Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Właściwości.<br />
5’ fosfataza, usuwająca 5’ grupę fosforanową z ssDNA i dsDNA, ssRNA i dsRNA z<br />
deoksyrybonukleotydotrójfosforanów i rybonukleotydotrójfosforanów:<br />
5’<br />
3’<br />
5’<br />
P OH<br />
3’<br />
P OH<br />
3’ 5’<br />
3’<br />
5’<br />
Zastosowanie.<br />
1) Defosforylacja dsDNA w celu uniemożliwienia autoligacji wektora użytego do<br />
klonowania<br />
2) Defosforylacja DNA i RNA do znakowania końców 5’ za pomocą kinazy<br />
polinukleotydowej T4<br />
3) Jako składnik w systemie immunodetekcji<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
Cięty i wytrącony plazmid np. 30μl<br />
Alkaiczna fosfataza 1,3μl<br />
Bufor do alkaicznej fosfatazy 10 ∗<br />
10μl<br />
Dopełnić wodą do 100μl<br />
(10 ∗ - 10 razy stężony)<br />
►Inkubacja w 37°C przez 30 min.<br />
►Zahamowanie reakcji – dodanie 1,1μl EDTA 0,5M, inkubacji w 75°C przez 10 min<br />
►Przed dalszymi manipulacjami należy usunąć białko przez ekstrakcję mieszaniną<br />
fenol/chloroform<br />
►Ponowne wytrącenie plazmidu.<br />
2. 3. Ligaza DNA faga T4<br />
Właściwości<br />
Katalizuje odtwarzanie wiązania fosfodwuestrowego pomiędzy grupa fosforanową znajdującą<br />
się na końcu 5’ fragmentu restrykcyjnego a grupą hydroksylową na końcu 3’ (wcześniej te<br />
wiązania są niszczone przez enzymy restrykcyjne). Reakcja ta zależna jest od ATP. In vitro<br />
enzym ten niezbędny jest w procesie replikacji (łączeni fragmentów Okazaki). Bierze też<br />
udział w naprawie DNA.<br />
3’<br />
5’<br />
OH P GATC<br />
CTAG P OH<br />
5’<br />
3’<br />
Ligaza + ATP<br />
GATC<br />
CTAG
Change language