S P I S T R E Ś C I

AKADEMIA MEDYCZNA IM. PROF. F. SKUBISZEWSKIEGO 

W LUBLINIE 

KATEDRA BIOCHEMII I BIOLOGII MOLEKULARNEJ 

PRZEPISY DO ĆWICZEŃ Z BIOCHEMII 

dla studentów Wydziału Lekarskiego 

POD REDAKCJĄ 

PROF. NADZW. DR HAB. MARTY STRYJECKIEJ-ZIMMER 

LUBLIN 2004

Opracowanie skryptu: 

Rozdziały: 1, 2, 3, 18 prof. nadzw. dr hab. Marta Stryjecka-Zimmer 

Rozdziały: 4, 5, 6, 9, 10, 11 dr Danuta Suchożebrska-Jesionek 

Rozdziały: 7, 8, 19 dr Ewa Nowosadzka-Gromaszek 

Rozdziały: 12, 13, 14, 15 dr Wiesława Ogrodnik 

Rozdziały: zasady BHP, 16, 17, 20 dr Stanisława Szymonik-Lesiuk 

2

SPIS TREŚCI 

ZASADY BEZPIECZEŃSTWA I HIGIENY PRACY W LABORATORIUM ............... 7 

ROZDZIAŁ I 

OGÓLNE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO – CHEMICZNE BIAŁEK ................................... 9 

• Próby barwne: wykrywanie wiązania peptydowego oraz niektórych aminokwasów. 

• Porównanie składu aminokwasowego albuminy i żelatyny. 

• Denaturacja białek: działanie silnych kwasów, soli metali ciężkich, podwyższonej 

temperatury i rozpuszczalników organicznych. 

• Dializa 

• Równowaga Gibbsa-Donnana 

ROZDZIAŁ II 

WYSALANIE I ILOŚCIOWE OZNACZANIE BIAŁKA ............................................... 16 

• Frakcjonowanie białek osocza za pomocą wysalania. 

• Ilościowe oznaczanie stężenia białka metodą biuretowa 

• Wysalanie hemoglobiny 

ROZDZIAŁ III 

METODY STOSOWANE DO ROZDZIAŁU BIAŁEK .................................................. 19 

• Rozdział elektroforetyczny białek surowicy krwi na żelu poliakryloamidowym 

• Sączenie molekularne białek w żelu Sephadex – rozdzielenie hemoglobiny i błękitu 

metylenowego 

• Odsalanie roztworu albuminy w żelu Sephadex 

• Rozpuszczalność białek w punkcie izoelektrycznym, wyznaczanie Pi 

dla kazeiny 

ROZDZIAŁ IV 

WARUNKI DZIAŁANIA ENZYMÓW ............................................................................. 23 

• Wpływ pH na aktywność amylazy ślinowej 

• Wpływ temperatury na aktywność amylazy ślinowej 

• Wpływ aktywatorów i inhibitorów na aktywność amylazy 

• Enzymatyczny rozkład skrobii 

• Oznaczanie aktywności amylazy we krwi lub moczu metoda Wolgemutha 

ROZDZIAŁ V 

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH ............................................................. 27 

• Wyznaczanie energii aktywacji reakcji enzymatycznej 

• Oznaczanie stałej Michaelisa dla inwertazy 

ROZDZIAŁ VI 

UTLENIANIA BIOLOGICZNE. OKSYDOREDUKTAZY ............................................ 33 

• Preparatyka i oznaczanie dehydrogenazy bursztynianowej 

• Wykrywanie oksydazy fenolowej w ekstrakcie z ziemniaka 

• Wykrywanie peroksydazy próbą indofenolową 

• Próba na katalazę. 

3

ROZDZIAŁ VII 

OGÓLNE WŁAŚCIWOŚCI I IDENTYFIKACJA CUKRÓW ....................................... 40 

• Reakcje barwne i próby redukcyjne na cukry: (próba Molischa, próba Fehlinga, próba 

Benedicta, proba Nylandera, próba Barfoeda, próba Seliwanowa, próba Biala, próba 

jodowa) 

• Schemat różnicowania cukrów 

• Stopniowa hydroliza skrobii i wykrywanie produktów jej degradacji 

ROZDZIAŁ VIII 

CUKRY ZŁOŻONE,GLIKOPROTEINY. BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI ................... 45 

• Preparatyka i hydroliza glikogenu 

• Badanie aktywności fosforylazy z wyciągu ziemniaka, fosforoliza skrobii 

• Izolacja i charakterystyka mucyny 

• Oznaczanie ilościowe kwasu sjalowego w surowicy krwi metodą rezorcynolową wg 

Svennerholma 

ROZDZIAŁ IX 

WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNE TŁUSZCZÓW. TRAWIENIE LIPIDÓW. 

ANALIZA ŻÓŁCI. ............................................................................................................... 49 

• Emulgowanie i rozpuszczalność tłuszczów. Wykrywania glicerolu-próba akroleinowa 

• Wykrywanie kwasów tłuszczowych- reakcja zmydlania 

• Wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych 

• Oznaczanie liczby jodowej 

• Oznaczanie liczby kwasowej 

• Trawienie tłuszczów lipazą trzustkową 

• Wpływ żółci na aktywność enzymów lipolitycznych 

• Wykrywanie kwasów żółciowych 

• Wykrywanie barwników żółciowych 

• Wykrywanie cholesterolu 

ROZDZIAŁ X 

LIPIDY ZŁOŻONE – FOSFOLIPIDY .............................................................................. 55 

• Preparatyka lecytyn 

• Wykrywanie składników lecytyny: glicerolu - próba akrpleinowa, kwasów 

tłuszczowych – reakcja zmydlania, choliny i fosforu 

ROZDZIAŁ XI 

STEROIDY ........................................................................................................................... 57 

• Wykazanie obecności cholesterolu w mózgu 

• Oznaczanie ilościowe cholesterolu w surowicy 

• Wykrywanie cholesterolu w surowicy metoda chromatografii cienkowarstwowej 

ROZDZIAŁ XII 

SOK ŻOŁĄDKOWY ........................................................................................................... 60 

• Oznaczanie pH soku żołądkowego 

• Oznaczanie wolnego kwasu solnego oraz kwasoty całkowitej soku żołądkowego. 

• Oznaczanie deficytu kwasu solnego w soku żołądkowym 

• Wykrywanie kwasu mlekowego mlekowego soku żołądkowym 

4

ROZDZIAŁ XIII 

ENZYMY PROTEOLITYCZNE ....................................................................................... 64 

• Oznaczanie kinetyki działania trypsyny za pomocą miareczkowania formolowego 

• Wykazanie aktywności podpuszczki 

• Badanie proteolitycznej aktywności pepsyny 

• Trawienie kazeiny pepsyną w środowisku kwaśnym 

• Badanie proteolitycznej aktywności trypsyny 

• Trawienie żelatyny przez trypsynę 

• Trawienie kazeiny trypsyną w środowisku alkalicznym 

ROZDZIAŁ XIV 

PRZEMIANA POŚREDNIA AMINOKWASÓW ............................................................ 69 

• Preparatyka transaminazy alaninowej (ALAT) z wątroby 

• Oznaczanie aktywności transaminazy alaninowej 

• Ilościowe oznaczanie zawartości mocznika w surowicy krwi 

ROZDZIAŁ XV 

CHARAKTERYSTYKA KWASÓW NUKLEINOWYCH ............................................. 72 

• Preparatyka kwasu deoksyrybonukleinowego z wątroby 

• Charakterystyka DNA (wykrywanie fosforanów, zasad purynowych i deoksyrybozy) 

• Preparatyka kwasu rybonukleinowego rybonukleinowego z drożdży 

• Charakterystyka RNA (wykrywanie fosforanów, zasad purynowych i pentoz) 

• Oznaczanie stężenia kwasu moczowego w surowicy krwi 

ROZDZIAŁ XVI 

WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE ..................................................................... 78 

• Badanie rozpuszczalności karotenoidów w tłuszczach i rozpuszczalnikach 

organicznych 

• Wykrywanie witaminy A i D w tranie z wątroby dorsza 

• Fluorymetryczne wykrywanie tiaminy (witaminy B1) 

• Fluorymetryczne wykrywanie i badanie właściwości oksydoredukcyjnych ryboflawiny 

(witaminy B2) 

• Ilościowe oznaczanie witaminy C w ziemniaku /cebuli 

• Ilościowe oznaczanie wapnia w surowicy krwi 

ROZDZIAŁ XVII 

HORMONY .......................................................................................................................... 87 

• Wykrywanie estrogenów metodą Kobera 

• Wykrywanie 17-ketosteroidów próbą Zimmermanna 

• Ilościowe oznaczanie testosteronu 

• Oznaczanie aktywności fosfatazy zasadowej (AP) metoda Kinga-Armstronga 

ROZDZIAŁ XVIII 

ANALIZA CHEMICZNA KRWI ....................................................................................... 94 

• Badanie wpływu czynników fizycznych fizycznych chemicznych na trwałość 

erytrocytów 

• Wykazanie złożonego charakteru hemoglobiny 

• Wykrywanie anhydrazy węglanowej w erytrocytach 

5

• Wykrywanie właściwości peroksydatywnych krwi próbą piramidonową 

• Wykrywanie katalizy 

• Wykrywanie jakościowe składników krwi ( jony chlorkowe, siarczanowe, 

fosforanowe, mocznik, kreatynina, kwas moczowy) 

• Ilościowe oznaczanie hemoglobiny 

• Zastosowanie filtracji żelowej do analizy pochodnych hemoglobiny 

• Oznaczanie stężenia glukozy we krwi metoda kolorymetryczną wg Samogyi i Nelsona 

ROZDZIAŁ XIX 

ANALIZA MOCZU FIZJOLOGICZNEGO I PATOLOGICZNEGO ........................ 100 

• Określenie odczynu moczu 

• Oznaczenie ciężaru właściwego moczu 

• Wykrywanie składników nieorganicznych moczu 

• Wykrywanie składników organicznych moczu 

• Wykrywanie składników patologicznych moczu – białka, cukrów, ciał ketonowych, 

kwasów żółciowych, bilirubiny, krwi) 

ROZDZIAŁ XX 

TKANKA MIĘŚNIOWA ................................................................................................... 105 

• Przygotowanie ekstraktu wodnego i solnego z tkanki mięśniowej 

• Wykrywanie mioalbumin w ekstrakcie wodnym 

• Wykrywanie organicznych i nieorganicznych składników drobnocząsteczkowych w 

ekstrakcie wodnym mięśni (wykrywanie kreatyny, kreatyniny, karnozynykwasu 

mlekowego, jonów chlorkowych, jonów siarczanowych i jonów fosforanowych) 

• Wykrywanie globulin w ekstrakcie solnym 

• Wykrywanie kolagenu w supernatancie III 

6

ZASADY BEZPIECZEŃSTWA I HIGIENY PRACY 

KATEDRA I ZAKŁAD BIOCHEMII I BIOLOGII MOLEKULARNEJ 

Akademii Medycznej im prof. Feliksa Skubiszewskiego w Lublinie 

NIESZCZĘŚLIWE WYPADKI W LABORATORIACH SĄ NAJCZĘŚCIEJ SPOWODO- 

WANE LEKCEWAŻENIEM PODSTAWOWYCH PRZEPISÓW BEZPIECZEŃSTWA PRACY, 

NIE PRZESTRZEGANIEM CZYSTOŚCI I PORZĄDKU. 

NALEŹY BEZWZGLĘDNIE PODPORZĄDKOWAĆ SIĘ ZALECENIOM OSOBY 

PROWADZĄCEJ ĆWICZENIA W ZAKRESIE SPOSOBU WYKONANIA DOŚWIADCZEŃ 

ORAZ OGÓLNEGO PORZĄDKU OBOWIĄZUJĄCEGO NA SALI ĆWICZEŃ ZGODNIE 

Z ZASADAMI BEZPIECZEŃSTWA PRACY. 

1. Laboratorium chemiczne jest miejscem pracy, należy zachowywać się w nim 

w sposób odpowiedzialny 

2. Podczas wykonywania ćwiczeń należy zawsze zdawać sobie sprawę z rodzaju 

wykonywanej czynności, gdyż pozwala to na przewidywanie ewentualnych skutków. 

3. W laboratorium znajdują się płyny żrące, łatwo palne, trujące, barwiące, dlatego 

należy pracować w fartuchu ochronnym a razie potrzeby używać rękawiczek 

jednorazowego użytku. 

4. Nie wolno wnosić do laboratorium okrycia wierzchniego. 

5. W laboratorium nie wolno ani jeść, ani kłaść jedzenia na stole laboratoryjnym. 

6. Na stołach laboratoryjnych znajduje się zestaw odczynników podstawowych, które są 

dokładnie opisane. Po zakończeniu pracy sprawdź, czy wszystkie odczynniki, znajdują 

się na swoim miejscu. 

7. Specjalne odczynniki i sprzęt, potrzebne do wykonania danego ćwiczenia, są 

umieszczone na półkach oraz na tacach, przynoszonych przez laborantów. 

8. Żadnej substancji nie badaj smakiem. 

9. Odczynniki stężone i żrące są umieszczone na tacy, pod digestorium. Do pobrania 

tych substancji posługuj się pipetą z nasadką dozującą lub cylindrem. Podczas pracy z 

nimi zachowaj szczególną ostrożność i zabezpiecz się, stosując odpowiednio 

opuszczoną szybę wyciągu. Pamiętaj, że zobojętnianie stężonego kwasu zasadą jest 

reakcją silnie egzoergiczną 

Wszelkie stężone odczynniki stanowią potencjalne zagrożenie, szczególnie dla oczu 

oraz błon śluzowych jamy ustnej i nosa. 

Nie wolno przenosić odczynników stężonych i żrących. 

10. Nie zapalaj ognia, jeśli pracujesz z substancjami łatwopalnymi-eter, aceton, alkohol 

Pożar powstały na skutek zapalenia się rozpuszczalników gaś specjalną gaśnicą. 

11. Nie używaj tej samej pipety szklanej lub końcówki pipety automatycznej do różnych 

roztworów. Nie wlewaj raz pobranego roztworu ponownie do butelki. 

12. Roztwory wodne w probówkach ogrzewaj tylko w łaźni wodnej 

13. Umiejętnie korzystaj z instalacji gazowej. 

7

14. Doświadczenia, podczas których powstają substancje o przykrym i duszącym zapachu 

wykonuj pod wyciągiem z włączoną wentylacją przy szybie opuszczonej poniżej 

poziomu ust. 

15. Przy oparzeniu skóry kwasem lub ługiem miejsce oparzone przemyj dokładnie 5% 

roztworem NaHCO3 (w przypadku oparzenia kwasem) lub 2% CH3COOH 

(w przypadku oparzenia ługiem). Odczynniki przeznaczone do tego celu znajdują się 

zawsze na półkach stołów laboratoryjnych w zestawie odczynników podstawowych 

16. W razie oparzenia oczu płucz je obficie wodą, wprowadzając strumień wody do 

zewnętrznych kącików pod powieki. 

17. W razie oparzenia termicznego skóry przemyj jej powierzchnię etanolem. 

18. Każdy wypadek, np. poparzenie lub skaleczenie, zgłoś osobie prowadzącej ćwiczenia, 

która udzieli dalszej pomocy lub skieruje do odpowiedniego specjalisty. 

19. Wiele odczynników stosowanych w pracowni biochemicznej jest potencjalnymi 

truciznami. Często myj ręce podczas pracy i koniecznie przed opuszczeniem 

pracowni. 

20. Oszczędzaj odczynniki i szkło. 

21. Opuszczenie stanowiska pracy zgłoś osobie prowadzącej ćwiczenia. 

PAMIĘTAJ 

• Postępując nieostrożnie, możesz zostać kaleką lub spowodować nieszczęście kolegi, 

dlatego stosuj się ściśle do wszystkich poleceń osoby prowadzącej zajęcia. 

• Przed opuszczeniem laboratorium po zajęciach (zakończonych przez asystenta), 

sprawdź czystość i porządek na Twoim stanowisku pracy - pozostaw to miejsce 

w takim porządku, w jakim sam chciałbyś go zastać, przychodząc ponownie na 

zajęcia. 

8

ROZDZIAŁ I 

OGÓLNE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO – CHEMICZNE BIAŁEK 

Autor: prof. nadzw. dr hab. Marta Stryjecka-Zimmer 

Białka są cząsteczkami, które pełnią szereg ważnych funkcji biologicznych. Występują 

w komórkach, zwierzęcych, gdzie stanowią składnik dominujący oraz poza nimi. 

Mogą pełnić funkcje strukturalne, mogą też spełniać funkcje dynamiczne jako enzymy, 

hormony, regulatory ekspresji genów, białka transportujące, onkotycznie czynne, białka obronne, 

receptorowe i kurczliwe. 

Białka są wielkocząsteczkowymi polimerami zbudowanymi z aminokwasów połączonych 

wiązaniami peptydowymi. Masa cząsteczkowa białek wynosi zazwyczaj ponad 10 tysięcy 

daltonów (około 100 aminokwasów) aminokwasów może sięgać nawet kilku milionów 

daltonów. Dla cząsteczek mniejszych liczących mniej jak 10 aminokwasów stosuje się 

określenie oligopeptydy, lub polipeptydy, jeśli występuje więcej aminokwasów w cząsteczce. 

Wszystkie białka są syntetyzowane jako polimery, które mogą zawierać 20 różnych 

aminokwasów posiadających specyficzne kodony w kodzie genetycznym DNA. 

AMINOKWASY 

Wszystkie aminokwasy, z których powstają białka zawierają centralny atom węgla – 

węgiel alfa do którego przyłączony jest atom wodoru, grupa aminowa, grupa karboksylowa oraz 

grupa boczna o zróżnicowanej budowie. W warunkach fizjologicznego pH (pH około 7,4) grupa 

karboksylowa jest zdysocjowana i tworzy jon karboksylowy, a grupa aminowa jest protonowana 

(-NH3 + ). Aminokwasy, dzięki obecności grup dysocjujących są jednocześnie kwasami 

i zasadami, czyli związkami amfoterycznymi. Istotnymi właściwościami aminokwasów, które 

mają wpływ na budowę i funkcje białek są właściwości elektrostatyczne, hydofobowość/ 

hydrofilowość (polarność) reaktywność reaktywność chemiczna. Ponieważ w białkach prawie 

wszystkie grupy karboksylowe i aminowe są połączone wiązaniami peptydowymi o roli 

aminokwasu wchodzącego w skład białka decyduje głównie charakter grupy bocznej. 

Właściwości grupy bocznej pozwalają na podział w obrębie aminokwasów na aminokwasy 

niepolarne (hydrofobowe) i polarne – hydrofilowe (niedysocjujące, kwaśne i zasadowe). 

W komórkach zwierzęcych nie zachodzi synteza wszystkich aminokwasów niezbędnych do 

syntezy białek. Aminokwasy, które nie są syntetyzowane, muszą być dostarczone (aminokwasy 

egzogenne) w białkach diety. 

STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK 

Liniowa sekwencja aminokwasów w białkach jest określana jako struktura 

pierwszorzędowa i zawiera informację niezbędną dla utworzenia unikalnej trójwymiarowej 

struktury przestrzennej białka,. Cząsteczki białek tworzą skomplikowane struktury, w których 

wyróżniamy 4 poziomy organizacji (struktura pierwszo-, drugo-, trzecio- i czwartorzędowa). Dla 

określenia przestrzennego ułożenia cząsteczek stosuje się termin „konformacja”. 

Kluczową rolę dla biologicznej funkcji białek mają zjonizowane grupy w łańcuchach bocznych 

aminokwasów wchodzących w ich skład. Posiadają charakterystyczne wartości stałych 

dysocjacji (Ka). Znajomość pKa dla kwaśnych grup jonizujących oraz zastosowanie równania 

Hendersona-Hasselbacha pozwalają na ocenę ładunku cząsteczki przy określonym pH. Zmiana 

pH środowiska wpływa na stan jonizacji aminokwasu, peptydu lub białka i ich fizjologiczną 

aktywność. 

Wartość pH, w którym wypadkowy ładunek cząsteczki, peptydu, białka lub cząsteczki innego 

związku amfoterycznego wynosi zero określana jest jako punk izoelektryczny (pl). W roztworze 

pH wyższym od punku izoelektrycznego wypadkowym, dominującym ładunkiem cząsteczki 

9

aminokwasu, peptydu lub białka jest ładunek ujemny, natomiast w roztworze o pH niższym od 

punktu izoelektrycznego dominującym ładunkiem jest ładunek dodatni. 

Białka w środowisku wodnym tworzą roztwory koloidalne, a w stanie zolu utrzymują się dzięki 

ładunkowi elektrycznemu i uwodnieniu cząsteczki. 

Rozpuszczalność białka w roztworach wodnych zależy od rodzaju i rozmieszczenia łańcuchów 

bocznych reszt aminokwasów hydrofilowych i hydrofobowych. W roztworze o pH zbliżonym do 

punktu izoelektrycznego, gdy wypadkowy ładunek cząsteczki jest bliski zero, warstwa 

hydratacyjna jest niewielka – zwłaszcza w przypadku białek hydrofobowych i łatwo następuje 

agregacja koloidu. 

W punkcie izoelektrycznym białka wykazują najmniejszą rozpuszczalność, najmniejsze ciśnienie 

osmotyczne i najmniejszą lepkość. 

Denaturacja białka jest rezultatem zniszczenia natywnej struktury przestrzennej (II – IV 

rzędowej), bez hydrolizy wiązań peptydowych. Najczęściej jest procesem nieodwracalnym i 

prowadzi do utraty biologicznej funkcji białka i zmian właściwości fizykochemicznych. 

Rozfałdowane łańcuchy polipeptydowi wykazują tendencję do agregacji na skutek oddziaływań 

hydrofobowych. 

Do czynników denaturujących należą m.in.: wysoka temperatura, silne kwasy i zasady, 

rozpuszczalniki organiczne, detergenty, jony metali ciężkich, promieniowanie ultrafioletowe, 

wysokie stężenia mocznika. Wzrost temperatury powoduje rozrywanie wiązań wodorowych, 

spadek stabilności cząsteczek białka i spadek ich aktywności. Większość białek traci swoją 

natywną strukturę w temperaturze około 60 o C, chociaż znane są białka, które wytrzymują 

temperatury bliskie 100 o C. 

CEL ĆWICZENIA 

1. Wykazanie wiązań peptydowych w białkach oraz jakościowa ocena zawartości 

określonych aminokwasów składzie białek przy zastosowaniu specyficznych prób 

barwnych (porównanie albuminy i żelatyny) 

2. Poznanie niektórych cech fizykochemicznych białek – białka jako związki 

wielkocząsteczkowe, dializa, denaturacja białek, równowaga Gibsa-Donnana. 

WYKONANIE 

I. PRÓBY BARWNE 

1. Próba biuretowa Piotrkowskiego 

Do 1 ml. roztworu białka dodać taką samą objętość 2 n NaOH, wymieszać i dodać kilka kropli 

1% CuSO4. Obserwować reakcję barwną. 

Oligo-, polipeptydy i białka posiadają powtarzające się wiązania peptydowe /-CO-NH-/. W 

środowisku zasadowym wiązania peptydowe ulegają enolizacji i tworzą barwne kompleksy z 

jonami miedziowymi. Barwa kompleksu jest fioletowo-niebieska. Reakcja biuretowa może być 

wykorzystana do kolorymetrycznego, ilościowego oznaczania białek. 

Nazwa reakcji biuretowej pochodzi stąd, że jest ona dodatnia również w obecności biuretu 

(dwumocznika, powstającego w wyniku kondensacji dwóch cząsteczek mocznika przy 

ogrzewaniu. 

10

2. Reakcja ksantopreteinowa 

Do 1 ml. roztworu białka dodać taką samą objętość stężonego HNO3. Po oziębieniu zawartość 

probówki zalkalizować 30% NaOH. Obserwować reakcję barwną. 

Przy podwyższonej temperaturze, pod wpływem stężonego kwasu azotowego, powstają 

pochodne nitrowe aminokwasów aromatycznych (fenyloalanina, tryptofan,, tyrozyna) o barwie 

żółtej. Po zalkalizowaniu powstają sole o barwie pomarańczowej. 

3. Reakcja Millona 

Do 1 -2 ml. roztworu białka dodać 0,5 ml. odczynnika Millona i ogrzewać pół do jednej minuty 

we wrzącej łaźni wodnej. Powstaje czerwony precypitat, przy dłuższym ogrzewaniu czerwone 

zabarwienie może zniknąć. 

Odczynnik Millona jest mieszaniną azotu i azotynu rtęci i otrzymuje się go przez 

rozpuszczeniu metalicznej rtęci w stężonym kwasie azotowym. Dodatnią próbę Millona 

otrzymuje się w obecności fenolu, wolnej tyrozyny lub białek pełnowartościowych 

(doborowych) zawierających aminokwasy aromatyczne. W reakcji tej powstaje prawdopodobnie 

kompleksowa sól rtęci z grupą OH lub NO2, która daje czerwony precypitat. 

4. Próba Adamkiewicza-Hopkinsa 

Do 1 – 2 ml. roztworu białka dodać 1 ml. stężonego kwasu octowego, lekko wymieszać. 

Mieszaninę podwarstwić 2 ml. stężonego kwasu siarkowego. Obserwować reakcje barwne na 

granicy dwóch cieczy. 

Dodatni wynik reakcji charakteryzuje się powstaniem fioletowego pierścienia na granicy 

dwóch cieczy. Tworzące się fioletowe zabarwienie powstaje w wyniku reakcji tryptofanu 

(pierścień indolowy) z kwasem glioksalowym. Kwas glioksalowy występuje jako zanieczyszczenie 

stężonego kwasu octowego. Dodatnią reakcje dają białka zawierające tryptofan. 

5. Próba cystynowa 

Do 1 ml. roztworu białka dodać kilka kropli stężonego NaOH i ogrzewać przez kilka minut we 

wrzącej łaźni wodnej. Po ochłodzeniu dodać kilka kropli 2% octanu ołowiawego i próbę 

ponownie ogrzać. Obserwować zmianę barwy. 

Przy ogrzewaniu w środowisku alkalicznym wolnej lub związanej w białku cysteiny czy 

cystyny powstaje siarczek sodu, który w reakcji z octanem ołowiu tworzy czarny osad siarczku 

ołowiu. 

6. Próba Saka-Guchi 

Do 1 ml roztworu białka dodać 1ml. 5% NaOH, kilka kropli alfa naftolu i kroplę 10% 

podbrominu sodu. Wymieszać i obserwować przebieg reakcji. 

Aminokwas arginina wolna lub związana z białkiem posiada grupę guanidynową, która 

reaguje z alfa-naftolem i podbrominem sodu utleniając się do barwnego (czerwonego) 

połączenia. 

Obecny w mieszaninie nadmiar podbrominu sodu utlenia amoniak do wolnego azotu, który pod 

postacią pęcherzyków gazu wydziela się z mieszaniny reagującej. 

Wszystkie opisane powyżej reakcje barwne są oparte na właściwościach chemicznych 

łańcuchów bocznych (-R ) zawartych w aminokwasach. 

