Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
1.2. System ekspresyjny z udziałem polimerazy faga T7<br />
1.2.1.Elementy składowe systemu:<br />
Wektor pET 16b<br />
� Wektor zwierający promotor Ø 10 (promotor genu 10 z faga T7) – np. pT7 i<br />
rodzina wektorów pET (firma Novagen) np. PET16b, pET15b , pET23a.<br />
Promotor Ø 10 jest bardzo wydajnym promotorem in vitro i in vivo, który<br />
rozpoznawany jest tylko przez polimerazę RNA faga T7<br />
� Szczep bakteryjny posiadający gen kodujący polimerazę RNA faga T7.<br />
- Gen ten może znajdować się na plazmidzie np. pGP1-2 w przypadku szczepu<br />
E. coli K 38.<br />
- Może też znajdować się na chromosomie bakteryjnym jak w przypadku<br />
szczepu E. coli BL 21 (DE3). Szczep ten jest stabilnym lizogenem faga λDE3<br />
z genem polimerazy T7 pod kontrolą promotora lacUV5.<br />
• Plazmid ekspresyjny do klonowań translacyjnych - celem klonowania jest<br />
produkt białkowy<br />
• MCS z odpowiednimi miejscami cięcia dla enzymów restrykcyjnych (NdeI,<br />
XhoI, BamHI)<br />
• Promotor T7 rozpoznawany tylko przez polimerazę RNA faga T7<br />
• Sekwencja OPERATORA lacO, (fragment regulatorowy operonu<br />
laktozowego) zlokalizowany tuż za promotorem a przed sekwencją MCS (patrz<br />
mapa plazmidu). Jeżeli z sekwencją operatora połączy się represor LacI,<br />
transkrypcja zostanie zablokowana. Represor stanowi fizyczną przeszkodę dla<br />
polimerazy. Do zajścia ekspresji klonowanego genu oprócz polimerazy RNA<br />
faga T7 wymagana jest obecność induktora, IPTG znoszącego represje.<br />
• Klonowanie genu białka w miejsce MCS pET16 wprowadza na N-końcu<br />
białka 10 reszt His (ogon polihistydynowy), dzięki temu do oczyszczania<br />
produktu białkowego można wykorzystać chromatografię powinowactwa.<br />
• Obecność genu bla gwarantującego gospodarzowi oporność na ampicylinę,<br />
- umożliwia selekcję odpowiednich klonów. Po transformacji bakterie należy<br />
wysiewać wyłącznie na pożywkę z ampicyliną. Dzięki temu<br />
uzyskamy wzrost tylko tych komórek, które pobrały plazmid.<br />
IPTG – induktor niemetaboliczny. Znosi represję, ale w odróżnieniu od laktozy nie jest<br />
rozkładany przez bakterie i dzięki temu jego stężenie w pożywce jest stałe.
Change language