Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

Rys 3. Rozdział w żelu agarozowym plazmidu pET16b.
Plazmid widoczny w trzech formach:
OC – kolista powstała po przecięciu jednej z nici DNA,
L – liniowa powstała po przecięciu obu nici DNA
CCC – kolista, superzwinięta
4. AMPLIFIKACJA DNA in vitro METODĄ ŁAŃCUCHOWEJ REAKCJI
POLIMERAZY (PCR).
Metoda ta służy do amplifikacji segmentu DNA położonego pomiędzy regionami o znanej
sekwencji. W reakcji tej używane jako primery (startery) są dwa oligonukleotydy,
komplementarne do sekwencji położonych na przeciwległych niciach matrycowego DNA,
flankujące rejon DNA, który ma podlegać amplifikacji. DNA jest syntetyzowane w serii
reakcji katalizowanych przez polimerazę DNA. Każdy cykl składa się z następujących
etapów:
1. Denaturacji matrycowego DNA w temperaturze 94-95 0 C, w obecności czterech
rodzjów dNTP oraz dużego nadmiaru primerów.
2. Przyłączenia primerów do sekwencji homologicznych w matrycowym DNA, co
następuje po ochłodzeniu do temperatury 45-65 0 C,
3. Wydłużania primerów przez polimerazę DNA w temperaturze 72 0 C, co w rezultacie
pozwala na syntezę fragmentu DNA.
Temperatura przyłączania primerów zależy od długości oligonukleotydów (długość
ich nie powinna być mniejsza niż 15-16 nukleotydów, optymalna to 22-28 nt), ich
temperatury topnienia i specyficznego łączenia się z matrycowym DNA. Każdy cykl,
składający się z denaturacji, przyłączenia i syntezy, powtarzany jest wielokrotnie (od
25 do 40 razy). DNA będący produktem każdego cyklu służy jako matryca w
następnych cyklach, czego skutkiem jest szybkie powiększanie puli syntetyzowanego
DNA.
Produktem reakcji PCR jest dwuniciowy fragment DNA, którego końcami są końce 5’
primerów, a długość określona jest przez odległość pomiędzy primerami. Poza tym
zsyntetyzowany DNA posiada tępe końce.
DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna)
OC
L
CCC
18