11

II. DENATURACJA BIAŁEK 

1. Działanie silnych kwasów na białka 

Do dwóch probówek wlać po około 1 ml. roztworu białka. Następnie do jednej dodać 1 – 2 

krople kwasu sulfosalicylowego a do drugiej 1 – 2 krople kwasu trójchlorooctowego (TCA). 

Wymieszać i obserwować zmiany zachodzące w roztworze białka. 

Do probówki wprowadzić 1 ml. stężonego kwasu azotowego a następnie zawartość probówki 

nawarstwić przy pomocy pipety równą objętością roztworu białka, tak aby płyny się nie 

mieszały. Obserwować. 

Wyjaśnienie: 

Jony wodorowe, wprowadzone w wysokich stężeniach do roztworu białka powodują zmianę 

jonizacji łańcuchów bocznych aminokwasów i utratę zdolności do tworzenia wiązań jonowych i 

wodorowych. Prowadzi to do rozluźnienia struktury przestrzennej cząsteczek białka, które 

wykazują silną tendencję do agregacji i wypadają z roztworu w postaci osadu. 

Kwasy: sulfosalicylowy, trójchlorooctowy tworzą z kationowymi postaciami białka 

nierozpuszczalne sole. Wiele odczynów stosowanych do wykazania obecności białka w 

roztworze oparte jest na procesie koagulacji i denaturacji. Próba podwarstwiania roztworu białka 

stężonym kwasem azotowym nosi nazwę próby Hellena i znalazła zastosowanie praktyczne do 

wykrywania białka w moczu patologicznym. Do wykrywania bardzo małych ilości białka w 

moczu można również wykorzystać próbę koagulacyjną z kwasem sulfosalicylowym. 

2. Działanie soli metali ciężkich 

Do trzech probówek odmierzyć po 1 – 2 ml. roztworu białka. Następnie dodać po kilka kropli 

następujących roztworów soli: do probówki pierwszej – octan ołowiawy, do drugiej – siarczan 

miedziowy, do trzeciej – chlorek żelazowy. Obserwować zmiany zachodzące w roztworze 

białka. 

Wyjaśnienie: 

Sole metali ciężkich mogą dawać z anionami białkowymi białczany metali a często tworzą 

związki kompleksowe, trudno rozpuszczalne. Na przykład jony miedzi dają z białkiem trwałe 

połączenia kompleksowe w wytworzeniu których biorą udział dwie grupy aminowe i dwie 

zdysocjowane grupy karboksylowe. 

Rozpuszczalność białczanów metali może ulegać zmianie, tak, że początkowo wypadający osad 

rozpuści się po dodaniu większej ilości soli (np.: w przypadku dodawania chlorku żelazowego). 

Jony metali ciężkich mogą również rozrywać mostki dwusiarczkowe w białkach. 

3. Działanie podwyższonej temperatury 

Do 1 – 2 ml. roztworu białka dodać kilka kropli 1% roztworu kwasu octowego, wymieszać i 

wstawić probówkę do wrzącej łaźni wodnej. Obserwować zmiany zachodzące w roztworze 

białka. 

Wyjaśnienie: 

Pod wpływem wysokiej temperatury następuje zwiększenie drgań atomów między którymi 

istnieją wiązania wodorowe, wskutek czego dochodzi do ich rozerwania. Rozerwaniu mogą 

również ulegać wiązania hydrofobowe. 

12

4. Działanie rozpuszczalników organicznych. 

Do dwóch probówek wlać po 1 ml. białka i po około 3 ml. 96% etanolu. Po wymieszaniu do 

pierwszej probówki dodać taką samą ilość wody. Drugą probówkę odstawić na dwie godziny i 

po tym czasie dodać taką samą ilość wody. Obserwować zmiany zachodzące w roztworze białka. 

Wyjaśnienie: 

Rozpuszczalniki organiczne takie jak: alkohol, eter, chloroform, aceton powodują obniżenie 

stałej dielektrycznej środowiska i powodują zniszczenie interakcji hydrofobowych między 

niepolarnymi resztami aminokwasowymi łańcucha polipeptydowego. Rozpuszczalniki 

organiczne wykazują działanie denaturujące dopiero w większych stężeniach po dłuższym 

czasie działania. 

Destabilizująco na oddziaływanie hydrofobowe w białkach działają również roztwory mocznika 

w stężeniach od 5 M do 10 M oraz detergenty. Denaturacja mocznikiem nie prowadzi do 

agregacji cząsteczek białka i może być odwrócona poprzez stopniowe zmniejszanie stężenia 

mocznika w roztworze, np.drogą dializy. 

III. DIALIZA 

Do worka dializacyjnego dać około 10 ml. roztworu białka w 5% NaCl i opłukać worek wodą 

destylowaną. Worek umieścić w 150 ml. zlewce i zalać 50 ml. wody destylowanej, w której 

uprzednio nie wykazano białka i jonów chlorkowych (białko wykrywać rekacją z kwasem 

sulfosalicylowym a chlorki azotanem srebra). Po jednej godzinie dializy wykonać ponownie 

próby na białko i jony chlorkowe. 

Wyjaśnienie: 

Białka są związkami wielkocząsteczkowymi i w roztworach wodnych tworzą układy o 

charakterze koloidów liofilowych. Cząsteczki białka posiadają wymiary większe niż pory błony 

półprzepuszczalnej i nie przechodzą przez tą błonę, w przeciwieństwie do organicznych i 

nieorganicznych substancji drobnocząsteczkowych (po około ½ godziny stwierdzamy obecność 

NaCl w wodzie). Ta własność białek może być wykorzystana do uwolnienia białek od substancji 

drobnocząsteczkowych w procesie dializy. Rozdzielenie substancji wielkocząsteczkowych od 

drobnocząsteczkowych przy wykorzystaniu błony półprzepuszczalnej określamy jako dializę. 

Całkowite usunięcie substancji drobnocząsteczkowych z roztworu białka jest możliwe przy 

zastosowaniu częstej wymiany rozpuszczalnika lub zastosowaniu jego dużej objętości. 

IV. RÓWNOWAGA GIBBSA - DONNANA 

Do zlewki dać 100 ml wody destylowanej i 10 ml 0,04% błękitu bromofenolowego a następnie 

dodawać kroplami 0,1 n HCl do momentu uzyskania barwy czerwonej z zieloną fluorescencją. 

Płyn podzielić na dwie równe części i umieścić w dwóch zlewkach na 150 ml. ( jedna porcja 

służy jako kontrola dla płynu dializacyjnego, a w drugiej umieści się worek zawierający 15 ml 

roztworu zabarwionego białka) 

Następnie przygotować roztwór białka do badania. W tym celu dać do zlewki na 100 ml 10 ml 

roztworu białka (albumina jaja w 0,9% NaCl), 9 ml wody destylowanej i 1 ml 0,04% błękitu 

bromofenolowego. Następnie dodawać kroplami, stale mieszając, 1 n HCl do momentu 

uzyskania barwy niebiesko-zielonej. 

13

15 ml tego roztworu dać do worka celofanowego. Worek ten umieści w zlewce zawierającej 

50 ml płynu dializacyjnego. 

Po upływie około 1 godziny obserwuje się zmianę barwy. Płyn dializacyjny, w którym 

umieszczono worek jest żółty, a białko w worku celofanowym przyjmuje barwę fiołkowoczerwoną. 

Analogiczne doświadczenie można przeprowadzić w środowisku zasadowym 

Wyjaśnienie: 

Wymian jonów między przestrzenią międzykomórkową a wnętrzem komórki odbywa się przez 

błony komórkowe. Ważną rolę w rozmieszczeniu tych jonów odgrywają białka, które powodują 

nierównomierne rozmieszczenie jonów dyfundujących po obu stronach błony. 

Pod pojęciem równowagi Donnana rozumiemy stan, który ustali się w rozmieszczeniu 

elektrolitów znajdujących się po obu stronach błony. Ma to miejsce wtedy, gdy po jednej stronie 

znajduja się jony zdolne do przechodzenia przez błonę, natomiast jeden z jonów drugiej strony 

nie może przez błonę przenikać. 

Np. jeśli po jednej stronie błony komórkowej znajduje się NaCl, a po drugiej sól sodowa białka 

(anion niedyfundujacy) 

w I z w I z 

Na + 

B - 

Na + 

Cl - 

Na + 

Stan początkowy Stan po czasie t 

B - 

Cl - 

w - wnętrze komórki lub worka dializacyjnego, 

z – zewnętrzny płyn 

to po ustaleniu równowagi w myśl prawa Donnana muszą być ustalone dwa warunki: 

1. Z każdej strony błony suma kationów i anionów musi być sobie równa: 

/Na + /w = B - + /Cl - / w /Na + / z = /Cl - /z 

2. Iloczyny stężeń jonów dyfundujących muszą być równe po obu stronach błony: 

/Na + /z /Cl - /z = /Na + /w /Cl - /w 

Gdy zamiast soli białka znajduje się kation lub anion białkowy wówczas efekt Gibbsa-Donnana 

będzie uzewnętrzniał różnicę pH. W momencie równowagi : 

/H + /z /Cl - / z = /H + /w /Cl - /w 

Na + 

Cl - 

14

Ponieważ w płynie wewnętrznym (worek dializacyjny) znajduje się białko i HCl, stąd jon Cl 

występuje jako B + Cl - oraz H + Cl - , zatem /H + / w < /Cl - /w 

Natomiast w płynie zewnętrznym (dializacyjnym) znajduje się tylko HCl i dlatego 

/H + / z = /Cl - /z stąd wynika, ze stężenie jonów wodorowych w płynie zewnętrznym jest 

większe niż wewnątrz worka dializacyjnego, /H + /w < /H + /z a więc roztwór wewnątrz 

worka dializacyjnego jest mniej kwaśny. 

Im więcej białka znajduje się po jednej stronie błony półprzepuszczalnej tym większa wytworzy 

się różnica w rozmieszczeniu jonów. Zjawisko to ma duże znaczenie w regulacji ciśnienia 

osmotycznego, a także w regulacji pH środowiska wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego. 

15

ROZDZIAŁ II 

WYSALANIE I ILOŚCIOWE OZNACZANIE BIAŁKA 


Do rozdziału białek stosuje się szereg metod, które oparte są: 

1. na różnicach w ich rozpuszczalności: w roztworach soli metali lekkich i siarczanu 

amonu, w rozpuszczalnikach polarnych, w roztworach o różnym pH i różnej sile jonowej. 

2. na różnicach w ładunku białek: techniki elektoferetyczne i chromatografia 

jonowymienna. 

3. na różnicach w wielkości cząsteczek: filtracja żelowa, ultrawirowanie. 

4. na właściwościach hydrofobowych: chromatografia w odwróconej fazie. 

5. na powinowactwie do odpowiednich ligandów: chromatografia powinowactwa. 

Uzyskanie z mieszaniny wielu białek wybranego białka w formie czystej wymaga kolejnego 

zastosowania różnych metod. 

Dla oznaczania zawartości białka całkowitego w roztworach najczęściej stosuje się 

następujące metody: 

1. Metoda spektrofotometryczna – oparta jest na określeniu absorbancji dla badanego 

roztworu białka przy długości fali 280 nm. Metoda ta opiera się na własnościach reszt 

aromatycznych, które absorbują promieniowanie elektromagnetyczne w tym zakresie 

ultrafioletu. Różne białka wykazują charakterystyczne współczynniki absorbancji, 

zależnie od zawartości reszt tyrozyny, fenyloalaniny i tryptofanu. 

2. Metoda biuretowa – odczyn biuretowy dają białka i peptydy zbudowane co najmniej z 

trzech aminokwasów. Reakcja ta polega na tworzeniu barwnego kompleksu z jonami 

miedziowymi w środowisku zasadowym. Stężenie powstającego kompleksu barwnego 

jest proporcjonalne do liczby wiązań peptydowych związków zawartych w badanym 

roztworze. Liczba wiązań peptydowych jest proporcjonalna do ilości białka w związku z 

tym reakcja biuretowa znalazła zastosowanie podczas oznaczania białka metodą 

kolorymetryczną. 

Wysalanie białek 

Białka tworzą roztwory koloidalne a czynnikami, które utrzymują je w roztworze jest ładunek 

elektryczny oraz powinowactwo do wody. Z roztworów można białka wytrącić za pomocą 

wysokich stężeń soli obojętnych metali ziem alkalicznych i siarczanu amonu, których jony dają 

hydraty i wiążąc wodę zmniejszają rozpuszczalność białek. Proces ten nosi nazwę wysalania. 

Siarczan amonu jest czynnikiem najsilniej wysalającym. Różne białka wysalają się przy 

odmiennych stężeniach soli, co ma znaczenie przy frakcjonowaniu białek. Wysalanie białek jest 

zjawiskiem odwracalnym. Przy ponownym uwodnieniu białka przechodzą z powrotem do 

roztworu i nie tracą swoich funkcji biologicznych. 

16

Ogólna charakterystyka białek osocza krwi 

Prawidłowe osocze krwi zawiera 6 – 8 g. białka/dl. 50 – 60% ogółu białek stanowią 

albuminy, pozostałe białka to mieszanina globulin i fibrynogen. Białka osocza klasyfikuje się na 

podstawie ich rozpuszczalności oraz rozdziałów elektroforetycznych. 

Albumina – białko o masie cząsteczkowej około 69 kDa. pI tego białka wynosi 4,7 i w 

fizjologicznym pH posiada ładunek ujemny. Podczas elektroforezy w zasadowym pH ma 

największą ruchliwość do anody. Albumina jest białkiem silnie hydrofilowym, rozpuszcza się w 

wodzie i wysala się przy 100% wysyceniu siarczanem amonu. Główne funkcje albuminy to 

utrzymanie ciśnienia onkotycznego w łożysku naczyń oraz transport różnych cząsteczek, np.: 

kwasów tłuszczowych, bilirubiny, leków. 

Globuliny – grupa białek słabo rozpuszczalnych w wodzie, wymagających niewielkich 

stężeń soli dla ich rozpuszczenia. Przy wyższych stężeniach soli ulegają wysoleniu. Pełnią 

głównie funkcje transportowe. Uzyskane podczas elektroforezy frakcje zawierają między 

innymi: 

Alfa 1 : glikoproteiny – białka „ostrej fazy” oraz lipoproteiny HDL 

Alfa 2 : haptoglobiny, ceruloplazminę, protrombinę, glikoproteiny oraz lipoproteiny VLDL 

Beta : transferynę, lipoproteiny LDL, składniki dopełniacza 

Gamma: immunoglobuliny o właściwościach przeciwciał 

Fibrynogen – w osoczu ludzi jego poziom wynosi 0,3 – 0,6 g/dl. Czynnik krzepnięcia, 

glikoproteina.Cząsteczka ma kształt wydłużony. Monomery mogą polimeryzować i tworzyć 

fibrynę (włóknik). 


1. Frakcjonowanie białek osocza 

2. Ilościowe oznaczanie stężenia białek metodą biuretową 

WYKONANIE 

I . WYSALANIE BIAŁEK OSOCZA 

Do 7,5 ml. osocza bydlęcego dodać 2,5 ml. nasyconego roztworu (NH4)2SO4,- 

Aby otrzymać 25% nasycenie roztworu, wymieszać i pozostawić na 5 minut. Wytrąca się osad 

fibrynogenu, który należy odwirować przez 5 minut przy 2000 obrotów /min. Płyn znad osadu 

(supernatant) zdekantować do drugiej probówki (gdyby dodatkowo powstał kożuch białkowy 

należy go połączyć z osadem fibrynogenu). 

W zdekantowanym supernatancie znajdują się albuminy i globuliny (roztwór A). 

Do osadu fibrynogenu dodać 7,5 ml. 0,9% NaCl, lekko wymieszać, rozpuścić, pozostawić na 5 

minut (roztwór B). 

Pobrać 5 ml. mieszaniny albumin i globulin (roztwór A) do suchej probówki i dodać 2,5 ml. 

nasyconego roztworu (NH4)2SO4, aby otrzymać 50% nasycenie tej soli. Po 10 minutach sączyć 

przez suchy sączek. Na sączku pozostaje osad globulin a w przesączu znajdują się albuminy 

(roztwór C). Osad globulin zachować (sprawdzić rozpuszczalność w wodzie i 0,9% NaCl). 

W poszczególnych próbkach – w roztworach A. B, C przeprowadzić oznaczenia białka próbą 

biuretową. 

17

Wyjaśnienie: 

Białka osocza wysalają się z roztworu przy różnym nasyceniu siarczanem amonu. Fibrynogen 

traci wodę hydratacyjną przy 25% nasyceniu, globuliny ulegają koagulacji przy połowicznym 

(50%) nasyceniu siarczanem amonu a albuminy przy 100% nasyceniu (całkowitym). Własności 

te mają duże znaczenie praktyczne i pozwalają na rozdzielenie albumin i globulin. 

II. ILOŚCIOWE OZNACZANIE STĘŻENIA BIAŁKA METODĄ BIURETOWĄ 

1.Oznaczanie białka całkowitego osocza 

Do probówki odmierzyć 50 ul. osocza używanego do frakcjonowania białek, uzupełnić wodą 

destylowaną do 2,0 ml., następnie dodać 8,0 ml. odczynnika biuretowego (alkaliczny roztwór 

siarczanu miedzi w winianie sodowo-potasowym). Nadmiar siarczanu miedzi wiąże się z 

winianem sodowo-potasowym na związek kompleksowy, rozpuszczalny. 

Zmierzyć absorbancję badanej próbki przy 540 nm wobec próby kontrolnej (2,0 ml. wody 

zamiast roztworu białka). Wynik odczytać z krzywej kalibracyjnej, sporządzonej dla znanych 

rozcieńczeń wzorcowego roztworu białka. Wartość stężenia białka podać w g/100 ml. 

2.Oznaczanie stężenia białek osocza po frakcjonowaniu 

Do kolejnych trzech probówek odmierzyć: 

A/ 0,25 ml. roztworu A zawierającego albuminy i globuliny i uzupełnić wodą destylowaną 

do 2,0 ml. 

B/ 0,5 ml. roztworu B zawierającego fibrynogen i uzupełnić wodą do 2,0 ml. 

C/ 0,5 ml. roztworu C zawierającego albuminy i uzupełnić wodą do 2,0 ml. 

Do wszystkich trzech probówek dodać po 8,0 ml. odczynnika biuretowego, wymieszać, 

pozostawić na 20 minut. Zmierzyć absorbancję badanych próbek wobec próby kontrolnej 

(ślepej) przy długości fali 540 nm. Stężenia białka odczytać z krzywej kalibracyjnej 

(wzorcowej). 

Obliczanie zawartości frakcji białek w 7,5 ml. osocza 

Próbka A – stężenie białka z krzywej kalibracyjnej x 40 (rozcieńczenie) = albumina + 

globuliny 

Próbka B – stężenie białka z krzywej kalibracyjnej x 15 (rozcieńczenie) = fibrynogenu 

Próbka C – stężenie białka z krzywej kalibracyjnej x 30 (rozcieńczenie) = albumin 

Przeliczyć stężenie białka w poszczególnych próbkach na obj.100 ml. osocza (g/100 ml.) 

III. WYSALANIE HEMOGLOBINY 

Do probówek odmierzyć: 

1. 2,0 ml. hemoglobiny, dodać 2,0 ml. 0,9% NaCl 

2. 2,0 ml. hemoglobiny i 2,0 ml. nasyconego siarczanu amonu 

3. 4,0 ml. hemoglobiny a następnie dodać porcjami krystaliczny siarczan amonu, stale 

mieszając do momentu uzyskania nasycenia. Pozostawić na 15 minut. 

Próbki 2 i 3 sączyć przez twarde sączki. Przesącz w probówce 3 jest bezbarwny. Po dodaniu 

wody na sączek w próbce 3, przesącz zabarwi się. 

Wyjaśnienie: 

Hemoglobina wysala się przy nasyceniu całkowitym (100%) siarczanem amonu i dlatego 

przesącz po strąceniu hemoglobiny w probówce 3 jest bezbarwny. 

18

ROZDZIAŁ III 

METODY STOSOWANE DO ROZDZIAŁU BIAŁEK 


Elektroforezą nazywamy ruch naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym do 

przeciwnie naładowanych elektrod. Białka obdarzone ładunkiem przemieszczają się w polu 

elektrycznym w kierunku elektrody przeciwnie naładowanej. Każde białko posiada 

charakterystyczne pH, nazywane punktem izoelektrycznym, gdy wypadkowy ładunek cząsteczki 

jest równy zero i nie porusza się ona w polu elektrycznym. W pH niższym od pI białko 

występuje w formie kationowej a w pH bardziej zasadowym od pI staje się anionem. 

Ruchliwość elektroforetyczna zależy od pH środowiska, jonizacji cząsteczki białka, wielkości 

cząsteczki i jej kształtu oraz napięcia między biegunami prądu. Ruchliwość elektroforetyczna (u) 

jest stosunkiem szybkości migracji (V) do pola elektrycznego (E), u= V/E i wyraża się w 

cm./V/sek. Stosuje się szereg technik elektroforetycznych, ale najczęściej rozdział 

elektroforetyczny przeprowadza się na stałych nośnikach nasyconych buforem. Mogą to być 

paski bibuły, naturalne żele-skrobiowe i agarozowe lub żele syntetyczne – żel poliakrylamidowy 

o dużej sile rozdzielczej. 

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym wykorzystuje wielkość ładunków elektrycznych 

cząsteczek białka przy jednoczesnym działaniu nośnika jako sita molekularnego. 

Jeśli elektroforezę białek przeprowadza się w obecności detergentu SDS (sól sodowa siarczanu 

dedecylu) detergent wiąże się do hydrofobowych regionów denaturowanego białka, maskuje ich 

ładunek i nadaje im swój (1 g. białka wiąże 1,4 g. SDS). Powstające micelle białkowe mają 

ujemny ładunek elektrostatyczny, proporcjonalny do ich masy cząsteczkowej. Umożliwia to 

rozdział białek zgodnie z ich masami cząsteczkowymi. Metodę rozdziału w żelu z dodatkiem 

SDS nazwano elektroforezą denaturującą. 

Elektroforezę można wykorzystać dla rozdziału białek osocza lub surowicy dla celów 

diagnostycznych. W przypadku nośnika nasyconego buforem alkalicznym, najczęściej pH 8,6, 

białka osocza uzyskują ładunek ujemny i wędrują z różną szybkością do anody. Po zakończeniu 

rozdziału, utrwaleniu i wybarwieniu analiza obrazu elektroforetycznego pozwala na wstępną 

ocenę ewentualnych zmian w składzie frakcji białkowych pacjenta. 

Metoda sączenia molekularnego pozwala na rozdział białek na podstawie wielkości ich 

cząsteczek. Rozdział przeprowadza się na kolumnach wypełnionych porowatymi, silnie 

uwodnionymi ziarnami żelu dekstranowego (np.,: Sephadex) lub poliakrylamidowego o 

określonych rozmiarach porowatości (tzw. sita molekularne). Stan żelu i rozmiary określa tzw. 

indeks retencji wody podający ilość wody zaadsorbowanej przez 1 g. żelu. Wyższa wartość tego 

indeksy wskazuje, że żel zatrzymuje większe cząsteczki. Małe cząsteczki wnikają w pory w 

ziarnach żelu, natomiast duże cząsteczki wędrują pomiędzy ziarnami i wypływają z kolumny 

szybciej niż białka mniejsze, które mają dłuższą drogę w kolumnie i migrują wolniej. 

Dobierając żel o odpowiedniej wielkości ziaren oraz stosując do rozdziału białka o znanych 

masach cząsteczkowych można wykalibrować kolumnę, wykreślić krzywą zależności między 

masą cząsteczkową a objętością eluentu przy której białko wypływa z kolumny. 

Sączenie molekularne można również wykorzystać do usuwania z roztworów białek związków 

drobnocząsteczkowych. 

19


1. Zapoznanie się z techniką rozdziału elektroforetycznego białek osocza krwi, analiza 

uzyskanych wyników 

2. Wykorzystanie sit molekularnych do rozdziału i oczyszczania białek 

3. Charakterystyka białka złożonego 

WYKONANIE 

I. ROZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY BIAŁEK SUROWICY KRWI NA 

ŻELU POLIAKRYLOAMIDOWYM 

Rozdział elektroforetyczny białek surowicy krwi zostanie przeprowadzony przy zastosowaniu 

żelu poliakryloamidowego bez dodatku czynników denaturujących. 

Przygotowanie żelu poliakryloamidowego polega na polimeryzacji monomerów akryloamidu z 

tworzącym wiązania krzyżowe N,N-metylenobisakryloamidem zmieszanych ze sobą w 

odpowiednich proporcjach w obecności nadsiarczanu amonowego i czterymetyloetylodwuaminy 

(Temed) jako katalizatorów. 

Studenci otrzymują płytki ze spolimeryzowanym żelem poliakryloamidowym 8,75%. 

W celu przeprowadzenia elektroforezy aparat do elektroforezy należy wypełnić buforem 

elektrodowym Tris-glicyna o pH = 8,3 i umieścić w nim płytki z żelem. Do „studzienek” żelu 

wprowadzić ostrożnie odpowiednią pipetą po 5 ul. badanego materiału, który został 

przygotowany w następujący sposób: 0,1 ml. osocza + 0,1 ml. glicerolu + 0,1 ml. buforu Tris- 

HCl (pH 8,8) + 0,3 ml.H2 O + błękit bromofenolowy. 

Elektroforezę prowadzić przy napięciu 120 V i natężeniu 20 mA przez 2 – 3 godziny. Po dojściu 

barwnika do końca żelu wyłączyć zasilanie prostownika i wyjąć płytki z aparatu. Wyjąć żel i 

ostrożnie przenieść go do kuwety z roztworem barwnika – Commassie S i pozostawić na 15 

minut w temperaturze pokojowej, mieszając kilkakrotnie. Po tym czasie zlać barwnik do butelki, 

a żel przepłukać wodą, po czym umieścić go w odbarwiaczu (10% kwas octowy + 30% mentol), 

ciągle mieszając. Po 30 minutach zmienić odbarwiacz na nową porcję i czynności te powtarzać 

aż do uzyskania bezbarwnego tła żelu. Żel po odbarwieniu przechowywać w 5% roztworze 

kwasu octowego. 

Narysować schemat elektroforegramu, zidentyfikować poszczególne frakcje białkowe, 

porównać profile elektroforetyczne białek surowicy krwi w niektórych przypadkach 

klinicznych. 

II. SĄCZENIE MOLEKULARNE BIAŁEK W ŻELU SEPHADEX 

Przygotowanie żelu: przed wprowadzeniem na kolumnę żel powinien być pozostawiony do 

napęcznienia w wodzie lub w roztworze NaCl. Czas pęcznienia wynosi dla żeli o małej wartości 

indeksu około 3 godzin, dla żelu o wysokiej wartości indeksu 3 dni. Napęczniały żel 

wprowadzamy do kolumny tak aby uzyskać jednorodne wypełnienie. Górną powierzchnię 

wypełnienia pokrywa się zabezpieczającym krążkiem bibuły. Kolumnę należy następnie 

zrównoważyć przemywając ją za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika w ilości 

odpowiadającej trzykrotnej objętości słupa żelu. 

