaktsioon, mille käigus vabaneb<br />
ammoniaak. Aminorühma kadumisel<br />
muutuvad need aminohapped vastavalt<br />
asparagiin- ja glutamiinhappeks, mis kutsuvad<br />
esile peptiidahela foldingu muutuse ja võivad<br />
viia valgu aktiivsuse kadumisele.<br />
Kui asendada Asn aminohappejäägiga, mis<br />
vastab ligikaudselt tema omadustele ja<br />
suurusele (näit. isoleutsiin (Ile) või treoniin<br />
(Thr), siis taoline asendus stabiliseerib<br />
ensüümi.<br />
3.Vabade sulfhüdrüülrühmade arvu vähendamine.<br />
4. Ensüümi “rebuilding”<br />
Ensüümide termostabiilsus on suuresti<br />
ensüümi “tuumas” asetleidvate hüdrofoobsete<br />
interaktsioonide tulemus. Üks võimalik tee<br />
ensüümide termostabiliseerimiseks on nende<br />
interaktsioonide suurendamine.<br />
Komplekssed lahendused<br />
Subtilisiin<br />
1. Oksüdatsioon<br />
Valkude ebastabiilsuse peamisi põhjusi on<br />
vastuvõtlikus oksüdatsioonile. Eriti valkude<br />
puhul, mis sisaldavad metioniini, tsüsteiini või<br />
trüptofaani jääke kas aktiivtsentris või selle<br />
vahetus läheduses. Taoliste ensüümide<br />
tööstuslikul rakendamisel on põhiprobleemiks<br />
nende oksüdatiivne inaktivatsioon.<br />
Bacillus ssp eraldatud subtilisiin on põhiline<br />
detergentide koostisse kuuluv ensüüm.<br />
Positsioonis 222 asuv metioniin, mis esineb<br />
kõigil Bacillus ssp.’st eraldatud subtilisiinidel,<br />
asub vahetult aktiivstentris asuva seriini jäägi<br />
lähedal, mis on vajalik katalüüsiks. Selle Met<br />
oksüdatsioon viib ensüümi inaktivatsioonile<br />
takistades substraadi pääsu aktiivtsentrisse.<br />
Tänapäeval takistab see oluliselt valgendajate<br />
kasutamist detergentide koostises.<br />
Lahendus: Met kõrvaldamine.<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
Konstrueeriti mutandid, mis sisaldasid kõik 19<br />
võimalikku asendust selles 222 positsioonis ja<br />
määrati kõigi mutantide spetsiifiline aktiivsus<br />
wild-type Met sisaldava ensüümi suhtes (wildtype=100%).<br />
Cys mutandi eriaktiivsus oli pisut<br />
suurem 138% kuid ta oli sarnaselt wild-type<br />
ensüümile H2O2 manulusel inaktiveeritav<br />
(kuigi veidi vähem). Kui kõigil teistel<br />
mutantidel oli mingi aktiivsus olemas, siis Ala<br />
ja Ser mutantide eriaktiivsus oli suurim (53%<br />
ja 35%) ja taoliselt modifitseeritud ensüümid<br />
palju vastupidavamad H2O2 suhtes. Seega on<br />
taoliselt võimalik teha oksüdatsioonile<br />
resistentsemaid ensüüme asendades oksüdatsioonitundlikud<br />
aminohapped resistentsetega.<br />
2. Disulfiidsillad<br />
Subtilisiini molekuli sisestati kaks täiendavat<br />
disulfiid silda, et tõsta termostabiilsust.<br />
3. Ensüümi spetsiifilisuse muutmine<br />
Subtilisiinil on suur hüdrofoobne sidumis sait,<br />
milles paikneb külgahelana 166. pos. AH jääk.<br />
W-t ensüümil on seal glütsiin. Asendades selle<br />
kõigi 19 võimaliku aminohappega uuriti nende<br />
substraadi-spetsiifikat ja saadi väga erinev<br />
spekter. Näiteks Lys 166 asenduse puhul oli<br />
kcat/Km 800 x suurem kui wild-type ensüümi<br />
puhul.<br />
4. Elektrostaatilised efektid<br />
On olulised ensümaatilise katalüüsi juures<br />
osaledes transitsiooni saidi (laetud) stabiliseerimisel.<br />
