Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
3. IZOLACJA PLAZMIDU METODĄ LIZY ALKALICZNEJ. Metoda ta pozwala na izolację plazmidów i pozbycie się większości chromosomalnego DNA gospodarza i białek. Roztwór I – GET – niszczenie ściany komórkowej, uwrażliwienie błony cytoplazmatycznej Glukoza – powoduje, że roztwór jest hipertoniczny, wnikając do komórki powoduje jej pęcznienie Tris – HCl – utrzymuje stałe pH, związek o dużej pojemności buforowej. EDTA – chelatuje jony dwuwartościowe potrzebne do działania DN-az (Ca 2+ , Mg 2+ ) Lizozym – niszczenie peptydoglikanu (wiązanie β 1,4 glikozydowe) Roztwór II SDS – detergent jonowy – zmienia napięcie powierzchniowe osłon komórkowych – ułatwia pękanie błony, treść komórki wypływa na zewnątrz. NaOH – silna zasada – denaturacja DNA i białek Roztwór III octan potasu – pH 4,8 w niskiej temperaturze, DNA ulega renaturacji. DNA chromosomalne jest długie zlepia się i nie poddaje się całkowitej renaturacji – wraz z większością białek i resztkami błon tworzy kompleksy i ulega precypitacji. Stosunkowo małe cząsteczki DNA (plazmidy) w formie CCC oraz RNA pozostają w roztworze. Po odwirowaniu pozostające w roztworze białka usuwa się poprzez ekstrakcję mieszaniną fenol-chloroform. Zagęszczenie preparatu DNA plazmidowego przeprowadza się przez wytrącanie 95% etanolem. Osad po wysuszeniu rozpuszcza się w wodzie jałowej lub buforze TE ( Tris i EDTA) RNA można usunąć z preparatu za pomocą RN-azy wolnej od DN-azy. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Materiały: 1. Pożywka LB 2. Roztwór I (bufor GET): 50 mM glukoza 1,8 g glukozy = 10 ml 1 M glukozy 10 mM EDTA 4 ml 0,5 M EDTA 25 mM Tris-HCl, pH 8 5 ml 1 M Tris-HCl, pH 8 200 ml Przechowywać w 4 0 C 3. Roztwór II- mieszanina lizująca, przygotowana tuż przed użyciem: jałowa woda 4 ml 0,2 N NaOH 1,2 ml 1N NaOH 1% SDS 0,6 ml 10%SDS 6 ml (wystarczy na 24 próbki) 4. Roztwór III (3M K + - 5M CH3COO - ): 5 M CH3COOK 12 ml CH3COOH lodowaty 2,3 ml jałowa woda 5,7 ml 20 ml 5. Fenol 6. Chloroform: alkohol izoamylowy w stosunku obj. 24:1 7. 96% alkohol etylowy 8. 70% alkohol etylowy 9. Woda redestylowana jałowa DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna) 16
Wykonanie: 1. Zaszczepić pojedynczą kolonie bakteryjną w 25 ml pożywki LB uzupełnionej ampicyliną do stężenia 10 μg/ml (hodowle prowadzić w kolbie o objętości 100 ml). Bakterie hodować przez noc w temp. 370C w wytrząsarce. 2. Wprowadzić 1,5 ml hodowli do probówki. Wirować 1- 2 min. Supernatant odrzucić. Czynności te powtórzyć 2 - 3 razy (w tej samej probówce). 3. Osad rozpuścić w 100 μl buforu GET + lizozym (roztwór I), energicznie worteksujemy do całkowitego rozbicia osadu. 4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. 5. Dodać 200 μl świeżo przygotowanego roztworu II. Mieszać delikatnie przez odwracanie probówki trzy razy. Nie worteksować! 6. Inkubować w lodzie 5 minut. 7. Dodać 150 μl zimnego roztworu III. Worteksować przez około 30 sekund. 8. Wirować 5 - 15 minut. 9. Przenieść supernatant (około 400 μl) do czystych probówek (nie naruszyć osadu!) Zebrany roztwór musi być klarowny 10. Dodać 200 μl fenolu i 200 μl mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy 23:1 v:v. Worteksować przez około 30 sekund. 11. Wirować 5 min. 12. Zebrać ok. 400 μl górnej fazy do nowej probówki. Nie wolno naruszyć dolnej warstwy! Zebrany roztwór musi być klarowny. Zmętnienie roztworu świadczy o zanieczyszczeniu fenolem. Gdy tak się stanie należy zebrany roztwór ponownie zwirować. Zebrać delikatnie supernatant nie naruszając osadzonego na dnie fenolu. 13. Dodać 1 ml 96% alkoholu etylowego. Mieszać przez czterokrotne obracanie probówki. Inkubować, co najmniej 10 min. w temperaturze pokojowe lub niższej. Niższa temperatura jest wskazana przymałej ilości wytrącanego DNA. 14. Wirować 5 - 15 min. 15. Supernatant odrzucić, do osadu dodać 1ml 70% alkoholu etylowego. Mieszać przez czterokrotne obracanie probówki. 16. Wirować 30 sek. 17. W razie potrzeby powtórzyć punkty 16 i 17. 18. Supernatant odrzucić i osad suszyć pod próżnią. 19. Osad rozpuścić w 20 – 40 μl jałowej wody, 20. Efekt izolacji sprawdzić na żelu agarozowym DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna) 17
- Page 1 and 2: Akademia Medyczna w Gdańsku Katedr
- Page 3: 1. 1. Zagadnienia ogólne: CZĘŚĆ
- Page 6 and 7: Inne istotne cechy, które powinien
- Page 8: * Region ekspresji T7: gen bla miej
- Page 11 and 12: 1.3. Przygotowanie i transformacja
- Page 13 and 14: 2. WYBRANE ENZYMY WYKORZYSTYWANE DO
- Page 15: Zastosowanie. Dzięki ligazie może
- Page 19 and 20: cykl 4 W reakcji syntezy DNA stosow
- Page 21 and 22: - supernatant przenieść do jałow
- Page 23 and 24: DNA, Detekcja i analiza 23
- Page 25 and 26: Wykonanie: Sprawdzanie poziomu indu
- Page 27 and 28: CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Materiały: 1.