20

Rozdzielenie hemoglobiny i błękitu metylenowego 

Kolumny o średnicy 1,5 cm. i długości 30 cm. wypełnia się zawiesiną Sephadex G – 75 w 0,05 

M. NaCl tak, aby poziom płynu nie obniżył się poniżej osiadającego żelu. Kolumnę napełnia się 

do wysokości około 25 cm. Kiedy poziom płynu zrówna się z krążkiem bibuły (nie pozwolić 

aby powietrze dostawało się pod krążek) na krążek nakładać 0,5 ml. mieszaniny błękitu 

metylenowego z hemoglobiną. Kiedy nałożona mieszanina wsiąknie w bibułę kroplami dodaje 

się 0,05 M. NaCl. Następnie roztwór 0,05 M. NaCl dodaje się porcjami po 2 – 3 ml.. 

Wyjaśnienie: 

Rozdzielenie nałożonych substancji obserwuje się w miarę ich przepływu przez kolumnę. W 

odróżnieniu od wielkocząsteczkowej hemoglobiny związek o niskim ciężarze cząsteczkowym – 

błękit metylenowy wnika w małe pory ziaren Sephadexu i dlatego jego przepływ przez kolumnę 

jest znacznie wolniejszy niż hemoglobiny. Przy zastosowaniu sączenia molekularnego o 

wyższym współczynniku rozdzielczym, można rozdzielać białka różniące się między sobą masą 

cząsteczkową oraz oznaczać masy cząsteczkowe białek. 

III. ODSALANIE ROZTWORU ALBUMINY W ŻELU SEPHADEX 

Na kolumnę przygotowaną jak w poprzednim ćwiczeniu i zrównoważoną buforem 0,005 M. 

Tris-HCl o pH 8,6 wprowadzamy 0,5 ml. mieszaniny zawierającej 0,5% albuminę, 0,1% NaCl w 

buforze 0,005 Tris HCl pH 8,6. Próbkę należy nakładać kroplami bezpośrednio na powierzchnię 

bibuły przykrywającej żel. Po wsiąknięciu roztworu w żel, zamknąć odpływ, przemyć ścianki 

kolumny 0,5 ml. buforu, otworzyć odpływ. Po wsiąknięciu w żel buforu ponownie przemyć 

ścianki kolumny 1,0 ml buforu. Następnie prowadzić elucję zbierając frakcje o objętości około 

2,5 ml. Po zebraniu 10 frakcji kolumnę zamknąć, a zebrane frakcje rozdzielić po połowie i 

wykrywać białko (20% kwasem sulfosalicylowym lub 20% kwasem trójchlorooctowym) oraz 

chlorki (1% azotanem srebra). 

Wyjaśnienie: 

Białka są związkami wielkocząsteczkowymi i w roztworach wodnych tworzą układy o 

charakterze koloidów liofilowych. Cząsteczki białka posiadają wymiary większe niż pory błony 

półprzepuszczalnej i nie przechodzą przez tą błonę, w przeciwieństwie do organicznych i 

nieorganicznych substancji drobnocząsteczkowych (po około ½ godziny stwierdzamy obecność 

NaCl w wodzie). Ta własność białek może być wykorzystana dla uwolnienia białek od substancji 

drobnocząsteczkowych w procesie dializy. Rozdzielenie substancji wielkocząsteczkowych od 

drobnocząsteczkowych przy wykorzystaniu błony półprzepuszczalnej określamy jako dializę. 

IV. OZNACZANIE PUNKTU IZOELEKTRYCZNEGO DLA KAZEINY 

Przygotować dziewięć suchych probówek. Do pierwszej odmierzyć 3,2 ml. 1 M roztworu kwasu 

octowego i 6,8 ml. wody, a do następnych ośmiu po 5 ml. wody. Po dokładnym wymieszaniu 

zawartości w probówce pierwszej, przenieść z niej 5 ml. do drugiej, a z tej po wymieszaniu 

przenieść 5 ml. do trzeciej, itd.. Do każdej probówki dodać po 1 ml. roztworu kazeiny w octanie 

sodu i wymieszać. Obserwować roztwory natychmiast po wymieszaniu i po 30 minutach. 

21

Wyniki wpisać do tabeli: 

--------------------------------------------------------------------------------------------------------- 

Nr.probówki 1 2 3 4 5 6 7 8 

---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 

ml.CH3 COOH 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0,05 0,025 0,012 

---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 

pH roztworu 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6 

---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 

zmętnienie 

osad 

----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 

Wyjaśnienie: 

Białka charakteryzują się określoną rozpuszczalnością w roztworach o różnych stężeniach soli i 

pH. Minimalną rozpuszczalnośc obserwujemy w punkcie izoelektrycznym i wzrasta ona wraz z 

zakwaszaniem lub alkalizacją środowiska. Niektóre białka, zwłaszcza o własnościach 

hydrofobowych w pH zbliżonym do punktu izoelektrycznego wytrącają się z roztworu w postaci 

osadu. Przykładem takiego białka jest białko mleka - kazeina, należąca do grupy fosfoprotein, 

której osad otrzymuje się przez zakwaszenie mleka do pH około 4,7. 

Białka hydrofilowe, dzięki znacznej otoczce wodnej są zazwyczaj rozpuszczalne w roztworach o 

pH zbliżonym do ich punktu izoelektrycznego. Do takich białek należy albumina osocza krwi. 

22

ROZDZIAŁ IV 

WARUNKI DZIAŁANIA ENZYMÓW 

Autor: dr Danuta Suchożebrska-Jesionek 

Enzymy są biokatalizatorami umożliwiającymi przebieg reakcji chemicznej w 

organizmie. Mogą być zbudowane z samego białka np. (trypsyna, rybonukleaza), jednak w 

większości składają się z części białkowej apoenzymu i niebiałkowej grupy prostetycznej lub 

koenzymu. Część białkowa enzymu decyduje o specyficzności lub kierunku jego działania. 

Niebiałkowa część enzymu może uczestniczyć w przegrupowaniu elektronów, które 

umożliwia określoną przemianę substratu. W czasie katalizy enzymatycznej cząsteczki 

substratu wiążą się z enzymem w jego centrum aktywnym. Enzymy działając przez obniżenia 

energii aktywacji nie zmieniają stałej równowagi danej reakcji, przyśpieszają jedynie 

osiągnięcie stanu równowagi w reakcjach termodynamicznie możliwych (są to reakcje 

egzoergiczne, którym towarzyszy utrata energii swobodnej - ∆G). 

Białkowa struktura enzymów determinuje szereg ich podstawowych własności i 

uzależnia od działania czynników fizycznych i chemicznych. Na aktywność enzymów 

wpływają takie czynniki jak: temperatura, pH, obecność aktywatorów i inhibitorów. 

WPŁYW TEMPERATURY 

Podwyższenie temperatury powoduje z reguły przyspieszenie szybkości reakcji. Po 

podwyższeniu temperatury o 10˚C szybkość reakcji chemicznej zostaje zwiększona dwu lub 

trzykrotnie (prawo Van’t Hoffa). Prawo to może być stosowane również do reakcji 

enzymatycznych, ale tylko w pewnym zakresie temperatur. Białkowy charakter 

biokatalizatora powoduje, że w podwyższonej temperaturze ulegają one denaturacji i tracą 

swoje właściwości katalityczne. Dla większości enzymów optymalna temperatura jest bliska 

37˚C. 

WPŁYW PH 

Aktywność enzymów w dużej mierze zależna jest od stężenia jonów wodorowych w 

środowisku. Zmiana pH środowiska wpływa na stan jonizacji reszt aminokwasowych 

zlokalizowanych w obrębie centrum aktywnego, co prowadzi do zmian konformacji i zmian 

aktywności. Dla większości enzymów optymalne pH przypada na zakres obojętny, np. kinaza 

pirogronianowa 7,4; dehydrogenaza mleczanowa 7,2. Istnieją enzymy, które najlepiej działają 

w skrajnych wartościach pH, np. pepsyna 1-2, trypsyna 7,8, fosfataza alkaliczna 8,6, arginaza 

10. Małe odchylenia od optymalnej wartości pH powodują zmiany szybkości reakcji 

enzymatycznej, zaś duże odchylenia pH od tej wartości prowadzą do denaturacji białka 

enzymatycznego na skutek zniszczenia słabych wiązań i zmian jonizacji reszt 

aminokwasowych w obrębie centrum aktywnego enzymu. Ze względu na duże znaczenie 

stężenia jonów wodorowych dla reakcji enzymatycznej badania prowadzi się w obecności 

roztworów buforowych, które w pewnych granicach zapewniają stałą wartość pH. Jest to 

konieczne, ponieważ powstające w wyniku reakcji metabolity lub produkty reakcji mogą 

zakwaszać lub alkalizować środowisko reakcji. 

WPŁYW EFEKTORÓW 

Na aktywność enzymów wpływa obecność substancji zwanych efektorami. Mogą to być 

aktywatory wzmagające działanie enzymów lub inhibitory hamujące to działanie. 

Aktywatorami mogą być: 

23

• jony niektórych metali Mg²˖ (fosfatazy, fosforylazy), Zn²˖ (anhydraza węglanowa, 

dehydrogenaza mleczanowa), Cu²˖ (oksydazy). Aniony mają mały wpływ na aktywność 

enzymów, wyjątek stanowi amylaza aktywowana przez chlorki. 

• związki wielkocząsteczkowe o charakterze białkowym działające przez odblokowanie 

miejsc aktywnych enzymów 

• małocząsteczkowe związki organiczne usuwające wpływ substancji hamujących 

(cysteina, zredukowany glutation) 

Inhibitory zmniejszające szybkość reakcji enzymatycznej mogą działać w sposób 

odwracalny i nieodwracalny. Dzielimy je na kompetycyjne (współzawodniczące) i 

niekompetycyjne. Inhibitorami kompetycyjnymi mogą być związki wykazujące analogie 

strukturalne do substratu konkurując z nim o centrum katalityczne. Inhibicję aktywności 

enzymu można cofnąć przez zwiększenie stężenia substratu. Przykładem inhibitora 

kompetycyjnego jest malonian, który jest inhibitorem dehydrogenazy bursztnianowej. 

Inhibitory kompetycyjne blokujące reakcje enzymatyczne stanowią skuteczne środki 

chemioterapeutyczne. Liczne drobnoustroje wytwarzają witaminę kwas foliowy z kwasu paminobenzoesowego. 

Sulfonamid jako analog strukturalny kwasu p-aminobenzoesowego 

hamuje syntezę kwasu foliowego w komórkach drobnoustrojów doprowadzając je do śmierci. 

Inhibitor niekompetycyjny to związek nie wykazujący strukturalnego podobieństwa do 

substratu. Łączy się z enzymem przeważnie poza centrum katalitycznym tworząc kompleks 

enzym – inhibitor. Wtedy substrat może być związany w centrum katalitycznym, ale 

równoczesne przyłączenie inhibitora sprawia, że przetwarzanie substratu w produkt zostaje 

zahamowane. Zwiększenia stężenia substratu w środowisku reakcji nie wpływa na ten rodzaj 

hamowania. 

Przebieg reakcji enzymatycznej, która zależy od takich czynników, jak: pH środowiska, 

temperatura, czy obecność aktywatorów i inhibitorów można badać i obserwować w 

warunkach laboratoryjnych. W ćwiczeniu warunki działania enzymu przeanalizujemy ma 

przykładzie amylazy. 

Amylaza jest enzymem należącym do hydrolaz. Katalizuje rozkład wiązań α 1-4 

glikozydowych w skrobi. Skrobia jest materiałem zapasowym roślin. Składa się z amylozy i 

amylopektyny. Amyloza zbudowana jest z reszt glukozy powiązanych wiązaniem α 1-4 

glikozydowym. Amylopektyna stanowi zewnętrzną warstwę skrobi o łańcuchu rozgałęzionym 

z przewagą wiązań α 1-6 glikozydowych. 

W celach diagnostycznych oznacza się aktywność wielu enzymów, między innymi 

amylaz. Do oznaczania aktywności amylazy w surowicy krwi lub moczu stosuje się metodę 

Wohlgemutha. Polega ona na oznaczaniu ilości enzymu, która w ciągu 30 minut w 

temperaturze 37˚C w obecności jonów chlorkowych rozłoży 1 mg skrobi do produktów nie 

dających zabarwienia w reakcji z jodem. Wynik podaje się w jednostkach Wohlgemutha, 

uwzględniających ilość enzymu w 1 ml płynów ustrojowych. Oznaczanie aktywności 

amylazy ma duże znaczenie diagnostyczne w schorzeniach trzustki. 


1. Poznanie warunków działania enzymów na przykładzie amylazy ślinowej. 

2. Oznaczenie aktywności amylazy w surowicy lub moczu metodą Wohlgemutha. 

24

WYKONANIE 

1) WPŁYW PH NA AKTYWNOŚĆ AMYLAZY ŚLINOWEJ. 

Do trzech probówek odmierzyć po 3 ml 0,5% roztworu skrobi, 1ml jednego z trzech 

buforów cytrynianowo – fosforanowych o pH 5,0; 6,8; 8 i 2ml 1% NaCl. Zawartość 

probówek wymieszać i wstawić do łaźni wodnej o temp. 37˚C. Po ustaleniu się 

temperatury (co trwa 5 minut) dodać do probówek 1 ml roztworu amylazy lub po 0,5 ml 

rozcieńczonej śliny (ślinę rozcieńczać wodą destylowaną w stosunku 1:50) i wymieszać. 

Po pięciominutowej inkubacji do każdej probówki dodać po 3 krople rozcieńczonego 

roztworu jodu (płyn Lugola), wymieszać i porównywać intensywność granatowej barwy. 

Wyjaśnienie: W ślinie zawarta jest amylaza, enzym katalizujący hydrolityczny rozkład 

skrobi. Skrobia w reakcji z jodem tworzy kompleksy zabarwione niebiesko. Miarą 

intensywności hydrolitycznego rozkładu skrobi jest całkowity zanik lub zmniejszenie 

intensywności reakcji barwnej z jodem. Optimum pH dla amylazy ślinowej wynosi 6,8. 

2) WPŁYW TEMPERATURY NA AKTYWNOŚĆ AMYLAZY ŚLINOWEJ. 

Do trzech probówek dodać kolejno po 3 ml 0,5% roztworu skrobi, 1ml buforu 

cytrynianowo – fosforanowego o pH 6,8 i 2 ml 1% NaCl. Jedną probówkę umieścić w 

łaźni lodowej, drugą w temperaturze pokojowej, a trzecią w łaźni o temperaturze 37˚C. 

Do każdej probówki dodać po 1 ml roztworu amylazy lub rozcieńczonej jak wyżej śliny i 

wymieszać. Po 5 minutach dodać do każdej probówki po 3 krople roztworu jodu i 

wymieszać. Porównać zabarwienie prób i na tej podstawie określić optimum temperatury 

dla amylazy ślinowej. 

Wyjaśnienie: Większość enzymów organizmów zwierzęcych wykazuje optimum swego 

działania przy temperaturze 37˚C. W przeprowadzonym doświadczeniu najwyższy stopień 

rozkładu skrobi obserwuje się w probówce inkubowanej w 37˚C. 

3) WPŁYW AKTYWATORÓW I INHIBITORÓW NA AKTYWNOŚĆ AMYLAZY. 

Do trzech probówek dodać po 3 ml 0,5% roztworu skrobi i 1 ml buforu cytrynianowo – 

fosforanowego o pH 6,8. Do pierwszej dodać 2ml wody destylowanej, do drugiej 2 ml 

1% NaCl, do trzeciej 2 ml 0,5% roztworu CuSO4. Do wszystkich trzech probówek dodać 

następnie po 1 ml roztworu amylazy lub rozcieńczonej śliny i wymieszać. Po 5 minutach 

inkubacji w temperaturze 37ºC dodać po 3 krople roztworu jodu, wymieszać, obserwować 

zmiany zabarwienia. 

Wyjaśnienie: Wiele związków i jonów wpływa na szybkość reakcji katalizowanych przez 

enzymy. 

W przeprowadzonym doświadczeniu najwyższy stopień rozkładu skrobi obserwuje się w 

probówce drugiej, ponieważ jony chlorkowe aktywują tę reakcję. W probówce trzeciej 

skrobia nie uległa hydrolizie, ponieważ jon miedziowy jest niespecyficznym inhibitorem 

enzymów 

4) ENZYMATYCZNY ROZKŁAD SKROBI. OZNACZENIE AKTYWNOŚCI 

AMYLAZY W SUROWICY LUB W MOCZU METODĄ WOHLGEMUTHA. 

Do 10 ponumerowanych probówek dodać po 1 ml 0,9% NaCl. Do pierwszej z nich dodać 

1 ml surowicy lub moczu i po wymieszaniu przenieść 1 ml do drugiej probówki, z której 

po wymieszaniu przenieść 1 ml do następnej itd. Z ostatniej probówki odrzucić 1 ml 

płynu. Uzyskuje się w ten sposób materiał badawczy rozcieńczony w postępie 

25

geometrycznym od 1:2 do 1:1024. Do wszystkich probówek dodać po 2 ml 0,1% skrobi 

i po wymieszaniu wstawić na 30 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37˚C. Po tym 

czasie oziębić probówki w zimnej wodzie i dodać po kropli płynu Lugola. Zanotować 

numer ostatniej probówki, w której nie wystąpiło zabarwienie z jodem. 

Obliczanie jednostek Wohlgemuta 

W każdej probówce znajduje się 2 mg skrobi. Jeżeli zostanie ona rozłożona np. przez 1 ml 

surowicy 

16 – krotnie rozcieńczonej (probówka nr 4), to aktywność amylazy będzie wynosiła 32 

jednostki Wohlgemuta 

(16x2, ponieważ w próbie były 2 mg skrobi). Wartości fizjologiczne to 16 – 32 jednostek w 

surowicy. 

Doświadczenie można wykonać stosując różne rozcieńczenia surowicy, np. 1:1, 1:2 lub 1:10. 

Wyjaśnienie: Na ogół nie mierzy się bezwzględnej ilości enzymu, lecz aktywność 

enzymu. Autorzy opracowujący metody pomiaru aktywności enzymu, najczęściej w 

sposób dowolny definiowali tę aktywność. Według Wohlgemuta jednostka aktywności 

amylazy to ilość enzymu, która katalizuje rozkład 1 mg w warunkach metody. 

Komisja Enzymologiczna Międzynarodowej Unii Biochemicznej zaleca używanie 

standardowych jednostek aktywności enzymu. Do nich należy międzynarodowa jednostka 

aktywności enzymatycznej oznaczona symbolem U lub w Polsce J. Jedna jednostka U 

jest to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę jednego mikromola substratu w ciągu 

1 minuty w standardowych warunkach. W celu ujednolicenia warunków zaleca się 

stosować temperaturę 30˚C, optymalną siłę jonową i optymalne pH. 

26

ROZDZIAŁ V 

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH 


Kinetyka reakcji chemicznych zajmuje się badaniem szybkości przebiegu reakcji w 

zależności od różnych czynników (stężenia reagujących substancji, temperatury, obecności 

aktywatorów i inhibitorów). Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i 

matematyczne ujęcie zależności między szybkością reakcji, a czasem jej trwania. Poznanie 

tych zależności pozwala na określenie szybkości, z jaką będzie przebiegać reakcja w 

dowolnie obranym czasie i dowolnym stężeniu substratu. Szybkość reakcji chemicznej jest w 

każdej chwili proporcjonalna do stężenia substancji reagujących i oznacza stosunek przyrostu 

stężenia produktu (lub ubytku stężenia substratu) do czasu, w którym przyrost (ubytek) 

nastąpił. 

∆ c 

V = 

t 

V – szybkość reakcji, 

t – czas reakcji, 

∆ c – zmiana stężenia 

Schematycznie przebieg reakcji enzymatycznej można przedstawić: 

S + E [ES] E + P 

S – substrat, 

E – enzym, 

[ES] – kompleks enzym – substrat, 

P – produkt 

Dla zainicjowania reakcji chemicznej niezbędne jest doprowadzenie do układu pewnej ilości 

energii. Aby mogło dojść do skutecznych zderzeń między cząsteczkami reagującymi musi 

nastąpić ich przestrzenne uporządkowanie oraz zwiększenie ich energii kinetycznej. 

Konieczna dla tych celów energia została nazwana energią aktywacji. 

W zależności od wielkości energii aktywacji, szybkość reakcji chemicznych zmienia się wraz 

ze zmianą temperatury. 

Zależność szybkości reakcji od temperatury podaje równanie Arrheniusa: 

k2 Ea T2 - T1 

2,303 log = • 

k1 R T1 • T2 

gdzie: k1 i k2 – stałe szybkości w temperaturze T1 i T2, Ea – energia aktywacji w J/mol, 

R – stała gazowa 

8,319 J 

, T1 i T2 – temperatury pomiarów w skali Kelwina. 

mol • K 

2,303 log (k2 / k1) • R • T1 • T2 

Ea = 

T2 - T1 

27

W reakcjach enzymatycznych szybkości Vmax wyznaczone przy dużym nadmiarze substratu 

są wprost proporcjonalne do stałych szybkości, można zatem wartości k1 i k2 zastąpić 

wartościami V1 max i V2 max wyznaczonymi dla dwóch temperatur. 

WPŁYW STĘŻENIA SUBSTRATU NA SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ 

W żywej komórce w ujęciu kinetycznym zachodzą reakcje pierwszego, drugiego lub 

wyższego rzędu. Rząd reakcji zależy od rodzaju substancji biorących udział w reakcji 

enzymatycznej. Jeżeli w reakcji uczestniczy jeden substrat, to zachodzi reakcja pierwszego 

rzędu, której szybkość zależy od zmiany stężenia substratu. Natomiast w reakcji 

enzymatycznej, w której bierze udział więcej substratów, reakcje mają charakter wyższego 

rzędu, a ich szybkość zmienia się w zależności od stężenia wszystkich substancji reagujących. 

Ponadto znane są reakcje zerowego rzędu charakteryzujące się tym, że szybkość reakcji jest 

niezależna od stężenia substratu. Zjawisko to występuje w przypadku, gdy stężenie substratu 

[S] jest tak duże, że prowadzi do całkowitego wysycenia enzymu (E), a utworzony kompleks 

enzym – substrat [ES] jest dopiero właściwym substratem reakcji. W tych warunkach 

szybkość reakcji jest wartością maksymalną, zależną tylko od stężenia enzymu i jest 

proporcjonalna do niego. Gdy enzym jest w połowie wysycony substratem, to szybkość 

reakcji równa się połowie szybkości maksymalnej. Stężenie substratu potrzebne do 

osiągnięcia tego momentu reakcji enzymatycznej zostało nazwane stałą Michaelisa (Km). 

Stała Michaelisa określa powinowactwo enzymu do substratu. Enzymy posiadające 

niewielkie powinowactwo do danego substratu, będą posiadały wysoką wartość stałej 

Michaelisa, to znaczy, że potrzebne jest duże stężenie substratu dla osiągnięcia połowicznego 

wysycenia enzymu. Odwrotnie niska wartość stałej Michaelisa świadczy o dużym 

powinowactwie enzymu w stosunku do substratu. Wartości stałej Michaelisa oznaczone dla 

wielu enzymów wynoszą: od 10 ־¹ do 10 ־8 M / l. 

Równaniem opisującym zależność szybkości reakcji V od stężenia substratu [S] jest równanie 

Michaelisa – Menten. 

Vmax 

V = 

Km 

+ 1 

[S] 

gdzie V – szybkość reakcji, Vmax – szybkość maksymalna, Km – stała Michaelisa, 

[S] – stężenie substratu 

Graficznie przyjmuje ono postać hiperboli. 

Vmax 

Vmax 

2 

Km=[S]0,5 [S] 

Graficzne przedstawienie równania Michaelisa – Menten 

28

Sporządzając wykres zależności szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu 

możemy wyznaczyć Km. Podana metoda graficzna jest jednak niezbyt dokładna, nie daje 

bowiem pewności, czy została osiągnięta szybkość maksymalna reakcji Vmax. O wiele 

dogodniejszym sposobem wyznaczania wartości Km jest wykorzystanie równania 

Lineweavera – Burka, które jest przekształceniem (odwrotnością) równania Michaelisa – 

Menten. 

1 Km 1 1 

= • + 

V Vmax [S] Vmax 

Wykresem tego równania jest linia prosta. 

1/V 

1/Vmax 

- 1/Km 1/[S] 

Graficzne przedstawienie równania Lineweavera – Burka 

1 1 

Z wykresu z łatwością można odczytać wartość i i wyliczyć wartość 

Km Vmax 

stałej Michaelisa. 

Do obliczeń są szczególnie przydatne również przekształcenia równania Michaelisa – Menten 

przedstawione w formie: 

Vmax Km Vo [S] 

= + 1 lub = 

Vo [S] Vmax Km + [S] 

Znając wyznaczoną doświadczalnie Vo dla reakcji przy różnych stężeniach substratu, można 

korzystając z tych wzorów wyliczyć Km oraz szybkość maksymalną Vmax. 

Pomiary stałej Michaelisa dokonywane przy użyciu różnych substratów pozwalają 

wnioskować o sposobie wiązania enzymu z substratem, a zastosowanie do badań 

kinetycznych różnych aktywatorów i inhibitorów pozwala na wyciągnięcie wniosków 

dotyczących budowy centrum katalitycznego enzymu. 

29

Wiele enzymów nie wykazuje klasycznej kinetyki Michaelisa – Menten, charakteryzującej się 

wykresem hiperbolicznym. Wykres zależności szybkości reakcji V od stężenia substratu [S] 

przybiera kształt sigmoidalny z powodu występowania kooperatywności wiązania cząsteczek 

substratu. Taki typ kinetyki cechuje enzymy allosteryczne. 

W ćwiczeniu kinetykę reakcji enzymatycznej oraz wyznaczanie Km poznamy na 

przykładzie inwertazy. Inwertaza jest enzymem szeroko rozpowszechnionym w świecie 

zwierzęcym i roślinnym. Należy do hydrolaz rozszczepiających wiązanie β – glikozydowe 

sacharozy, rozkładając ten dwucukier na dwie cząsteczki heksoz: glukozę i fruktozę. 

Powstające podczas hydrolizy cukry o charakterze redukującym można oznaczyć ilościowo. 

Glukoza i fruktoza redukują sól miedziową w środowisku alkalicznym, a powstające jony 

miedziawe redukują fosforomolibdenian do błękitu fosforomolibdenowego. Natężenie barwy 

roztworu błękitu fosforomolibdenowego, proporcjonalne do ilości cukrów redukujących 

odczytujemy przez pomiar absorbancji przy 590 nm. 


1. Poznanie kinetyki reakcji enzymatycznej i roli enzymów w procesach metabolicznych. 

2. Wyznaczanie energii aktywacji dla reakcji enzymatycznej katalizowanej przez inwertazę. 

3. Oznaczanie stałej Michaelisa dla inwertazy. 

WYKONANIE: 

1) WYZNACZANIE ENERGII AKTYWACJI REAKCJI ENZYMATYCZNEJ. 

W doświadczeniu tym wyznacza się energię aktywacji dla reakcji hydrolitycznego 

rozkładu sacharozy katalizowanej przez inwertazę. 

