Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej

CZEŚĆ PRAKTYCZNA
Materiały i sprzęt:
• Pożywki LB
• Jałowy roztwór 0,1 M CaCl2.
• Jałowe probówki wirownicze
• Wirówka z chłodzeniem
• szczep BL21
A. Otrzymywanie świeżych komórek kompetentnych.
1. Pojedynczą kolonię bakteryjną pobraną z płytki agarowej zaszczepić 5- 25 ml pożywki
LB w kolbie o objętości 100 ml. Hodowlę inkubować przez noc w temperaturze 37°C
w wytrząsarce wodnej.
2. Odmłodzić hodowlę bakteryjną przez zaszczepienie 50 ml pożywki LB 0.5 ml
hodowli nocnej. Hodować z wytrząsaniem w temp. 37 °C do OD600=0,2.
3. Hodowlę schłodzić przez umieszczenie kolby w lodzie. Przenieść hodowlę bakteryjną
do jałowej probówki. Bakterie osadzić przez wirowanie 4000 obr./min. W temp. 4°C,
10 min.
4. Osad bakteryjny zawiesić w 10 ml schłodzonego w lodzie roztworu 0,1 M CaCl2.
Całość inkubować w lodzie przez 10 min. Zawiesinę osadzić przez wirowanie jw.
Supernatant odrzucić.
5. Bakterie zawiesić w 2 ml zimnego roztworu 0,1M CaCl2. Po 20-30 min inkubacji w
lodzie gotowe są do użycia. Inkubacje w lodzie można przedłużyć do 12 godz. Co
może zwiększyć wydajność transformacji.
B. Transformacja.
1. Do 0,2 ml przygotowanych jw. komórek kompetentnych dodać roztwór plazmidowego
DNA o objętości maksymalnie 10 μl.
2. Inkubować próby w lodzie przez 30 min.
3. Szybko przenieść je na 60 s do 3 min do 42°C.
4. Dodać 0,8 ml pożywki LB i hodować w 37°C przez 45 - 60 min.
5. Na płytki z odpowiednim antybiotykiem wysiewać po 0,1ml hodowli.
6. Hodować przez noc w cieplarce w temp 37°C.
7. Obecność plazmidów sprawdzić stosując metodą lizy alkalicznej i elektroforezy
agarozowej.
8. Sprawdzenie obecności odpowiedniego klonowanego genu (odpowiedniego produktu
ligacji) przy użyciu reakcji PCR.