Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

Liza komórek bakteryjnych.
2. IZOLACJA I OCZYSZCZANIE BIAŁKA.
1. Do osadu bakteryjnego zawieszonego w 5 ml buforu lizującego dodać lizozym do
stężenia końcowego 0,2 mg/ml oraz PMSF w stężeniu końcowym 1 mM.
2. Inkubować lodzie 30 min.
3. Rozbić komórki ultradźwiękami przy użyciu sonikatora (6 cykli po 1 min z 1 min
przerwami).
4. Lizat zwirować – 30 min 22 tys. obr/min, 4°C
5. Supernatant użyć do dalszego oczyszczania.
Oczyszczania białka przy użyciu chromatografii powinowactwa w warunkach
natywnych.
Dzięki użyciu do klonowania jednego z wektorów pET (pET16b) białko rekombinacyjne
uzyskuje na końcu N „ogon polihistydynowy”. Do oczyszczania białka wykorzystana zostanie
metoda chromatografii powinowactwa na złożu Ni-NTA.
Rys. 7 Interakcja pomiędzy osadzonym na nośniku jonem niklu a dwiema resztami histydyny.
Macierz złoża Ni-NTA to ziarna agarozowe z ligandem chelatującym metale – nośnikiem
(kwas nitrylotrioctowy - NTA). Jon metalu (Ni 2+ ) unieruchomiony jest na nośniku poprzez
cztery stabilne wiązania. Jon metalu związany ze złożem ma dwa wolne miejsca wiążące i
może tworzyć wiązania koordynacyjne z histydyną na N końcu białka. Imidazol który ma
większe powinowactwo do niklu niż histydyna wypiera białko za złoża. Do elucji białek nie
specyficznie związanych ze złożem używa się 20-40 mM stężenia imidazolu, do elucji białek
specyficznie związanych ze złożem (właściwe białko rekombinacyjne) używa się większego
stężenia imidazolu (200 - 400 mM).
Białka, Ekspresja klonowanego genu
26