• Przygotować 5 probówek zawierających po 2 ml odczynnika miedziowego, 1,5 ml 

wody destylowanej i 

0,1 ml 0,1 n Na OH. 

• Przygotowanie prób inkubacyjnych: Do 2 probówek dodać po 2 ml 0,1 M 

roztworu sacharozy. 

Jedną probówkę pozostawić w temperaturze pokojowej, drugą umieścić w temperaturze 

37 ˚C. 

Do obydwu probówek dodać po 2 ml roztworu inwertazy. Przed dodaniem inwertazy do 

probówki inkubowanej w 37 ˚C należy również i enzym ogrzać wstępnie do tej samej 

temperatury. Próbki dobrze wymieszać i po upływie 2,5 oraz 5 minut pobrać kolejno po 

0,4 ml mieszaniny i przenieść do probówki z odczynnikiem miedziowym. Do piątej 

probówki dodać 0,2 ml sacharozy i 0,2 ml wody destylowanej. Probówka ta stanowi próbę 

kontrolną. Przez przeniesienie próbek inkubacyjnych do odczynnika miedziowego 

następuje zahamowanie reakcji enzymatycznej. 

• Ilościowe oznaczenie produktów hydrolizy sacharozy. Wszystkie probówki z 

odczynnikiem 

miedziowym i dodanymi składnikami reakcji enzymatycznej umieścić we wrzącej łaźni 

wodnej na okres 8 minut. W tym czasie zachodzi proces redukcji soli miedziowej pod 

wpływem uwolnionych z sacharozy monosacharydów. Po ostudzeniu próbek dodać do 

każdej po 2 ml odczynnika fosforomolibdenowego, dokładnie wymieszać i pobrać po 0,5 

ml roztworu, i przenieść do probówek zawierających po 9,5 ml wody destylowanej. 

Wymieszać i oznaczyć natężenie barwy kolorymetrycznie przy 590 nm. Z krzywej 

kalibracyjnej odczytać stężenie produktu w mg. 

30

• Uzyskane wyniki wykorzystać do sporządzenia wykresu zależności między ilością 

uwolnionego 

produktu (oś rzędnych) od czasu w minutach (oś odciętych). 

Szybkość reakcji enzymatycznej w dwu różnych temperaturach przedstawić graficznie 

jako tangensy kątów utworzonych przez styczne do pierwszych odcinków krzywych i 

podać je w mg produktów reakcji na minutę. Uzyskane wartości szybkości maksymalnych 

podstawić do wzoru na energię aktywacji w miejsce stałych k1 i k2, a temperaturę podać w 

stopniach Kelvina. Obliczyć wyniki korzystając z kalkulatora lub tablic logarytmicznych. 

2) OZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA DLA INWERTAZY. 

Oznaczenie wpływu stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej przeprowadzić na 

czterech roztworach sacharozy o stężeniu: 0,02 M, 0,04 M, 0,08 M i 0,16 M. Roztwory 

sacharozy sporządzono w buforze octanowym o pH = 4,7. Przed przeprowadzeniem 

właściwej inkubacji przygotować dla każdego stężenia sacharozy zestaw pięciu probówek 

zawierających po: 2 ml odczynnika miedziowego, 1,5 ml wody destylowanej i 0,1 ml 0,1 n 

NaOH. Następnie przygotować próby dla poszczególnych stężeń sacharozy. W tym celu do 

jednej probówki dodać 2 ml roztworu sacharozy o odpowiednim stężeniu, a do drugiej 2 ml 

roztworu inwertazy (optymalne stężenie wcześniej ustalone). Obie probówki umieścić w 

łaźni wodnej w temperaturze 30 ˚C na 10 minut celem ustalenia temperatur. Następnie 

zapoczątkować reakcję enzymatyczną przez połączenie substratu z enzymem (czas 0), próbę 

wymieszać i pozostawić w temperaturze inkubacyjnej. Po upływie 2,5; 5; 10; 15 minut, licząc 

czas od zapoczątkowania reakcji pobierać z probówki inkubacyjnej po 0,4 ml mieszaniny i 

przenieść do wcześniej przygotowanych probówek z odczynnikiem miedziowym celem 

zahamowania reakcji. Do piątej probówki, stanowiącej próbę kontrolną należy dodać 0,2 ml 

odpowiedniego stężenia sacharozy, oraz 0,2 ml wody. Uzyskane w ten sposób próby z 

różnych czasów inkubacji wstawić następnie do wrzącej łaźni wodnej na 8 minut. Po tym 

czasie próby wyjąć, ostudzić do temperatury pokojowej, następnie do wszystkich dodać po 2 

ml odczynnika fosforomolibdenowego, dobrze wymieszać i przenieść po 0,5 ml roztworu do 

9,5 ml wody destylowanej. Próbki wymieszać i oznaczyć gęstość optyczną przy długości 590 

nm. Ilość produktów hydrolizy sacharozy odczytać z krzywej wzorcowej. Otrzymane wyniki 

wstawić do tabelki sporządzonej oddzielnie dla każdego badanego stężenia sacharozy. 

Stężenie sacharozy w M. 

Czas inkubacji 

mg glukozy 

w minutach 

2,5 

5,0 

10,0 

15,0 

Na podstawie wyników umieszczonych w tabeli sporządzić wykresy zależności między 

ilością uwolnionego produktu w mg (oś rzędnych) od czasu w minutach (oś odciętych). 

Wykresy te należy sporządzić dla każdego stężenia sacharozy. Następnie obliczyć szybkość 

początkową reakcji (Vo). W tym celu na każdym wykresie należy przeprowadzić styczną do 

31

krzywej w punkcie odpowiadającym stężeniu produktu w czasie t = 0 i wyznaczyć szybkość 

początkową reakcji tgα, pamiętając, że 

Vo = tgα = 

Otrzymane wyniki szybkości początkowej Vo zestawić w formie tabelki. 

Stężenie sacharozy 

w Molach 

0,01 

0,02 

0,04 

0,08 

c 

t 

Vo w mg produktów / 

minutę 

Uwaga: Stężenia substratu w tabelce są o połowę niższe niż stężenia sacharozy 

wyjściowe. W trakcie inicjowania reakcji enzymatycznej następuje dwukrotne rozcieńczenie 

zarówno substratu, jak i enzymu. 

Na podstawie danych z tabelki sporządzić wykres kinetyki enzymatycznej hydrolizy 

sacharozy. Na osi odciętych odkłada się wartości stężenia sacharozy w Molach / litr, a na osi 

rzędnych wartości szybkości początkowej. 

Wyjaśnienie: Wykreślona na podstawie danych eksperymentalnych krzywa ma charakter 

hiperboli. Przebieg krzywej świadczy o tym, że dla danego stężenia enzymu istnieje takie 

stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga wartość praktycznie równą szybkości 

maksymalnej reakcji. Dalsze zwiększenie stężenia substratu nie powoduje już wzrostu 

szybkości reakcji. Na sporządzonym wykresie można więc wyznaczyć szybkość maksymalną 

Vmax, oraz ½ Vmax, czyli otrzymać wartość stałej Michaelisa (Km). Stężenie substratu, przy 

którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej nazywamy stałą Michaelisa. 

32

ROZDZIAŁ VI 

UTLENIANIA BIOLOGICZNE. OKSYDOREDUKTAZY 


Utlenianie biologiczne jest ciągiem reakcji oksydacyjno- redukcyjnych i zachodzi 

w wewnętrznych błonach mitochondriów. Reakcje te katalizują enzymy z klasy 

oksydoreduktaz. Przyjmując mechanizm ich działania jako kryterium oksydoreduktazy można 

podzielić na następujące grupy: oksydazy, dehydrogenazy, hydroperoksydazy i oksygenazy. 

1. Oksydazy utleniają substraty przy udziale tlenu, przy czym akceptorem wodoru jest tlen 

atomowy (mitochondria), bądź cząsteczkowy (peroksysomy), a w wyniku reakcji 

powstaje H2O lub H2O2. 

AH2 + ½O2 → A + H2O 

Przykład: oksydaza cytochromowa 

AH2 + O2 → A + H2O2 

Tego typu oksydazy są flawoproteidami, których koenzymem jest FAD i FMN, np. oksydaza 

L-aminokwasowa, oksydaza ksantynowa. W reakcjach katalizowanych prze enzymy 

flawinowe zachodzi też utlenianie jednoelektronowe. Powstaje wówczas anionorodnik 

ponadtlenkowy, który zaliczany jest do reaktywnych form tlenu (RFT). 

FpH2 + O2 → FpH + H+ + O2- 

Ze względu na silne własności utleniające rodniki ponadtlenkowe są bardzo szkodliwe. Mogą 

być utleniane przez cytochrom c. 

cyt c (Fe 3+ ) + O2 ֿ → cyt c (Fe 2+ ) + O2 

W usuwaniu rodników ponadtlenkowych biorą też udział szeroko rozpowszechnione 

dysmutazy ponadtlenkowe (SOD) 

2. Dehydrogenazy stanowią liczną grupę enzymów. Katalizują utlenianie substratu przez 

odebranie wodorów (protonów i elektronów). Akceptorem wodorów mogą być różnego 

typu związki, przy czym inne, niż tlen, Sumarycznie reakcje można zapisać równaniem: 

AH2 + B ↔ A + BH2 

Dehydrogenazy umożliwiają również przebieg procesów utleniania w nieobecności tlenu 

oraz przenoszenie protonów, elektronów w obrębie łańcucha oddechowego. 

AH2 NAD, NADP, FAD, FMN. 

A NADH2 , NADPH2 , FADH2 ,FMNH2 . 

Różnią się rodzajem koenzymu, z którym współpracują: 

NAD – dehydrogenaza jabłczanowa 

NADP – dehydrogeza glukozo-6 fosforanu 

FAD – dehydrogenaza bursztynianowa 

liponian – dehydrogenaza pirogronianowa 

33

3. Hydroperoksydazy 

Do tej grupy zalicza się peroksydazy i katalazę. Peroksydazy katalizują reakcję utlaniania 

substratów w obecności nadtlenku wodoru według reakcji: 

2H2O2 + AH2 → 2H2O + A 

Katalaza należąca do najbardziej aktywnych enzymów powoduje rozkład nadtlenku wodoru 

zgodnie z reakcją: 

2H2O2 → 2H2O + O2 

W reakcji tej H2O2 jest zarówno substratem, jak i akceptorem elektronów. Katalaza występuje 

w wątrobie, nerce, krwinkach czerwonych i białych. 

4. Oksygenazy – katalizują reakcję wbudowania tlenu do substratuów. Dzieli się je na dwie 

podgrupy. 

A. Dioksygenazy – wbudowują obydwa atomy tlenu do substratu: 

A + O2 → AO2 

uczestniczą one w degradacji różnych zwiazków, np. oksygenaza tryptofanowa, 

dioksygenaza homogentyzynianowa 

B. Monoksygenazy (hydroksylazy) wbudowują do substratu tylko jeden z atomów tlenu, 

a drugi ulega redukcji do wody, co wymaga udziału dodatkowego donora elektronów 

lub kosubstratu. 

A + O2 + BH2 → A-OH + H2O + B 

Enzymy tej podgrupy uczestniczą w procesach hydroksylacji wielu związków, np. 

aminokwasów, sterydów (hydroksylaza cholesterolowa, hydroksylaza fenyloalaniny) a także 

uczestniczą w metabolizmie wielu ksenobiotyków (leków). W ćwiczeniu enzymy z klasy 

oksydoreduktaz poznamy na przykładzie dehydrogenazy bursztynianowej, mięśnia sercowego 

oraz oksydazy fenolowej, katalazy i peroksydazy obecnych w ekstrakcie z ziemniaka. 

Dehydrogenaza bursztynianowa jest flawoproteiną zawierającą żelazo nie związane z hemem. 

Enzym ten katalizuje odwodornienie bursztynianu do fumaranu, przy czym utlenia się za 

pośrednictwem ubichinonu i ukladu cytochromowego. Do oznaczania aktywności 

i wykrywania wielu dehydrogenaz używa się barwników np. błękitu metylenowego, 

2,6-dwuchlorofenoloindofenolu, które po przyjęciu wodorów odbarwiają się przechodząc 

w tzw. leukozwiązki. 

Oksydazy fenolowe są miedzioproteinami. Substratem dla enzymu mogą być fenole, orto- 

i para-difenole. Produktem utleniania są chinony, które kondensują do ciemno zabarwionych 

związków. 

34


1. Preparatyka i badanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej z mięśnia sercowego. 

2. Badanie aktywności oksydazy fenolowej, peroksydazy i katalazy w ekstrakcie 

z ziemniaka. 

WYKONANIE 

1) PREPARATYKA I OZNACZANIE DEHYDROGENAZY BURSZTYNIANOWEJ. 

Około 50g zmielonego mięśnia serca wołowego mieszać przez kilka minut z 400ml wody 

destylowanej, wycisnąć przez gazę i powtarzać mieszanie z wodą destylowaną kilka razy, 

aż płyn odrzucany będzie bezbarwny. Przemyty preparat zawiesić w 50ml 0,1M buforu 

fosforanowego o pH 7,4 i rozcierać w moździerzu przez kilka minut na drobną suspensję. 

Następnie dodać 20ml buforu fosforanowego, wymieszać i wirować 15 minut przy 3000 

obrotów/min. Supernatant użyć do badania aktywności dehydrogenazy bursztynianowej. 

W tym celu do 9 próbówek odmierzyć roztwory jak podano w tabeli: 

Nr próbówki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 

Bufor 

fosforanowy, pH 

7,4 

Bursztynian 0,01 

M 

2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 

- 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 

DCFIF 110 mg/l 1,0 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 

KCN 0,02 M 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - 0,2 0,2 0,2 

Malonian sodu 

0,01 M 

- - - - - - 1,0 - - 

HgCl2 - - - - - - - 0,4 0,4 

Woda 

destylowana 

Ekstrakt 

zawierający 

enzym 

5,0 4,0 3,0 3,8 4,2 4,2 3,0 3,6 2,6 

0,2 0,2 0,2 0,4 - 0,2 0,2 0,2 0,2 

Uwaga: objętości roztworów w tabeli podano w ml 

Ekstrakt zawierający enzym dodać na końcu. Po wymieszaniu prób inkubować je 

w temperaturze pokojowej i obserwować szybkość odbarwiania się dwuchlorofenoloindofenolu 

w poszczególnych probówkach. 

35

Wyjaśnienie: 

Ekstrakt z mięśnia serca wołu zawiera składniki łańcucha oddechowego, w tym także 

enzym mitochondrialny dehydrogenazę bursztynianową (EC.1.3.99.1). Wykrywanie 

aktywności dehydrogenazy bursztynianowej polega na redukcji niebieskiego barwnika 

2,6-dwuchlorofenoloindofenolu (DCFIF), który, przyjmując atomy wodoru, odbarwia się. 

Barwnik ten jest sztucznym akceptorem atomów wodoru, odszczepianych od 

bursztynianu. Naturalnym akceptorem atomów wodoru jest tlen. Jego obecność opóźnia 

odbarwianie się DCFIF. W celu wykluczenia wpływu tlenu, do probówek dodano KCN, 

który jest inhibitorem oksydazy cytochromowej. Zablokowanie oksydazy cytochromowej 

skierowuje strumień elektronów i protonów łańcucha oddechowego na sztuczne 

akceptory w tym doświadczeniu na DCFIF. 

CH2COOH utl. zred. utl. 

| FAD UQH2 cyt. c1b cyt. c cyt.aa O -- 

CH2COOH 

H-C-COOH cyt. c1b cyt. c cyt. aa 

|| FADH2 UQ zred. utl. zred. ½ O2 

HOOC-C-H 

2e 

Malonian 2H + + DCFIF DCFIFH2 

Cl 

HgCl2 

HO N O 

HO 

N OH 

Cl 

2,6 dwuchlorofenoloindofenol forma zredukowana 

forma utleniona (niebieski) (bezbarwny) 

Obserwowana szybkość odbarwiania poszczególnych prób potwierdza wnioski, jakie 

wynikają z rozpatrywania ich składu. Najszybciej nastąpi odbarwienie w próbie 4., 

ponieważ zawiera ona dwa razy większe stężenie enzymu, niż próby pozostałe, kolejno 

odbarwiać się będzie próba 2. Próba 3. odbarwi się jeszcze później, ponieważ zawiera 

dwa razy większe stężenie dwuchlorofenoloindofenolu. Próby 1 i 5 nie odbarwią się, 

ponieważ pierwsza nie zawiera bursztynianu (źródła elektronów i protonów), a piąta – 

enzymu. Próba 6. po długim czasie może się częściowo odbarwić z uwagi na 

wyczerpanie się tlenu w roztworze. Próba 7. zawiera inhibitor dehydrogenazy 

bursztynianowej, kwas malonowy, który będzie hamować działanie tego enzymu i próba 

nie będzie się odbarwiają wcale, bądź słabo po długim czasie. Próba 8. i 9. zawierająca 

niespecyficzny inhibitor HgCl2 nie odbarwi się nawet przy większym stężeniu substratu 

utlenianego (9). 

Cl 

Cl 

H 

KCN 

36

2) BADANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY FENOLOWEJ, PEROKSYDAZY 

I KATALAZY W EKSTRAKCIE Z ZIEMNIAKA. 

a) Otrzymanie ekstraktu z ziemniaka: 

Zetrzeć dwa ziemniaki na tarce. Miazgę zawiesić z 50 ml wody destylowanej 

i wycisnąć przez gazę. Wyciąg wodny przenieść do cylindra, a po opadnięciu skrobi 

płyn zdekantować i użyć do dalszych prób. 

b) Wykrywanie oksydazy fenolowej. 

Do badania aktywności oksydazy fenolowej przygotować próby, jak podano w tabeli: 

nr probówki 1 2 3 

wyciąg z ziemniaka (ml) 1 1+ 1 

woda destylowana (ml) 5 4 4 

fenol 0,3 % (ml) - 1 1 

objętość końcowa (ml) 6 6 6 

+ - wyciąg z ziemniaka przegotować przed dodaniem dalszych roztworów 

Próby inkubować w 37°C przez godzinę mieszając od czasu do czasu. Obserwować 

zmianę zabarwienia. 

Wyjaśnienie: 

Oksydaza fenolowa (oksydoreduktaza o-difenol: tlen EC.1.10.3.1) działa na o-difenole i 

monofenole w myśl reakcji: 

OH 

OH 

Reakcja katalizowana przez oksydazę fenolową 

O 

+ 1/2 O 2 + H 2 O 

W próbówce 1. i 3. podczas inkubacji dochodzi do utleniania fenolu przy udziale 

oksydazy fenolowej. Powstały ortochinon ulega dalszym przemianom do ciemno 

zabarwionej melaniny. Konieczność wykonania prób kontrolnych wynika z faktu, że w 

wyciągu ziemniaczanym obecne są endogenne fenole oraz możliwa jest niespecyficzna 

przemiana fenolu podczas dość długiej inkubacji. 

O 

37

c) Wykrywanie peroksydazy próbą indofenolową: 

Przygotować trzy próbówki, zawierające roztwory, jak podano w tabeli: 

nr probówki 1 2 3 

wyciąg z ziemniaka (ml) 1 1+ - 

woda destylowana (ml) - - 1 

α-naftol 5% 1 kropla 1 kropla 1 kropla 

p-fenylenodwuamina 1 kropla 1 kropla 1 kropla 

H2O2 3% kilka kropli kilka kropli kilka kropli 

+ - wyciąg z ziemniaka przegotować przed dodaniem dalszych roztworów 

Wyjaśnienie: 

Po wymieszaniu obserwować zmianę zabarwienia. 

Peroksydaza (oksydoreduktaza donor: nadtlenek wodoru EC.1.11.1.7) jest hemoproteiną 

i katalizuje utlenianie substratów przy udziale nadtlenku wodoru. W próbie 1. pod wpływem 

peroksydazy zachodzi utlenianie α-naftolu i sprzęganie z p-fenylenodwuaminą, w wyniku 

czego powstaje błękit indofenolowy. Zachodzi reakcja: 

NH 2 

NH 2 

OH 

+ + 2H 2 O 2 + 4H 2 O 

O 

N 

NH 2 

Błękit indolofenolowy 

Powstawanie błękitu indofenolowego w próbie na peroksydazę. 

Kontrolne próby 2,3 wykonuje się ze względu na zabarwienie p-fenylenodwuaminy oraz 

niespecyficzna jej reakcję z α-naftolem w obecności H2O2 przebiegającą znacznie wolniej niż 

ma to miejsce w obecności enzymu. 

38

d) Próba na katalazę: 

Wyjaśnienie: 

Do dwóch probówek odmierzyć po 1 ml ekstraktu z ziemniaka. W jednej probówce 

enzym zinaktywować, wstawiając na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej, po czym do 

obydwu probówek dodać po 1 ml wody utlenionej. Obserwować wynik reakcji. 

Katalaza (oksydoreduktaza nadtlenek wodoru: nadtlenek wodoru, EC.1.11.1.6) 

katalizuje rozkład H2O2 w myśl reakcji: 

2 H2O2 → 2 H2O + O2 

W czasie reakcji pojawia się gazowy tlen w postaci pęcherzyków. 

39

ROZDZIAŁ VII 

OGÓLNE WŁAŚCIWOŚCI I IDENTYFIKACJA CUKRÓW 

Autor: dr Ewa Nowosadzka-Gromaszek 

Węglowodany( cukrowce, sacharydy) ze względu na budowę dzielimy na: 

• monosacharydy (jednocukry) czyli cukry proste 

• oligosacharydy (kilkucukry) złożone z 2-10 cząsteczek monosacharydów 

• polisacharydy (wielocukry) związki wielkocząsteczkowe złożone z wielu cząsteczek 

monosacharydów 

Monosacharydy są związkami organicznymi, których właściwości chemiczne i biologiczne 

uwarunkowane są obecnością grupy aldehydowej /lub ketonowej, ułożeniem przestrzennym 

grup hydroksylowych oraz liczbą atomów węgla w cząsteczce. Ze względu na liczbę atomów 

węgla w cząsteczce wyróżnia się: triozy (3 C), tetrozy (4 C), pentozy (5 C), heksozy (6 C) 

i heptozy (7 C). Monosacharydy posiadające grupę aldehydową nazywa się aldozami (np. 

glukoza, galaktoza), zaś te które posiadają grupę ketonową- ketozami (np. fruktoza). 

Tetrozy i większe cukry mogą ulegać cyklizacji dzięki reakcji grupy aldehydowej / lub 

ketonowej z grupą hydroksylową przy innym atomie węgla tego cukru. Tworzą się wówczas 

formy pierścieniowe cukrów, które są pochodnymi piranu z pierścieniem sześcioczłonowym 

(tzw. piranozy) lub furanu z pierścieniem pięcioczłonowym (tzw. furanozy). W wyniku 

powstania pierścienia powstaje w cukrach prostych dodatkowy asymetryczny węgiel tzw. 

anomeryczny. Konsekwencją tego są dalsze odmiany cukrów α i β, które 

w roztworach wodnych ulegają wzajemnym przekształceniom.. Triozy i tetrozy występują 

wyłącznie w formie otwartej, pozostałe cukry mają cząsteczkę ukształtowaną w zamknięty 

pierścień heterocykliczny. W środowisku zasadowym formy pierścieniowe łatwo przechodzą 

w formy łańcuchowe. 

Monosacharydy mogą łączyć się ze sobą poprzez grupy wodorotlenowe z wydzieleniem 

cząsteczki wody. Z cukrów prostych powstają wówczas cukry złożone, a utworzone w ten 

sposób wiązania noszą nazwę glikozydowych. Określając rodzaj wiązania podaje się formę 

anomeryczną α lub β oraz numery węgli między którymi wiązanie powstało. 

Spośród wielu węglowodanów występujących w przyrodzie przedmiotem ćwiczeń będą tylko 

nieliczne ale najbardziej powszechne mono-, di- oraz polisacharydy takie jak: glukoza, 

galaktoza, fruktoza, arabinoza, laktoza, maltoza, sacharoza i skrobia. 

Identyfikacja cukrów opiera się na przeprowadzeniu reakcji barwnych i redukcyjnych. 

Ogólnie reakcje barwne wykorzystują fakt iż mocne kwasy (H2SO4, HCl) powodują 

odwodnienie cukrów do pochodnych furfuralowych (pentoz do furfuralu, ketoz do 

hydroksymetylofurfuralu). Związki te w obecności fenoli (np. α- naftolu, rezorcyny, orcyny) 

tworzą barwne połączenia. Reakcje barwne dają nie tylko monosacharydy , ale również oligo- 

i polisacharydy, które pod wpływem kwasu ulegają uprzedniej hydrolizie do cukrów prostych. 

Na zasadzie reakcji barwnych cukrów uwarunkowanych działaniem stężonych kwasów 

oparte są próby Molischa, Seliwanowa i Biala. 

Próby redukcyjne cukrów stanowią podstawę najczęściej stosowanych jakościowych 

i ilościowych metod ich oznaczania. Wszystkie cukry proste wykazują w środowisku 

alkalicznym właściwości redukujące co jest związane z obecnością w otwartej konfiguracji 

łańcuchowej cukru wolnej grupy aldehydowej (aldozy) lub ketonowej ( ketozy). Właściwości 

redukujące dwucukrów są uwarunkowane typem wiązania glikozydowego. Zazwyczaj 

w wiązanie jest włączony anomeryczny atom węgla tylko jednego z monosacharydów. Taki 

disacharyd ma wówczas jeszcze jedna wolną grupę aldehydową lub ketonową 

o właściwościach redukujących 

40

(np. laktoza, maltoza). Natomiast gdy oba anomeryczne atomy węgla tworzą wspólne 

wiązanie, taki disacharyd jest cukrem nieredukującym (np. sacharoza) i dopiero po kwaśnej 

hydrolizie powodującej rozbicie wiązania glikozydowego pojawią się właściwości redukcyjne 

poszczególnych składników cukrowych. 

Istotą prób redukcyjnych jest utlenienie cukru przez związek który sam ulega wówczas 

redukcji. Zasada ta została wykorzystana w reakcji cukrów z odczynnikami Fehlinga, 

Benedicta i Nylandera, gdzie odbywa się redukcja Cu 2+ do Cu + , lub Bi 3+ do metalicznego 

bizmutu. 

CEL ĆWICZENIA: 

1) Poznanie niektórych właściwości cukrów ułatwiających ich różnicowanie: 

- działanie kwasów na cukry, odczyny barwne 

- reakcje w środowisku zasadowym, właściwości redukujące cukrów 

2) Stopniowa hydroliza skrobi w obecności rozcieńczonych kwasów. Sprawdzenie postępu 

hydrolizy przez przeprowadzenie próby jodowej i redukcyjnej. 

WYKONANIE: 

I. REAKCJE BARWNE I PRÓBY REDUKCYJNE NA CUKRY 

1) Próba Molischa - ogólna reakcja na cukry 

Do 1 ml roztworu badanego cukru dodać kilka kropli odczynnika Molischa, wymieszać. 

Następnie próbę podwarstwić ok. 1 ml stężonego kwasu siarkowego wlewając go ostrożnie po 

ściance probówki. Na granicy obu cieczy pojawi się fioletowy pierścień. 

