Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

More documents

Recommendations

Info

3. ANALIZA ILOŚCI I JAKOŚCI BIAŁKA. 3. 1. Elektorforeza poliakrylamidowa białek Metoda ta jest powszechnie stosowana do rozdziału i charakterystyki białek. Na jednym żelu można przeprowadzić jednocześnie rozdział wielu próbek, a rozdzielone białka można skutecznie wykryć na żelu metodą barwienia lub autoradiografii. Żel poliakrylamidowy powstaje w wyniku reakcji polimeryzacji akrylamidu z N,N’metyleno-bis-akrylamidem. Gęstość żelu zależy od stężenia obu tych składników, stopień usieciowania żelu od całkowitego stężenia Bis-akrylamidu. Reakcja polimeryzacji jest katalizowana przez nadsiarczan amonu i TEMED. Utworzony żel służy jako nośnik do rozdziału elektroforetycznego, funkcjonuje jednocześnie jako sito molekularne, co wpływa na skuteczny rozdział makrocząsteczek. Wielkość porów sita uwarunkowana zarówno przez stężenie akrylamidu (ze wzrostem stężenia maleje wielkość porów), jak i przez stopień usieciowania, musi być właściwie dobrana do wielkości rozdzielanych cząsteczek. Najczęściej stosowane są żele o stężeniu od 7,5 do 12,5%. Obecnie preferowana jest forma płytowa żelu dająca możliwość naniesienia jednocześnie na jeden żel wielu próbek. Najczęściej stosuje się elektroforezę na tzw. żelu nieciągłym, w którym próbkę nanosi się na żel zagęszczający (o dużych porach) spolimeryzowany na wierzchu żelu rozdzielającego (o małych porach). W tej technice bufor elektrodowy oraz bufory wchodzące w skład obu żeli różnią się składem i pH. Zaletą tego systemu jest koncentracja białek podczas wędrówki przez żel zagęszczający, co powoduje, że niezależnie od objętości próbki białka wchodzą w żel rozdzielający w postaci wąskiego, zatężonego pasma. Technika elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z użyciem anionowego detergentu, siarczanu dodecylu (SDS), pozwala na rozdział białek zgodnie z ich masą cząsteczkową. Przed i w trakcie elektroforezy białka ulegają dysocjacji i denaturacji w obecności SDS, co nadaje im określony ładunek elektryczny - ujemny. W rezultacie czynnikiem decydującym o szybkości poruszania się białek w trakcie elektroforezy jest ich masa cząsteczkowa. W warunkach natywnych jest to nie możliwe ponieważ poszczególne białka mają różny punkt izolelektryczny. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Materiały: 1. Bufor lizujący 4 x stężony do przygotowania próbek na żel 0,125 M Tris HCl pH 6.8 5% SDS 10% β-merkaptoetanol 20% glicerol 2. 30 % roztwór akrylamidów 3. Bufor do żelu górnego 0,5 M Tris-HCl, 0,4% SDS. 4. Bufor do żelu dolnego 1,5 M Tris-HCl, 0,4% SDS. 5. Roztwór nadsiarczanu amonu 10% 6. TEMED 7. Bufor elektrodowy 10 x stężony 8. Woda redestylowana. Białka, Ekspresja klonowanego genu 28
Wykonanie: Zachować podaną kolejność czynności. 1. Przygotowanie próbek na żel. • Do próbek (np. 50 μl), które chcemy sprawdzić na zawartość białka (np. próbki zebrane w czasie indukcji i oczyszczania białka) dodać ¼ objętości 4 x stężonego buforu lizującego. • Umieścić próbki w łaźni wodnej na 4 min. • Próbki mogą być przechowywane do miesiąca w 4 0 C 2. Przygotowanie płytek. • Dokładnie umyte płytki szklane odtłuścić przecierając alkoholem (denaturat). • Złożyć płytki z odpowiednimi przekładkami i umieścić w statywie do wylewania żeli UWAGA!!! Akrylamid jest związkiem toksycznym! Wszystkie czynności należy wykonywać w rękawiczkach! 3. Przygotowanie żelu dolnego (rozdzielającego) 12,5% • Sporządzić mieszaninę: Bufor 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 0,4% SDS 2,0 ml 30% roztwór akrylamidów 3,3 ml Woda 2,7 ml 10% nadsiarczan amonu 40 µl TEMED 8 µl TEMED dodajemy na samym końcu tuż przed wylaniem żelu. • Wymieszać dokładnie wszystkie składniki • Wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do 2/3 wysokości, zostawiając miejsce na żel górny i grzebień. • Na żel nawarstwić ostrożnie 1-2 mm wody • Pozostawić do polimeryzacji ok. 20 min 4. Przygotowanie żelu górnego (zagęszczającego) 5%. • Sporządzić mieszaninę: Bufor 0,5 M Tris-HCl pH 8,8, 0,4% SDS 0,8 ml 30% roztwór akrylamidów 0,5 ml Woda 2,1 ml 10% nadsiarczan amonu 30 µl TEMED 6 µl • Zlać wodę z żelu dolnego • Napełnić płytki żelem górnym • Wsunąć grzebień tak, aby nie powstały pęcherzyki powietrza • Pozostawić do polimeryzacji Białka, Ekspresja klonowanego genu 29
Page 1 and 2: Akademia Medyczna w Gdańsku Katedr
Page 3: 1. 1. Zagadnienia ogólne: CZĘŚĆ
Page 6 and 7: Inne istotne cechy, które powinien
Page 8: * Region ekspresji T7: gen bla miej
Page 11 and 12: 1.3. Przygotowanie i transformacja
Page 13 and 14: 2. WYBRANE ENZYMY WYKORZYSTYWANE DO
Page 15 and 16: Zastosowanie. Dzięki ligazie może
Page 17 and 18: Wykonanie: 1. Zaszczepić pojedyncz
Page 19 and 20: cykl 4 W reakcji syntezy DNA stosow
Page 21 and 22: - supernatant przenieść do jałow
Page 23 and 24: DNA, Detekcja i analiza 23
Page 25 and 26: Wykonanie: Sprawdzanie poziomu indu
Page 27: CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Materiały: 1.
Page 31 and 32: • Zahamować reakcję roztworem "
Page 33 and 34: BUFOR DO PRZECIWACIAŁ 1 % żelatyn
Page 35 and 36: papier absorpcyjny żel nitrocelulo
Page 37 and 38: Objaśnienienie skrótów: IPTG - i

Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?