Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Skrypt ćwiczeniowy - Katerda i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Akademia Medyczna w Gdańsku<br />
Katedra i <strong>Zakład</strong> <strong>Mikrobiologii</strong> <strong>Farmaceutycznej</strong><br />
Ćwiczenia z Biologii Molekularnej<br />
dla III roku Medycyny Laboratoryjnej.<br />
Rok 2007
Spis treści:<br />
CZĘŚĆ PIERWSZA: DNA................................................1<br />
1. KLONOWANIE DNA......................................................................................................1<br />
1. 1. Zagadnienia ogólne:...................................................................................................1<br />
1.2. System ekspresyjny z udziałem polimerazy faga T7..................................................4<br />
1.3. Przygotowanie i transformacja komórek kompetentnych...........................................9<br />
2. WYBRANE ENZYMY WYKORZYSTYWANE DO MODYFIKACJI DNA.........11<br />
2.1. Enzymy restrykcyjne - Obróbka enzymatyczna oczyszczonego DNA.....................11<br />
2. 2. Fosfataza alkaiczna – enzym modyfikujący koniec 5’ DNA..................................11<br />
2. 3. Ligaza DNA faga T4................................................................................................12<br />
2. 4. Polimeraza DNA Taq...............................................................................................13<br />
3. IZOLACJA PLAZMIDU METODĄ LIZY ALKALICZNEJ...................................14<br />
4. AMPLIFIKACJA DNA in vitro METODĄ PCR........................................................16<br />
5. DETEKCJA I ANALIZA DNA.....................................................................................20<br />
5. 1. Elektroforeza dna na żelu agarozowym...................................................................20<br />
CZĘŚĆ DRUGA: BIAŁKA...............................................22<br />
1. PRODUKCJA ZREKOMBINOWANEGO BIAŁKA ................................................22<br />
1.1 Sprawdzenie poziomu indukcji białka.......................................................................22<br />
2. IZOLACJA I OCZYSZCZANIE BIAŁKA..................................................................24<br />
3.ANALIZA ILOŚCI I JAKOŚCI BIAŁKA....................................................................26<br />
3. 1. Elektorforeza poliakrylamidowa białek...................................................................26<br />
3. 2. Western blotting – immunobloting..........................................................................29
1. 1. Zagadnienia ogólne:<br />
CZĘŚĆ PIERWSZA: DNA<br />
1. KLONOWANIE DNA.<br />
Technika klonowania polega na wprowadzeniu do komórek biorcy ściśle określonego<br />
odcinka DNA dawcy zawierającego jeden lub kilka genów w celu zmienienia właściwości<br />
biorcy. Fragment DNA, który ma być wprowadzony do komórek biorcy musi zostać<br />
połączony odpowiednim wektorem (nośnikiem). W efekcie otrzymuje się klony, czyli zbiór<br />
identycznych organizmów. Narzędzia wykorzystywane w klonowaniu to:<br />
1) szczepy bakteryjne, 2) wektory, 3) enzymy.<br />
W dużym skrócie najczęściej wykonywany schemat klonowania przebiega w następujący<br />
sposób:<br />
1. DNA przeznaczony do klonowania może być wyizolowany z komórek dawcy lub<br />
zsyntetyzowany chemicznie (PCR).<br />
2. Następnie oba końce klonowanego fragmentu DNA zostają pocięte przy użyciu<br />
enzymów restrykcyjnych.<br />
3. Otrzymane fragmenty miesza się następnie in vitro w odpowiednim stosunku z<br />
wektorem uciętym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Użycie odpowiednich<br />
enzymów restrykcyjnych powoduje, że klonowany fragment DNA i ucięty wektor<br />
posiadają komplementarne do siebie końce (końce lepkie lub tępe – patrz roz. 2.1)<br />
4. Wektor i fragment DNA zostają połączone przy udziale ligazy DNA faga T4. (patrz<br />
roz. 2.3)<br />
5. Uzyskane w ten sposób hybrydowe cząsteczki DNA wprowadza się metodą<br />
transformacji do odpowiednio przygotowanego biorcy. Biorca powinien zapewnić<br />
ekspresję klonowanego DNA, jak również zwiększyć liczbę kopii zrekombinowanego<br />
wektora.<br />
6. Uzyskane klony selekcjonuje się na odpowiednich podłożach (zwykle zawierającymi<br />
antybiotyk). Najczęściej stosowanym gospodarzem dla obcego DNA są komórki<br />
bakteryjne.<br />
Klonowanie umożliwia wyizolowanie z heterogennej mieszaniny DNA fragment DNA<br />
będący przedmiotem naszego zainteresowania i jego powielenie, tzn. amplifikację w np.<br />
komórce mikroorganizmu. Użyty do klonowania DNA nie musi być pochodzenia<br />
bakteryjnego, z kolei musi zostać połączony z wektorem, który ma zdolność do<br />
autonomicznej replikacji w mikroorganizmie. Wybór eukariotycznego gospodarza wiąże się z<br />
użyciem wektora zdolnego do replikacji w tym organizmie. Hodowanie bakterii niosących<br />
zrekombinowane DNA nie stanowi większego problemu, umożliwia to wyizolowanie dużej<br />
ilości zarówno specyficznego DNA jak i produktu białkowego, które można poddać dalszym<br />
badaniom.
Do klonowania genów są potrzebne:<br />
1. Fragment DNA, który zamierzamy klonować. Najczęściej jest to krótki odcinek DNA<br />
powstały po trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (posiada lepkie lub<br />
tępe końce) lub mechanicznym fragmentowaniu (tępe końce lub lepkie<br />
niespecyficzne) bądź produkt PCR.<br />
2. Wektor, zapewniający powielenie obcego DNA w komórkach gospodarza. Stosuje się<br />
generalnie dwa rodzaje wektorów: plazmidowe i pochodzenia wirusowego. Wśród<br />
tych drugich dużą popularność zyskały prokariotyczne fagi Escherichia coli<br />
dwuniciowe (bakteriofag λ) i jednoniciowe (bakteriofagi M13 i f1) oraz eukariotyczny<br />
wirus SV40.<br />
3. Gospodarz, zwykle jest to szczep bakteryjny, drożdżowy lub eukariotyczna linia<br />
komórkowa o odpowiednio zmodyfikowanym dla celów inżynierii genetycznej i ściśle<br />
określonym genotypie.<br />
1.1.1. Wektory plazmidowe.<br />
Plazmidy - koliste zamknięte, pozachromosomalne, autonomicznie replikujące się<br />
cząsteczki DNA. Stały się one główną bazą do konstrukcji wektorów plazmidowych.<br />
Występują naturalnie w komórkach wielu gatunków bakterii Gram-dodatnich i Gramujemnych.<br />
Przenoszą informację genetyczną, która wielokrotnie pełni ważną funkcje w<br />
komórce. Wśród najistotniejszych cech fenotypowych kodowanych przez plazmidowe<br />
DNA wymienić można: oporność na antybiotyki, jony metali ciężkich, produkcje<br />
antybiotyków, kolicyn, prostych węglowodanów, niektórych toksyn itp. Obecnie<br />
praktycznie nie wykorzystuje się ich w nie zmienionej formie w procesie klonowania.<br />
Wektor – to autonomicznie replikująca się cząsteczka DNA, która została<br />
skonstruowana sztucznie na bazie naturalnych plazmidów w celu przenoszenia<br />
dodatkowej informacji genetycznej. Ogólnie rzecz biorąc wektory są pochodnymi<br />
naturalnie występujących plazmidów.<br />
Podstawowe modyfikacje wprowadzone do wektorów plazmidowych:<br />
1. Redukcja masy cząsteczkowej. Im mniejszy wektor tym większa jego pojemność<br />
oraz prościej nim manipulować (np. tworzyć mapę restrykcyjną klonowanego<br />
DNA)<br />
2. Usunięcie genów warunkujących możliwość transferu zrekombinowanego<br />
plazmidu do innych bakterii – przekazywanie wektora odbywać się będzie jedynie<br />
w pionie (czyli z komórek macierzystych do potomnych).<br />
3. Włączenie w miejsce gdzie ma być wklonowanie obce DNA syntetycznego<br />
oligonukleotydu z sekwencjami rozpoznawanymi przez wiele enzymów<br />
restrykcyjnych – miejsce wielokrotnego klonowania (ang. Multiple Cloning Sites<br />
– MCS).<br />
MCS umożliwia bezpośrednie wstawienie fragmentów klonowanego DNA, które<br />
powstały przez trawienie jednym z wielu lub (najczęściej) dwoma różnymi<br />
enzymami. Oznacza to, że wektor który zostanie wybrany do klonowania musi w<br />
miejscu MCS posiadać miejsca restrykcyjne dla takich samych enzymów, jakimi<br />
zostanie potraktowany fragment obcego DNA, który ma być do niego<br />
wprowadzony. Dzięki temu łączone za pomocą ligazy końce będą<br />
komplementarne. Klonowanie tylko w miejscu MCS gwarantuje, że przy ekspresji<br />
klonowanego genu będzie zachowana ramka odczytu.<br />
4. Wprowadzenie silnego promotora przed miejscem MCS. Jego obecność zapewnia<br />
wydajną ekspresję klonowanego genu.
