Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

Wykonanie:
1. Zaszczepić pojedynczą kolonie bakteryjną w 25 ml pożywki LB uzupełnionej
ampicyliną do stężenia 10 μg/ml (hodowle prowadzić w kolbie o objętości 100 ml).
Bakterie hodować przez noc w temp. 370C w wytrząsarce.
2. Wprowadzić 1,5 ml hodowli do probówki. Wirować 1- 2 min. Supernatant odrzucić.
Czynności te powtórzyć 2 - 3 razy (w tej samej probówce).
3. Osad rozpuścić w 100 μl buforu GET + lizozym (roztwór I), energicznie
worteksujemy do całkowitego rozbicia osadu.
4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
5. Dodać 200 μl świeżo przygotowanego roztworu II.
Mieszać delikatnie przez
odwracanie probówki trzy razy. Nie worteksować!
6. Inkubować w lodzie 5 minut.
7. Dodać 150 μl zimnego roztworu III. Worteksować przez około 30 sekund.
8. Wirować 5 - 15 minut.
9. Przenieść supernatant (około 400 μl) do czystych probówek (nie naruszyć osadu!)
Zebrany roztwór musi być klarowny
10. Dodać 200 μl fenolu i 200 μl mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy 23:1 v:v.
Worteksować przez około 30 sekund.
11. Wirować 5 min.
12. Zebrać ok. 400 μl górnej fazy do nowej probówki. Nie wolno naruszyć dolnej
warstwy! Zebrany roztwór musi być klarowny. Zmętnienie roztworu świadczy o
zanieczyszczeniu fenolem. Gdy tak się stanie należy zebrany roztwór ponownie
zwirować. Zebrać delikatnie supernatant nie naruszając osadzonego na dnie fenolu.
13. Dodać 1 ml 96% alkoholu etylowego. Mieszać przez czterokrotne obracanie
probówki. Inkubować, co najmniej 10 min. w temperaturze pokojowe lub niższej.
Niższa temperatura jest wskazana przymałej ilości wytrącanego DNA.
14. Wirować 5 - 15 min.
15. Supernatant odrzucić, do osadu dodać 1ml 70% alkoholu etylowego. Mieszać przez
czterokrotne obracanie probówki.
16. Wirować 30 sek.
17. W razie potrzeby powtórzyć punkty 16 i 17.
18. Supernatant odrzucić i osad suszyć pod próżnią.
19. Osad rozpuścić w 20 – 40 μl jałowej wody,
20. Efekt izolacji sprawdzić na żelu agarozowym
DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna) 17