Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

1. 1. Zagadnienia ogólne:
CZĘŚĆ PIERWSZA: DNA
1. KLONOWANIE DNA.
Technika klonowania polega na wprowadzeniu do komórek biorcy ściśle określonego
odcinka DNA dawcy zawierającego jeden lub kilka genów w celu zmienienia właściwości
biorcy. Fragment DNA, który ma być wprowadzony do komórek biorcy musi zostać
połączony odpowiednim wektorem (nośnikiem). W efekcie otrzymuje się klony, czyli zbiór
identycznych organizmów. Narzędzia wykorzystywane w klonowaniu to:
1) szczepy bakteryjne, 2) wektory, 3) enzymy.
W dużym skrócie najczęściej wykonywany schemat klonowania przebiega w następujący
sposób:
1. DNA przeznaczony do klonowania może być wyizolowany z komórek dawcy lub
zsyntetyzowany chemicznie (PCR).
2. Następnie oba końce klonowanego fragmentu DNA zostają pocięte przy użyciu
enzymów restrykcyjnych.
3. Otrzymane fragmenty miesza się następnie in vitro w odpowiednim stosunku z
wektorem uciętym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Użycie odpowiednich
enzymów restrykcyjnych powoduje, że klonowany fragment DNA i ucięty wektor
posiadają komplementarne do siebie końce (końce lepkie lub tępe – patrz roz. 2.1)
4. Wektor i fragment DNA zostają połączone przy udziale ligazy DNA faga T4. (patrz
roz. 2.3)
5. Uzyskane w ten sposób hybrydowe cząsteczki DNA wprowadza się metodą
transformacji do odpowiednio przygotowanego biorcy. Biorca powinien zapewnić
ekspresję klonowanego DNA, jak również zwiększyć liczbę kopii zrekombinowanego
wektora.
6. Uzyskane klony selekcjonuje się na odpowiednich podłożach (zwykle zawierającymi
antybiotyk). Najczęściej stosowanym gospodarzem dla obcego DNA są komórki
bakteryjne.
Klonowanie umożliwia wyizolowanie z heterogennej mieszaniny DNA fragment DNA
będący przedmiotem naszego zainteresowania i jego powielenie, tzn. amplifikację w np.
komórce mikroorganizmu. Użyty do klonowania DNA nie musi być pochodzenia
bakteryjnego, z kolei musi zostać połączony z wektorem, który ma zdolność do
autonomicznej replikacji w mikroorganizmie. Wybór eukariotycznego gospodarza wiąże się z
użyciem wektora zdolnego do replikacji w tym organizmie. Hodowanie bakterii niosących
zrekombinowane DNA nie stanowi większego problemu, umożliwia to wyizolowanie dużej
ilości zarówno specyficznego DNA jak i produktu białkowego, które można poddać dalszym
badaniom.