Wyjaśnienie: 

Próba Molischa jest ogólną niespecyficzną reakcją wykrywającą obecność każdego cukru 

w roztworze. Dodatni wynik reakcji mogą dawać także niektóre związki 

niewęglowodanowe jak np. aldehydy, aceton czy kwasy organiczne. Składnikiem 

odczynnika Molischa jest α- naftol. Powstałe pod wpływem stężonego kwasu siarkowego 

pochodne furfuralowe cukrów dają z α- naftolem fioletowo zabarwione połączenia. 

2) Próba Fehlinga – reakcja redukcyjna 

W probówce zmieszać 1 ml odczynnika Fehlinga I z 1 ml odczynnika Fehlinga II. Następnie 

dodać kilka kropli roztworu badanego cukru i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej, aż do 

pojawienia się ceglastego osadu co świadczy o obecności cukru o właściwościach 

redukujących. 

Wyjaśnienie: 

Przez zmieszanie obu odczynników- Fehlinga I (siarczan miedzi) i Fehlinga II (alkaliczny 

roztwór siarczanu sodowo- potasowego) wytwarza się wodorotlenek miedziowy. Obecność 

cukru redukującego powoduje redukcję dwuwartościowej miedzi wodorotlenku 

miedziowego do jednowartościowej miedzi tlenku miedziawego. Cukier utlenia się do 

kwasu onowego. 

3) Próba Benedicta – reakcja redukcyjna 

Do 5 ml odczynnika Benedicta dodać 0,5 ml roztworu badanego cukru, wymieszać. Ogrzewać 

ok. 5 min. we wrzącej łaźni wodnej do momentu pojawienia się osadu tlenku miedziawego 

świadczącego o obecności cukru o właściwościach redukujących. 

41

Wyjaśnienie: 

Odczynnik Benedicta zawiera węglan miedziowy w cytrynianie sodu. W tej reakcji cukier 

o właściwościach redukujących redukuje dwuwartościową miedż do jednowartościowej 

tlenku miedziawego. Cukier utlenia się do kwasu onowego. Próba Benedicta jest 

najbardziej swoista i czuła ze wszystkich prób redukcyjnych na cukry. 

4) Próba Nylandera – reakcja redukcyjna 

Do 4 ml roztworu badanego cukru dodać 1 ml odczynnika Nylandera, wymieszać i ogrzewać 

kilka minut we wrzącej łażni wodnej. W trakcie ogrzewania płyn żółknie, ciemnieje aż w 

końcu wytrąca się czarny osad metalicznego bizmutu. 

Wyjaśnienie: 

Odczynnik Nylandera zawiera zasadowy azotan bizmutu. W obecności cukru redukującego 

trójwartościowy bizmut ulega redukcji do bizmutu metalicznego, który wytrąca się w 

postaci czarnego osadu. 

5) Próba Barfoeda – reakcja redukcyjna / odróżnienie jednocukrów od dwucukrów 

redukujących/ 

Do jednej probówki odpipetować 1 ml dowolnego monosacharydu, a do drugiej probówki 1 

ml roztworu dwusacharydu ( maltozy lub laktozy). Nastepnie do obu probówek dodać po 0,5 

ml odczynnika Barfoeda, wymieszać i wstawić do wrzącej łażni wodnej na ok. 3 minuty. Po 

tym czasie w probówce zawierającej monosacharyd wytrąca się ceglasty osad tlenku 

miedziawego. 

Wyjaśnienie: 

Próba Barfoeda pozwala odróżnić cukry proste od dwucukrów redukujących. Odczynnik 

Barfoeda zawiera octan miedziowy w kwasie mlekowym. Reakcję redukcji przeprowadza 

się tu w środowisku słabo kwaśnym, a w tych warunkach monosacharydy łatwo redukują 

dwuwartościowe jony miedzi do jednowartościowych w tlenku miedziawym. Dwucukry 

redukujące są w tych warunkach mniej reaktywne i dopiero po dłuższym ogrzewaniu 

(powyżej 15 minut), gdy ulegną hydrolizie do jednocukrów mogą dać dodatni wynik 

reakcji. 

6) Próba Seliwanowa – wykrywanie ketoz 

Zmieszać 0,5 ml roztworu badanego cukru (fruktozy) z 1 ml odczynnika Seliwanowa. 

Probówkę wstawić do wrzącej łażni wodnej na 30 sekund. Po tym czasie pojawia się 

łososiowo- różowe zabarwienie świadczące o obecności cukru o charakterze ketozy. 

Wyjaśnienie: 

Odczynnik Seliwanowa jest roztworem rezorcyny w kwasie solnym. Pod wpływem 

stężonego kwasu z ketoz szczególnie łatwo powstaje hydroksymetylofurfural, który 

reagując z rezorcyną tworzy pochodne o łososiowo- różowym zabarwienu. Reakcja 

Seliwanowa służy do odróżnienia ketoz (np. fruktozy) od aldoz (np. glukozy). 

Sacharoza dzięki temu że zawiera w swojej cząsteczce fruktozę daje dodatni odczyn 

Seliwanowa lecz po czasie nieco dłuższym niż 30 sekund. 

42

7) Próba Biala – wykrywanie pentoz 

Zmieszać 1 ml roztworu badanego cukru (arabinozy) z 1 ml odczynnika Biala, a następnie 

probówkę wstawić do wrzącej łażni wodnej na ok. 10 minut. Po tym czasie pojawia się 

zielononiebieskie zabarwienie świadczące o obecności cukru o charakterze pentozy. 

Wyjaśnienie: 

Odczynnik Biala jest roztworem orcyny w kwasie solnym z dodatkiem FeCl3. W wysokiej 

temperaturze pod wpływem stężonego kwasu solnego i w obecności FeCl3 pentozy 

przekształcają się w furfurale które kondensując z orcyną dają produkty o barwie 

zielononiebieskiej. 

8) Próba jodowa – wykrywanie skrobi 

W probówce zmieszać 1 ml roztworu skrobi z 1 kroplą odczynnika Lugola. Po wymieszaniu 

pojawia się ciemnoniebieskie zabarwienie. 

Wyjaśnienie: 

Odczynnik Lugola zawiera jod w roztworze jodku potasu. Skrobia tworzy z jodem 

kompleksy 

o charakterystycznej ciemnoniebieskiej barwie powstałej na skutek wbudowywania się 

cząsteczek jodu w spiralne łańcuchy amylazy. 

Właściwości wybranych na ćwiczeniach cukrów zebrać w tabeli: 

Próba: 

Cukier Molischa Fehlinga Benedicta Nylandera Barfoeda Seliwanowa Biala Lugola 

_______________________________________________________________________________________ 

glukoza 

fruktoza 

arabinoza 

maltoza 

laktoza 

sacharoza 

skrobia 

Posługując się poznanymi w ćwiczeniu właściwościami cukrów można zidentyfikować 

nieznany cukier postępując według przedstawionego schematu (dotyczy cukrów wybranych 

do ćwiczeń): 

43

eakcja Molischa 

_______________│__________ 

↓ ↓ 

( - ) (+ ) 

brak cukru obecny cukier 

↓ 

reakcja redukcyjna / Fehlinga, Benedicta lub Nylandera / 

_____________________________ |_________________ 

↓ ↓ 

( - ) (+ ) 

cukier nieredukujący cukier redukujący 

↓ ↓ 

reakcja z jodem reakcja Barfoeda 

_____|__________ ___________|______________ 

↓ ↓ ↓ ↓ 

( + ) ( - ) ( - ) ( + ) 

skrobia dwucukier nieredukujacy dwucukier redukujący jednocukier : 

(sacharoza) (maltoza lub laktoza) - glukoza 

r. Seliwanowa (+) - fruktoza 

r. Seliwanowa (+) 

- arabinoza 

r. Biala (+) 

II. STOPNIOWA HYDROLIZA SKROBI I WYKRYWANIE PRODUKTÓW 

JEJ DEGRADACJI. 

Przygotować dwa zestawy po 7 probówek w każdym. W pierwszym zestawie do każdej 

probówki dodać po2 krople odczynnika Lugola, a w drugim zestawie po 0,5 ml 1 N NaOH. 

Przygotować kolbkę stożkową do której odmierzyć 30 ml 1% kleiku skrobiowego i 10 ml 2 N 

H2SO4, wymieszać. Przed wykonaniem hydrolizy przenieść po 1 ml mieszaniny do 

pierwszych probówek w obu zestawach. Następnie kolbkę z mieszaniną umieścić nad 

palnikiem na siatce azbestowej, ogrzać i utrzymywać w stanie łagodnego wrzenia w celu 

przeprowadzenia hydrolizy skrobi. Od momentu wrzenia, co 2 minuty pobierać ostrożnie! 

2 ml gorącej mieszaniny i rozlewać po 1 ml do kolejnych probówek obu zestawów. 

Po zakończonej hydrolizie do probówek w drugim zestawie dodać po 1 ml odczynnika 

Benedicta i ogrzewać próby we wrzącej łaźni wodnej ok. 5 min. 

Porównać w obu zestawach reakcje otrzymane w probówkach poddanych hydrolizie przez 

różny okres czasu. 

Wyjaśnienie: 

W obecności rozcieńczonych kwasów hydroliza skrobi przebiega znacznie wolniej, 

stopniowo, z utworzeniem produktów pośrednich: dekstryn, maltozy i glukozy. 

Charakterystyczną właściwością skrobi jest jej ciemno niebieska reakcja z jodem. W miarę 

postępu hydrolizy barwa próby jodowej przechodzi w fiołkowo niebieską (amylodekstryny), 

brunatno czerwoną (erytrodekstryny), jasnożółtą. a więc aż do zaniku reakcji z jodem 

/zużycie substratu/. Achrodekstryny, maltoza i glukoza nie dają barwnych reakcji z jodem. 

Równolegle w miarę postępującej hydrolizy reakcje na obecność cukrów redukujących 

wychodzą dodatnio /przyrost zawartości produktów/. 

44

ROZDZIAŁ VIII 

CUKRY ZŁOŻONE, GLIKOPROTEINY – 

BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI 


Polisacharydy (wielocukry, cukry złożone) są wielkocząsteczkowymi polimerami cukrów 

prostych występującymi obficie zarówno u roślin jak i w organizmach zwierzęcych. Polimery, 

liniowe lub rozgałęzione mogą składać się z jednego rodzaju cukru prostego (homoglikany) 

lub też z różnych cukrów prostych i ich pochodnych (heteroglikany) powiązanych wiązaniem 

glikozydowym. Związki te pełnią rolę strukturalną lub są formą magazynowania energii. W 

wielu strukturach komórkowych węglowodany występują jako fragmenty cukrowe o różnej 

budowie i wielkości, często w połączeniu z białkami (glikoproteiny) lub lipidami 

(glikolipidy). 

Głównymi polimerami zbudowanymi tylko z glukozy są glikogen u zwierząt i skrobia 

występująca u roślin. Glikogen jest analogiem skrobi (o budowie podobnej do amylopektyny) 

ale o większym rozgałęzieniu i krótszych łańcuchach bocznych. Reszty glukozy połączone są 

w glikogenie wiązaniami α-1,4, co 8-10 reszt występują wiązania α-1,6 glikozydowe dzięki 

którym tworzą się rozgałęzienia. Glikogen jest formą zapasową glukozy, zmagazynowaną 

jako ważna rezerwa energetyczna głównie w wątrobie i mięśniach, a jego zawartość w tych 

narządach zależy od diety i stanu fizjologicznego organizmu. Zadanie glikogenu mięśniowego 

polega na dostarczeniu energii podczas skurczu. Natomiast glikogen wątrobowy służy do 

utrzymania stałego stężenia glukozy we krwi co jest jednym z najważniejszych mechanizmów 

homeostatycznych organizmu. Rozkład glikogenu przeprowadza należąca do transferaz 

fosforylaza glikogenowa przy współudziale enzymu usuwającego rozgałęzienia. Enzym 

występuje w dwóch wzajemnie przekształcających się formach, jako aktywna fosforylaza 

a i zwykle nieaktywna fosforylaza b. Zarówno rozkład jak i synteza glikogenu kontrolowane 

są przez regulację hormonalną jak i allosteryczną. Cukry nie są wyłącznie źródłem i paliwem 

energetycznym organizmu. Reszty oligo- i polisacharydów wchodzące w skład 

proteoglikanów i glikoprotein stanowią min. elementy strukturalne tkanek, mają istotny udział 

w budowie i funkcji błon komórkowych. 

Ważnym składnikiem oligosacharydów występujących w glikoproteinach i glikolipidach są 

kwasy sjalowe. Zwykle znajdują się one na nieredukuiącym końcu oligosacharydów, są 

nośnikami ładunków ujemnych i nadają kwaśny charakter wszystkim oligosacharydom w 

których wystepują. Kwasy sjalowe są N- lub O- acetylowymi pochodnymi kwasu 

neuraminowego. Obecność ich nadaje związkom biologicznym określone właściwości 

chemiczne, immunologiczne i fizjologiczne. Kwas sjalowy występuje powszechnie w 

tkankach i płynach ustrojowych min. w surowicy krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym, ślinie, 

soku żołądkowym, mleku kobiecym ponadto w tkance nerwowej, naczyniowej, wątrobie, 

mięśniach, nerce. W trakcie rozwoju różnych procesów chorobowych obserwuje się zmiany 

w zawartości kwasu sjalowego w glikoproteinach i innych makrocząsteczkach, co stało się 

podstawą wielu badań klinicznych. 


1) Izolowanie glikogenu z wątroby i przeprowadzenie kwaśnej hydrolizy. 

2) Badanie aktywności fosforylazy z wyciągu ziemniaka – fosforoliza skrobi. 

3) Izolacja i charakterystyka mucyn ze śliny. 

4) Oznaczanie ilościowe kwasu sjalowego w surowicy krwi metodą rezorcynową 

Svennerholma. 

45

WYKONANIE: 

1) PREPARATYKA I HYDROLIZA GLIKOGENU 

Do probówki wirówkowej odmierzyć 5 ml 30% KOH, wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Do 

gorącego KOH wrzucić kawałek wątroby lub mięśnia (porcję wielkości orzecha laskowego). 

Ogrzewać ok. 15 minut mieszając od czasu do czasu bagietką szklaną aż do rozpuszczenia 

tkanki. Następnie probówkę ochłodzić i odwirować 

(3 tys. obr / 15 min). Klarowny płyn znad osadu zdekantować do kolbki stożkowej 

i zobojętnić wobec papierka wskaźnikowego dodając ok. 2 – 2,5 ml stężonego HCl ( wykonać 

pod wyciągiem !). Następnie, gdy płyn przestanie się pienić dodać 15 ml 96 % etanolu 

i delikatnie wymieszać. Wytrącony glikogen odwirować (j.w.), supernatant odrzucić a osad 

rozpuścić w 2 ml wody destylowanej i zakwasić dodając ok. 0,3-1 ml 2 N HCl. Zawartość 

podzielić na dwie probówki. 

Do jednej dodać 2-3 krople płynu Lugola, zaobserwować zabarwienie próby. 

Drugą probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 15 min. celem przeprowadzenia 

hydrolizy glikogenu. 

Wyjąć, oziębić i zobojętnić dodając ok. 1-2 ml 2 N NaOH. Wykonać reakcję z odczynnikiem 

Fehlinga, powstaje ceglasty osad tlenku miedziawego ( przy niewielkiej ilości cukru może nie 

pojawić się osad tylko roztwór przyjmie zielone zabarwienie). 

Wyjaśnienie: 

W środowisku alkalicznym, w podwyższonej temperaturze wiązania glikozydowe nie ulegają 

hydrolizie 

(w odróżnieniu od wiązań peptydowych i estrowych). Tę właściwość wykorzystuje się do 

izolowania glikogenu z tkanek. Podczas ekstrakcji w stężonym KOH białka i tłuszcze ulegają 

hydrolizie natomiast glikogen pozostaje nie rozłożony. Po odwirowaniu pozostałości 

tkankowych glikogen można wytrącić z roztworu 96 % etanolem. 

Glikogen z jodem daje charakterystyczną brunatno czerwoną barwę. Wiązania glikozydowe 

łatwo natomiast hydrolizują w roztworach kwasów. Podczas kwaśnej hydrolizy, 

w podwyższonej temperaturze glikogen ulegnie rozłożeniu do cząsteczek glukozy. Reakcja 

z odczynnikiem Fehlinga wyjdzie wówczas dodatnio. 

2) BADANIE AKTYWNOŚCI FOSFORYLAZY 

Przygotować wyciąg z ziemniaka. W tym celu zetrzeć na tarce ziemniak, miazgę zawiesić 

w 100 ml wody destylowanej, wycisnąć przez gazę. Wyciąg z ziemniaka odstawić, po 

opadnięciu skrobi zdekantować i płyn użyć do badań. 

Do zlewki odmierzyć 10 ml wyciągu ziemniaczanego zawierającego fosforylazę. Próbę 

wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 45 - 50 o C! , mieszając ogrzewać 5 minut (w tych 

warunkach inaktywuje się β- amylaza roślinna przeszkadzająca w doświadczeniu). 

Przygotować dwie probówki. 

Do jednej odmierzyć 2ml skrobi, 5 ml wyciągu z ziemniaka i 3 ml buforu fosforanowego, 

wymieszać. 

Do drugiej dodać 2 ml skrobi, 5 ml wyciągu ziemniaczanego i 3 ml wody destylowanej, 

wymieszać. 

Przed wstawieniem do inkubacji pobrać z każdej z probówek po 0,5 ml i wykonać reakcję 

z płynem Lugola w celu potwierdzenia obecności skrobi. Pozostałe próby inkubować w temp. 

37 o C przez 60 min. Po inkubacji wykonać reakcję z jodem na obecność skrobi. 

46

Wyjaśnienie: 

Fosforylaza katalizuje rozpad polisacharydów zapasowych (skrobi lub glikogenu). Enzym 

należy do glikozylotransferaz. Katalizowana reakcja zachodzi na drodze fosforolizy, gdzie 

wiązania α- 1,4 glikozydowe 

ulegają rozbiciu a reszta α- glukozy przeniesiona zostaje na ortofosforan. 

Po godzinnej inkubacji; 

• w probówce pierwszej pod działaniem fosforylazy odłącza się reszta glukozy 

z nieredukującego końca skrobi i wiąże się z kwasem fosforowym, powstaje glukozo- 

1-fosforan. W próbie obserwujemy brak reakcji z jodem. 

• w drugiej probówce reakcja nie zajdzie z powodu braku reszty fosforanowej. 

Obecność skrobi potwierdza dodatnia reakcja z płynem Lugola. 

3) IZOLACJA I CHARAKTERYSTYKA MUCYNY. 

Zebrać do czystej probówki ok. 5 ml śliny. Dodać 0,5 ml 0,1N kwasu octowego, wymieszać. 

Wytrąca się osad mucyny, który należy oddzielić od supernatantu przez dekantację lub 

wirowanie. 

Otrzymany osad mucyny rozdzielić na trzy probówki i wykonać następujące próby: 

a) Próba biuretowa Piotrowskiego- wykrywanie białka 

Około 1⁄3 osadu mucyny rozpuścić w 1 ml wody destylowanej. Dodać 1ml 2N NaOH, 

wymieszać, następnie dodać 2-3 krople 1% roztworu CuSO4. Powstaje niebiesko-fiołkowe 

zabarwienie. 

b) Próba Molischa- wykrywanie cukrów 

1/3 osadu mucyny rozpuścić w 1 ml wody destylowanej, dodać 2-3 krople α- naftolu, 

wymieszać. Próbę podwarstwić dodając ok. 1 ml stężonego kwasu siarkowego (nie mieszać!). 

Na granicy faz powstaje fioletowy pierścień. 

c) Próba Adamkiewicza- Hopkinsa- wykrywanie tryptofanu 

Do 1/3 osadu dodać 1 ml stężonego kwasu octowego zawierającego FeCl3. Próbę wymieszać 

i podwarstwić ok. 

1 ml stężonego kwasu siarkowego. Pojawia się fioletowy pierścień na granicy faz. 

[ Zamiast tej próby można wykonać reakcję Millona na obecność aminokwasów 

aromatycznych: do osadu dodać ok. 1 ml wody i kilka kropli odczynnika Millona. Ogrzewać 

aż do pojawienia się czerwono zabarwionego precypitatu.] 

Wyjaśnienie: 

Mucyny są białkami złożonymi należącymi do glikoprotein. Mucyna nadaje ślinie lepkość, 

około 40% cząsteczki tego białka stanowią aminocukry. Z cukrów często występuje 

acetylogalaktozamina sprzężona z kwasem sjalowym. Obecność komponenty białkowej w 

mucynie stwierdza się dodatnią reakcją biuretową, natomiast składnik cukrowy wykrywa się 

próbą Molischa. Obecność tryptofanu w części białkowej mucyny potwierdza dodatnia 

reakcja Adamkiewicza- Hopkinsa. 

47

4) OZNACZANIE ILOŚCIOWE KWASU SJALOWEGO W SUROWICY KRWI 

(metoda rezorcynowa wg. Svennerholma). 

Wykonanie: 

Przygotować dwie probówki- kontrolną (K) i badaną (B). Do probówek odmierzyć po 0,2 ml 

surowicy krwi oraz po 1,8 ml wody destylowanej. Do kontroli (K) odmierzyć 2 ml 

odczynnika kontrolnego ( bez rezorcyny ! ), zaś do probówki z próbą badaną (B) dodać 2 ml 

odczynnika rezorcynowego. 

Obie probówki zamknąć korkami i wstawić na 15 min do wrzącej łaźni wodnej , po czym 

ochłodzić pod bieżącą, zimną wodą. Następnie do obu prób (K) i (B) dodać po 5 ml alkoholu 

izoamylowego i energicznie wytrząsać przez 3 min. (produkt reakcji o barwie fioletowo- 

niebieskiej przechodzi do warstwy alkoholowej). Probówki wstawić do zlewki z lodem na 15 

minut. Po tym czasie zawartość każdej przelać do suchych probówek wirówkowych i 

wirować przez 3 min. przy 1 tys. obr /min. Powstałą w obu próbach, górną warstwę 

alkoholową zebrać przy pomocy plastikowej pipetki i przenieść do suchych szklanych 

probówek. 

Odczytać ekstynkcję próby badanej (B) wobec kontrolnej (K) najpierw przy długości fali 580 

nm (A580) a następnie przy 450 nm (A450). Wyliczyć różnicę absorbancji przy 580 i 450 nm 

(A580 – A450) i z krzywej wzorcowej odczytać zawartość kwasu sjalowego w surowicy krwi. 

Wynik podać w mM/l surowicy. 

Zawartość kwasu sjalowego w surowicy krwi wg Svennerholma wynosi 2, 34 ± 0,42 

mM/l lub 63, 6 ± 9,7 mg / %. 

Wyjaśnienie: 

Metody ilościowego oznaczania kwasu sjalowego oparte są na zasadzie tworzenia barwnych 

związków podczas ogrzewania z rezorcyną, orcyną lub dimetyloaminobenzaldehydem 

rozpuszczonych w stężonych kwasach. Metoda rezorcynowa wg Svennerholma jest dosyć 

czuła a wpływ związków interferujących (np. ketoheksoz) przeszkadzających w oznaczeniu 

eliminuje się przez równoległe przeprowadzenie odczytów przy 580 i 450 nm. 

Podwyższony poziom kwasu sjalowego stwierdza się min. w nowotworach, cukrzycy, stanach 

zapalnych, chorobach tkanki łącznej, alkoholiźmie, zawale serca, gruźlicy. 

48

ROZDZIAŁ IX 

WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE TŁUSZCZÓW. 

TRAWIENIE TLUSZCZÓW. ANALIZA ŻÓŁCI. 


Tłuszczowce stanowią heterogenną grupę związków wykazujących jednakowe 

własności fizykochemiczne, a przede wszystkim nierozpuszczalność w wodzie i rozpuszczalność 

w rozpuszczalnikach organicznych (benzen, eter, chloroform). Z różnorodną budową 

lipidów łączą się ich liczne funkcje biologiczne. 

Tłuszcze proste (triacyloglicerole) stanowią materiał zapasowy w postaci tkanki podskórnej. 

Produkty rozkładu triacylogliceroli, wolne kwasy tłuszczowe /WKT/, spalane w wielu 

tkankach dostarczają komórkom dużych ilości energii. Tkanka tłuszczowa podskórna chroni 

organizm przed nadmiernym oddawaniem ciepła, a zgromadzona w okolicy różnych 

narządów chroni je przed urazami. Przykładem może być torebka tłuszczowa 

nerki i ciało tłuszczowe poza gałką oczną. 

Tłuszcze złożone (fosfolipidy, glikolipidy), a także cholesterol, będące związkami 

amfipatycznymi posiadającymi grupy hydrofilowe i hydrofobowe, są podstawowymi 

składnikami błon zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych. Wzajemny stosunek poszczególnych 

klas lipidów oraz charakter wchodzących w ich skład kwasów tłuszczowych decyduje 

o specyfice poszczególnych błon i warunkuje ich sprawne funkcjonowanie. Lipidy stanowią 

barierę przy przechodzeniu większości metabolitów przez błony, przez co stają się jednym z 

elementów regulacji przemian. Poza błonami fosfolipidy występują w płynach ustrojowych 

gdzie pełnią dodatkowe funkcje /detergenty/. Są składnikami żółci, surfaktantu płucnego 

i lipoprotein osocza. 

Lipidy są nie tylko materiałem zapasowym i strukturalnym dla ustroju, lecz pełnią 

także wyspecjalizowane funkcje regulacyjne. Pochodnymi wielonienasyconych kwasów 

tłuszczowych są prostaglandyny, tromboksany i leukotrieny. Sterydami są wszystkie hormony 

kory nadnerczy, hormony płciowe męskie i żeńskie, a także kalcyferol /wit. D/ oraz kwasy 

żółciowe. 

Do lipidów należą też karotenowce, z których wywodzi się witamina A, niezbędna 

w procesie widzenia. 

TRAWIENIE TŁUSZCZÓW. SKŁAD I ROLA ŻÓŁCI. 

W pokarmie znajduje się wiele składników o charakterze lipidowym. Obok 

występujących w największej ilości triacylogliceroli są też cholesterol, fosfolipidy, witaminy 

rozpuszczalne w tłuszczach A, D, E, K, karotenoidy. 

Trawienie tłuszczów u osób dorosłych zachodzi dopiero w jelitach. Wprawdzie 

w żołądku znajduje się lipaza, enzym hydrolizujący triacyloglicerole, ale optimum jej 

działania leży w zakresie pH bliskim 6,0 , co wobec kwaśnego środowiska, panującego 

w żołądku /pH 1,5- 2,0 /czyni ją praktycznie nieaktywną. Lipaza ta ma znaczenie jedynie 

u osesków, ponieważ pH ich żołądka jest bliskie 6,0 , a tłuszcz mleka, przyjmowany 

w pożywieniu przez noworodki jest doskonale zemulgowany. Tłuszcze z innych pokarmów 

niż mleko muszą być w jelicie wstępnie rozdrobnione i przejść z fazy olejowej w wodną. 