Inne istotne cechy, które powinien posiadać dobry wektor:<br />
1. Obecność jednego lub kilku genów markerowych, służących do wyróżnienia i<br />
selekcji transformantów, czyli komórek, które pobrały zrekombinowany wektor<br />
(głównie są to geny oporności na antybiotyk np. ampicylinę, tetracyklinę,<br />
chloramfenikol, kanamycynę)<br />
2. Powinien być dobrze scharakteryzowaną pod względem fizycznym i chemicznym<br />
cząsteczką, łatwą do oczyszczenia.<br />
3. Nie powinien zawierać genów, których rozprzestrzenianie może stanowić<br />
zagrożenie dla życia lub zdrowia ludzi, zwierząt czy roślin.<br />
Gwałtowny rozwój biologii molekularnej sprawił, że ilość konstruowanych wektorów jest<br />
olbrzymia i nie sposób w skrócie opisać całej wiedzy na ich temat. Tworzono serie wektorów<br />
przeznaczonych do bardzo konkretnych celów. Jedną z ważniejszych to grupa wektorów<br />
ekspresyjnych.<br />
1.1.2. Wektory ekspresyjne<br />
● Zawierają one silny promotor, podlegający regulacji zewnętrznej, służący do<br />
wyrażania obcych genów<br />
Wykorzystuje się m. in. promotor laktozowy, dziki lub zmodyfikowany (lacUV5),<br />
tryptofanowy, lambdowe PL (promotor lewy) i PR (p. prawy), promotory fuzyjne tac<br />
(połączenie laktozowego i tryptofanowego) i inne.<br />
● Mogą zawierać też terminatory transkrypcji oraz sygnały translacyjne.<br />
● Obce geny mogą być wyrażone jako białko natywne lub jako fuzja z innym, dobrze<br />
scharakteryzowanym białkiem.<br />
● Ważnymi seriami wektorów w tej grupie są wektory zawierające promotor faga T7<br />
rozpoznawane wyłącznie przez polimerazę faga T7.<br />
Polimeraza RNA faga T7 jest bardzo specyficzna wobec swoich promotorów, nie<br />
rozpoznaje również obcych (inne niż faga) sygnałów terminacyjnych. Przeprowadzana<br />
przez nią transkrypcja przebiega 5 razy szybciej niż w przypadku polimerazy RNA E.<br />
coli. Ponadto jest białkiem niewrażliwym na rifampicynę (antybiotyk ten blokuje<br />
polimerazę RNA E. coli).<br />
Zespół F. Studiera skonstruował serię wektorów pET (plazmid for expression by T7<br />
RNA polymerase). Wektory wykorzystywane do ekspresji produktu białkowego<br />
klonowanego genu.<br />
Posiadają promotor i terminator dla polimerazy RNA faga T7 oraz sygnały startu<br />
translacji pochodzące od fagowego genu 10 (główne białko kapsydu).<br />
Do promotora polimerazy T7 dodano operator promotora laktozowego w pozycji +2<br />
(patrz mapa plazmidu pET16b). Daje to możliwość regulacji ekspresji przy pomocy<br />
represora LacI, dla którego gen też został wprowadzony do wektorów pET (Warto<br />
przypomnieć sobie regulacje operonu laktozowego!). Aby zaszła wydajna ekspresja<br />
klonowanego genu z takiego wektora w szczepie bakteryjnym musi posiadać on gen<br />
polimerazy RNA faga T7.<br />
Aby ułatwić oczyszczanie klonowanego białka dodatkowo do wektorów pET<br />
wprowadzono za MCS sekwencje kodującą 10 lub 6 reszt histydyny. Dzięki temu<br />
produkt białkowy na swym N lub C końcu dodatkowo uzyskiwał polihistydynowy<br />
„ogon”. Do oczyszczania takiego białka można wykorzystać chromatografię<br />
powinowactwa (roz. 9). Wektory i szczepy oraz zestawy do oczyszczania<br />
wykorzystywane do stworzenia takiego produktu białkowego nazwano systemem pET<br />
His-Tag lub systemem ekspresyjnym z udziałem polimerazy faga T7.
1.2. System ekspresyjny z udziałem polimerazy faga T7<br />
1.2.1.Elementy składowe systemu:<br />
Wektor pET 16b<br />
� Wektor zwierający promotor Ø 10 (promotor genu 10 z faga T7) – np. pT7 i<br />
rodzina wektorów pET (firma Novagen) np. PET16b, pET15b , pET23a.<br />
Promotor Ø 10 jest bardzo wydajnym promotorem in vitro i in vivo, który<br />
rozpoznawany jest tylko przez polimerazę RNA faga T7<br />
� Szczep bakteryjny posiadający gen kodujący polimerazę RNA faga T7.<br />
- Gen ten może znajdować się na plazmidzie np. pGP1-2 w przypadku szczepu<br />
E. coli K 38.<br />
- Może też znajdować się na chromosomie bakteryjnym jak w przypadku<br />
szczepu E. coli BL 21 (DE3). Szczep ten jest stabilnym lizogenem faga λDE3<br />
z genem polimerazy T7 pod kontrolą promotora lacUV5.<br />
• Plazmid ekspresyjny do klonowań translacyjnych - celem klonowania jest<br />
produkt białkowy<br />
• MCS z odpowiednimi miejscami cięcia dla enzymów restrykcyjnych (NdeI,<br />
XhoI, BamHI)<br />
• Promotor T7 rozpoznawany tylko przez polimerazę RNA faga T7<br />
• Sekwencja OPERATORA lacO, (fragment regulatorowy operonu<br />
laktozowego) zlokalizowany tuż za promotorem a przed sekwencją MCS (patrz<br />
mapa plazmidu). Jeżeli z sekwencją operatora połączy się represor LacI,<br />
transkrypcja zostanie zablokowana. Represor stanowi fizyczną przeszkodę dla<br />
polimerazy. Do zajścia ekspresji klonowanego genu oprócz polimerazy RNA<br />
faga T7 wymagana jest obecność induktora, IPTG znoszącego represje.<br />
• Klonowanie genu białka w miejsce MCS pET16 wprowadza na N-końcu<br />
białka 10 reszt His (ogon polihistydynowy), dzięki temu do oczyszczania<br />
produktu białkowego można wykorzystać chromatografię powinowactwa.<br />
• Obecność genu bla gwarantującego gospodarzowi oporność na ampicylinę,<br />
- umożliwia selekcję odpowiednich klonów. Po transformacji bakterie należy<br />
wysiewać wyłącznie na pożywkę z ampicyliną. Dzięki temu<br />
uzyskamy wzrost tylko tych komórek, które pobrały plazmid.<br />
IPTG – induktor niemetaboliczny. Znosi represję, ale w odróżnieniu od laktozy nie jest<br />
rozkładany przez bakterie i dzięki temu jego stężenie w pożywce jest stałe.
* Region ekspresji T7:<br />
gen bla<br />
miejsce startu<br />
replikacji<br />
pET 16b<br />
(5711 pz)<br />
*<br />
region<br />
ekspresji T7<br />
gen<br />
represora<br />
lacI<br />
promotor T7 operator lac 10 His<br />
Nde I<br />
MCS<br />
XhoI BamH I<br />
Miejsce klonowania nowego genu<br />
Miejsce przyłączenia represora<br />
terminator T7
Szczep E. coli BL 21 (DE 3)<br />
Polimeraza<br />
RNA<br />
E.coli<br />
• Szczep ten na chromosomie posiada sztucznie wprowadzony gen kodujący<br />
polimerazę RNA faga T7 pod kontrolą promotora lacUV5 rozpoznawanego<br />
przez polimerazę RNA E. coli.<br />
• Promotor podlega regulacji zewnętrznej. Bez induktora do sekwencji operatora<br />
zostaje przyłączony represor LacI. Ekspresja jest indukowana przez dodanie<br />
do pożywki IPTG.<br />
represor<br />
LacI<br />
gen<br />
represora<br />
LacI<br />
Indukcja IPTG<br />
lacO<br />
promotor<br />
lacUV5<br />
gen polimerazy<br />
RNA faga T7<br />
Genom<br />
E.coli<br />
polimeraza<br />
RNA T7<br />
Indukcja IPTG<br />
Polimeraza T7<br />
RNA T7<br />
represor<br />
LacI<br />
gen<br />
represora<br />
LacI<br />
lacO<br />
promotor T7<br />
pET 16b<br />
Rys. 1 Elementy regulatorowe w systemie nadprodukcji białek faga T7.<br />
gen kodujący<br />
białko<br />
Przy braku induktora uzyskujemy podwójną blokadę:<br />
1. Represor blokuje promotor lacUV5 na chromosomie bakteryjnym – polimeraza RNA<br />
E. coli nie może transkrybować genu polimerazy RNA faga T7.<br />
2. Represor łączy się z sekwencją operatora (lacO) blokując dostęp do promotora faga<br />
T7 na plazmidzie.<br />
Gdyby z jakiegoś powodu nie doszło do represji promotora na plazmidzie (np.<br />
mutacja sekwencji operatora lacO) przy braku induktora i tak nie dojdzie do ekspresji<br />
klonowanego genu – brak polimerazy RNA T7<br />
Dodanie induktora: w pierwszej kolejności musi dojść do ekspresji genu polimerazy<br />
RNA T7 z chromosomu, odpowiada za to polimeraza bakteryjna. Dopiero jak<br />
powstanie polimeraza T7 rozpozna ona specyficznie promotor faga T7 na plazmidzie i<br />
dojdzie do ekspresji klonowanego genu.