Seriin proteaaside keemiline<br />
modifitseerimine on näidanud, et katalüüsi pH<br />
sõltuvus muutub ensüümi üldise pinnalaengu<br />
muutudes. Sellest tuleneb üldine meetod<br />
ensüümide pH sõltuvuse modifitseerimiseks,<br />
muutes ensüümi aktiivtsentri elektrostaatilist<br />
ümbrust ensüümi GI-ga.<br />
Subtilisiini puhul on näidatud, et ühe<br />
pinnalaengu muutus omab olulist efekti<br />
ensüümi pH sõltuvusele. Asendades Asp 99,<br />
mis paikneb 14-15Å kaugusel aktiivtsentrist<br />
laenguta Ser jäägiga mõjutab taoline muutus<br />
nii aktiivtsentri ionisatsiooni konstanti ja<br />
ensüümi ülekande oleku laengut<br />
EKSTREMOFIILIDE KASUTAMINE<br />
<strong>BIOTEHNOLOOGIA</strong>S<br />
NB! Hea ülevaade “The production of<br />
biocatalysts and biomolecules from extremophiles”<br />
(2002) Schiraldi and DeRosa Trends in<br />
Biotech pp.515-521.<br />
Termofiilid, psührofiilid, atsidofiilid, alkalofiilid,<br />
halofiilid, osmofiilid, barofiilid, radiatsiooni<br />
resistentsed ja raskemetallide tolerantsed<br />
mikroorganismid. Kõigil neil on suur<br />
biotehnoloogiline ja kommertsiaalne tähtsus.<br />
Termofiilid:<br />
psührofiilid –5 - +20°C<br />
mesofiilid +15 - +40°C<br />
termofiilid +45 - +100°C<br />
hüpertermofiilid üle +100°C<br />
4 http://www.biotech.ebc.ee/
Süstemaatika: arhebakterid, prokarüoodid ja<br />
eukarüoodid<br />
Kuidas nad seda saavutavad?<br />
Enamus termosüüme on sarnased mesofiilsetele<br />
ensüümidele k.a. fülogeneetilised<br />
variatsioonid.<br />
1. Nende aminohappeline järjestus on<br />
tüüpiliselt 40-85% sarnane nende<br />
mesofiilsetele analoogidele.<br />
2. Nende 3D struktuurid on ülekantav ka<br />
nende mesofiilsetele analoogidele<br />
3. Neil on sama katalüütiline mehhanism.<br />
Välja arvatud vähesed erandid saab kloonitud<br />
termosüüme edukalt ekspresseerida mesofiilsetes<br />
organismides. Neil on kõik natiivsele<br />
ensüümile omased omadused.<br />
Kuigi on olemas teatud täiendavad faktorid<br />
nagu: soolad, polüamiinid või glükosüleerimine,<br />
mis aitavad stabiliseerida teatud<br />
termosüüme on enamus neist “sisemiselt”<br />
termostabiilsed. Seega on see erineva<br />
aminohappelise järjestuse tulemus.<br />
Iga termosüüm on stabiliseeritud erinevate<br />
mehhanismide unikaalse kombinatsiooni<br />
poolt. Kõik eeldatavad aminohapete asendamise<br />
reeglid mesosüümide ja termosüümide<br />
vahel (määratud statistilise analüüsi põhjal) on<br />
vastuolus vähemalt ühe termosüümi järjestusega.<br />
Seega pole olemas universaalset valgu<br />
stabiliseerimise mehhanismi.<br />
Enamus valkude stabilisatsioonil osalevaid<br />
molekulaarseid mehhanisme on väljaselgitatud<br />
uurides mesofiilseid ensüüme. Nüüd on juba<br />
ka olemas kristalliseeritud termosüüme ja<br />
seetõttu võimalik võrrelda nii mesosüüme kui<br />
termosüüme. Vt. Hea ülevaade (1996) Trends<br />
in Biotech June p.185.<br />
1. Termosüümid on “rigiidsemad”<br />
Ensüümid peavad hoidma oma katalüütiliselt<br />
aktiivset struktuuri lahtivoltimise eest denatureerivates<br />
reaktsioonitingimustes Erinevad<br />
mehhanismid: α-heeliksi stabiliseerimine,<br />
