Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

5. DETEKCJA I ANALIZA DNA.
5. 1. Elektroforeza DNA na żelu agarozowym.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA.
Materiały i sprzęt:
1. Agaroza 0,45 g (mały żel 1,5 % o długości około 8 cm)
2. 1 x stężony bufor TBE (90 mM Tris-boran, 2 mM EDTA)
3. Bufor obciążający 6 x razy stężony do próbek.
4. Marker DNA
5. Roztwór bromku etydyny.
6. Zasilacz.
7. Mały aparat do elektroforezy poziomej.
Wykonanie
1. Agarozę rozpuścić w 30 ml buforu TBE.
2. Agarozę wylać na płytę aparatu, przed zastygnięciem umieścić w żelu grzebień na
odpowiedniej głębokości, aby uzyskać studzienki.
3. Po zastygnięciu żelu zalać go buforem 1 x stężonym TBE tak, aby pokrywał on
powierzchnię żelu.
4. Próbki DNA po 10 μl zawiesić w buforze obciążającym 2 μl.
5. Nanieść próbki do studzienek w żelu.
6. Elektroforezę prowadzić przy stałym napięciu 100 V do momentu uzyskania
prawidłowego rozdziału próbek
7. Żel barwić w roztworze bromku etydyny
8. Analizę wyników prowadzić w świetle UV.
a).wylewanie żelu agarozowego
grzebień
Płytka do
wylewania żelu
b). prawidłowe ustawienie grzebienia
Zęby grzebienia
DNA, AMPLIFIKACJA (PCR)
A
agaroza
Taśma uszczelniająca
Żel agarozowy
Szkielet cukrowo-fosforanowy
a). cząsteczka bromku etydyny
H2N
Para zasad
3,4 Å I
Cząsteczka DNA
N +
EtBr
NH2
CH3Br -
b). interkalacja bromku etydyny
w obręb podwójnej nici DNA
B
Cząsteczka
bromku etydyny
>3,4 Å
I 3,4 Å
22