Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

5. Przygotowanie aparatu do elektroforezy.
• Po spolimeryzowaniu żelu górnego umieścić płytki z żelem w aparacie do
elektroforezy
• Napełnić 1 x stężonym buforem elektrodowym dolne i górne naczynie
elektrodowe.
• Wyjąć ostrożnie grzebień, wszystkie utworzone studzienki muszą być zalane
buforem elktrodowym
6. Nanoszenie próbek na żel.
• Przygotowane wcześniej próbki nanosić do kolejnych studzienek w żelu przy
pomocy pipety automatycznej z tipsem o kapilarnym zakończeniu.
• Oprócz próbek badanych nanieść próbkę wzorcową
7. Rozdział elektroforetyczny
• Połączyć dolną elektrodę z biegunem „+”, a górną z biegunem „-” zasilacza.
• Włączyć zasilacz i prowadzić rozdzial przy napieciu 160V
• Kontynuować rozdział aż do wyjścia barwnika.
• Po zakończonym rozdziale wyłączyć prąd, wylać bufor, wyjąć płytkę
• Ostrożnie rozdzielić płytki
• Żel wybarwić
3. 1. 2. Barwienie żeli poliakrylamidowych.
1. Barwienie przy użyciu barwnika Coomassie Brillant Blue.
• Przygotować roztwór barwnika: 0,2% Coomassie Brillant Blue w mieszaninie
kwas octowy: metanol: woda o proporcjach 1: 5 : 5
• Żel zalać barwnikiem, czas barwienia zależy od grubości żelu, dla żelu 1 mm
jest to około 2 godz.
• Odbarwiać w mieszaninie kwas octowy – metanol – woda 1 : 2 : 8 przez noc.
2. Barwienie srebrem.
• Płukać żel w 50% metanolu przez godzinę lub całą noc
• Przygotować w odzielnych naczyniach dwie mieszaniny:
a) 0,8 g AgNO3 w 4 ml redestylowanej H2O
b) 75,6 mg NaOH w 21 ml wody i 1,4 ml wody amoniakalnej
• Dodawać kroplami roztwór srebra do miszanego cały czas roztworu b),
dopełnić do 100 ml wodą
• Barwić żel 15 min.
• Płukać żel 3 x redestylowaną wodą po 5 min
• Zalać żel świeżo przygotowanym wywoływaczem
0,5 ml 1% kwasu cytrynowego
50 µl 37% formaldehydu
dopełnić do 100 ml H2O redestylowaną
• Wywoływać żel do uzyskania prążków o pożądanej intensywności
• Zlać wywoływacz i przepłukać szybko żel wodą
Białka, Ekspresja klonowanego genu
30