Zachodzi to w dwunastnicy, z udziałem żółci i zawartych w niej fosfolipidów i kwasów 

żółciowych. Obniżają one napięcie powierzchniowe wody, dzięki czemu zachodzi 

rozdrobnienie tłuszczu i utrwalenie powstałej emulsji. Zarówno kwasy żółciowe jak 

49

i fosfolipidy są substancjami amfipatycznymi i w środowisku wodnym łatwo tworzą micele. 

Grupy hydrofobowe takich substancji skierowane są do wnętrza, hydrofilne zaś na zewnątrz 

miceli, co umożliwia otoczenie jej płaszczem wodnym. W takie micele, zwane mieszanymi, 

wchodzą także kwasy tłuszczowe i monoacyloglicerole. Są one produktami trawienia 

tłuszczów w jelicie. Triacyloglicerole i estry cholesterolu, jako substancje apolarne, nie mogą 

tworzyć samoistnych miceli, ale mogą być wbudowane w micele mieszane. Przejście lipidów 

z fazy olejowej do wodnej czyni je podatnymi na działanie enzymów lipolitycznych. Do 

enzymów tych należą: lipaza trzustkowa, fosfolipazy A1, A2 , esteraza cholesterolowa, które 

zawarte są w soku trzustkowym. Lipaza trzustkowa katalizuje częściową hydrolizę tłuszczów 

prostych. Może ona odszczepiać reszty acylowe triacyloglicerolu jedynie w pozycji C1 i C3 

według reakcji: 

Triacyloglicerol + H2O ― lipaza trzustkowa → β–monoacyloglicerol + 2 kwasy tłuszczowe 

Fosfolipaza A1 uwalnia resztę acylową z pozycji C1 fosfolipidu zaś fosfolipaza A2 

z pozycji C2. Powstaje lizofosfatyd i wolny kwas tłuszczowy. Esteraza cholesterolowa 

hydrolizuje estry cholesterolu. Produkty działania wymienionych enzymów: monoacyloglicerole, 

lizofosfatydy, cholesterol i kwasy tłuszczowe łatwo wchodzą w micele mieszane a z nich 

drogą biernej dyfuzji wchłaniają się do komórek śluzówki. Niezbędna jest przy tym obecność 

kwasów żółciowych. W enterocytach zachodzi kolejno aktywacja kwasów tłuszczowych 

i resynteza triacylogliceroli. Resyntetyzują się też estry cholesterolu. 

Żółć obok kwasów żółciowych zawiera barwniki żółciowe będące końcowym 

produktem rozpadu hemu, składnika hemoglobiny, a także inne substancje nierozpuszczalne 

w wodzie (cholesterol, leki), które tylko tą drogą mogą być wydalone z organizmu. Dlatego 

też żółć określana jest jako płyn ustrojowy, będący jednocześnie wydzieliną i wydaliną. 


1) Poznanie struktury i właściwości tłuszczowców. 

2) Określenie liczby kwasowej, zmydlania i jodowej. 

3) Trawienie tłuszczów mleka i oliwy 

4) Wykrywanie składników żółci. 

WYKONANIE: 

1) EMULGOWANIE I ROZPUSZCZALNOŚĆ TŁUSZCZÓW: 

Do pięciu probówek dodać po 0,5 ml oleju, a następnie dodawać do pierwszej próbówki 

2 ml wody, do drugiej – 2 ml mydła, do trzeciej – 2 ml żółci, do czwartej – 2 ml eteru, do 

piątej – 2 ml chloroformu. Wszystkie probówki energicznie wstrząsać i zaobserwować wynik. 

Wyjaśnienie: 

Woda posiada duże napięcie powierzchniowe więc w probówce pierwszej olej zgromadzi 

się na powierzchni. W probówkach 2 i 3 wytworzy się trwała emulsja, ponieważ mydło i żółć 

są dobrymi detergentami. W probówkach 4 i 5 tłuszcz się rozpuści. 

50

2) WYKRYWANIE GLICEROLU / PRÓBA AKROLEINOWA/ 

Do 2 suchych probówek dodać po około 0,2 g KHSO4,a następnie dodać do pierwszej 

probówki 2 krople glicerolu, a do drugiej 2 krople oleju. Obie probówki łagodnie ogrzewać aż 

do pojawienia się dymu o drażniącym zapachu. Wylot probówki zamknąć szczelnie bibułą 

zwilżoną uprzednio amoniakalnym roztworem azotanu srebra, próbę nadal ogrzewać 

i obserwować zabarwienie bibuły 

Wyjaśnienie: 

Kwaśny siarczan potasu /KHSO4/ powoduje odwodnienie glicerolu i wytworzenie 

akroleiny o drażniącym zapachu. Akroleina /nienasycony aldehyd/ redukuje bezbarwne jony 

srebra Ag +1 do srebra metalicznego Ag 0 barwy czarnej. 

3) WYKRYWANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH /REAKCJA ZMYDLANIA/. 

Do probówki dodać 0,5 ml oleju, a następnie dodać 5 ml 10 % alkoholowego roztworu 

NaOH. Zmieszać i ogrzewać przez 5 –10.minut we wrzącej łaźni wodnej aż do odparowania 

etanolu. Powstaje opalizujący roztwór, który wstrząsany intensywnie pieni się. Roztwór 

powstałego mydła podzielić na dwie części. Do jednej probówki dodać parę kropel 1 M 

H2SO4, wytrącają się nierozpuszczalne kwasy tłuszczowe. Do drugiej probówki dodawać 

kroplami roztwór chlorku wapnia /CaCl2/,wytrąca się nierozpuszczalne mydło wapniowe. 

4) WYKRYWANIE NIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH. 

a) Rozpuścić 5 kropli oleju w 1 ml alkoholu etylowego. Dodawać kroplami odczynnik 

Hübla /roztwór jodu oraz chlorku rtęciowego w alkoholu/. Płyn odbarwia się, 

ponieważ brunatny jod cząsteczkowy J2 redukuje się do bezbarwnych jonów 

jodkowych J -1 wysycających wiązania podwójne. 

b) Rozpuścić 5 kropli oleju w 5 ml 1 % roztworu węglanu sodu /Na2CO3/. Próbę lekko 

ogrzać i dodać 1-2 krople 1 % roztworu nadmanganianu potasu. Obserwować reakcję. 

Wyjaśnienie: 

W oleju roślinnym występuje przewaga kwasów tłuszczowych nienasyconych 

o jednym lub kilku wiązaniach podwójnych. Wiązania te łatwo ulegają utlenieniu np. pod 

wpływem KMnO4. Nadmanganian odbarwia się, ponieważ Mn +7 redukuje się do Mn +4 . 

5) OZNACZANIE LICZBY ZMYDLANIA: 

Liczba zmydlania jest to ilość miligramów KOH potrzebna do zmydlenia 1 g tłuszczu 

i zobojętnienia zawartych w nim kwasów tłuszczowych. 

Wykonanie: 

Do kolby stożkowej o pojemności 100 ml odważyć 1 g tłuszczu i dodać 10 ml 0,5 M. 

roztworu KOH i 50 ml etanolu. Ogrzewać ostrożnie we wrzącej łaźni wodnej przez 20 minut. 

W wyniku hydrolizy tłuszcz zostaje rozłożony do glicerolu i kwasów tłuszczowych, które z 

51

wodorotlenkiem potasu dają mydła. Nadmiar KOH odmiareczkować 0,5 M. roztworem HCl 

wobec fenoloftaleiny. Równolegle należy wykonać próbę kontrolną bez dodawania tłuszczu. 

Obliczenia: 

28,055(a-b) 

LZ = , gdzie a – ilość ml HCl potrzebna do zmiareczkowania próby kontrolnej 

c b – ilość ml HCl potrzebna do zmiareczkowania próby badanej 

c – ilość tłuszczu w gramach 

Wyjaśnienie: 

Liczba zmydlania pozwala na wyznaczenie średniej masy cząsteczkowej kwasów 

tłuszczowych wchodzących w skład danego tłuszczu. Tłuszcze zawierające dużą ilość estrów 

kwasów o niskiej masie cząsteczkowej (jak masłowy, kapronowy, kaprylowy), posiadają 

wysoką liczbę zmydlania. Natomiast tłuszcze o dużym odsetku estrów kwasów 

wysokocząsteczkowych (stearynowy, palmitynowy, olejowy) mają niskie liczby zmydlania. 

6) OZNACZANIE LICZBY JODOWEJ: 

Liczba jodowa jest miarą ilości nienasyconych wiązań; jest to ilość gramów jodu 

związanego przez 100g tłuszczu. 

Wykonanie: 

Do dwóch erlenmajerek z odważką 0,1g oleju i 0,1 g smalcu dodać po 3 ml 

chloroformu. Każdy tluszcz po rozpuszczeniu zmiareczkować odczynnikiem Hübla do trwałej 

barwy żółtej. 

Wyjaśnienie: 

Podczas miareczkowania odczynnik Hübla odbarwia się, ponieważ jod jest 

przyłączany do wiązań podwójnych w kwasach nienasyconych. W momencie wysycenia 

wszystkich wiązań roztwór zabarwia się od nadmiaru jodu (odczynnika Hübla). 

7) OZNACZANIE LICZBY KWASOWEJ: 

Liczba kwasowa jest to ilość miligramów KOH, potrzebna do zobojętnienia wolnych 

kwasów organicznych zawartych w jednym gramie tłuszczu. 

Wykonanie: 

Rozpuścić 5g tłuszczu w 50 ml rozpuszczalnika (96% etanol – eter 3:1). 

Miareczkować 0,1 M. etanolowym roztworem KOH wobec fenoloftaleiny do barwy różowej. 

Wykonać równolegle próbę kontrolną miareczkując 50 ml rozpuszczalnika 0,1 M. KOH do 

barwy różowej wobec fenoloftaleiny. 

Obliczenie: 

5,611(a-b) 

LK = , gdzie a – ilość ml KOH zużyta na zmiareczkowanie próby badanej 

c b – ilość ml KOH zużyta na zmiareczkowanie próby kontrolnej 

c – ilość tłuszczu w gramach 

52

Wyjaśnienie: 

Oznaczanie liczby kwasowej posiada znaczenie przy ocenie tłuszczów jadalnych. 

Wysokie liczby kwasowe mają tłuszcze nieświeże, zjełczałe, częściowo zhydrolizowane, 

cechujące się wysoką zawartością wolnych kwasów organicznych. 

8) TRAWIENIE TŁUSZCZU LIPAZĄ TRZUSTKOWĄ: 

Do dwóch probówek odmierzyć po 2 ml wyciągu trzustki. Jedną probówkę umieścić 

we wrzącej łaźni wodnej na pięć minut w celu inaktywacji enzymu (kontrola). Do obu 

probówek dodać po 4 ml mleka, po 2 – 3 krople fenoloftaleiny i kroplami 1% Na2CO3 do 

barwy różowej. Obie probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37 ° C. W probówce 

zawierającej aktywny enzym nastąpi odbarwienie próby. 

Wyjaśnienie: 

Mleko zawiera dobrze zemulgowany tłuszcz, który jest substratem dla lipazy 

trzustkowej. Węglan sodu alkalizuje środowisko do pH 8-9 (optimum dla lipazy). W czasie 

inkubacji lipaza hydrolizuje i uwalnia kwasy tłuszczowe, które zakwaszają środowisko 

i następuje odbarwienie fenoloftaleiny. 

9) WPŁYW ŻÓŁCI NA AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW LIPOLITYCZNYCH 

Do 10 ml oliwy dodać 8 kropli 0,1 n NaOH i mocno wytrząsać aż do uzyskania 

trwałej emulsji. Do dwóch szerokich probówek odmierzyć po 3 ml emulsji. Do jednej dodać 

1 ml wody, do drugiej 1 ml żółci, a następnie do obu po 2 ml wyciągu z trzustki. Inkubować 

w temperaturze pokojowej przez 20 min., wstrząsając energicznie co 5 min. Po zakończeniu 

inkubacji do obu probówek dodać po 8 ml etanolu i po 5 kropli fenoloftaleiny. Miareczkować 

0,1 n NaOH do różowego zabarwienia. 

Wyjaśnienie: 

Obecność żółci (kwasów żółciowych) w próbie wpływa na wzrost aktywności 

lipolitycznej soku trzustkowego, wskutek czego zwiększone stężenie kwasów tłuszczowych 

wymaga większego zużycia wodorotlenku do ich zobojętnienia. 

10) WYKRYWANIE KWASÓW ŻÓŁCIOWYCH: 

a) Próba Pettenkofera. Do 2 ml rozcieńczonej żółci dodać 5 kropli 0,5% sacharozy 

i podwarstwić stężonym kwasem siarkowym. Na pograniczu obu warstw powstaje czerwony 

pierścień. 

Wyjaśnienie: 

Sacharoza pod wpływem stężonego kwasu siarkowego ulega przekształceniu do pochodnych 

furfuralowych, które kondensują z kwasami żółciowymi, dając barwne produkty. 

b) Próba Haya. Do dwóch probówek wlać 2 ml wody destylowanej. Do jednej z nich dodać 

kilka kropłi żółci. Do obu probówek dodać małą szczyptę kwiatu siarki. Obserwować 

zachowanie się kwiatu siarki. 

53

Wyjaśnienie: 

Woda posiada duże napięcie powierzchniowe, kwiat siarki utrzymuje się na powierzchni 

wody. Kwasy żółciowe obniżają napięcie powierzchniowe cieczy, kwiat siarki opada na dno. 

11) WYKRYWANIE BARWNIKÓW ŻÓŁCIOWYCH: 

a) Próba Gmelina. 1 ml rozcieńczonej żółci podwarstwić stężonym kwasem azotowym na 

granicy obu płynów powstają kolorowe pierścienie. 

Wyjaśnienie: 

Kwas azotowy utlenia żółtą bilirubinę do zielonej biliwerdyny i czerwonej bilifuscyny. 

b) Próba Rossina. Do 2 ml rozcieńczonej żółci dodać kilka kropli 2 n kwasu octowego, 

a następnie ostrożnie nawarstwić 0,05% roztworem jodu. Na granicy płynów powstaje 

szarozielone zabarwienie. 

Wyjaśnienie: 

Jod utlenia bilirubinę do biliwerdyny. 

12) WYKRYWANIE CHOLESTEROLU: 

a) Próba Salkowskiego. Roztwór cholesterolu w chloroformie podwarstwić stęzonym 

kwasem siarkowym. Warstwa chloroformowa zabarwia się na czerwono. 

b) Próba Libermana-Burcharda. Do 1 ml przygotowanego odczynnika (lodowaty kwas 

octowy + stężony kwas siarkowy) dodać kroplę żółci. Powstaje zielone zabarwienie. 

Wyjaśnienie: 

Cholesterol zawierający wiązania podwójne daje barwne produkty w obecności mocnych 

kwasów. Pod wpływem kwasu siarkowego (reakcja Salkowskiego) dochodzi do odciągnięcia 

cząsteczki wody i tworzy się kwas disulfonowy bicholestadienu o barwie czerwonej. W 

obecności kwasu siarkowego i bezwodnika kwasu octowego (reakcja Libermanna–Burcharda) 

tworzy się kwas monosulfonowy bicholestadienu o barwie zielonej. 

54

ROZDZIAŁ X 

LIPIDY ZŁOŻONE – FOSFOLIPIDY 


Fosfolipidy należące do tłuszczów złożonych to zróżnicowana grupa związków, 

których wspólną cechą jest występowanie w ich budowie reszt kwasu fosforowego. Wśród 

fosfolipidów wyróżniamy dwie grupy: fosfoglicerydy i sfingomieliny. Do grupy fosfoglicerydów 

zaliczamy: kwas fosfatydowy, fosfatydylocholinę (lecytynę), fosfatydyloetanoloaminę 

(kefalinę), fosfatydyloinozytol, fosfatydyloserynę, plazmalogeny. W ich skład wchodzi: 

glicerol, kwasy tłuszczowe, reszta fosforanowa oraz cholina, etanolamina, seryna, inozytol. 

Drugą grupę fosfolipidów stanowią sfingomieliny. W ich skład wchodzi: sfingozyna 

(aminoalkohol), kwas tłuszczowy, reszta fosforanowa i cholina. 

Fosfolipidy są elementem budulcowym wszystkich komórek, głównie błon 

komórkowych. Występują szczególnie obficie w tkance nerwowej, krwi, limfie, wątrobie, 

żółtku jaja. Degradacja fosfolipidów zachodzi pod wpływem specyficznych hydrolaz 

(fosfolipaz). Wyróżniamy fosfolipazę A1, A2, B, C, D. Hydroliza niektórych fosfolipidów np. 

fosfatydyloinozytoli katalizowana przez fosfolipazę C stanowi ważny etap w przekazywaniu 

sygnału przez błonę komórkową. Glicerofosfolipidy stanowią też substrat dla fosfolipazy A2, 

uwalniającej z nich nienasycone kwasy tłuszczowe, w tym kwas arachidonowy będący 

prekursorem prostaglandyn. Kwas arachidonowy uczestniczy też w wewnątrzkomórkowym 

przekaźnictwie sygnału. Podobnie coraz większe znaczenie w regulacji procesów życiowych 

komórek przypisuje się sfingozynie i ceramidom pochodzącym z degradacji sfingolipidów. 

Zaburzony metabolizm fosfolipidów może być przyczyną wielu procesów chorobowych np. 

zespołu niewydolności oddechowej (brak surfaktantu płucnego), stwardnienia rozsianego 

i sfingolipidoz (wrodzony defekt enzymów lizosomalnych). Przedmiotem ćwiczeń będzie 

jeden z fosfolipidów- lecytyna, której cząsteczka obok glicerolu zawiera dwa łańcuchy 

kwasów tłuszczowych, fosforan oraz cholinę. Ekstrakcję lecytyny z żółtka jaja kurzego, które 

jest bogatym źródłem tego lipidu, przeprowadza się najczęściej przy użyciu rozpuszczalników 

organicznych. 


Preparatyka lecytyny i poznanie jej składu. 

WYKONANIE 

PREPARATYKA LECYTYNY 

Sproszkowane żółtko (2-3g) rozcierać w moździerzu przez 2-3minuty z 10 ml mieszaniny 

chloroformu i metanolu /2:1/. Ekstrakt przesączyć do suchej probówki przez sączek zwilżony 

uprzednio rozpuszczalnikiem. Przesącz odparować do sucha we wrzącej łaźni wodnej. 

Otrzymana brunatno zabarwiona oleista masa jest surowym preparatem lecytyny, 

zanieczyszczonym głównie barwnikami (karotenami). Na uzyskanym preparacie lecytyny 

wykonać próby na obecność składników lecytyny. 

55

WYKRYWANIE SKŁADNIKÓW LECYTYNY 

1) Wykazanie obecności glicerolu- próba akroleinowa. 

Do suchej probówki przenieść szczyptę lecytyny i ok. 1g KHSO4 (1/2 łyżeczki). 

Wylot probówki zamknąć korkiem ze zgiętą rurką szklaną, która będzie odprowadzała 

lotne produkty reakcji. Powoli ogrzewać probówkę we wrzącej łaźni wodnej do momentu 

pojawienia się przykrego drażniącego zapachu. Następnie zanurzyć wylot rurki 

odprowadzającej do probówki z roztworem K2Cr2O7 zakwaszonym kwasem siarkowym. 

Zaobserwować zmianę zabarwienia roztworu. UWAGA: Wykonać tylko jedną próbę 

pokazową. 

Wyjaśnienie 

Obecny w lecytynie glicerol w obecności KHSO4 ulega odwodnieniu tworząc 

nienasycony aldehyd- akroleinę, która wykazuje właściwości redukujące. Redukuje 

dichromian potasu (pomarańczowy) do chromianu potasu (zielony). 

2) Wykazanie obecności kwasów tłuszczowych- reakcja zmydlania. 

Do szczypty lecytyny dodać 3ml 10% alkoholowego roztworu KOH i mieszaninę 

ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. Następuje hydrolityczny rozpad 

lecytyny. Kwasy tłuszczowe uwalniają się w postaci soli potasowych (mydeł). Aby 

potwierdzić obecność powstających mydeł dodać do probówki 5 ml wody destylowanej i 

wytrząsnąć. Roztwór pieni się. 

3) Wykazanie obecności choliny. 

Do probówki z osadem lecytyny dodać 2 ml 20% NaOH i ogrzewać we wrzącej 

łaźni wodnej aż do pojawienia się charakterystycznego zapachu. 

Wyjaśnienie 

W środowisku silnie zasadowym dochodzi do hydrolizy wiązania estrowego pomiędzy 

choliną i kwasem fosforowym lecytyny. Uwolniona cholina ulega rozkładowi do glikolu 

etylowego i trimetyloaminy, która wykazuje charakterystyczny zapach solanki śledziowej. 

4) Wykazanie obecności fosforu. 

Do probówki zawierającej szczyptę lecytyny dodać 0,5 ml 20% NaOH i ogrzewać 

przez 2 minuty we wrzącej łaźni wodnej. Następnie dodać 2 ml roztworu molibdenianu 

amonu. Powstaje fosfomolibdenian amonu o żółtej barwie. 

56

ROZDZIAŁ XI 

STEROIDY 


Steroidy są pochodnymi cyklopentanoperhydrofanantrenu (steranu). Cholesterol jest 

głównym steroidem organizmu zwierzęcego. W tkankach występuje jako składnik błon 

komórkowych oraz jako substrat wyjściowy do syntezy kwasów żółciowych cholekarcyferolu 

oraz hormonów steroidowych (hormony kory nadnerczy, hormony płciowe męskie i żeńskie). 

Szczególnie w dużych ilościach obecny jest w tkance nerwowej, wątrobie, korze nadnerczy 

i skórze. Cholesterol występuje w ustroju w formie wolnej i estryfikowanej kwasami 

tłuszczowymi. Reakcje estryfikacji katalizuje LCAT- acylotransferaza, lecytyna: cholesterol. 

U dorosłego człowieka znajduje się 140g cholesterolu całkowitego, z czego 40g zawarte jest 

w tkance nerwowej, a tylko około 6% pozostałej części (około 8 g) występuje jako składnik 

lipoprotein osocza. W osoczu zdrowego człowieka na czczo około 60% całkowitego 

cholesterolu znajduje się w lipoproteinach β (LDL), około 30% w lipoproteinach α (HDL), 

a pozostałe 10% w lipoproteinach preβ (VLDL). Istotną rolę w regulacji przemian 

i biosyntezy cholesterolu odgrywają dwie klasy lipoprotein: 

LDL – lipoproteiny o niskiej gęstości, powstające z VLDL, transportują cholesterol z 

wątroby do tkanek obwodowych; 

HDL – lipoproteiny o wysokiej gęstości powstające w wątrobie i jelicie, transportują 

cholesterol z narządów obwodowych do wątroby. 

Obecny w surowicy cholesterol jest zarówno pochodzenia endogennego, jak i egzogennego. 

Głównym narządem syntetyzującym ten lipid jest wątroba, a następnie jelito cienkie i skóra. 

Im większa podaż cholesterolu egzogennego, tym mniejsza synteza cholesterolu 

endogennego. 

Oznaczenie cholesterolu we krwi ma dużą wartość diagnostyczną. Znajomość jego stężenia 

jest między innymi niezbędna do ustalenia typu hiperlipoproteinemii. W laboratoriach 

oznacza się cholesterol całkowity oraz cholesterol zawarty we frakcjach HDL i LDL. 

W surowicy ludzi zdrowych prawidłowy poziom cholesterolu wynosi 3,6-5,2 mmol/l. 

Cholesterol frakcji HDL wykazuje właściwości antymiażdżycowe. Prawidłowe jego stężenie 

waha się od 0,9- 2 mmol/l. 


1) Poznanie budowy i funkcji steroidów. 

2) Wykazanie obecności cholesterolu w mózgu 

3) Ilościowe oznaczanie cholesterolu w surowicy 

4) Wykrywanie cholesterolu zawartego w surowicy krwi metodą chromatografii 

cienkowarstwowej 

1) WYKAZANIE OBECNOŚCI CHOLESTEROLU W MÓZGU 

Do doświadczenia użyto mózgi wieprzowe, które przygotowano w następujący sposób: 

rozdrobniony mózg zwierzęcy zmieszano z trzema częściami CaSO4 w celu odwodnienia. Po 

stwardnieniu masy i wysuszeniu roztarto ją w moździerzu na proszek. 

57

WYKONANIE 

Do zlewki z odważką sproszkowanego mózgu dodać 6 ml chloroformu i próbę dokładnie 

wymieszać. Po 10 minutach mieszaninę przesączyć przez bibułę uprzednio zwilżoną 

chloroformem. Do 3 ml wyciągu chloroformowego dodać 6 kropli bezwodnika kwasu 

octowego i 1-2 krople stężonego kwasu siarkowego. Wstrząsnąć i obserwować zmianę 

zabarwienia. 

Wyjaśnienie: 

Najbogatszym źródłem cholesterolu jest mózg, żółtko jaja kurzego oraz wątroba. Cholesterol 

zawierający wiązania podwójne, tak jak wiele innych steroidów, tworzy barwne produkty w 

obecności mocnych kwasów. W obecności stężonego kwasu siarkowego i bezwodnika kwasu 

octowego (reakcja Liebermana – Burcharda) tworzy produkty o barwie czerwonofioletowej, 

niebieskiej, w końcu zielonej, co świadczy o znacznej zawartości cholesterolu w mózgu. 

2) OZNACZANIE ILOŚCIOWE CHOLESTEROLU W SUROWICY 

WYKONANIE 

Do dwóch suchych probówek odmierzyć po 4,2 ml odczynnika Liebermanna – Burcharda 

(Uwaga! Roztwór żrący, zachować ostrożność!) Do pierwszej probówki dodać 0,2 ml 

surowicy (próba badana), a do drugiej 0,2 ml wody destylowanej (próba kontrolna).Próbki 

dobrze wymieszać i pozostawić na 10 minut w ciemnym miejscu. Odczytać w kolorymetrze 

gęstość optyczną próby badanej wobec próby kontrolnej, przy długości 660 nm. Stężenie 

cholesterolu odczytać z krzywej kalibracyjnej. 

Wyjaśnienie: 

Użyta metoda kolorymetryczna opiera się na jakościowej próbie Liebermana – Burcharda. 

Cholesterol reaguje z bezwodnikiem kwasu octowego i w obecności kwasu siarkowego 

tworzy kompleks o barwie niebiesko-zielonej. Zawartość cholesterolu w surowicy ludzi 

zdrowych waha się w szerokich granicach i zależy od wieku, płci jak i rodzaju diety. 

W surowicy człowieka zdrowego poziom cholesterolu wynosi od 140 do 200 mg% 

(3,6 – 5,2 mmol/l). 

3) WYKRYWANIE CHOLESTEROLU W SUROWICY METODĄ CHROMATO- 

GRAFII CIENKOWARSTWOWEJ 

a) Przygotowanie lipidowego ekstraktu surowicy krwi 

1 ml surowicy krwi wytrząsać 30 minut z 20 ml mieszaniny chloroform: metanol (2:1). 

