Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

More documents

Recommendations

Info

• Przeciwciała wyznakowane radioaktywnie. Metody detekcji radioaktywnej polegają na odczycie densytometrycznym lub na ekspozycji na kliszę rentgenowską. • Przeciwciała wyznakowane enzymatycznie. Są to proste metody nie wymagające specjalistycznego sprzętu i dające bezpośredni wynik. Używa się buforu z substratami dla enzymu którym wyznakowane są przeciwciała. W wyniku reakcji otrzymuje się barwny produkt – w postaci prążka na błonie w miejscu gdzie znajduje się wykrywane białko. Enzymy wykorzystywane do znakowania: Alkaliczna fosfataza – substraty to BCIP/NBT – prurpurowo-czarny produkt Peroksydaza chrzanowa – substrat AEC albo DAB – niebiesko-czarny produkt CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Materiały i sprzęt: 1. Aparat do elektrotransferu. 2. Kuwety. 3. Błona nitrocelulozowa – przycięta do wymiaru żelu. 4. Papier absorbujący – np. Whatman 3MM 5. Roztwory: BUFOR DO TRANSFERU Tris 25 mM 2,9 g Glicyna 190 mM 14,5 g Metanol 20% 200 ml Dopełnić wodą do 1 L BUFOR 1 x TBS 20 mM Tris 4,84 g 500 mM NaCl 58,48 g Dopełnić wodą do 2 L pH 7,5 BUFOR DO PŁUKANIA 1 x TTBS 20 mM Tris 4,84 g 500 mM NaCl 58,48 g Tween 20 0,5 ml Dopełnić wodą do 1 L pH 7,5 BUFOR BLOKUJĄCY 3% żelatyna 3 g 1 x TBS 100 ml Podgrzać do 37°C w celu rozpuszczenia żelatyny, następnie schłodzić. Białka, Ekspresja klonowanego genu 32
BUFOR DO PRZECIWACIAŁ 1 % żelatyna 2 g 1 x TTBS 200 ml Podgrzać do 37°C w celu rozpuszczenia żelatyny, schłodzić przed dodaniem przeciwciał. a) Pierwszy roztwór przeciwciał – 100 ml Rozpuścić gatunkowo specyficzne podstawowe królicze albo mysie IgG w odpowiednim mianie. b) Drugi roztwór przeciwciał – 100 ml Rozpuścić drugie przeciwciało odpowiednie do podstawowego, skoniugowane z fosfatazą alkaliczną (miano 3,000 - 33 µl na 100 ml buforu). BUFOR WĘGLANOWY 0,1 M NaHCO3 8,40 g 1 mM MgCl2 x 6 H2O 0,203 g Dodać wody do 900 ml i doprowadzić pH do 9,8 dodając NaOH. Dopełnić wodą do 1000 ml. ROZTWÓR DO REAKCJI BARWNEJ Z FOSFATAZĄ ALKALICZNĄ Roztwór A 140 µl DMF 60 µl H2O 0,006 g NBT Roztwór B 200 µl DMF 0,003 g BCIP Proporcje na jedną reakcję. Przed samym użyciem połączyć roztwór A i B. Dopełnić do 20 ml buforem węglanowym Białka, Ekspresja klonowanego genu 33
Page 1 and 2: Akademia Medyczna w Gdańsku Katedr
Page 3: 1. 1. Zagadnienia ogólne: CZĘŚĆ
Page 6 and 7: Inne istotne cechy, które powinien
Page 8: * Region ekspresji T7: gen bla miej
Page 11 and 12: 1.3. Przygotowanie i transformacja
Page 13 and 14: 2. WYBRANE ENZYMY WYKORZYSTYWANE DO
Page 15 and 16: Zastosowanie. Dzięki ligazie może
Page 17 and 18: Wykonanie: 1. Zaszczepić pojedyncz
Page 19 and 20: cykl 4 W reakcji syntezy DNA stosow
Page 21 and 22: - supernatant przenieść do jałow
Page 23 and 24: DNA, Detekcja i analiza 23
Page 25 and 26: Wykonanie: Sprawdzanie poziomu indu
Page 27 and 28: CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Materiały: 1.
Page 29 and 30: Wykonanie: Zachować podaną kolejn
Page 31: • Zahamować reakcję roztworem "
Page 35 and 36: papier absorpcyjny żel nitrocelulo
Page 37 and 38: Objaśnienienie skrótów: IPTG - i

Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?