1.3. Przygotowanie i transformacja komórek kompetentnych.<br />
Wprowadzenie zrekombinowanych cząsteczek do wnętrza komórek gospodarza stanowi<br />
jeden z najważniejszych etapów klonowania DNA. Wprowadzone do wnętrza komórki DNA<br />
ulega często degradacji, ale może się zdarzyć, że nie zostanie zniszczone. Dotyczy to głównie<br />
plazmidów, które posiadają miejsce startu replikacji (ang. origin), mogą autonomicznie<br />
utrzymywać się we wnętrzu komórki bakteryjnej. Pobranie plazmidu wiąże się z nabyciem<br />
przez komórkę nowych cech.<br />
Wiele bakterii (np. Bacillus czy Hemophilus) posiada naturalną zdolność do pobierania<br />
cząsteczek DNA ze środowiska, w którym żyją. Często używana w biologii bakteria<br />
Escherichia coli może być w ten stan wprowadzona na drodze indukcji chemicznej (np. przez<br />
traktowanie komórek chlorkiem wapnia tzw. metoda chlorkowa). Wydajność tej metody waha<br />
się w granicach 10 5 -10 6 transformantów/μg plazmidowego DNA. Komórki zawiesza się w<br />
zimnym (0°C) roztworze 50 lub 100 mM chlorku wapnia. Po dodaniu roztworu DNA,<br />
cząsteczki kwasu nukleinowego absorbują się na powierzchni komórek. Szybkie<br />
podwyższenie temperatury (do 43°C na około 3 min.) powoduje zmiany w powłokach<br />
komórkowych bakterii pozwalające na wniknięcie cząsteczek DNA do wnętrza komórek.<br />
W przypadku transformacji bakterii plazmidami niosącymi geny warunkujące oporność na<br />
antybiotyki, przed wysianiem mieszaniny transformacyjnej na płytki selekcyjne konieczna<br />
jest inkubacja hodowli (przez około godzinę) w pożywce bez antybiotyku. Pozwala to na<br />
ekspresję genu oporności na antybiotyk.<br />
Rys. 2 Przypuszczalny mechanizm transformacji komórek E. coli
CZEŚĆ PRAKTYCZNA<br />
Materiały i sprzęt:<br />
• Pożywki LB<br />
• Jałowy roztwór 0,1 M CaCl2.<br />
• Jałowe probówki wirownicze<br />
• Wirówka z chłodzeniem<br />
• szczep BL21<br />
A. Otrzymywanie świeżych komórek kompetentnych.<br />
1. Pojedynczą kolonię bakteryjną pobraną z płytki agarowej zaszczepić 5- 25 ml pożywki<br />
LB w kolbie o objętości 100 ml. Hodowlę inkubować przez noc w temperaturze 37°C<br />
w wytrząsarce wodnej.<br />
2. Odmłodzić hodowlę bakteryjną przez zaszczepienie 50 ml pożywki LB 0.5 ml<br />
hodowli nocnej. Hodować z wytrząsaniem w temp. 37 °C do OD600=0,2.<br />
3. Hodowlę schłodzić przez umieszczenie kolby w lodzie. Przenieść hodowlę bakteryjną<br />
do jałowej probówki. Bakterie osadzić przez wirowanie 4000 obr./min. W temp. 4°C,<br />
10 min.<br />
4. Osad bakteryjny zawiesić w 10 ml schłodzonego w lodzie roztworu 0,1 M CaCl2.<br />
Całość inkubować w lodzie przez 10 min. Zawiesinę osadzić przez wirowanie jw.<br />
Supernatant odrzucić.<br />
5. Bakterie zawiesić w 2 ml zimnego roztworu 0,1M CaCl2. Po 20-30 min inkubacji w<br />
lodzie gotowe są do użycia. Inkubacje w lodzie można przedłużyć do 12 godz. Co<br />
może zwiększyć wydajność transformacji.<br />
B. Transformacja.<br />
1. Do 0,2 ml przygotowanych jw. komórek kompetentnych dodać roztwór plazmidowego<br />
DNA o objętości maksymalnie 10 μl.<br />
2. Inkubować próby w lodzie przez 30 min.<br />
3. Szybko przenieść je na 60 s do 3 min do 42°C.<br />
4. Dodać 0,8 ml pożywki LB i hodować w 37°C przez 45 - 60 min.<br />
5. Na płytki z odpowiednim antybiotykiem wysiewać po 0,1ml hodowli.<br />
6. Hodować przez noc w cieplarce w temp 37°C.<br />
7. Obecność plazmidów sprawdzić stosując metodą lizy alkalicznej i elektroforezy<br />
agarozowej.<br />
8. Sprawdzenie obecności odpowiedniego klonowanego genu (odpowiedniego produktu<br />
ligacji) przy użyciu reakcji PCR.
2. WYBRANE ENZYMY WYKORZYSTYWANE DO<br />
MODYFIKACJI DNA.<br />
2.1. Enzymy restrykcyjne - Obróbka enzymatyczna oczyszczonego DNA.<br />
Enzymy restrykcyjne dzięki zdolności rozpoznawania i cięcia specyficznych sekwencji<br />
nukleotydowych stanowią narzędzie do obróbki DNA. Większość z nich rozpoznaje<br />
sekwencje palindromowe sześcio- (NdeI, BamHI, PstI) lub czteronukleotydowe (AluI).<br />
Produktami trawienia DNA tymi enzymami są fragmenty restrykcyjne posiadające lepkie lub<br />
tępe końce. Do przeprowadzenie reakcji niezbędne są jony magnezu (Mg ++ ).<br />
Obróbka DNA - trawienie enzymami restrykcyjnymi AluI, NdeI, BamHI, PstI.<br />
a) enzym trawiący DNA z pozostawieniem tępych końców<br />
5’ – N-N-A-G-C-T-N-N – 3’ AluI 5’ - N-N-A-G - 3’ 5’- C-T-N-N - 3’<br />
3’ – N-N-T-C-G-A-N-N – 5’ 3’ – N-N-T-C – 5’ 3’- G-A-N-N –5’<br />
b) enzymy trawiące DNA pozostawiające lepkie końce 5’.<br />
Tępe końce<br />
5’ – N-N-C-A-T-A-T-G-N-N – 3’ NdeI 5’ – N-N-C-A-3’ 5’-T-A-T-G-N-N –3’<br />
3’ – N-N-G-T-A-T-A-C-N-N – 5’ 3’ – N-N-G-T-A-T-5’ 3’- A-C-N-N –5’<br />
Lepkie końce 5’<br />
5’ – N-N-G-G-A-T-C-C-N-N – 3’ BamHI 5’ – N-N-G-3’ 5’-G-A-T-C-C-N-N –3’<br />
3’ – N-N-C-C-T-A-G-G-N-N – 5’ 3’ – N-N-C-C-T-A-G-5’ 3’-G-N-N – 5’<br />
Lepkie końce 5’<br />
c) enzym trawiący DNA pozostawiający lepkie końce 3’.<br />
5’ – N-N-C-T-G-C-A-G-N-N – 3’ PstI 5’ – N-N-C-T-G-C-A-3’ 5’-G-N-N – 3’<br />
3’ – N-N-G-A-C-G-T-C-N-N – 5’ 3’ – N-N-G-5’ 3’-A-C-G-T-C-N-N – 5’<br />
Lepkie końce 3’<br />
2. 2. Fosfataza alkaiczna – enzym modyfikujący koniec 5’ DNA.<br />
Źródłem jest jelito cielęce (fosfataza CIP, ang. Calf Intestine Phosphatase). Jest to<br />
dimeryczny glikopeptyd, złożony z dwóch identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej<br />
69 kD. Zawiera cztery atomy cynku na cząsteczkę. CIP może być inaktywowany termicznie<br />
przez inkubację w 65°C.
Właściwości.<br />
5’ fosfataza, usuwająca 5’ grupę fosforanową z ssDNA i dsDNA, ssRNA i dsRNA z<br />
deoksyrybonukleotydotrójfosforanów i rybonukleotydotrójfosforanów:<br />
5’<br />
3’<br />
5’<br />
P OH<br />
3’<br />
P OH<br />
3’ 5’<br />
3’<br />
5’<br />
Zastosowanie.<br />
1) Defosforylacja dsDNA w celu uniemożliwienia autoligacji wektora użytego do<br />
klonowania<br />
2) Defosforylacja DNA i RNA do znakowania końców 5’ za pomocą kinazy<br />
polinukleotydowej T4<br />
3) Jako składnik w systemie immunodetekcji<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
Cięty i wytrącony plazmid np. 30μl<br />
Alkaiczna fosfataza 1,3μl<br />
Bufor do alkaicznej fosfatazy 10 ∗<br />
10μl<br />
Dopełnić wodą do 100μl<br />
(10 ∗ - 10 razy stężony)<br />
►Inkubacja w 37°C przez 30 min.<br />
►Zahamowanie reakcji – dodanie 1,1μl EDTA 0,5M, inkubacji w 75°C przez 10 min<br />
►Przed dalszymi manipulacjami należy usunąć białko przez ekstrakcję mieszaniną<br />
fenol/chloroform<br />
►Ponowne wytrącenie plazmidu.<br />
2. 3. Ligaza DNA faga T4<br />
Właściwości<br />
Katalizuje odtwarzanie wiązania fosfodwuestrowego pomiędzy grupa fosforanową znajdującą<br />
się na końcu 5’ fragmentu restrykcyjnego a grupą hydroksylową na końcu 3’ (wcześniej te<br />
wiązania są niszczone przez enzymy restrykcyjne). Reakcja ta zależna jest od ATP. In vitro<br />
enzym ten niezbędny jest w procesie replikacji (łączeni fragmentów Okazaki). Bierze też<br />
udział w naprawie DNA.<br />
3’<br />
5’<br />
OH P GATC<br />
CTAG P OH<br />
5’<br />
3’<br />
Ligaza + ATP<br />
GATC<br />
CTAG
Zastosowanie.<br />
Dzięki ligazie możemy połączyć ze sobą fragmenty restrykcyjne, które posiadają takie same<br />
końce lepkie bądź tępe. Ligacja tępych końców jest procesem mniej wydajnym, wymaga<br />
użycia większej ilości enzymu i wydłużenia czasu inkubacji.<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
Mieszanina w odpowiednio dobranej<br />
Proporcji zdefosforylowanego plazmidu i insertu – 5-7μl<br />
Bufor do ligazy faga T4 10 ∗<br />
1μl<br />
10mM ATP 1μl<br />
Ligaza 1u/ dla lepkich końców<br />
2u/dla tępych końców<br />
Dopełniamy do 10 μl wodą dejonizowaną<br />
►Inkubacja ok. 2 -10 godz. w 16°C. Czas i temperaturę inkubacji należy zastosować zgodnie<br />
