Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

Zastosowanie.
Dzięki ligazie możemy połączyć ze sobą fragmenty restrykcyjne, które posiadają takie same
końce lepkie bądź tępe. Ligacja tępych końców jest procesem mniej wydajnym, wymaga
użycia większej ilości enzymu i wydłużenia czasu inkubacji.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Mieszanina w odpowiednio dobranej
Proporcji zdefosforylowanego plazmidu i insertu – 5-7μl
Bufor do ligazy faga T4 10 ∗
1μl
10mM ATP 1μl
Ligaza 1u/ dla lepkich końców
2u/dla tępych końców
Dopełniamy do 10 μl wodą dejonizowaną
►Inkubacja ok. 2 -10 godz. w 16°C. Czas i temperaturę inkubacji należy zastosować zgodnie
z zaleceniami producenta
►Zahamowanie reakcji – 10 min w 65°C
►Użyć mieszaninę do transformacji.
2. 4. Polimeraza DNA Taq
Źródłem tego enzymu są termofilne bakterie Thermus aquaticus YT1 lub rekombinant E. coli.
Enzym ten funkcjonalnie podobny jest do DNA polimerazy I E. coli. Cenną jego
właściwością jest termostabilność w zakresie temperatur od 37°C do 94°C, a optimum
działania wykazuje przy 80°C.
Właściwości.
1) 5’→3’ DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy
jednoniciowego DNA (ssDNA) oraz primera DNA lub RNA z końcem 3’-OH.
2) 5’→3’ egzonukleaza, degradująca od końca 5’-P dwuniciowy DNA (dsDNA) lub
hybryd DNA-RNA.
Zastosowanie
1) Amplifikacja DNA przez łańcuchową reakcję polimeryzacji (ang. Polimerase Chain
Reaction – PCR)
2) Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera
3) W genomowym „footprintingu”