Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

CZĘŚĆ DRUGA: BIAŁKA
1. PRODUKCJA ZREKOMBINOWANEGO BIAŁKA – EKSPRESJA
KLONOWANEGO GENU.
Uzyskane w procesie transformacji klony należy sprawdzić na obecność
zrekombinowanego genu. W celu można wykonać reakcję PCR na wyizolowanym lizą
alkaliczną plazmidzie. Plazmid można też trawić enzymami restrykcyjnymi wykorzystanymi
wcześniej w procesie klonowania. W obu przypadkach uzyskanie fragmentów DNA o
określonej długości będzie świadczyło o obecności w wektorze klonowanego genu. Gdy
celem klonowania jest produkcja białka na dużą skalę zanim się do tego przystąpi należy
sprawdzić poziom indukcji i czy uzyskane białko ma oczekiwaną masę.
1.1 Sprawdzenie poziomu indukcji białka.
Klonowanie z wykorzystaniem sytemu polimerazy faga T7 daje możliwość ścisłej kontroli
ekspresji klonowanego białka. Transkrypcja białka zajdzie tylko w momencie dodania do
hodowli induktora IPTG (zniesienie represji z operatora; I – 1.2). Poziom indukcji dodatkowo
można regulować stężeniem IPTG. Najlepszym momentem do indukcji dla bakterii jest faza
logarytmicznego wzrostu. W tym czasie intensywnie zachodzą wszystkie procesy komórkowe
(replikacja, transkrypcja, translacja), duże jest stężenie wykorzystywanych enzymów. W
jakiej fazie wzrostu znajdują się bakterie można określić spektrofotometrycznie. Mierzy się
poziom zmętnienia pożywki (absorbancję) na spektrofotometrze nastawionym na długości fali
λ = 600, wyskalowanym na czystej pożywce. OD600=0,5 świadczy, że bakterie znajdują się
logarytmicznej fazie wzrostu. Do tego momentu białko rekombinacyjne nie powinno być
wykrywane w komórce bakteryjnej, albo znajdować się na bardzo niskim poziomie. Po
dodaniu w tym momencie IPTG rusza intensywna ekspresja klonowanego genu. Prawidłowy
przebieg indukcji można sprawdzić dopiero na żelu poliakrylamidowym, w tym celu przed i
po dodaniu IPTG należy pobrać i przygotować próbki na żel.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Materiały:
1. Pożywki LB
2. roztwór ampicyliny 1mg/ml
3. IPTG
4. Bufor A (20 mM Tris-HCl pH 7.9, 0.2 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 5% glicerol,
0, 5 M β-merkaptoetanol, PMSF 1 mM.
5. Bufor lizujący do przygotowania próbek na żel.
EDTA – blokuje metaloproteazy chelatując jony metali, które są w centrum aktywnym tych
enzymów.
β-merkaptoetanol – w procesie oczyszczania białek używa się go w celu ochrony białek
tiolowych przed utlenieniem.
PMSF – inhibitor proteaz serynowych.
Białka, Ekspresja klonowanego genu
24