z zaleceniami producenta<br />
►Zahamowanie reakcji – 10 min w 65°C<br />
►Użyć mieszaninę do transformacji.<br />
2. 4. Polimeraza DNA Taq<br />
Źródłem tego enzymu są termofilne bakterie Thermus aquaticus YT1 lub rekombinant E. coli.<br />
Enzym ten funkcjonalnie podobny jest do DNA polimerazy I E. coli. Cenną jego<br />
właściwością jest termostabilność w zakresie temperatur od 37°C do 94°C, a optimum<br />
działania wykazuje przy 80°C.<br />
Właściwości.<br />
1) 5’→3’ DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy<br />
jednoniciowego DNA (ssDNA) oraz primera DNA lub RNA z końcem 3’-OH.<br />
2) 5’→3’ egzonukleaza, degradująca od końca 5’-P dwuniciowy DNA (dsDNA) lub<br />
hybryd DNA-RNA.<br />
Zastosowanie<br />
1) Amplifikacja DNA przez łańcuchową reakcję polimeryzacji (ang. Polimerase Chain<br />
Reaction – PCR)<br />
2) Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera<br />
3) W genomowym „footprintingu”
3. IZOLACJA PLAZMIDU METODĄ LIZY ALKALICZNEJ.<br />
Metoda ta pozwala na izolację plazmidów i pozbycie się większości chromosomalnego<br />
DNA gospodarza i białek.<br />
Roztwór I – GET – niszczenie ściany komórkowej, uwrażliwienie błony cytoplazmatycznej<br />
Glukoza – powoduje, że roztwór jest hipertoniczny, wnikając do komórki powoduje jej<br />
pęcznienie<br />
Tris – HCl – utrzymuje stałe pH, związek o dużej pojemności buforowej.<br />
EDTA – chelatuje jony dwuwartościowe potrzebne do działania DN-az (Ca 2+ , Mg 2+ )<br />
Lizozym – niszczenie peptydoglikanu (wiązanie β 1,4 glikozydowe)<br />
Roztwór II<br />
SDS – detergent jonowy – zmienia napięcie powierzchniowe osłon komórkowych – ułatwia<br />
pękanie błony, treść komórki wypływa na zewnątrz.<br />
NaOH – silna zasada – denaturacja DNA i białek<br />
Roztwór III<br />
octan potasu – pH 4,8 w niskiej temperaturze, DNA ulega renaturacji. DNA chromosomalne<br />
jest długie zlepia się i nie poddaje się całkowitej renaturacji – wraz z większością białek i<br />
resztkami błon tworzy kompleksy i ulega precypitacji. Stosunkowo małe cząsteczki DNA<br />
(plazmidy) w formie CCC oraz RNA pozostają w roztworze.<br />
Po odwirowaniu pozostające w roztworze białka usuwa się poprzez ekstrakcję mieszaniną<br />
fenol-chloroform. Zagęszczenie preparatu DNA plazmidowego przeprowadza się przez<br />
wytrącanie 95% etanolem. Osad po wysuszeniu rozpuszcza się w wodzie jałowej lub buforze<br />
TE ( Tris i EDTA) RNA można usunąć z preparatu za pomocą RN-azy wolnej od DN-azy.<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
Materiały:<br />
1. Pożywka LB<br />
2. Roztwór I (bufor GET):<br />
50 mM glukoza 1,8 g glukozy = 10 ml 1 M glukozy<br />
10 mM EDTA 4 ml 0,5 M EDTA<br />
25 mM Tris-HCl, pH 8 5 ml 1 M Tris-HCl, pH 8<br />
200 ml<br />
Przechowywać w 4 0 C<br />
3. Roztwór II- mieszanina lizująca, przygotowana tuż przed użyciem:<br />
jałowa woda 4 ml<br />
0,2 N NaOH 1,2 ml 1N NaOH<br />
1% SDS 0,6 ml 10%SDS<br />
6 ml (wystarczy na 24 próbki)<br />
4. Roztwór III (3M K + - 5M CH3COO - ):<br />
5 M CH3COOK 12 ml<br />
CH3COOH lodowaty 2,3 ml<br />
jałowa woda 5,7 ml<br />
20 ml<br />
5. Fenol<br />
6. Chloroform: alkohol izoamylowy w stosunku obj. 24:1<br />
7. 96% alkohol etylowy<br />
8. 70% alkohol etylowy<br />
9. Woda redestylowana jałowa<br />
DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna) 16
Wykonanie:<br />
1. Zaszczepić pojedynczą kolonie bakteryjną w 25 ml pożywki LB uzupełnionej<br />
ampicyliną do stężenia 10 μg/ml (hodowle prowadzić w kolbie o objętości 100 ml).<br />
Bakterie hodować przez noc w temp. 370C w wytrząsarce.<br />
2. Wprowadzić 1,5 ml hodowli do probówki. Wirować 1- 2 min. Supernatant odrzucić.<br />
Czynności te powtórzyć 2 - 3 razy (w tej samej probówce).<br />
3. Osad rozpuścić w 100 μl buforu GET + lizozym (roztwór I), energicznie<br />
worteksujemy do całkowitego rozbicia osadu.<br />
4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.<br />
5. Dodać 200 μl świeżo przygotowanego roztworu II.<br />
Mieszać delikatnie przez<br />
odwracanie probówki trzy razy. Nie worteksować!<br />
6. Inkubować w lodzie 5 minut.<br />
7. Dodać 150 μl zimnego roztworu III. Worteksować przez około 30 sekund.<br />
8. Wirować 5 - 15 minut.<br />
9. Przenieść supernatant (około 400 μl) do czystych probówek (nie naruszyć osadu!)<br />
Zebrany roztwór musi być klarowny<br />
10. Dodać 200 μl fenolu i 200 μl mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy 23:1 v:v.<br />
Worteksować przez około 30 sekund.<br />
11. Wirować 5 min.<br />
12. Zebrać ok. 400 μl górnej fazy do nowej probówki. Nie wolno naruszyć dolnej<br />
warstwy! Zebrany roztwór musi być klarowny. Zmętnienie roztworu świadczy o<br />
zanieczyszczeniu fenolem. Gdy tak się stanie należy zebrany roztwór ponownie<br />
zwirować. Zebrać delikatnie supernatant nie naruszając osadzonego na dnie fenolu.<br />
13. Dodać 1 ml 96% alkoholu etylowego. Mieszać przez czterokrotne obracanie<br />
probówki. Inkubować, co najmniej 10 min. w temperaturze pokojowe lub niższej.<br />
Niższa temperatura jest wskazana przymałej ilości wytrącanego DNA.<br />
14. Wirować 5 - 15 min.<br />
15. Supernatant odrzucić, do osadu dodać 1ml 70% alkoholu etylowego. Mieszać przez<br />
czterokrotne obracanie probówki.<br />
16. Wirować 30 sek.<br />
17. W razie potrzeby powtórzyć punkty 16 i 17.<br />
18. Supernatant odrzucić i osad suszyć pod próżnią.<br />
19. Osad rozpuścić w 20 – 40 μl jałowej wody,<br />
20. Efekt izolacji sprawdzić na żelu agarozowym<br />
DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna) 17
Rys 3. Rozdział w żelu agarozowym plazmidu pET16b.<br />
Plazmid widoczny w trzech formach:<br />
OC – kolista powstała po przecięciu jednej z nici DNA,<br />
L – liniowa powstała po przecięciu obu nici DNA<br />
CCC – kolista, superzwinięta<br />
4. AMPLIFIKACJA DNA in vitro METODĄ ŁAŃCUCHOWEJ REAKCJI<br />
POLIMERAZY (PCR).<br />
Metoda ta służy do amplifikacji segmentu DNA położonego pomiędzy regionami o znanej<br />
sekwencji. W reakcji tej używane jako primery (startery) są dwa oligonukleotydy,<br />
komplementarne do sekwencji położonych na przeciwległych niciach matrycowego DNA,<br />
flankujące rejon DNA, który ma podlegać amplifikacji. DNA jest syntetyzowane w serii<br />
reakcji katalizowanych przez polimerazę DNA. Każdy cykl składa się z następujących<br />
etapów:<br />
1. Denaturacji matrycowego DNA w temperaturze 94-95 0 C, w obecności czterech<br />
rodzjów dNTP oraz dużego nadmiaru primerów.<br />
2. Przyłączenia primerów do sekwencji homologicznych w matrycowym DNA, co<br />
następuje po ochłodzeniu do temperatury 45-65 0 C,<br />
3. Wydłużania primerów przez polimerazę DNA w temperaturze 72 0 C, co w rezultacie<br />
pozwala na syntezę fragmentu DNA.<br />
Temperatura przyłączania primerów zależy od długości oligonukleotydów (długość<br />
ich nie powinna być mniejsza niż 15-16 nukleotydów, optymalna to 22-28 nt), ich<br />
temperatury topnienia i specyficznego łączenia się z matrycowym DNA. Każdy cykl,<br />
składający się z denaturacji, przyłączenia i syntezy, powtarzany jest wielokrotnie (od<br />
25 do 40 razy). DNA będący produktem każdego cyklu służy jako matryca w<br />
następnych cyklach, czego skutkiem jest szybkie powiększanie puli syntetyzowanego<br />
DNA.<br />
Produktem reakcji PCR jest dwuniciowy fragment DNA, którego końcami są końce 5’<br />
primerów, a długość określona jest przez odległość pomiędzy primerami. Poza tym<br />
zsyntetyzowany DNA posiada tępe końce.<br />
DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna)<br />
OC<br />
L<br />
CCC<br />
18
cykl 4<br />
W reakcji syntezy DNA stosowana jest termostabilna polimeraza wyizolowana z<br />
termofilnej bakterii Thermus aquaticus-Taq polimeraza (II.4.).<br />
