Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Temp.<br />
[ 0 C]<br />
100<br />
94<br />
72<br />
50<br />
37<br />
denaturacja<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
UWAGA!!!<br />
W reakcji PCR mogą być amplifikowane tak małe ilości DNA, jak nawet pojedyncza<br />
cząsteczka. Zalecane są następujące środki ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu<br />
próbki:<br />
• Wszystkie czynności wykonywać w rękawiczkach<br />
• Używać buforów przeznaczonych wyłącznie do reakcji PCR<br />
• Używać wyłącznie jałowych tipsów i probówek<br />
• Nie chlapać roztworami DNA<br />
I. Przygotowanie matrycowego DNA.<br />
1. Plazmid oczyszczony metodą lizy alkaicznej do mieszaniny reakcyjnej 2.<br />
2. Próbka bakteryjna do mieszaniny reakcyjnej 1:<br />
- pojedynczą kolonię bakteryjną przenieść jałowo do probówki<br />
- zawiesić w 1ml buforu lizującego (40 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,3 M KCl,<br />
10 mM EDTA), próbkę energicznie wymieszać<br />
- wirować 5 min<br />
- supernatant odrzucić, osad zawiesić ponownie w 1ml buforze lizującym z dodatkiem<br />
lizozymu<br />
- wymieszać i inkubować 5 min na stole<br />
- wirować 2 min<br />
- supernatant odrzucić, osad zawiesić w 300 µl jałowej wody<br />
- próbkę gotować 10 min w łaźni wodnej<br />
- po ostudzeniu wirować 5 min<br />
DNA, AMPLIFIKACJA (PCR)<br />
Cykl 1 Cykl 2<br />
denaturacja<br />
Dołączanie<br />
startera<br />
Wydłużanie<br />
łańcucha<br />
1 2 3 4<br />
Rys 5. Profil termiczny PCR<br />
czas [min]<br />
20
Change language