Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

Wykonanie:
Sprawdzanie poziomu indukcji białka:
1. Przygotować hodowlę nocną.
- do 25 ml pożywki LB z dodatkiem ampicyliny w stężeniu końcowym 1 µg/ml
posiać jedną kolonie szczepu E. coli BL21 zawierającego plazmid pET16b z
klonowanym genem.
- inkubować przez noc z wytrząsaniem w temp. 37°C
2. Odmłodzenie hodowli nocnej.
- do świeżej pożywki LB 50 ml uzupełnionej ampicyliną jw. Przenieść 0,5 - 1 ml
hodowli nocnej
3. Prowadzić hodowle do OD600= 0,5
4. Pobrać próbkę 1,5 ml hodowli do jałowej probówki – przygotować
próbkę na żel.
5. Do hodowli dodać IPTG do stężenia 0,5 mM (albo 1 mM).
6. Co 30 min (cztery razy – po 1, 1.5, 2 i 2.5 godziny) od momentu indukcji pobierać
próbki tak jak w punkcie 4.
7. Przeprowadzić analizę próbek na zawartość białka metodą elektroforezy
poliakrylamidowej.
Produkcja zrekombinowanego białka na dużą skalę.
1-5.Wykonujemy jak wyżej. Zmieniamy tylko objętość pożywki hodowli
nocnej i hodowli właściwej w zależności jak dużo chcemy uzyskać pasty
bakteryjnej do dalszego oczyszczania produktu białkowego. Hodowle po
dodaniu IPTG prowadzimy do momentu uzyskana najlepszego poziomu
indukcji określonego w poprzednim doświadczeniu.
6. Po określonym czasie prowadzenia hodowli całą pożywkę z wirować (30 min.
4000 obr./min, 4°C)
8. Osad bakteryjny zawiesić w buforze A zamrozić w ciekłym azocie i
przechowywać w temperaturze - 80°C.
Białka, Ekspresja klonowanego genu
25