Matrycą do syntezy DNA może być DNA liniowy, plazmidowy (ccc), cały genom np.<br />
bakterii; nie musi być on oczyszczany. Reakcja amplifikacji DNA metodą PCR odbywa się w<br />
specjalnym urządzeniu, umożliwiającym szybkie zmiany temperatury (termocykler).<br />
Zastosowanie PCR<br />
1. Amplifikacja fragmentu DNA – uzyskanie dużej ilości określonego fragmentu DNA<br />
np. do klonowania<br />
2. Diagnostyka molekularna – wykrywanie patogenów w próbkach klinicznych,<br />
identyfikacja próbek w medycynie sądowej (możliwa z bardzo niewielkiej próbki, np.<br />
pojedynczego włosa), analiza mutacji w chorobach nowotworowych<br />
3. Synteza specyficznych sond.<br />
4. Tworzenie bibliotek genomowych<br />
Rys. 4 Schemat obrazuje cztery pierwsze cykle łańcuchowej reakcji polimerazy<br />
in vitro – PCR. Prosta ciągła linia oznacza matrycową nić DNA, która ulega powieleniu<br />
(amplifikacji). Strzałki biała i czarna obrazują odpowiednio lewy i prawy primer.<br />
Oligonukleotydowe primery mają długość 18–30 pz i są komplementarne do obszarów<br />
ograniczających amplifikowaną sekwencję.<br />
DNA, AMPLIFIKACJA (PCR)<br />
cykl 3<br />
cykl 2<br />
cykl 1<br />
19
Temp.<br />
[ 0 C]<br />
100<br />
94<br />
72<br />
50<br />
37<br />
denaturacja<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
UWAGA!!!<br />
W reakcji PCR mogą być amplifikowane tak małe ilości DNA, jak nawet pojedyncza<br />
cząsteczka. Zalecane są następujące środki ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu<br />
próbki:<br />
• Wszystkie czynności wykonywać w rękawiczkach<br />
• Używać buforów przeznaczonych wyłącznie do reakcji PCR<br />
• Używać wyłącznie jałowych tipsów i probówek<br />
• Nie chlapać roztworami DNA<br />
I. Przygotowanie matrycowego DNA.<br />
1. Plazmid oczyszczony metodą lizy alkaicznej do mieszaniny reakcyjnej 2.<br />
2. Próbka bakteryjna do mieszaniny reakcyjnej 1:<br />
- pojedynczą kolonię bakteryjną przenieść jałowo do probówki<br />
- zawiesić w 1ml buforu lizującego (40 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,3 M KCl,<br />
10 mM EDTA), próbkę energicznie wymieszać<br />
- wirować 5 min<br />
- supernatant odrzucić, osad zawiesić ponownie w 1ml buforze lizującym z dodatkiem<br />
lizozymu<br />
- wymieszać i inkubować 5 min na stole<br />
- wirować 2 min<br />
- supernatant odrzucić, osad zawiesić w 300 µl jałowej wody<br />
- próbkę gotować 10 min w łaźni wodnej<br />
- po ostudzeniu wirować 5 min<br />
DNA, AMPLIFIKACJA (PCR)<br />
Cykl 1 Cykl 2<br />
denaturacja<br />
Dołączanie<br />
startera<br />
Wydłużanie<br />
łańcucha<br />
1 2 3 4<br />
Rys 5. Profil termiczny PCR<br />
czas [min]<br />
20
– supernatant przenieść do jałowej probówki i używać do reakcji PCR w objętości 5<br />
µl<br />
II. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej<br />
Reakcja odbywa się w całkowitej objętości 50 μl. W mieszaninie znajduje się 10<br />
pmoli każdego primera, 2 ng DNA plazmidowego, 200 μM dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,3<br />
50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 jednostka Taq polimerazy.<br />
UWGA!<br />
Kolejność dodawania poszczególnych składników jest istotna!<br />
Probówka podczas dodawania poszczególnych składników powinna<br />
znajdować się w lodzie.<br />
Przepis praktyczny na jedną reakcje (próbkę).<br />
Mieszanina 1<br />
1. woda redestylowana jałowa 39,9 μl<br />
2. bufor 10x stężony 5 μl<br />
3. 10 mM dNTP 0,8 μl<br />
4. 10 μΜ primer lewy 1 μl<br />
5. 10 μΜ primer prawy 1 μl<br />
6. matryca DNA – plazmid 1 μl<br />
7. Τaq polimeraza DNA 1u/μl 1,3 μl<br />
Mieszanina 2<br />
1. woda redestylowana jałowa 36,5 μl<br />
2. bufor 10x stężony 5 μl<br />
3. 10mM dNTP 0,8 μl<br />
4. 10μΜ primer lewy 1 μl<br />
5. 10μΜ primer prawy 1 μl<br />
6. matryca DNA – próbka bakteryjna 5 μl<br />
7. Τaq polimeraza DNA 1u/μl 1,3 μl<br />
Wszystkie odczynniki do reakcji PCR przechowujemy w lodzie. Po wykonaniu reakcji<br />
natychmiast chowamy do –20 0 C.<br />
Wykonanie:<br />
1. Powyższe składniki dokładnie wymieszać.<br />
2. Umieścić w termocyklerze nastawionym na określony program.<br />
3. Włączyć program.<br />
4. Zanalizować produkty amplifikacji na żelu agarozowym<br />
DNA, AMPLIFIKACJA (PCR) 21
5. DETEKCJA I ANALIZA DNA.<br />
5. 1. Elektroforeza DNA na żelu agarozowym.<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA.<br />
Materiały i sprzęt:<br />
1. Agaroza 0,45 g (mały żel 1,5 % o długości około 8 cm)<br />
2. 1 x stężony bufor TBE (90 mM Tris-boran, 2 mM EDTA)<br />
3. Bufor obciążający 6 x razy stężony do próbek.<br />
4. Marker DNA<br />
5. Roztwór bromku etydyny.<br />
6. Zasilacz.<br />
7. Mały aparat do elektroforezy poziomej.<br />
Wykonanie<br />
1. Agarozę rozpuścić w 30 ml buforu TBE.<br />
2. Agarozę wylać na płytę aparatu, przed zastygnięciem umieścić w żelu grzebień na<br />
odpowiedniej głębokości, aby uzyskać studzienki.<br />
3. Po zastygnięciu żelu zalać go buforem 1 x stężonym TBE tak, aby pokrywał on<br />
powierzchnię żelu.<br />
4. Próbki DNA po 10 μl zawiesić w buforze obciążającym 2 μl.<br />
5. Nanieść próbki do studzienek w żelu.<br />
6. Elektroforezę prowadzić przy stałym napięciu 100 V do momentu uzyskania<br />
prawidłowego rozdziału próbek<br />
7. Żel barwić w roztworze bromku etydyny<br />
8. Analizę wyników prowadzić w świetle UV.<br />
a).wylewanie żelu agarozowego<br />
grzebień<br />
Płytka do<br />
wylewania żelu<br />
b). prawidłowe ustawienie grzebienia<br />
Zęby grzebienia<br />
DNA, AMPLIFIKACJA (PCR)<br />
A<br />
agaroza<br />
Taśma uszczelniająca<br />
Żel agarozowy<br />
Szkielet cukrowo-fosforanowy<br />
a). cząsteczka bromku etydyny<br />
H2N<br />
Para zasad<br />
3,4 Å I<br />
Cząsteczka DNA<br />
N +<br />
EtBr<br />
NH2<br />
CH3Br -<br />
b). interkalacja bromku etydyny<br />
w obręb podwójnej nici DNA<br />
B<br />
Cząsteczka<br />
bromku etydyny<br />
>3,4 Å<br />
I 3,4 Å<br />
22
DNA, Detekcja i analiza<br />
23
CZĘŚĆ DRUGA: BIAŁKA<br />
1. PRODUKCJA ZREKOMBINOWANEGO BIAŁKA – EKSPRESJA<br />
KLONOWANEGO GENU.<br />
Uzyskane w procesie transformacji klony należy sprawdzić na obecność<br />
zrekombinowanego genu. W celu można wykonać reakcję PCR na wyizolowanym lizą<br />
alkaliczną plazmidzie. Plazmid można też trawić enzymami restrykcyjnymi wykorzystanymi<br />
wcześniej w procesie klonowania. W obu przypadkach uzyskanie fragmentów DNA o<br />
określonej długości będzie świadczyło o obecności w wektorze klonowanego genu. Gdy<br />
celem klonowania jest produkcja białka na dużą skalę zanim się do tego przystąpi należy<br />
sprawdzić poziom indukcji i czy uzyskane białko ma oczekiwaną masę.<br />
1.1 Sprawdzenie poziomu indukcji białka.<br />
Klonowanie z wykorzystaniem sytemu polimerazy faga T7 daje możliwość ścisłej kontroli<br />
ekspresji klonowanego białka. Transkrypcja białka zajdzie tylko w momencie dodania do<br />
hodowli induktora IPTG (zniesienie represji z operatora; I – 1.2). Poziom indukcji dodatkowo<br />
można regulować stężeniem IPTG. Najlepszym momentem do indukcji dla bakterii jest faza<br />
logarytmicznego wzrostu. W tym czasie intensywnie zachodzą wszystkie procesy komórkowe<br />
(replikacja, transkrypcja, translacja), duże jest stężenie wykorzystywanych enzymów. W<br />
jakiej fazie wzrostu znajdują się bakterie można określić spektrofotometrycznie. Mierzy się<br />
poziom zmętnienia pożywki (absorbancję) na spektrofotometrze nastawionym na długości fali<br />
λ = 600, wyskalowanym na czystej pożywce. OD600=0,5 świadczy, że bakterie znajdują się<br />
logarytmicznej fazie wzrostu. Do tego momentu białko rekombinacyjne nie powinno być<br />
wykrywane w komórce bakteryjnej, albo znajdować się na bardzo niskim poziomie. Po<br />
