Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

3. ANALIZA ILOŚCI I JAKOŚCI BIAŁKA.
3. 1. Elektorforeza poliakrylamidowa białek
Metoda ta jest powszechnie stosowana do rozdziału i charakterystyki białek. Na
jednym żelu można przeprowadzić jednocześnie rozdział wielu próbek, a rozdzielone białka
można skutecznie wykryć na żelu metodą barwienia lub autoradiografii.
Żel poliakrylamidowy powstaje w wyniku reakcji polimeryzacji akrylamidu z N,N’metyleno-bis-akrylamidem.
Gęstość żelu zależy od stężenia obu tych składników, stopień
usieciowania żelu od całkowitego stężenia Bis-akrylamidu. Reakcja polimeryzacji jest
katalizowana przez nadsiarczan amonu i TEMED. Utworzony żel służy jako nośnik do
rozdziału elektroforetycznego, funkcjonuje jednocześnie jako sito molekularne, co wpływa na
skuteczny rozdział makrocząsteczek. Wielkość porów sita uwarunkowana zarówno przez
stężenie akrylamidu (ze wzrostem stężenia maleje wielkość porów), jak i przez stopień
usieciowania, musi być właściwie dobrana do wielkości rozdzielanych cząsteczek.
Najczęściej stosowane są żele o stężeniu od 7,5 do 12,5%. Obecnie preferowana jest forma
płytowa żelu dająca możliwość naniesienia jednocześnie na jeden żel wielu próbek.
Najczęściej stosuje się elektroforezę na tzw. żelu nieciągłym, w którym próbkę nanosi się na
żel zagęszczający (o dużych porach) spolimeryzowany na wierzchu żelu rozdzielającego (o
małych porach). W tej technice bufor elektrodowy oraz bufory wchodzące w skład obu żeli
różnią się składem i pH. Zaletą tego systemu jest koncentracja białek podczas wędrówki przez
żel zagęszczający, co powoduje, że niezależnie od objętości próbki białka wchodzą w żel
rozdzielający w postaci wąskiego, zatężonego pasma.
Technika elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z użyciem anionowego detergentu,
siarczanu dodecylu (SDS), pozwala na rozdział białek zgodnie z ich masą cząsteczkową.
Przed i w trakcie elektroforezy białka ulegają dysocjacji i denaturacji w obecności SDS, co
nadaje im określony ładunek elektryczny - ujemny. W rezultacie czynnikiem decydującym o
szybkości poruszania się białek w trakcie elektroforezy jest ich masa cząsteczkowa. W
warunkach natywnych jest to nie możliwe ponieważ poszczególne białka mają różny punkt
izolelektryczny.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Materiały:
1. Bufor lizujący 4 x stężony do przygotowania próbek na żel
0,125 M Tris HCl pH 6.8
5% SDS
10% β-merkaptoetanol
20% glicerol
2. 30 % roztwór akrylamidów
3. Bufor do żelu górnego 0,5 M Tris-HCl, 0,4% SDS.
4. Bufor do żelu dolnego 1,5 M Tris-HCl, 0,4% SDS.
5. Roztwór nadsiarczanu amonu 10%
6. TEMED
7. Bufor elektrodowy 10 x stężony
8. Woda redestylowana.
Białka, Ekspresja klonowanego genu
28