elektrostaatiliste interaktsioonide optimeerimine<br />
ja konformatsioonilised muutused.<br />
2. Hüdrofoobsed interaktsioonid<br />
Arvatakse et hüdrofoobsed interaktsioonid<br />
annavad vajaliku energia valkude vesilahuses<br />
kokku pakkimiseks. Näit. T. thermophilus’e 3isopropüülmalaadi<br />
dehüdrogenaasil on kaks<br />
hüdrofoobset jääki (Leu246 ja Val249)<br />
ensüümi dimeeri piirpinnal, mis on E. coli-s<br />
asendatud vähemhüdrofoobsete jääkidega (Glu<br />
ja Met). Tehes E. coli’s samad asendused saab<br />
ka seda stabiliseerida dissotsatsiooni ja<br />
denaturatsiooni vastu..<br />
3. “Pakkimise” efektiivsus<br />
Ensüümi valguline “tuum” on tüüpiliselt<br />
hüdrofoobne, suurenenud pakkimise efektiivsus<br />
on sageli korrelatsioonis suurenenud<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
hüdrofoobsusega. Kristallograafilistel uuringutel<br />
põhinev suunatud mutagenees on<br />
näidanud, et kui täita volditud struktuuris<br />
hüdrofoobsed “õõned” ja suurendada sellega<br />
pakkimise hüdrofoobsust tõuseb ka valgu<br />
termostabiilsus.<br />
4. Soola sillad<br />
Immobiliseerunud ioonid on väga aktiivsed,<br />
viidates sellele, et intramolekulaarsed valgupinna<br />
soolasillad on väga stabiilsed, isegi kui<br />
valk on väga polaarses keskkonnas. Soola<br />
sillad stabiliseerivad ka sekundaarstruktuuri,<br />
suurendades selle rigiidsust. T. thermophilus’e<br />
RNase H täiendavad soolasillad toetavad pH<br />
efekti. Soolasildade võrgustik, mis E. coli’l<br />
puudub stabiliseerib ß-heeliksit.<br />
B stearothermophilus’e fosfoglütseraat kinaas<br />
sisaldab 15 täiendavat soolasilda võrreldes<br />
pärmi ensüümiga.<br />
5. Konformatsiooniliste pingete vähendamine<br />
6. Lahtipakkimise entroopia vähendamine<br />
Lahtipakitud valkudes on Gly (millel puudub<br />
ß-süsinik) aminohappejäägiks millel on<br />
kõrgeim konformatsiooniline entroopia.<br />
Pakkimisel kulub kõige rohkem energiat Gly<br />
paikapanekuks. Teisalt: Pro jäägid oma<br />
pürrolidooniringiga võivad omada vähe<br />
konfiguratsioone, mis on samuti määratud<br />
eelneva jäägi konfiguratsiooni poolt. Gly<br />
asendamine mingi teise AH-jäägiga.<br />
7. α-heeliksi stabiliseerimine<br />
Termosüümide heeliksites on valdavalt Ala<br />
jäägid.<br />
8. Vesiniksidemed<br />
Positiivne korrelatsioon termostabiilsuse ja<br />
subühiku siseste laetud-neutraalsete<br />
vesiniksidemete vahel.<br />
9. Loop’ide stabiliseerimine<br />
Luubid on valkudes nn. nõrgad lülid. Need on<br />
regioonid, kus lahtipakkimine (termiline<br />
denaturatsioon) toimub kõigepealt. Termosüümide<br />
luubid on lühemad kui nende mesosüümidest<br />
analoogidel, või puuduvad mõned<br />
neist üldse. See tõstab valgu kompaktsust.<br />
10 Resistentsus kovalentsele destruktsioonile<br />
Cys destruktsioon, Asn ja Glu deamiinimine,<br />
Cys oksüdatsioon ja peptiidsidemete hüdrolüüs.<br />
Termosüümidel on vähem tundlikke AHjääke.<br />
Termosüümide inaktivatsioon toimub<br />
eelkõige kovalentsel modifikatsioonil ja vähem<br />
lahtipakkimise tõttu on see mehhanism üks<br />
tähtsamaid termostabiilsete ensüümide<br />
saamisel insener-geneetika abil.<br />
5 http://www.biotech.ebc.ee/
Change language