dodaniu w tym momencie IPTG rusza intensywna ekspresja klonowanego genu. Prawidłowy<br />
przebieg indukcji można sprawdzić dopiero na żelu poliakrylamidowym, w tym celu przed i<br />
po dodaniu IPTG należy pobrać i przygotować próbki na żel.<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
Materiały:<br />
1. Pożywki LB<br />
2. roztwór ampicyliny 1mg/ml<br />
3. IPTG<br />
4. Bufor A (20 mM Tris-HCl pH 7.9, 0.2 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 5% glicerol,<br />
0, 5 M β-merkaptoetanol, PMSF 1 mM.<br />
5. Bufor lizujący do przygotowania próbek na żel.<br />
EDTA – blokuje metaloproteazy chelatując jony metali, które są w centrum aktywnym tych<br />
enzymów.<br />
β-merkaptoetanol – w procesie oczyszczania białek używa się go w celu ochrony białek<br />
tiolowych przed utlenieniem.<br />
PMSF – inhibitor proteaz serynowych.<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
24
Wykonanie:<br />
Sprawdzanie poziomu indukcji białka:<br />
1. Przygotować hodowlę nocną.<br />
- do 25 ml pożywki LB z dodatkiem ampicyliny w stężeniu końcowym 1 µg/ml<br />
posiać jedną kolonie szczepu E. coli BL21 zawierającego plazmid pET16b z<br />
klonowanym genem.<br />
- inkubować przez noc z wytrząsaniem w temp. 37°C<br />
2. Odmłodzenie hodowli nocnej.<br />
- do świeżej pożywki LB 50 ml uzupełnionej ampicyliną jw. Przenieść 0,5 - 1 ml<br />
hodowli nocnej<br />
3. Prowadzić hodowle do OD600= 0,5<br />
4. Pobrać próbkę 1,5 ml hodowli do jałowej probówki – przygotować<br />
próbkę na żel.<br />
5. Do hodowli dodać IPTG do stężenia 0,5 mM (albo 1 mM).<br />
6. Co 30 min (cztery razy – po 1, 1.5, 2 i 2.5 godziny) od momentu indukcji pobierać<br />
próbki tak jak w punkcie 4.<br />
7. Przeprowadzić analizę próbek na zawartość białka metodą elektroforezy<br />
poliakrylamidowej.<br />
Produkcja zrekombinowanego białka na dużą skalę.<br />
1-5.Wykonujemy jak wyżej. Zmieniamy tylko objętość pożywki hodowli<br />
nocnej i hodowli właściwej w zależności jak dużo chcemy uzyskać pasty<br />
bakteryjnej do dalszego oczyszczania produktu białkowego. Hodowle po<br />
dodaniu IPTG prowadzimy do momentu uzyskana najlepszego poziomu<br />
indukcji określonego w poprzednim doświadczeniu.<br />
6. Po określonym czasie prowadzenia hodowli całą pożywkę z wirować (30 min.<br />
4000 obr./min, 4°C)<br />
8. Osad bakteryjny zawiesić w buforze A zamrozić w ciekłym azocie i<br />
przechowywać w temperaturze - 80°C.<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
25
Liza komórek bakteryjnych.<br />
2. IZOLACJA I OCZYSZCZANIE BIAŁKA.<br />
1. Do osadu bakteryjnego zawieszonego w 5 ml buforu lizującego dodać lizozym do<br />
stężenia końcowego 0,2 mg/ml oraz PMSF w stężeniu końcowym 1 mM.<br />
2. Inkubować lodzie 30 min.<br />
3. Rozbić komórki ultradźwiękami przy użyciu sonikatora (6 cykli po 1 min z 1 min<br />
przerwami).<br />
4. Lizat zwirować – 30 min 22 tys. obr/min, 4°C<br />
5. Supernatant użyć do dalszego oczyszczania.<br />
Oczyszczania białka przy użyciu chromatografii powinowactwa w warunkach<br />
natywnych.<br />
Dzięki użyciu do klonowania jednego z wektorów pET (pET16b) białko rekombinacyjne<br />
uzyskuje na końcu N „ogon polihistydynowy”. Do oczyszczania białka wykorzystana zostanie<br />
metoda chromatografii powinowactwa na złożu Ni-NTA.<br />
Rys. 7 Interakcja pomiędzy osadzonym na nośniku jonem niklu a dwiema resztami histydyny.<br />
Macierz złoża Ni-NTA to ziarna agarozowe z ligandem chelatującym metale – nośnikiem<br />
(kwas nitrylotrioctowy - NTA). Jon metalu (Ni 2+ ) unieruchomiony jest na nośniku poprzez<br />
cztery stabilne wiązania. Jon metalu związany ze złożem ma dwa wolne miejsca wiążące i<br />
może tworzyć wiązania koordynacyjne z histydyną na N końcu białka. Imidazol który ma<br />
większe powinowactwo do niklu niż histydyna wypiera białko za złoża. Do elucji białek nie<br />
specyficznie związanych ze złożem używa się 20-40 mM stężenia imidazolu, do elucji białek<br />
specyficznie związanych ze złożem (właściwe białko rekombinacyjne) używa się większego<br />
stężenia imidazolu (200 - 400 mM).<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
26
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
Materiały:<br />
1. Kolumna upakowana złożem Ni-NTA – ok. 1 ml<br />
2. Bufory: lizujący, płuczący, elucyjny<br />
3. 30 % etanol<br />
Bufor lizujący/wiążąc:<br />
50 mM NaH2PO4<br />
300 mM NaCl<br />
10 mM imidazol<br />
pH 8<br />
Bufor płuczący:<br />
50 mM NaH2PO4<br />
300 mM NaCl<br />
20 mM imidazol<br />
pH 8<br />
Bufor elucyjny:<br />
50 mM NaH2PO4<br />
300 mM NaCl<br />
250 mM imidazol<br />
pH 8<br />
Wykonanie:<br />
Zaktywowane złoże Ni-NTA, przechowujemy w 30 % etanolu lub 0,02 % azydku w<br />
temperaturze pokojowej. Złoże powinno mieć jasnoniebieski kolor. Przyjmuje się, że raz<br />
zaktywowane złoże można użyć od 5 do 10. Kiedy kolor złoża z jasnoniebieskiego zrobi się<br />
brązowo-siwy, należy wypłukać jony Ni 2+ 0,5 M EDTA i zregenerować złoże wg wskazań<br />
producenta.<br />
1. Zrównoważyć złoże buforem wiążącym – 5- 10 objętości złoża.<br />
2. Nanieść na przygotowaną kolumnę supernatant uzyskany z wirowania lizatu<br />
komórkowego. Równocześnie zbierając frakcje białka nie związanego ze złożem.<br />
3. Płukać złoże buforem płuczącym - 5- 10 objętości złoża.<br />
4. Płukać złoże buforem elucyjnym - 5- 10 objętości złoża.<br />
W przypadku pkt 3 i 4 zbierać każdą frakcje o objętości złoża do oddzielnych<br />
probówek.<br />
5. Płuczemy złoże 30 % etanolem.<br />
6. Zawartość białka w kolejnych zbieranych frakcjach z kolumny określić za pomocą<br />
elektroforezy poliakrylamidowej.<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
27
3. ANALIZA ILOŚCI I JAKOŚCI BIAŁKA.<br />
3. 1. Elektorforeza poliakrylamidowa białek<br />
Metoda ta jest powszechnie stosowana do rozdziału i charakterystyki białek. Na<br />
jednym żelu można przeprowadzić jednocześnie rozdział wielu próbek, a rozdzielone białka<br />
można skutecznie wykryć na żelu metodą barwienia lub autoradiografii.<br />
Żel poliakrylamidowy powstaje w wyniku reakcji polimeryzacji akrylamidu z N,N’metyleno-bis-akrylamidem.<br />
Gęstość żelu zależy od stężenia obu tych składników, stopień<br />
usieciowania żelu od całkowitego stężenia Bis-akrylamidu. Reakcja polimeryzacji jest<br />
katalizowana przez nadsiarczan amonu i TEMED. Utworzony żel służy jako nośnik do<br />
rozdziału elektroforetycznego, funkcjonuje jednocześnie jako sito molekularne, co wpływa na<br />
skuteczny rozdział makrocząsteczek. Wielkość porów sita uwarunkowana zarówno przez<br />
stężenie akrylamidu (ze wzrostem stężenia maleje wielkość porów), jak i przez stopień<br />
usieciowania, musi być właściwie dobrana do wielkości rozdzielanych cząsteczek.<br />
Najczęściej stosowane są żele o stężeniu od 7,5 do 12,5%. Obecnie preferowana jest forma<br />
płytowa żelu dająca możliwość naniesienia jednocześnie na jeden żel wielu próbek.<br />
Najczęściej stosuje się elektroforezę na tzw. żelu nieciągłym, w którym próbkę nanosi się na<br />
żel zagęszczający (o dużych porach) spolimeryzowany na wierzchu żelu rozdzielającego (o<br />
małych porach). W tej technice bufor elektrodowy oraz bufory wchodzące w skład obu żeli<br />
różnią się składem i pH. Zaletą tego systemu jest koncentracja białek podczas wędrówki przez<br />
żel zagęszczający, co powoduje, że niezależnie od objętości próbki białka wchodzą w żel<br />
rozdzielający w postaci wąskiego, zatężonego pasma.<br />
Technika elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z użyciem anionowego detergentu,<br />
siarczanu dodecylu (SDS), pozwala na rozdział białek zgodnie z ich masą cząsteczkową.<br />
Przed i w trakcie elektroforezy białka ulegają dysocjacji i denaturacji w obecności SDS, co<br />