- Page 29 and 30: Wykonanie: Zachować podaną kolejn
- Page 31 and 32: • Zahamować reakcję roztworem "
- Page 33 and 34: BUFOR DO PRZECIWACIAŁ 1 % żelatyn
- Page 35 and 36: papier absorpcyjny żel nitrocelulo
- Page 37 and 38: Objaśnienienie skrótów: IPTG - i
3. IZOLACJA PLAZMIDU METODĄ LIZY ALKALICZNEJ.<br />
Metoda ta pozwala na izolację plazmidów i pozbycie się większości chromosomalnego<br />
DNA gospodarza i białek.<br />
Roztwór I – GET – niszczenie ściany komórkowej, uwrażliwienie błony cytoplazmatycznej<br />
Glukoza – powoduje, że roztwór jest hipertoniczny, wnikając do komórki powoduje jej<br />
pęcznienie<br />
Tris – HCl – utrzymuje stałe pH, związek o dużej pojemności buforowej.<br />
EDTA – chelatuje jony dwuwartościowe potrzebne do działania DN-az (Ca 2+ , Mg 2+ )<br />
Lizozym – niszczenie peptydoglikanu (wiązanie β 1,4 glikozydowe)<br />
Roztwór II<br />
SDS – detergent jonowy – zmienia napięcie powierzchniowe osłon komórkowych – ułatwia<br />
pękanie błony, treść komórki wypływa na zewnątrz.<br />
NaOH – silna zasada – denaturacja DNA i białek<br />
Roztwór III<br />
octan potasu – pH 4,8 w niskiej temperaturze, DNA ulega renaturacji. DNA chromosomalne<br />
jest długie zlepia się i nie poddaje się całkowitej renaturacji – wraz z większością białek i<br />
resztkami błon tworzy kompleksy i ulega precypitacji. Stosunkowo małe cząsteczki DNA<br />
(plazmidy) w formie CCC oraz RNA pozostają w roztworze.<br />
Po odwirowaniu pozostające w roztworze białka usuwa się poprzez ekstrakcję mieszaniną<br />
fenol-chloroform. Zagęszczenie preparatu DNA plazmidowego przeprowadza się przez<br />
wytrącanie 95% etanolem. Osad po wysuszeniu rozpuszcza się w wodzie jałowej lub buforze<br />
TE ( Tris i EDTA) RNA można usunąć z preparatu za pomocą RN-azy wolnej od DN-azy.<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
Materiały:<br />
1. Pożywka LB<br />
2. Roztwór I (bufor GET):<br />
50 mM glukoza 1,8 g glukozy = 10 ml 1 M glukozy<br />
10 mM EDTA 4 ml 0,5 M EDTA<br />
25 mM Tris-HCl, pH 8 5 ml 1 M Tris-HCl, pH 8<br />
200 ml<br />
Przechowywać w 4 0 C<br />
3. Roztwór II- mieszanina lizująca, przygotowana tuż przed użyciem:<br />
jałowa woda 4 ml<br />
0,2 N NaOH 1,2 ml 1N NaOH<br />
1% SDS 0,6 ml 10%SDS<br />
6 ml (wystarczy na 24 próbki)<br />
4. Roztwór III (3M K + - 5M CH3COO - ):<br />
5 M CH3COOK 12 ml<br />
CH3COOH lodowaty 2,3 ml<br />
jałowa woda 5,7 ml<br />
20 ml<br />
5. Fenol<br />
6. Chloroform: alkohol izoamylowy w stosunku obj. 24:1<br />
7. 96% alkohol etylowy<br />
8. 70% alkohol etylowy<br />
9. Woda redestylowana jałowa<br />
DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna) 16
Change language