Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

Inne istotne cechy, które powinien posiadać dobry wektor:
1. Obecność jednego lub kilku genów markerowych, służących do wyróżnienia i
selekcji transformantów, czyli komórek, które pobrały zrekombinowany wektor
(głównie są to geny oporności na antybiotyk np. ampicylinę, tetracyklinę,
chloramfenikol, kanamycynę)
2. Powinien być dobrze scharakteryzowaną pod względem fizycznym i chemicznym
cząsteczką, łatwą do oczyszczenia.
3. Nie powinien zawierać genów, których rozprzestrzenianie może stanowić
zagrożenie dla życia lub zdrowia ludzi, zwierząt czy roślin.
Gwałtowny rozwój biologii molekularnej sprawił, że ilość konstruowanych wektorów jest
olbrzymia i nie sposób w skrócie opisać całej wiedzy na ich temat. Tworzono serie wektorów
przeznaczonych do bardzo konkretnych celów. Jedną z ważniejszych to grupa wektorów
ekspresyjnych.
1.1.2. Wektory ekspresyjne
● Zawierają one silny promotor, podlegający regulacji zewnętrznej, służący do
wyrażania obcych genów
Wykorzystuje się m. in. promotor laktozowy, dziki lub zmodyfikowany (lacUV5),
tryptofanowy, lambdowe PL (promotor lewy) i PR (p. prawy), promotory fuzyjne tac
(połączenie laktozowego i tryptofanowego) i inne.
● Mogą zawierać też terminatory transkrypcji oraz sygnały translacyjne.
● Obce geny mogą być wyrażone jako białko natywne lub jako fuzja z innym, dobrze
scharakteryzowanym białkiem.
● Ważnymi seriami wektorów w tej grupie są wektory zawierające promotor faga T7
rozpoznawane wyłącznie przez polimerazę faga T7.
Polimeraza RNA faga T7 jest bardzo specyficzna wobec swoich promotorów, nie
rozpoznaje również obcych (inne niż faga) sygnałów terminacyjnych. Przeprowadzana
przez nią transkrypcja przebiega 5 razy szybciej niż w przypadku polimerazy RNA E.
coli. Ponadto jest białkiem niewrażliwym na rifampicynę (antybiotyk ten blokuje
polimerazę RNA E. coli).
Zespół F. Studiera skonstruował serię wektorów pET (plazmid for expression by T7
RNA polymerase). Wektory wykorzystywane do ekspresji produktu białkowego
klonowanego genu.
Posiadają promotor i terminator dla polimerazy RNA faga T7 oraz sygnały startu
translacji pochodzące od fagowego genu 10 (główne białko kapsydu).
Do promotora polimerazy T7 dodano operator promotora laktozowego w pozycji +2
(patrz mapa plazmidu pET16b). Daje to możliwość regulacji ekspresji przy pomocy
represora LacI, dla którego gen też został wprowadzony do wektorów pET (Warto
przypomnieć sobie regulacje operonu laktozowego!). Aby zaszła wydajna ekspresja
klonowanego genu z takiego wektora w szczepie bakteryjnym musi posiadać on gen
polimerazy RNA faga T7.
Aby ułatwić oczyszczanie klonowanego białka dodatkowo do wektorów pET
wprowadzono za MCS sekwencje kodującą 10 lub 6 reszt histydyny. Dzięki temu
produkt białkowy na swym N lub C końcu dodatkowo uzyskiwał polihistydynowy
„ogon”. Do oczyszczania takiego białka można wykorzystać chromatografię
powinowactwa (roz. 9). Wektory i szczepy oraz zestawy do oczyszczania
wykorzystywane do stworzenia takiego produktu białkowego nazwano systemem pET
His-Tag lub systemem ekspresyjnym z udziałem polimerazy faga T7.