nadaje im określony ładunek elektryczny - ujemny. W rezultacie czynnikiem decydującym o<br />
szybkości poruszania się białek w trakcie elektroforezy jest ich masa cząsteczkowa. W<br />
warunkach natywnych jest to nie możliwe ponieważ poszczególne białka mają różny punkt<br />
izolelektryczny.<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
Materiały:<br />
1. Bufor lizujący 4 x stężony do przygotowania próbek na żel<br />
0,125 M Tris HCl pH 6.8<br />
5% SDS<br />
10% β-merkaptoetanol<br />
20% glicerol<br />
2. 30 % roztwór akrylamidów<br />
3. Bufor do żelu górnego 0,5 M Tris-HCl, 0,4% SDS.<br />
4. Bufor do żelu dolnego 1,5 M Tris-HCl, 0,4% SDS.<br />
5. Roztwór nadsiarczanu amonu 10%<br />
6. TEMED<br />
7. Bufor elektrodowy 10 x stężony<br />
8. Woda redestylowana.<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
28
Wykonanie:<br />
Zachować podaną kolejność czynności.<br />
1. Przygotowanie próbek na żel.<br />
• Do próbek (np. 50 μl), które chcemy sprawdzić na zawartość białka (np. próbki<br />
zebrane w czasie indukcji i oczyszczania białka) dodać ¼ objętości 4 x stężonego<br />
buforu lizującego.<br />
• Umieścić próbki w łaźni wodnej na 4 min.<br />
• Próbki mogą być przechowywane do miesiąca w 4 0 C<br />
2. Przygotowanie płytek.<br />
• Dokładnie umyte płytki szklane odtłuścić przecierając alkoholem (denaturat).<br />
• Złożyć płytki z odpowiednimi przekładkami i umieścić w statywie do wylewania<br />
żeli<br />
UWAGA!!!<br />
Akrylamid jest związkiem toksycznym! Wszystkie czynności należy<br />
wykonywać w rękawiczkach!<br />
3. Przygotowanie żelu dolnego (rozdzielającego) 12,5%<br />
• Sporządzić mieszaninę:<br />
Bufor 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 0,4% SDS 2,0 ml<br />
30% roztwór akrylamidów 3,3 ml<br />
Woda 2,7 ml<br />
10% nadsiarczan amonu 40 µl<br />
TEMED 8 µl<br />
TEMED dodajemy na samym końcu tuż przed wylaniem żelu.<br />
• Wymieszać dokładnie wszystkie składniki<br />
• Wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do 2/3 wysokości, zostawiając miejsce<br />
na żel górny i grzebień.<br />
• Na żel nawarstwić ostrożnie 1-2 mm wody<br />
• Pozostawić do polimeryzacji ok. 20 min<br />
4. Przygotowanie żelu górnego (zagęszczającego) 5%.<br />
• Sporządzić mieszaninę:<br />
Bufor 0,5 M Tris-HCl pH 8,8, 0,4% SDS 0,8 ml<br />
30% roztwór akrylamidów 0,5 ml<br />
Woda 2,1 ml<br />
10% nadsiarczan amonu 30 µl<br />
TEMED 6 µl<br />
• Zlać wodę z żelu dolnego<br />
• Napełnić płytki żelem górnym<br />
• Wsunąć grzebień tak, aby nie powstały pęcherzyki powietrza<br />
• Pozostawić do polimeryzacji<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
29
5. Przygotowanie aparatu do elektroforezy.<br />
• Po spolimeryzowaniu żelu górnego umieścić płytki z żelem w aparacie do<br />
elektroforezy<br />
• Napełnić 1 x stężonym buforem elektrodowym dolne i górne naczynie<br />
elektrodowe.<br />
• Wyjąć ostrożnie grzebień, wszystkie utworzone studzienki muszą być zalane<br />
buforem elktrodowym<br />
6. Nanoszenie próbek na żel.<br />
• Przygotowane wcześniej próbki nanosić do kolejnych studzienek w żelu przy<br />
pomocy pipety automatycznej z tipsem o kapilarnym zakończeniu.<br />
• Oprócz próbek badanych nanieść próbkę wzorcową<br />
7. Rozdział elektroforetyczny<br />
• Połączyć dolną elektrodę z biegunem „+”, a górną z biegunem „-” zasilacza.<br />
• Włączyć zasilacz i prowadzić rozdzial przy napieciu 160V<br />
• Kontynuować rozdział aż do wyjścia barwnika.<br />
• Po zakończonym rozdziale wyłączyć prąd, wylać bufor, wyjąć płytkę<br />
• Ostrożnie rozdzielić płytki<br />
• Żel wybarwić<br />
3. 1. 2. Barwienie żeli poliakrylamidowych.<br />
1. Barwienie przy użyciu barwnika Coomassie Brillant Blue.<br />
• Przygotować roztwór barwnika: 0,2% Coomassie Brillant Blue w mieszaninie<br />
kwas octowy: metanol: woda o proporcjach 1: 5 : 5<br />
• Żel zalać barwnikiem, czas barwienia zależy od grubości żelu, dla żelu 1 mm<br />
jest to około 2 godz.<br />
• Odbarwiać w mieszaninie kwas octowy – metanol – woda 1 : 2 : 8 przez noc.<br />
2. Barwienie srebrem.<br />
• Płukać żel w 50% metanolu przez godzinę lub całą noc<br />
• Przygotować w odzielnych naczyniach dwie mieszaniny:<br />
a) 0,8 g AgNO3 w 4 ml redestylowanej H2O<br />
b) 75,6 mg NaOH w 21 ml wody i 1,4 ml wody amoniakalnej<br />
• Dodawać kroplami roztwór srebra do miszanego cały czas roztworu b),<br />
dopełnić do 100 ml wodą<br />
• Barwić żel 15 min.<br />
• Płukać żel 3 x redestylowaną wodą po 5 min<br />
• Zalać żel świeżo przygotowanym wywoływaczem<br />
0,5 ml 1% kwasu cytrynowego<br />
50 µl 37% formaldehydu<br />
dopełnić do 100 ml H2O redestylowaną<br />
• Wywoływać żel do uzyskania prążków o pożądanej intensywności<br />
• Zlać wywoływacz i przepłukać szybko żel wodą<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
30
• Zahamować reakcję roztworem "przerywacza" – 10% kwas octowy i 45%<br />
metanol<br />
3. 2. Western blotting – immunobloting.<br />
Immunoblotting jest połączeniem rozdziału elektroforetycznego w żelu ze specyficzną<br />
detekcją immunochemiczną. Immunoblotting może być użyty do charakterystyki białka<br />
(antygenu): wykrywania obecności białka, określania jego jakości i masy cząsteczkowej oraz<br />
wydajności ekstrakcji.<br />
Procedurę immunoblotingu można podzielić na sześć etapów:<br />
1. Przygotowanie próby białka.<br />
2. Rozdział elektroforetyczny próby białka w żelu poliakrylamidowym.<br />
3. Transfer rozdzielonych polipeptydów na membranę.<br />
4. Blokowanie niespecyficznych miejsc na membranie.<br />
5. Dodanie przeciwciał.<br />
6. Detekcja.<br />
Ad. 1. Przygotowanie próby białka.<br />
Jako próbę można użyć całe lizaty z komórek bakteryjnych, hodowli komórkowych, tkanek i<br />
narządów. W większości przypadków przed naniesieniem na żel nie potrzeba ich wcześniej<br />
oczyszczać. Ponieważ ograniczona jest całkowita ilość białka które może być wystarczająco<br />
rozdzielone w żelu, niektóre mniejsze białka mogą być obecne w ilościach poniżej poziomu<br />
detekcji. W tych przypadkach aby zwiększyć poziom detekcji, próbka białka musi być<br />
częściowo oczyszczona przez standardową chromatografię (np HPLC).<br />
Ad. 2. Rozdział elektroforetyczny próby białka w żelu poliakrylamidowym.<br />
Wykonuje się zgodnie z procedurą opisaną w 3.1.<br />
Ad. 3. Transfer rozdzielonych polipeptydów na membranę.<br />
Najczęściej do wiązania przenoszonych białek wykorzystuje się błony nylonowe i<br />
nitrocelulozowe. Elektrotransfer wykonuje się w specjalnym aparacie.<br />
Ad. 4 i 5. Blokowanie niespecyficznych miejsc na membranie. Dodanie przeciwciał.<br />
Próba białkowa zawiera mieszninę dużej ilości polipeptydow w której chcemy oznaczyć i<br />
scharakteryzować jedno konkretne białko - antygen z dużą liczbą epitopów. W tym celu<br />
wykorzystujemy przeciwciało królicze albo mysie (IgG), specyficznie wiążce się z tym<br />
jednym antygenem znajdującym się na błonie. Zanim zostaną dodane przeciwciała należy<br />
„zablokować” powierzchnię błony gdzie nie ma przeniesionych białek, eliminując w ten<br />
sposób tło i niespecyfiną hybrydyzację. W tym celu stosuje się bufor blokujący, w którym<br />
jako czynnik blokujący można zastosować: odtłuszczone mleko, BSA, żelatynę i dodatkowo<br />
detergent Tween 20. Dopiero po przepłukaniu błony w buforze blokującym dodaje się<br />
zawiesinę podstawowego przeciwciała w odpowiednim mianie.<br />
Ad. 6. Detekcja.<br />
Detekcja może być bezpośrednia (rzadko) i pośrednia. Detekcja bezpośrednia polega na<br />
użyciu wyznakowanego, podstawowego przeciwciała, wykrywającego osadzone w błonie<br />
białko. Najczęściej jednak wykorzystywana jest detekcja pośrednia. Używa się drugiego<br />