Następnie dodać 4 ml 0,1N NaCl i wytrząsać 10 minut, po czym odwirować przez 10 minut 

przy 3000 obr./min. Górną warstwę wodno- alkoholową odrzucić, a dolną (chloroformową), 

stanowiącą lipidowy ekstrakt surowicy, użyć do rozdziału chromatograficznego. 

b) Rozdział chromatograficzny składników ekstraktu lipidowego 

• na płytce chromatograficznej zaznaczyć ołówkiem linię startu w odległości 2 cm od 

dolnej krawędzi płytki 

• na linii startu zaznaczyć punkty nanoszenia badanego materiału (co 2 cm) 

• nanieść po 2-3 krople ekstraktu chloroformowego lipidów oraz dostępne roztwory 

wzorcowe 

• umieścić płytkę w komorze chromatograficznej, zawierającej układ rozpuszczalników 

58

• rozwijać chromatogram aż czoło rozpuszczalnika dojdzie do końca płytki 

• płytkę wysuszyć i wstawić na kilka minut do komory z jodem 

• zidentyfikować wśród rozdzielonych lipidów surowicy cholesterol i jego estry 

Wyjaśnienie: 

Do identyfikacji lipidów stosuje się metody chromatograficzne. Chromatografia 

służąca do rozdzielania mieszaniny substancji, wykorzystuje różnicę w oddziaływaniu 

rozdzielanych substancji z dwoma układami: układem ruchomym i nieruchomym. Układami 

ruchomymi mogą być ciecze lub gaz, a nieruchomymi również ciecz związana z nośnikiem 

lub sam nośnik. Migracja fazy ruchomej względem nieruchomej (stacjonarnej) jest wywołana 

w zależności od metody różnymi czynnikami. W zastosowanej w ćwiczeniu chromatografii 

cienkowarstwowej (TLC) przepływ fazy ruchomej odbywa się na zasadzie sił kapilarnych tzn. 

cienka warstwa absorbentu jest stopniowo zwilżana przez rozpuszczalnik (eluent). 

Uniwersalnymi najczęściej stosowanymi absorbentami (fazą stałą) są: tlenek glinu, żel 

krzemionkowy i celuloza. Rozpuszczalnikiem (układem rozwijającym) dla lipidów jest 

mieszanina eter naftowy, stężony kwas octowy, eter etylowy w stosunku objętościowym 

(78:2:20). W obrazie chromatograficznym rozdzielanych lipidów surowicy krwi możemy 

obserwować obok cholesterolu i jego estrów także triacyloglicerole, fosfolipidy i wolne 

kwasy tłuszczowe. Metoda chromatografii cienkowarstwowej pozwala na szybką 

identyfikację większości lipidów surowicy i charakteryzuje się dużą czułością. 

59

ROZDZIAŁ XII 

SOK ŻOŁĄDKOWY 

KATABOLIZM BIAŁEK POKARMOWYCH. 

Autor: dr Wiesława Ogrodnik 

Katabolizm białek pokarmowych rozpoczyna się w żołądku, gdzie dochodzi do 

denaturacji i częściowego rozkładu białek do polipeptydów. Sok żołądkowy jest silnie 

kwaśnym płynem (pH około 1,5) zawierającym wodny roztwór kwasu solnego, enzymy 

trawienne, mucynę oraz sole mineralne. Ponad 99 % jego składu stanowi woda. Najobficiej 

występującym białkiem jest glikoproteina mucyna oraz enzymy takie jak pepsyna, 

podpuszczka (u osesków) oraz występująca śladowo lipaza żołądkowa. Kwas solny 

wytwarzany jest w wewnątrz komórek okładzinowych gruczołów błony śluzowej żołądka 

w ilości około 0,5 %, a następnie wydzielany do światła żołądka. Stężenie to byłoby 

niebezpieczne dla błony śluzowej żołądka, a nie dochodzi do tego, ponieważ następuje 

rozcieńczenie poprzez mieszanie ze śliną i pokarmem oraz buforowanie poprzez reakcje 

z glikoproteinami i fosforanami drugiego rzędu. Białka poprzez zjonizowane grupy 

karboksylowe przyłączają jony wodorowe, a poprzez zjonizowane grupy aminowe jony 

chlorkowe. Fosforany drugiego rzędu po włączeniu jonów wodorowych przechodzą 

w fosforany pierwszego rzędu. W wyniku tych reakcji buforowania powstają połączenia, 

z których kwas solny może się łatwo odszczepiać w miarę obniżania się aktualnej kwasoty 

żołądka. W związku z tym kwas solny w soku żołądkowym występuje w dwóch postaciach: w 

postaci wolnej (tzw. kwasowość wolna) i związanej (tzw. kwasowość związana). Kwas solny 

denaturuje spożyte białka, także przeprowadza nieczynną pepsynę (pepsynogen) 

w czynną postać i zapewnia prawidłowe pH dla czynnego enzymu, hamuje rozwój flory 

bakteryjnej, wpływa na motorykę ścian żołądka. W komórkach głównych gruczołów błony 

śluzowej żołądka syntetyzowana jest nieczynna postać pepsyny – pepsynogen. Po odłączeniu 

silnie zasadowego polipeptydu powstaje czynna postać enzymu - pepsyna. Optymalne pH dla 

działania pepsyny wynosi 1,5-2,0. Pepsyna rozkłada białka do dużych polipeptydów, poza 

skleroproteinami i białkami zasadowymi, hydrolizuje także nukleoproteidy. 

Podpuszczka (chymozyna, rennina), enzym występujący w żołądku osesków, działa w pH 

3.5-4 i ścina mleko. Enzym ten przekształca kazeinę (białko mleka) do parakazeiny (forma 

rozpuszczalna), która z jonami wapnia tworzy nierozpuszczalny parakazeinian wapnia 

(pospolity twaróg) łatwo trawiony przez inne enzymy proteolityczne, takie jak np. pepsyna. 

Treść pokarmowa przesuwa się z żołądka do jelita cienkiego, gdzie w trawieniu biorą udział 

wydzieliny pęcherzyka żółciowego, trzustki oraz błony śluzowej jelita. Wytworzone w 

żołądku polipeptydy są tutaj trawione przez enzymy proteolityczne dostarczane z sokiem 

trzustkowym. Z sokiem trzustkowym dostarczane są także obficie wodorowęglany, które 

wpływają na wytworzenie optymalnego pH 7,5-8,5 potrzebnego do działania enzymów 

trzustkowych w jelicie cienkim. Enzymy produkowane są w trzustce w postaciach 

nieczynnych, zwanych proenzymami. Są to: trypsynogen, chymotrypsynogen, 

prokarboksypeptydaza A i B oraz proelastaza. Aktywowane są one w miejscu swojego 

działania czyli jelicie cienkim. Trypsynogen powstający w ziarnistościach komórek 

gruczołowych trzustki aktywowany jest pod wpływem enzymu proteolitycznego - 

enteropeptydazy (enterokinazy), która odłącza od centrum aktywnego trypsynogenu 

sześciopeptyd blokujący to miejsce. Aktywne cząsteczki trypsyny aktywują następne 

cząsteczki trypsynogenu (autokataliza). Trypsyna jest także aktywatorem 

chymotrypsynogenu, prokarboksypeptydazy A i B oraz proelastazy. Tak powstają aktywne 

cząsteczki enzymów – chymotrypsyna, karboksypeptydaza A i B oraz elastaza, które rozbijają 

polipeptydy na mniejsze oligopeptydy. 

60

Karboksypeptydaza A odłącza z C-końca oligopeptydu aminokwasy aromatyczne lub 

z rozbudowanym łańcuchem bocznym. Natomiast karboksypeptydaza B rozrywa wiązania 

peptydowe w sąsiedztwie C-końcowej L-lizyny i L-argininy. Produktami karboksypeptydaz 

są krótkie peptydy i wolne aminokwasy. Następnymi enzymami proteolitycznymi układu 

pokarmowego są wydzielane z sokiem jelitowym aminopeptydazy i dipeptydazy. 

Aminopeptydazy hydrolizują N-końcowe wiązania peptydowe peptydów odrywając wolne 

aminokwasy. Dipeptydazy rozkładają dipeptydy do wolnych aminokwasów. Działalność 

enzymatyczna tych wszystkich enzymów proteolitycznych doprowadza do hydrolizy białek 

do wolnych aminokwasów, które mogą być wchłaniane z jelita cienkiego do krążenia 

wrotnego. Wchłanianie aminokwasów jest aktywnym procesem biochemicznym 

wymagającym nakładu energii. Aminokwasy transportowane są przez wiele przenośników, 

z których większość zależnych jest od jonu sodowego. 

Kwasota całkowita soku żołądkowego jest sumą zawartości wolnego i związanego 

kwasu solnego oraz innych kwaśnych związków, w tym białek, fosforanów i organicznych 

kwasów. Normalny sok żołądkowy na czczo nie zawiera wolnego kwasu solnego, a kwasota 

całkowita może dochodzić do 20 ml 0,1 N NaOH w 100 ml soku żołądkowego. Po podaniu 

histaminy lub innych bodźców stymulujących żołądek do wydzielania (śniadanie próbne) 

zawartość wolnego kwasu solnego po godzinie w normalnym soku żołądkowym wzrasta do 

20-40 ml 0,1N NaOH na 100 ml soku, a kwasota całkowita 40-60 ml. Jeżeli te wartości są 

wyższe, wskazuje to na nadkwaśność, jeżeli niższe to na niedokwaśność soku żołądkowego. 

Bezkwaśność jest to stan całkowitego braku kwasu solnego, wartości kwasoty wynoszą 0 lub 

kilka mililitrów 0,1 N NaOH na 100 ml soku. Bezkwaśność jest stanem towarzyszącym 

anemii złośliwej Addisona-Biermera, nieżytowi i rakowi żołądka. Natomiast brak kwasu 

solnego i pepsyny nazywana jest bezsocznością. Nadkwaśność występuje przy braku 

czynników regulujących kwasowość, wrzodzie dwunastnicy, zwężeniu odźwiernika i nieżycie 

kwaśnym żołądka. Bywa także przyczyną wrzodów żołądka. Niedokwaśność występuje w 

nieżycie niedokwaśnym żołądka. Przy braku kwasu solnego w soku żołądkowym i zaleganiu 

pokarmów zachodzą procesy fermentacyjne powodowane obecnością bakterii, co prowadzi 

do wytwarzania kwasów organicznych takich jak np. mlekowy czy masłowy. 


1. Oznaczanie pH prawidłowego i patologicznego soku żołądkowego. 

2. Ilościowe oznaczanie zawartości wolnego kwasu solnego oraz całkowitej kwasoty 

w prawidłowym i nadkwaśnym soku żołądkowym. 

3. Oznaczanie deficytu kwasu solnego w soku żołądkowym 

4. Wykrywanie kwasu mlekowego 

WYKONANIE 

1) OZNACZANIE pH SOKU ŻOŁĄDKOWEGO 

Do 3 szklanych probówek chemicznych odpipetować po 1 ml różnych soków żołądkowych: 

a. pierwsza probówka – prawidłowy sok żołądkowy 

b. druga probówka – nadkwaśny sok żołądkowy 

c. trzecia probówka – niedokwaśny sok żołądkowy 

Następnie zanurzyć w nich paseczki papierka uniwersalnego. 

Po 30 sekundach określić przybliżone pH porównując ze skalą. 

61

Wyjaśnienie 

Prawidłowy sok żołądkowy wykazuje na czczo pH między 1,5-2,5. Nadkwaśny sok 

żołądkowy ma pH poniżej wartości fizjologicznego soku żołądkowego. Niedokwaśny sok 

żołądkowy ma odczyn powyżej pH prawidłowego. 

2) ILOŚCIOWE OZNACZANIE WOLNEGO KWASU SOLNEGO ORAZ KWASOTY 

CAŁKOWITEJ SOKU ŻOŁĄDKOWEGO 

Do 3 szklanych kolbek lub zlewek (o objętości 25 ml) odmierzyć po 10 ml różnych soków 

żołądkowych: 

a. do pierwszej kolbki odmierzyć prawidłowy sok żołądkowy 

b. do drugiej kolbki odmierzyć nadkwaśny sok żołądkowy 

c. do trzeciej kolbki odmierzyć bezkwaśny sok żołądkowy. 

Następnie do każdej kolbki dodać po 2 krople roztworu oranżu metylowego i po 4 krople 

roztworu fenoloftaleiny i dokładnie wymieszać. Zawartość każdej kolbki miareczkować 0,1N 

roztworem NaOH do barwy łososiowej, ciągle mieszając. Zapisać ilość 0,1N roztworu NaOH 

zużytego na miareczkowanie każdej kolbki. 

Ilość mililitrów 0,1 N roztworu NaOH zużyta na miareczkowanie do barwy łososiowej służy 

do obliczania zawartości wolnego kwasu solnego w soku żołądkowym. 

Następnie miareczkować dalej zawartość każdej kolbki 0,1 N roztworem NaOH do zmiany 

barwy z łososiowej na różowo-czerwoną, ciągle mieszając. Znowu zapisać całkowitą ilość 

0,1N roztworu NaOH zużytego na miareczkowanie każdej kolbki. Ilość mililitrów roztworu 

0,1 N NaOH zużyta na miareczkowanie od początku do końcowej różowo-czerwonej barwy 

służy do obliczania całkowitej kwasoty soku żołądkowego. 

Ilość 0,1N roztworu NaOH zużyta do osiągnięcia barwy łososiowej pomnożona przez 10 

odpowiada miliekwiwalentom wolnego kwasu solnego w 1 litrze soku żołądkowego (mE/l). 

Całkowita ilość 0,1N roztworu NaOH zużyta od początku miareczkowania. aż do osiągnięcia 

barwy różowo-czerwonej pomnożona przez 10 odpowiada miliekwiwalentom wszystkich 

kwasów i substancji kwaśnych w 

1 litrze soku żołądkowego (mE/l), co odpowiada całkowitej kwasocie soku żołądkowego. 

Wyjaśnienie 

Podczas miareczkowania soku żołądkowego 0,1N roztworem NaOH w obecności wskaźnika, 

który zmienia barwę przy pH 2 (oranż metylowy) ilość zużytego roztworu 0,1N NaOH 

odpowiada ilości wolnego kwasu solnego. Miareczkowanie 0,1N roztworem NaOH w 

obecności wskaźnika zmieniającego barwę w pH 8,5 (fenoloftaleina) powoduje zobojętnienie 

wolnego i buforowanego kwasu solnego oraz kwasów organicznych i innych kwaśnych 

związków, co odpowiada całkowitej kwasocie soku żołądkowego. 

3) ILOŚCIOWE OZNACZANIE DEFICYTU KWASU SOLNEGO W SOKU 

ŻOŁĄDKOWYM 

Do szklanej kolbki (o objętości 25 ml) odpipetować 10 ml bezkwaśnego (deficytowego) soku 

żołądkowego i dodać 2 krople roztworu oranżu metylowego, następnie wymieszać. Po 

wymieszaniu miareczkować 0,1N roztworem HCl do barwy łososiowej, ciągle mieszając. 

Zapisać ilość zużytego do miareczkowania 0,1N roztworu HCl, co służy do obliczania 

deficytu kwasu solnego w soku żołądkowym. Ilość 0,1N roztworu HCl zużyta do osiągnięcia 

62

arwy łososiowej pomnożona przez 10 odpowiada miliekwiwalentom deficytu kwasu solnego 

w litrze soku żołądkowego (mE/l). 

Wyjaśnienie 

Deficyt kwasu solnego w soku żołądkowym można oznaczyć miareczkując sok 0,1N 

roztworem HCl do wystąpienia reakcji na wolny kwas solny. 

4) WYKRYWANIE KWASU MLEKOWEGO W SOKU ŻOŁĄDKOWYM 

Do 2 szklanych probówek chemicznych odpipetować po 1 ml różnych soków żołądkowych: 

a. pierwsza próbówka – prawidłowy sok żołądkowy 

b. druga próbówka – bezkwaśny sok żołądkowy 

Następnie zanurzyć w nich paseczki papierka Kongo i obserwować zmiany barwy. 

Wyjaśnienie 

Papierek Kongo zanurzony w prawidłowym soku żołądkowym zabarwia się na niebiesko, 

natomiast zanurzony w deficytowym soku żołądkowym nie zmienia barwy. 

W przypadku podejrzenia o bezkwaśność soku żołądkowego (deficyt kwasu solnego) należy 

wykonać próbę na obecność kwasu mlekowego, powstającego w żołądku na wskutek 

wzmożonych procesów fermentacyjnych spowodowanych rozwojem bakterii fermentacji 

mlekowej. 

63

ROZDZIAŁ XIII 

ENZYMY PROTEOLITYCZNE 


Enzymy proteolityczne katalizują reakcje rozpadu wiązań peptydowych z udziałem 

wody. Międzynarodowa Unia Enzymatyczna zalicza je do klasy hydrolaz. 

Jak każde białko, produkowane są one w komórkach, ale jedne z nich działają wewnątrz 

komórki, natomiast inne wykazują aktywność enzymatyczną poza komórką, i dlatego dzieli 

się je na proteazy wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe. Wewnątrzkomórkowymi 

protezami są zwierzęce katepsyny (umiejscowione głównie w lizosomach) oraz 

pozalizosomalne proteazy. Enzymy te biorą udział w katabolizmie białek komórki i 

największą aktywność proteolityczną przejawiają w pH 4-5. Wyróżniamy kilka rodzajów 

katepsyn – katepsynę I, II, II, IV. Katepsyny I i II są typowymi endopeptydazami. Katepsyna 

III jest aminopeptydazą, a katepsyna IV karboksypeptydazą, są one typowymi 

egzopeptydazami. Wewnątrzkomórkowymi protezami roślinnymi są: papaina (z soku 

mlecznego drzewa melonowego), bromelaina (z łodyg ananasa) czy oficyna (z soku fig). Ich 

optimum działania przypada na pH 5-7. 

Zewnątrzkomórkowe proteazy są to enzymy, które występują we krwi i innych płynach 

pozakomórkowych pełniąc tam różnorodne funkcje np. biorą udział w krzepnięciu krwi, 

fibrynolizie, aktywacji czynników dopełniających. Proteazami tego typu są także enzymy 

układu pokarmowego umożliwiające trawienie białek pokarmowych, takie jak podpuszczka, 

pepsyna, trypsyna, chymoptrypsyna, elastaza, karboksypeptydazy A i B, aminopeptydazy 

oraz trój- i dwupeptydazy. 

W zależności od sposobu działania na cząsteczkę białka (specyficzności w stosunku do 

substratu) enzymy proteolityczne dzielimy na dwie grupy: endopeptydazy i egzopeptydazy. 

Endopeptydazy, są enzymami, które hydrolizują wiązania peptydowe znajdujące się wewnątrz 

cząsteczki białka czy peptydu rozkładając go na mniejsze fragmenty i należą do nich pepsyna, 

trypsyna, chymotrypsyna. Do endopeptydaz roślinnych zaliczane są m.in. papaina, 

bromelanina, czy ficyna. Egzopeptydazy są enzymami, które hydrolizują wiązania 

peptydowe znajdujące się na C- lub N-końcu białka, odszczepiające pojedyncze aminokwasy. 

Karboksypeptydazy są enzymami odszczepiającymi aminokwas na C końcu peptydu, 

natomiast aminopeptydazy są enzymami odszczepiającymi aminokwas na N końcu peptydu. 

Enzymy proteolityczne można podzielić także biorąc pod uwagę budowę ich centrów 

aktywnych na : 

proteazy karboksylowe - zawierające w centrum aktywnym niezdysocjowaną grupę 

karboksylową (-COOH) np. pepsyna, podpuszczka, czy katepsyna IV 

proteazy serynowe – zawierające w centrum aktywnym hydroksylową grupę seryny (-OH) 

np. trypsyna, chymotrypsyna, czy trombina (enzym układu krzepnięcia krwi) 

proteazy tiolowe – zawierające w centrum aktywnym grupę tiolową cysteiny (-SH) np. 

katepsyna II 

metaloproteazy – których aktywność zależna jest od obecności określonych jonów metali 

(cynku, wapnia czy manganu) np. karboksypeptydaza A i B, bakteryjna termolizyna czy 

kolagenaza 

64


1. Oznaczanie kinetyki działania trypsyny za pomocą miareczkowania formolowego. 

2. Wykazanie aktywności proteolitycznej podpuszczki 

3. Wykazanie aktywności proteolitycznej pepsyny 

4. Wykazanie aktywności proteolitycznej trypsyny 

WYKONANIE 

1) OZNACZANIE KINETYKI DZIAŁANIA TRYPSYNY ZA POMOCĄ 

MIARECZKOWANIA FORMOLOWEGO 

Do 4 szklanych kolbek (o objętości 25 ml) odpipetować po 5 ml roztworu formaldehydu o pH 

8,5. Przygotować dwie szklane probówki chemiczne. 

Do pierwszej szklanej probówki wlać 6 ml rotworu trypsyny, a do drugiej probówki 26 ml 

roztworu żelatyny i obie wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37 0 C na 30 minut. 

Do następnej szklanej kolbki (o objętości 50 ml) przenieść 5 ml roztworu trypsyny i 25 ml 

roztworu żelatyny (przetrzymywanych w temperaturze 37 0 C) i wymieszać. Natychmiast po 

wymieszaniu przenosić kolejno 3 mililitrowe porcje do kolbek z formaldehydem. 

Pierwszą porcję pobrać po 2 min. i wlać do jednej z czterech kolbek z formaldehydem, 

wymieszać i natychmiast miareczkować 0,02 roztworem N NaOH. 

Drugą porcję pobrać po 5 min. i wlać do drugiej z kolbek z formaldehydem, wymieszać 

i natychmiast miareczkować 0,02N roztworem NaOH. 

Trzecią porcję pobrać po 10 min. i wlać do trzeciej z kolbek z formaldehydem, wymieszać 

i natychmiast miareczkować 0,02 roztworem N NaOH. 

Czwartą porcję pobrać po 15 min. i wlać do czwartej z kolbek z formaldehydem, wymieszać 

i natychmiast miareczkować 0,02 roztworem N NaOH. 

Ilość zużytego do miareczkowania 0,02N roztworu NaOH przeliczyć na ilość mikromoli 

wiązanych protonów grup karboksylowych. 

1 ml 0,02N roztworu NaOH odpowiada 20 mikromolom (µmol)grup karboksylowych. 

(- COOH). 

Sporządzić wykres zależności między ilością uwalnianych grup karboksylowych 

aminokwasów, a czasem inkubacji. Oznaczyć prędkości początkowe reakcji w µmol/min. 

Wyjaśnienie 

W środowisku zasadowym trypsyna rozkłada żelatynę, a uwolnione protony grup 

karboksylowych w wytworzonych peptydach stają się dostępne dla miareczkowania. 

Aktywność trypsyny można mierzyć oznaczając przyrost wolnych grup karboksylowych. W 

środowisku zawierającym formalinę, grupy aminowe wiążą się z formaliną i przestają wiązać 

protony. 

2) WYKAZANIE PROTEOLITYCZNEJ AKTYWNOŚCI PODPUSZCZKI 

Do trzech szklanych probówek chemicznych wlać po 2 ml świeżego mleka. 

Następnie: 

a. do pierwszej próbówki dodać 0,5 ml 0,01N roztworu HCl i 0,5 ml roztworu podpuszczki, 

wymieszać. 

b. do drugiej próbówki dodać 0,5 ml 0,01N roztworu HCl i 0,5 ml roztworu zdenaturowanej 

podpuszczki, wymieszać. 

65

Zdenaturowaną podpuszczkę przygotować przez jej zagotowanie! 

1 ml roztworu podpuszczki odpipetować do szklanej probówki i wstawić do wrzącej łaźni 

wodnej na 10 minut! 

c. do trzeciej próbówki dodać 0,5 ml 0,01N roztworu HCl i 0,5 ml roztworu podpuszczki 

i 1 ml 0,2N roztworu szczawianu amonu, wymieszać. 

Wszystkie próbówki wstawić do łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 0 C na 20 minut. 

Po tym czasie obserwować zmiany w próbówkach. 

Wyjaśnienie 

Podpuszczka (chymozyna, rennina), enzym występujący w żołądku osesków, działa w pH 

3.5-4. Jak widać w pierwszej probówce, enzym ten przekształca kazeinę (białko mleka) do 

parakazeiny (forma rozpuszczalna), która z jonami wapnia tworzy nierozpuszczalny 

parakazeinian wapnia. W drugiej probówce, zdenaturowana pod wpływem wysokiej 

temperatury podpuszczka jest nie aktywna, a więc nie wytworzy się parakazeinian wapnia. 

Szczawianu amonu wiąże jony wapnia występujące w mleku, co uniemożliwia tworzenie się 

parakazeinianu wapnia, co widać w trzeciej probówce. 

3) WYKAZANIE PROTEOLITYCZNEJ AKTYWNOŚCI PEPSYNY 

Do każdej z 4 szklanych probówek chemicznych wrzucić niewielkie ilości białka jaja kurzego 

lub włóknika. 

Następnie: 

a. do pierwszej probówki dodać 2 ml 0,1N roztworu HCl i 2 ml roztworu pepsyny, 

wymieszać. 

b. do drugiej probówki dodać 2 ml 0,1 N roztworu HCl i 2 ml roztworu zdenaturowanej 

pepsyny, wmieszać. 

Zdenaturowaną pepsynę przygotować przez jej zagotowanie! 3 ml roztworu pepsyny 

odpipetować do szklanej probówki i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut! 

c. do trzeciej probówki dodać 2 ml 0,1 roztworu N Na2CO3 i 2 ml roztworu pepsyny, 

wymieszać. 

d. do czwartej probówki dodać 2 ml 0,1N roztworu HCl i 2 ml wody destylowanej, 

wymieszać. 

Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 0 C na około 30 min. 

Po tym czasie obserwować zmiany w probówkach. 

Wyjaśnienie 

W prawidłowych warunkach (pH 1-2 i optymalna temp. 37 o C) pepsyna rozkłada białko, co 

widać w pierwszej probówce. W drugiej probówce, zdenaturowana pod wpływem wysokiej 

temperatury pepsyna jest nieaktywna, 

a więc nie rozkłada białka W zasadowym pH, pepsyna nie działa (trzecia próbówka). 

W czwartej próbówce nie nastąpił rozkład białka, bo nie dodaliśmy enzymu. 

4) TRAWIENIE KAZEINY PEPSYNĄ W ŚRODOWISKU KWAŚNYM 

Przygotować 2 szklane probówki chemiczne. 

a. do pierwszej odpipetować 1 ml roztworu pepsyny i 5 ml kwaśnego roztworu kazeiny. 

b. do drugiej odpipetować 1 ml roztworu zdenaturowanej pepsyny i 5 ml kwaśnego roztworu 

kazeiny. 

66

Pepsynę zdenaturować przez zagotowanie roztworu! 

2 ml roztworu pepsyny odpipetować do szklanej probówki i wstawić do wrzącej łaźni wodnej 

na 10 minut! 

Obie próbówki wstawić do łaźni wodnej temp. 37 0 C na około 30 minut. 

Po tym czasie do obu próbówek dodawać kroplami 10% roztwór octanu sodu i obserwować 

zmiany w probówkach. 

Wyjaśnienie 

W pierwszej próbówce następuje rozkład kazeiny, ponieważ enzym jest aktywny 

w prawidłowych warunkach (kwaśne środowisko i optymalna temperatura 37 0 C) i nie pojawia 

się osad kazeiny po dodaniu octanu sodu. 

