Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Materiały:
1. Kolumna upakowana złożem Ni-NTA – ok. 1 ml
2. Bufory: lizujący, płuczący, elucyjny
3. 30 % etanol
Bufor lizujący/wiążąc:
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
10 mM imidazol
pH 8
Bufor płuczący:
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
20 mM imidazol
pH 8
Bufor elucyjny:
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
250 mM imidazol
pH 8
Wykonanie:
Zaktywowane złoże Ni-NTA, przechowujemy w 30 % etanolu lub 0,02 % azydku w
temperaturze pokojowej. Złoże powinno mieć jasnoniebieski kolor. Przyjmuje się, że raz
zaktywowane złoże można użyć od 5 do 10. Kiedy kolor złoża z jasnoniebieskiego zrobi się
brązowo-siwy, należy wypłukać jony Ni 2+ 0,5 M EDTA i zregenerować złoże wg wskazań
producenta.
1. Zrównoważyć złoże buforem wiążącym – 5- 10 objętości złoża.
2. Nanieść na przygotowaną kolumnę supernatant uzyskany z wirowania lizatu
komórkowego. Równocześnie zbierając frakcje białka nie związanego ze złożem.
3. Płukać złoże buforem płuczącym - 5- 10 objętości złoża.
4. Płukać złoże buforem elucyjnym - 5- 10 objętości złoża.
W przypadku pkt 3 i 4 zbierać każdą frakcje o objętości złoża do oddzielnych
probówek.
5. Płuczemy złoże 30 % etanolem.
6. Zawartość białka w kolejnych zbieranych frakcjach z kolumny określić za pomocą
elektroforezy poliakrylamidowej.
Białka, Ekspresja klonowanego genu
27