gwarantującego detekcję wyznakowanego przeciwciała, wiążącego specyficznie przeciwciało<br />
podstawowe.<br />
Wykorzystuje się dwie metody detekcji:<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
31
• Przeciwciała wyznakowane radioaktywnie. Metody detekcji radioaktywnej polegają<br />
na odczycie densytometrycznym lub na ekspozycji na kliszę rentgenowską.<br />
• Przeciwciała wyznakowane enzymatycznie. Są to proste metody nie wymagające<br />
specjalistycznego sprzętu i dające bezpośredni wynik. Używa się buforu z substratami<br />
dla enzymu którym wyznakowane są przeciwciała. W wyniku reakcji otrzymuje się<br />
barwny produkt – w postaci prążka na błonie w miejscu gdzie znajduje się wykrywane<br />
białko.<br />
Enzymy wykorzystywane do znakowania:<br />
Alkaliczna fosfataza – substraty to BCIP/NBT – prurpurowo-czarny produkt<br />
Peroksydaza chrzanowa – substrat AEC albo DAB – niebiesko-czarny produkt<br />
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA<br />
Materiały i sprzęt:<br />
1. Aparat do elektrotransferu.<br />
2. Kuwety.<br />
3. Błona nitrocelulozowa – przycięta do wymiaru żelu.<br />
4. Papier absorbujący – np. Whatman 3MM<br />
5. Roztwory:<br />
BUFOR DO TRANSFERU<br />
Tris 25 mM 2,9 g<br />
Glicyna 190 mM 14,5 g<br />
Metanol 20% 200 ml<br />
Dopełnić wodą do 1 L<br />
BUFOR 1 x TBS<br />
20 mM Tris 4,84 g<br />
500 mM NaCl 58,48 g<br />
Dopełnić wodą do 2 L pH 7,5<br />
BUFOR DO PŁUKANIA 1 x TTBS<br />
20 mM Tris 4,84 g<br />
500 mM NaCl 58,48 g<br />
Tween 20 0,5 ml<br />
Dopełnić wodą do 1 L pH 7,5<br />
BUFOR BLOKUJĄCY<br />
3% żelatyna 3 g<br />
1 x TBS 100 ml<br />
Podgrzać do 37°C w celu rozpuszczenia żelatyny, następnie schłodzić.<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
32
BUFOR DO PRZECIWACIAŁ<br />
1 % żelatyna 2 g<br />
1 x TTBS 200 ml<br />
Podgrzać do 37°C w celu rozpuszczenia żelatyny, schłodzić przed dodaniem<br />
przeciwciał.<br />
a) Pierwszy roztwór przeciwciał – 100 ml<br />
Rozpuścić gatunkowo specyficzne podstawowe królicze albo mysie IgG w<br />
odpowiednim mianie.<br />
b) Drugi roztwór przeciwciał – 100 ml<br />
Rozpuścić drugie przeciwciało odpowiednie do podstawowego, skoniugowane z<br />
fosfatazą alkaliczną (miano 3,000 - 33 µl na 100 ml buforu).<br />
BUFOR WĘGLANOWY<br />
0,1 M NaHCO3 8,40 g<br />
1 mM MgCl2 x 6 H2O 0,203 g<br />
Dodać wody do 900 ml i doprowadzić pH do 9,8 dodając NaOH. Dopełnić wodą do<br />
1000 ml.<br />
ROZTWÓR DO REAKCJI BARWNEJ Z FOSFATAZĄ ALKALICZNĄ<br />
Roztwór A<br />
140 µl DMF<br />
60 µl H2O<br />
0,006 g NBT<br />
Roztwór B<br />
200 µl DMF<br />
0,003 g BCIP<br />
Proporcje na jedną reakcję. Przed samym użyciem połączyć roztwór A i B. Dopełnić do<br />
20<br />
ml buforem węglanowym<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
33
Wykonanie:<br />
1. Elektroblotting – transfer białek rozdzielonych w żelu poliakrylamidowym SDS na błonę<br />
nitrocelulozową w aparacie do transferu. Przed użyciem błonę należy płukać 10 min w<br />
buforze TBS. W odpowiedniej kolejności ułożyć żel, błonę i papier absorbujący na<br />
przekładkach do aparatu i zanurzyć w buforze do transferu, ostrożnie usuwając pęcherzyki<br />
powietrza z pomiędzy układanych warstw.<br />
2. Złożyć „kanapkę” jak przedstawia rysunek poniżej. Wszystkie komponenty muszą być<br />
zwilżone buforem i ściśle złożone. Umieścić „kanapkę” transferową w aparacie z błoną<br />
od strony elektrody dodatniej.<br />
3. Transfer prowadzić przez 1 – 18 godzin przy ~ 100 V w chłodni, albo okładając aparat<br />
lodem.<br />
4. Po transferze zanurzyć błonę w buforze blokującym. Inkubować 30 – 60 min z delikatnym<br />
wytrząsaniem. Żel poliakrylamidowy można teraz wybarwić Coomassie albo srebrem dla<br />
sprawdzenia efektywności transferu.<br />
5. Przenieść błonę do buforu TTBS, płukać mieszając przez 5 min<br />
6. Wymienić bufor TTBS i ponownie płukać 5 min.<br />
7. Zanurzyć błonę w pierwszym roztworze przeciwciał. Inkubować 1 – 2 godziny z<br />
delikatnym wytrząsaniem.<br />
8. Przepłukać błonę dwukrotnie przez 5 min w buforze TTBS.<br />
9. Przenieść błonę do drugiego roztworu przeciwciał.<br />
10. Płukać błonę w TTBS 5 min dwa razy.<br />
11. Płukać błonę w buforze TBS przez 5 min w celu usunięcia detergentu Tween 20.<br />
12. Przygotować świeżą mieszninę BCIP/NBT.<br />
13. Dla rozwinięcia reakcji barwnej zanurzamy błonę w roztworze substratów dla fosfatazy<br />
alkalicznej. W zależności od czułości reakcji inkubować 4 – 30 min a nawet do 4 godzin.<br />
14. Zahamować reakcję przez zanurzenie błony w buforze TBS z 20 mM EDTA.<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
34
papier<br />
absorpcyjny<br />
żel<br />
nitroceluloza<br />
obudowa z plastyku<br />
miękka<br />
podkładka<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
kierunek transferu białka<br />
+<br />
_<br />
anoda<br />
katoda<br />
bufor do<br />
elektroblottingu<br />
Rys. 8 Prawidłowe ułożenie żelu i błony w aparacie do elektrotransferu. Transfer przebiega<br />
od katody do anody, dlatego błona musi znajdować się po stronie elektrody dodatniej.<br />
analiza<br />
aminokwasów<br />
spektrofotometria<br />
(A 280 )<br />
barwienie Coomassie<br />
Blue<br />
Ile jest białka?<br />
kolorymetria<br />
(Bradford)<br />
detekcja transfer na błonę<br />
(elektrobloting)<br />
barwienie<br />
srebrem<br />
detekcja<br />
elektroforeza<br />
tusz indyjski barwienie żelazem barwienie złotem przeciwciała<br />
(immunobloting)<br />
35
Barwienie<br />
Coomassie Blue<br />
Elektroforeza<br />
Detekcja<br />
Białka, Ekspresja klonowanego genu<br />
Czy białko jest czyste ?<br />
Z ilu podjednostek jest zbudowane ?<br />
Jaką masę cząsteczkową ma białko i jego<br />
podjednostki ?<br />
Barwienie<br />
srebrem<br />
Porównanie masy cząsteczkowej w<br />
odniesieniu do standardowego markera<br />
białkowego<br />
Oszacowanie masy cząsteczkowej i ilości<br />
podjednostek nieznanego białka<br />
Konwencjonalna<br />
Filtracja na żelu<br />
Chromatografia<br />
Oszacowanie masy cząsteczkowej<br />
nieznanego białka<br />
HPLC<br />
Size-exclusion<br />
Rys. 10 Analiza czystości, masy cząsteczkowej i struktury podjednostek białka.<br />
36
Objaśnienienie skrótów:<br />
IPTG – izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd<br />
PMSF – fluorek fenylometylo sulfonylu<br />
EDTA – kwas etylenodiaminotertaoctowy<br />
Tris – Trihydroksymetyloaminometan<br />
SDS –siarczan dodecylu sodu<br />
TEMED – N, N, N’, N’-tetrametyloetylenodiamina<br />
NBT – azotan błękitu tetrazolowego<br />
BCIP – fosforan bromochloroindolylowy<br />
DMF – N-N Dimetyloformamid<br />
AEC – 3-amino-9-etylkarbazolu<br />
DAB - diaminobenzydyna<br />
HOOC-H2C CH2-COOH<br />
HOOC-2C<br />
HO-H 2 C<br />
N-CH2-CH2-N<br />
PMSF<br />
EDTA<br />
C<br />
CH 2 -OH<br />
NH 2<br />
TRIS<br />
CH2-COOH<br />
CH2-S02F<br />
CH 2 -OH<br />
OH<br />
HOCH 2<br />
OH<br />
IPTG<br />
H 3 C-(CH 2 ) 10 -H 2 C<br />
H3C<br />
H3C<br />
SDS<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
N-CH2-CH2-N<br />
TEMED<br />
CH 3<br />
S-CH-CH 3<br />
O<br />
S<br />
O<br />
CH3<br />
CH3<br />
ONa<br />
37
<strong>Skrypt</strong> zredagowany w oparciu o źródła:<br />
1. „Short protocols in molecular biology” pod redakcją F. M. Ausubel i inni.<br />
Wydawnictwo WILEY 2002 r.<br />
2. „Molecular Cloning – a laboratory manual” J. Sambrook, E. F. Fritsch,<br />
T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 r.<br />
3. „Antibodies - a laboratory manual” E. Harlow, D. Lane Cold Spring Harbor<br />
Laboratory Press 1988 r.<br />
4. „Podstawy inżynierii genetycznej: teoria, ćwiczenia, testy” J. Kur. Politechnika<br />
Gdańska 1994.<br />
5. „Inżynieria genetyczna” skrypt pod redakcją T. Kaczorowski. Uniwersytet<br />
Gdański.<br />
.<br />
KiZMF AMG, 2005-2007 38