Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

Wykonanie:
1. Elektroblotting – transfer białek rozdzielonych w żelu poliakrylamidowym SDS na błonę
nitrocelulozową w aparacie do transferu. Przed użyciem błonę należy płukać 10 min w
buforze TBS. W odpowiedniej kolejności ułożyć żel, błonę i papier absorbujący na
przekładkach do aparatu i zanurzyć w buforze do transferu, ostrożnie usuwając pęcherzyki
powietrza z pomiędzy układanych warstw.
2. Złożyć „kanapkę” jak przedstawia rysunek poniżej. Wszystkie komponenty muszą być
zwilżone buforem i ściśle złożone. Umieścić „kanapkę” transferową w aparacie z błoną
od strony elektrody dodatniej.
3. Transfer prowadzić przez 1 – 18 godzin przy ~ 100 V w chłodni, albo okładając aparat
lodem.
4. Po transferze zanurzyć błonę w buforze blokującym. Inkubować 30 – 60 min z delikatnym
wytrząsaniem. Żel poliakrylamidowy można teraz wybarwić Coomassie albo srebrem dla
sprawdzenia efektywności transferu.
5. Przenieść błonę do buforu TTBS, płukać mieszając przez 5 min
6. Wymienić bufor TTBS i ponownie płukać 5 min.
7. Zanurzyć błonę w pierwszym roztworze przeciwciał. Inkubować 1 – 2 godziny z
delikatnym wytrząsaniem.
8. Przepłukać błonę dwukrotnie przez 5 min w buforze TTBS.
9. Przenieść błonę do drugiego roztworu przeciwciał.
10. Płukać błonę w TTBS 5 min dwa razy.
11. Płukać błonę w buforze TBS przez 5 min w celu usunięcia detergentu Tween 20.
12. Przygotować świeżą mieszninę BCIP/NBT.
13. Dla rozwinięcia reakcji barwnej zanurzamy błonę w roztworze substratów dla fosfatazy
alkalicznej. W zależności od czułości reakcji inkubować 4 – 30 min a nawet do 4 godzin.
14. Zahamować reakcję przez zanurzenie błony w buforze TBS z 20 mM EDTA.
Białka, Ekspresja klonowanego genu
34