W drugiej próbówce enzym został zniszczony przez zagotowanie i po dodaniu octanu sodu 

powstaje osad nie strawionej kazeiny. Dodanie octanu sodu wytwarza pH punktu 

izoelektrycznego charakterystycznego dla kazeiny (4,5), w którym białko to jest 

nierozpuszczalne. 

5) WYKAZANIE PROTEOLITYCZNEJ AKTYWNOŚCI TRYPSYNY 

Do każdej z 4 szklanych probówek chemicznych wrzucić niewielkie ilości białka jaja kurzego 

lub włóknika. 

Następnie: 

a. do pierwszej probówki dodać 2 ml 0,2% roztworu Na2CO3 i 2 ml roztworu trypsyny, 

wymieszać. 

b. do drugiej próbówki dodać 2 ml 0,2% roztworu Na2CO3 i 2 ml roztworu zdenaturowanej 

trypsyny, wymieszać. 

Trypsynę zdenaturowaną przez zagotowanie roztworu.! 

3 ml roztworu trypsyny odpipetować do szklanej probówki i wstawić do wrzącej łaźni wodnej 

na 10 minut! 

c. do trzeciej probówki dodać 2 ml 0,1N roztworu HCl i 2 ml roztworu trypsyny, wymieszać. 

d. do czwartej próbówki dodać 2 ml 0,2% roztworu Na2CO3 i 2 ml wody 

destylowanej.wymieszać. 

Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 0 C na około 30 min. 

Po tym czasie obserwować zmiany w próbówkach. 

Wyjaśnienie 

W prawidłowych warunkach (pH 7,5-8,0 i optymalna temp. 37 o C) trypsyna rozkłada białko, 

co widać w pierwszej probówce. W drugiej probówce zdenaturowana pod wpływem wysokiej 

temperatury trypsyna jest nieaktywna, a więc nie rozkłada białka. W nieprawidłowym, 

kwaśnym pH, trypsyna nie działa (trzecia próbówka). W czwartej próbówce reakcja nie 

nastąpił rozkład białka, bo nie dodaliśmy enzymu. 

6) TRAWIENIE ŻELATYNY PRZEZ TRYPSYNĘ 


a. do pierwszej probówki odpipetować 3 ml 1% roztworu Na2CO3 i 3 ml roztworu trypsyny. 

b. do drugiej probówki odpipetować 3 ml 0,2% roztworu HCl i 3 ml roztworu trypsyny. 

67

Do obu włożyć po skrawku błony fotograficznej (wywołanej i utrwalonej). Obie próbówki 

wstawić do łaźni wodnej temp. 37 0 C na około 2 godziny. Po tym czasie obserwować zmiany 

w obu próbówkach 

Wyjaśnienie 

W wywołanej błonie fotograficznej (warstwa żelatyny) utkwione są cząstki srebra. Pod 

wpływem działania trypsyny warstwa żelatyny zostaje nadtrawiona, a cząstki srebra zostają 

wypłukane (ciemny osad na dnie probówki) i pozostaje tylko przezroczysta warstwa żelatyny. 

7) TRAWIENIE KAZEINY TRYPSYNĄ W ROZTWORZE ALKALICZNYM 


a. do pierwszej probówki odpipetować 2 ml roztworu trypsyny i 2 ml alkalicznego roztworu 

kazeiny. 

b. do drugiej probówki odpipetować 2 ml roztworu denaturowanej trypsyny i 2 ml 

alkalicznego roztworu kazeiny. 

Trypsynę zdenaturować przez zagotowanie roztworu! 

3 ml roztworu trypsyny odpipetować do szklanej probówki i wstawić do wrzącej łaźni wodnej 

na 10 minut! 

Obie próbówki wstawić do łaźni wodnej temp. 37 0 C na około 30 minut. Po tym czasie do obu 

probówek dodać kroplami 1% alkoholowy roztwór kwasu octowego i obserwować zmiany 

zachodzące w probówkach. 

Wyjaśnienie 

W pierwszej próbówce następuje rozkład kazeiny, ponieważ enzym jest aktywny (alkaliczne 

środowisko i optymalna temperatura 37 0 C) i nie pojawia się osad kazeiny po dodaniu kwasu 

octowego. W drugiej próbówce enzym został zniszczony przez zagotowanie i po dodaniu 

kwasu octowego powstaje osad niestrawionej kazeiny. Dodanie kwasu octowego wytwarza 

pH punktu izoelektrycznego charakterystycznego dla kazeiny (pH 4,5), w którym białko to 

jest nierozpuszczalne. 

68

ROZDZIAŁ XIV 

PRZEMIANA POŚREDNIA AMINOKWASÓW 


W metabolizmie aminokwasów istotna rolę odgrywają reakcje transaminacji 

katalizowane przez transaminazy (aminotransferazy), enzymy z klasy transferaz. Grupą 

prostetyczną tych enzymów jest fosforan pirydoksalu (witamina B6). Podczas reakcji 

następuje przeniesienie grupy aminowej z L-aminokwasu na α-ketokwas i wytwarza się nowy 

L-aminokwas i nowy α-ketokwas. Początkowo w centrum aktywnym enzymu grupa aminowa 

aminokwasu wiąże się z grupą aldehydową fosforanu pirydoksalu, wytwarzając połączenie 

typu zasady Schiffa. W następnym etapie reakcji odłącza się α-ketokwas, a grupa aminowa 

pozostaje związana z fosforanem pirydoksalu tworząc fosfopirydoksaminę. Centrum aktywne 

enzymu zostaje połączone z α-ketokwasem, który poprzez grupę ketonową reaguje z grupą 

aminową fosforanu pirydoksaminy, co prowadzi do wytworzenia nowego L-aminokwasu. Jak 

widać reakcja transaminacji jest reakcją prowadząca jednocześnie do rozpadu jednego 

L-aminokwasu oraz syntezy drugiego L-aminokwasu. Reakcje transaminacji przebiegają 

prawie we wszystkich tkankach i narządach organizmu ssaków. Najbogatsze w transaminazy 

są komórki: wątroby, serca, nerki oraz mięśni szkieletowych, gdzie enzymy te występują 

w cytoplazmie. Niewielkie ilości tych enzymów przeciekają przez błony komórki do osocza 

krwi. Znane są ich fizjologiczne zawartości we krwi. W momencie uszkodzenia błon 

komórkowych, treść tych komórek, a w tym także transaminazy przechodzą do płynu 

tkankowego i krwi. 

Transaminaza asparaginowa (ASPAT) i alaninowa (ALAT) są enzymami, które występują 

w dużych ilościach w mięśniu sercowym, mięśniach szkieletowych, wątrobie i mózgu. 

W surowicy krwi ludzi zdrowych stosunek aktywności AspAT do ALAT kształtuje się jak 

2:1. Normalna aktywność tych transaminaz w surowicy krwi zależna jest od zastosowanej 

metody oznaczania i waha się dla ASPAT pomiędzy 0 a 41 jednostek aktywności, dla ALAT 

pomiędzy 0 a 45 jednostek na mililitr osocza krwi. Wzrost aktywności w surowicy krwi tych 

enzymów wskazuje na uszkodzenie narządów. Dużą aktywność ASPAT stwierdza się 

w zawale mięśnia sercowego, w dystrofiach mięśni, w zapaleniu skóry i mięśni oraz 

w mioglobinurii napadowej. Dużą aktywność ALAT stwierdza się w ostrym zakaźnym 

(wirusowym) zapaleniu wątroby. W marskości wątroby oraz w pierwotnym lub 

przerzutowym nowotworze wątroby wzrost ASPAT jest zwykle wyższy niż ALAT. 

Małą aktywność transaminaz stwierdza się przy niedoborze witaminy B6 (np. spowodowanym 

powtarzanymi hemodializami), w niewydolności nerek i w ciąży. 

Mocznik jest głównym końcowym produktem katabolizmu azotu u człowieka. 

Mocznik syntetyzowany jest w wątrobie, a następnie uwalniany do krwi i wydalany przez 

nerki. Stanowi 80-90% wydalanego azotu. Nawet znikome ilości amoniaku są toksyczne dla 

układu nerwowego. Źródłem amoniaku jest głównie metabolizm aminokwasów. Objawami 

zatrucia amoniakiem są upośledzenie widzenia, bełkotliwa mowa, natomiast w ciężkich 

przypadkach śpiączka i zgon. Toksyczny amoniak przekształcany jest w nietoksyczny 

mocznik w cyklu mocznikowym. Wszelkie zaburzenia syntezy mocznika mogą spowodować 

zatrucie amoniakiem. Klinicznymi objawami, wspólnymi dla wszystkich zaburzeń tego 

procesu detoksykacji są: unikanie diety bogatej w białko, wymioty, nerwowość, letarg 

i opóźniony rozwój umysłowy. Ale i mocznik w podwyższonych ilościach jest związkiem 

toksycznym dla organizmu. W dużych stężeniach jest on czynnikiem denaturującym białko. 

Prawidłowa zawartość mocznika w osoczu krwi powinna wahać się między 3,3 do 6,7 mmol/l 

(20 do 40 mg%). Podwyższony poziom mocznika w osoczu krwi obserwuje się przy 

69

wzmożonym katabolizmie białek, w niewydolności nerek, mocznicy. Obniżony poziom 

mocznika występuje przy diecie niskobiałkowej, w ciężkich schorzeniach wątroby. 


1. Preparatyka transaminazy alaninowej z wątroby 

2. Ilościowe oznaczanie aktywności aminotransferazy alaninowej 

3. Ilościowe oznaczanie zawartości mocznika w surowicy krwi 

1) PREPARATYKA TRANSAMINAZY ALANINOWEJ (ALAT) Z WĄTROBY 

Do homogenizatora wrzucić 5 g drobno pokrojonej wątroby, następnie wlać 100 ml buforu 

fosforanowego o pH 7,4 i homogenizować 5 minut. Homogenat przelać do dużych próbówek 

wirówkowych i wirować 15 minut w 4000 obr/min. Osad odrzucić, a supernatant zawierający 

aminotransaminazę alaninową wykorzystać do ilościowego oznaczania jej aktywności. 

2) ILOŚCIOWE OZNACZANIE AKTYWNOŚCI TRANSAMINAZY ALANINOWEJ 

Przygotowanie próby badanej: 

Do szklanej probówki chemicznej odpipetować 0.5 ml substratu dla transaminazy alaninowej. 

Następnie dodać 0,1 ml supernatantu zawierającego transaminazę alaninową, wymieszać 

i pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach dodać do próby badanej 

0,5 ml roztworu 2,4-dinitrofenylohydrazyny, wymieszać i pozostawić na 20 minut 

w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach dodać 5 ml 0,4 N roztworu NaOH, wymieszać 

i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie przygotować próbę 

kontrolną! 

Przygotowanie próby kontrolnej: 

Do szklanej probówki chemicznej odpipetować 0,5 ml substratu dla transaminazy alaninowej. 

Następnie dodać 0,1 ml supernatantu zawierającego transaminazę alaninową, i bezpośrednio 

po tym, bardzo szybko!!! dodać 5 ml 0,4 N roztworu NaOH i 0,5 ml roztworu 

2,4-dinitrofenylohydrazyny, następnie szybko i dokładnie wymieszać !!! 

Odczytać absorbcję próby badanej wobec próby kontrolnej przy długości fali 505 nm. 

Z krzywej kalibracyjnej odczytać jednostki.aktywności enzymatycznej dla aminotransferazy 

alaninowej. 

Przeliczyć jednostki aktywności enzymatycznej na 1 g wątroby. 

Wyjaśnienie 

Transaminaza alaninowa (ALAT) katalizuje reakcje przeniesienia grupy aminowej 

z L-alaniny na α-ketoglutaran, a produktami tej reakcji są L-glutaminian i pirogronian. 

L-alanina + α-ketoglutaran �� L-glutaminian + pirogronian 

Miarą aktywności transaminazy alaninowej jest przyrost ilości pirogronianu, który 

z 2,4-dinitrofenylohydrazyną tworzy fenylohyrazon, który w środowisku zasadowym ma 

barwę brunatnoczerwoną. Natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do aktywności 

enzymu. 

70

3) OZNACZANIE ZAWARTOŚCI MOCZNIKA W SUROWICY KRWI 

Przygotowanie próby badanej: 

Do próbówki wirówkowej odmierzyć 2 ml surowicy, a następnie dodać 8 ml dokładnie 

wymieszanego odczynnika odbiałczającego, dokładnie wymieszać przez 5 minut. Następnie 

odwirować przy 3000 obrotów na minutę przez 5 minut. Po odwirowaniu pobrać 4 ml 

klarownego przesączu i dodać 1 ml odczynnika Ehrlicha, wymieszać i pozostawić na 5 minut. 

Następnie przygotować próbę kontrolną. 

Przygotowanie próby kontrolnej: 

Do szklanej probówki odmierzyć 4 ml 0.9 % roztworu NaCl i 1 ml odczynnika Ehrlicha, 

wymieszać. 

Następnie odczytać absorpcję próby badanej wobec próby kontrolnej przy długości fali 440 

nm. Przy pomocy krzywej kalibracyjnej obliczyć zawartość mocznika w surowicy krwi. 

Wyjaśnienie 

Po usunięciu z surowicy innych związków azotowych (z odczynnikiem odbiałczającym), 

mocznik tworzy barwny kompleks z p-dimetyloaminobenzaldehydem (odczynnik Ehrlicha). 

Natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia mocznika. 

71

ROZDZIAŁ XV 

KWASY NUKLEINOWE 


Kwasy nukleinowe - kwasy deoksyrybonukleinowy (DNAs) i kwasy rybonukleinowe 

(RNAs) – należą do podstawowych składników prawie każdej komórki. Są one zróżnicowane 

co do funkcji biologicznych, lokalizacji w obrębie komórki, budowy, składu i wielkości 

cząsteczek. 

Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) występuje w jądrze komórkowym i mitochondriach 

organizmów eukariotycznych. DNA jest chemiczną podstawą dziedziczności, zawiera 

informację genetyczną. Ten rodzaj kwasu nukleinowego służy jako matryca w procesie 

replikacji informacji genetycznej podczas podziału komórki, jest także matrycą w trakcie 

transkrypcji, w procesie syntezy RNA. 

Kwasy deoksyrybonukleinowe są związkami, których masa cząsteczkowa sięga kilkuset 

milionów daltonów. We wszelkiego rodzaju organizmach istnieją 3 podstawowe rodzaje 

kwasów rybonukleinowych (RNA): rRNA, mRNA i tRNA. Rybosomalny kwas 

rybonukleinowy (rRNA) odgrywa rolę w budowie i funkcji rybosomów, systemów organelli 

komórkowych służących do syntezy białka. Matrycowy kwas rybonukleinowy (mRNA) służy 

jako matryca do syntezy łańcuchów peptydowych w procesie translacji. Jest kwasem 

rybonukleinowym przenoszącym informacje z DNA do miejsca syntezy łańcucha 

peptydowego. Transportujący kwas rybonukleinowy (tRNA) służy do transportu aminokwasu 

procesie translacji informacji genetycznej zawartej w mRNA. Istnieje kilkadziesiąt rodzajów 

cząsteczek tRNA. 

Kwasy nukleinowe są związkami zbudowanymi z nukleotydów połączonych ze sobą 

wiązaniami fosfodiestrowymi utworzonymi pomiędzy resztą fosforanową a grupami 

hydroksylowymi w pozycji 3` i 5` dwóch sąsiednich cząsteczek cukrów: rybozy w przypadku 

RNA i 2-deoksyrybozy w przypadku DNA. 

Wspólną cechą kwasów nukleinowych jest ich polinukleotydowa budowa. Po hydrolizie 

kwasów nukleinowych powstają wolne nukleotydy składające się z zasady azotowej, cukru i 

reszty fosforanowej. Zasadami azotowymi wchodzącymi w skład łańcuchów 

polinukleotydowych kwasów nukleinowych są pochodne puryny lub pirymidyny. Głównymi 

purynami są adenina i guanina, a głównymi pirymidynami są cytozyna, uracyl (w przypadku 

RNAs) i tymina (w przypadku DNAs). Po odłączeniu reszty fosforanowej od nukleotydów 

powstają nukleozydy. Podstawowymi składnikami nukleozydów są zasady azotowe 

(purynowe i pirymidynowe) i cukry (ryboza w przypadku RNA i dezoksyryboza w przypadku 

DNA). Zasady azotowe połączone są z cukrami wiązaniami β-N-glikozydowymi. Atom węgla 

pierwszego (C-1`) cukru tworzy wiązanie glikozydowe z azotem pierwszym (N-1) zasady 

pirymidynowej lub azotem dziewiątym (N-9) zasady purynowej. 

Ilość kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) w komórce jest cechą stałą dla danego 

gatunku. Kwas dezoksyrybonukleinowy ma wielkie rozmiary i w związku z tym ma znaczny 

stopień upakowania cząsteczki. Długie łańcuchy DNA mają zdolność spiralizacji. Dwa 

spiralne łańcuchy DNA układają się względem siebie antyrównolegle, tworząc dalej 

superhelikalne struktury oplatające histony H2a, H2b, H3, H4 zwane nukleosomami. 

Nukleosomy tworzą dalsze struktury helikalne zwane solenoidami. Nukleoproteiny są to 

białka złożone, w których częścią niebiałkową są kwasy nukleinowe. W jądrze komórkowym 

kwas deoksyrybonukleinowy w połączeniu z białkami histony i białka niehistonowe) tworzy 

chromatynę. Rybosomalny kwas rybonukleinowy łącząc się z białkami tworzy rybosomy. 

Podczas rozkładu nukleoprotein kwasy nukleinowe są uwalniane po proteolizie białka. 

Łańcuchy DNA ulegają hydrolizie przy udziale deoksyrybonukleaz, enzymów z klasy 

72

hydroliz, natomiast łańcuchy RNA rozszczepiane są przez rybonukleazy. Powstające 

nukleotydy mogą ulegajać reakcji deaminacji. Produktem tej reakcji jest amoniak i 

deaminowane nukleotydy. Nukleotydy mogą również pod wpływem nukleotydaz i fosfataz 

ulegać rozkładowi do nukleozydów i kwasu o-fosforowego, a następnie do wolnych zasad 

azotowych i cukrów. Katabolizm zasad prowadzi do powstania różnych związków. Cytozyna 

i uracyl ulegaja przemianom do beta-alaniny, tymina dokwasi beta-aminoizomasłowego. 

U człowieka, końcowym produktem katabolizmu zasad purynowych jest utleniona puryna - 

kwas moczowy. W przemianie puryn ważą rolę odgrywają wątroba i nerki. Przy uszkodzeniu 

tych organów zwiększa się zawartość kwasu moczowego w surowicy krwi. Podwyższony 

poziom kwasu moczowego (hyperurykemia), pojawia się w dnie moczanowej oraz we 

wszystkich stanach niewydolności nerek. Wzrost poziomu kwasu moczowego występuje 

często w czasie głodzenia, przy zatruciu alkoholem, pod wpływem salicylatów, leków 

obniżających ciśnienie. Obniżenie stężenia kwasu moczowego można uzyskać po 

zastosowaniu diety bezpurynowej. Kwas moczowy jest związkiem trudno rozpuszczalnym w 

wodzie, łatwo wytrąca się w postaci kryształów soli sodowych kwasu moczowego i tworzy 

kamienie moczanowe w nerce, a także może odkładać się w narządach i tkankach. 

Prawidłowy poziom kwasu moczowego w osoczu człowieka waha się od 210-480 µmol/l 

(3,5 - 8,0 mg %). 


1. Preparatyka kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) z wątroby 

2. Charakterystyka kwasu deoksyrybonukleinowego otrzymanego z wątroby 

3. Preparatyka kwasów rybonukleinowych (RNA) z drożdży 

4. Charakterystyka kwasów rybonukleinowych otrzymanych z drożdży 

5. Ilościowe oznaczanie zawartości kwasu moczowego w surowicy krwi 

1) PREPARATYKA KWASU DEOKSYRYBONUKLEINOWEGO (DNA) 

Z WĄTROBY 

10 g wątroby wrzucić do homogenizatora, dopełnić do 100 ml 0,25M roztworem sacharozy 

w 0,9% roztworze NaCl. Zawartość homogenizować 2 minuty, przenieść do probówek 

wirówkowych i odwirować przy 3000 obr/min przez 15 minut. Supernatant odrzucić, osad 

zalać 3-5 objętościami (ok. 50 ml) 1M roztworu NaCl i mieszać około 15 minut w łaźni 

lodowej, a pod koniec mieszania dodać powoli! kroplami 9 ml 5% roztworu siarczanu 

dodecylo-sodowego (SDS) w 45% etanolu (działającym jako detergent), następnie wirować 

15 minut przy 3000 obr/min. Po odwirowaniu oddzielić osad od supernatantu. Osad zawiera 

białka, a supernatant DNA. Supernatant przelać do szklanej probówki i potraktować równą 

objętością etanolu. Etanol dodawać powoli ciągle mieszając bagietką, podczas mieszania 

powstają galaretowate włókna kwasu deoksyrybonukleinowego owijające się wokół bagietki. 

Na osadzie zawierającym białka należy wykonać próbę biuretową. Część osadu przenieść do 

szklanej probówki chemicznej i zawiesić w 1 ml wody destylowanej, następnie dodać 1 ml 

2N roztworu NaOH i wkroplić 2 krople 1% roztworu CuSO4, wymieszać. Fiołkowe 

zabarwienie roztworu świadczy o obecności związku zawierającego wiązania peptydowe. 

Wyjaśnienie 

Wątroba jest narządem zawierającym bardzo duże ilości kwasów nukleinowych, w tym 

kwasu deoksyrybo-nukleinowego (DNA), który występuje w postaci kompleksu z białkami. 

Po odwirowaniu homogenatu tkankowego w osadzie (jądra komórkowe) pozostają 

73

deoksyrybonukleoproteiny, które można ekstrahować do roztworu 1 M NaCl. Siarczan 

dodecylowo-sodowy rozbija kompleksy DNA z białkami. 

DNA nie rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych i wytrąca się z roztworu pod 

wpływem etanolu. 

2. CHARAKTERYSTYKA KWASU DEOKSYRYBONUKLEINOWEGO (DNA) 

OTRZYMANEGO Z WĄTROBY 

Pobrać niewielką ilość DNA otrzymanego z wątroby i rozpuścić w 4 ml 0,9% NaCl 

a. Hydroliza DNA i wykrywanie obecności fosforanów i zasad purynowych w hydrolizacie 

Hydroliza DNA 

Do szklanej probówki chemicznej pobrać około 2 ml roztworu DNA w 0,9 % NaCl, dodać 

1 ml stężonego H2SO4, wymieszać. Po wymieszaniu probówkę umieścić we wrzącej łaźni 

wodnej i pozostawić na 15 minut, utrzymując cały ten czas temperaturę wrzenia w łaźni. Po 

15 minutach probówkę z hydrolizatem DNA ostudzić, a po ostudzeniu hydrolizat DNA 

zobojętnić wobec papierka lakmusowego, stężonym NH4OH (ostrożnie – oba roztwory są 

mocno żrące!!). Na zobojętnionym hydrolizacie DNA wykonać próby na obecność 

fosforanów i zasad purynowych. 

Wykrywanie obecności fosforanów. 

Do szklanej probówki chemicznej odpipetować około 1 ml hydrolizatu DNA, następnie dodać 

0,5 ml 2N roztworu HNO3 i 2 ml molibdenianu amonowego, wymieszać. Po wymieszaniu 

probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać, aż do momentu kiedy w probówce 

pojawi się żółte zabarwienie świadczące o obecności fosforanów. Po ostygnięciu może 

wypaść żółty osad fosfomolibdenianu amonu. 

Wykrywanie obecności zasad purynowych. 

Do szklanej probówki chemicznej odpipetować około 1 ml hydrolizatu DNA, następnie 

kroplami dodawać 0,1N roztworu AgNO3 ciągle mieszając. Po pewnym czasie pojawi się 

biały osad soli srebrowych zasad purynowych, które są nierozpuszczalne w amoniaku. 

Rozpuszczalność osadu sprawdzić przez dodanie w nadmiarze rozcieńczonego roztworu 

NH4OH (wodorotlenek amonu). 

Wyjaśnienie 

Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) pod wpływem stężonego kwasu siarkowego ulega 

hydrolizie do nukleotydów, które z kolei dalej rozpadają się na zasady purynowe, 

dezoksyrybozę i reszty kwasu o-fosforowego. W tych warunkach nukleotydy pirymidynowe 

nie ulegają rozpadowi. 

Reszty kwasu fosforowego z molibdenianem amonu tworzą żółty osad fosfomolibdenianu 

amonu. 

Zasady purynowe z azotanem srebra tworzą biały osad soli srebrowych 

nierozpuszczalnych 

w amoniaku. 

b. Wykrywanie obecności cukru w roztworze DNA nie poddanym hydrolizie 

Ogólna reakcja na wykrywanie cukrów (Reakcja Molischa) 

Do szklanej probówki chemicznej odpipetować około 1 ml roztworu niezhydrolizowanego 

DNA, następnie dodać 0,5 ml roztworu α-naftolu, wymieszać i podwarstwić stężonym 

H2SO4. Na granicy cieczy pojawi się fioletowy pierścień świadczący o obecności cukru. 

74

Wykrywanie obecności deoksyrybozy (Reakcja Dischego) 

Do szklanej probówki chemicznej odpipetować około 1 ml roztworu niehydrolizowanego 

DNA, następnie dodać 2 ml odczynnika Dischego, wymieszać. Po wymieszaniu probówkę 

wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut, cały ten czas utrzymując temperaturę wrzenia 

w łaźni. Po 10 minutach w probówce pojawi się niebieskie zabarwienie świadczące 

o obecności deoksyrybozy. 

Wyjaśnienie 

Podczas kwaśnej hydrolizy DNA deoksyryboza może w znacznej mierze ulec rozpadowi. 

W związku z tym reakcje wykrywające obecność cukru wykonywane są na DNA nie 

poddanym hydrolizie. 

Cukry o liczbie atomów węgla większej niż 4 w cząsteczce pod wpływem mocnych kwasów 

nieorganicznych ulegają odwodnieniu i cyklizacji. Pentozy przekształcają się w furfural, 

a heksozy w hydroksymetylofurfural. Furfuralowe pochodne reagując z fenolowymi 

pochodnymi dają barwne związki. Podczas reakcji wszystkich pochodnych (furfuralowych 

i hydroksyfurfuralowych) z α-naftolem tworzy się fioletowy pierścień świadczący 

o obecności cukru (reakcja Molischa). Obecność deoksyrybozy potwierdza reakcja Dischego. 

Deoksyryboza w obecności stężonego kwasu nieorganicznego wytwarza furfural, który 

reagując z dwufenyloaminą tworzy związek o niebieskiej barwie. 

3) PREPARATYKA KWASU RYBONUKLEINOWEGO (RNA) Z DROŻDŻY 

10 g drożdży przenieść do szerokiej szklanej probówki chemicznej i dodać 5 ml wody 

destylowanej, wymieszać dokładnie szklaną bagietką. Następnie dodać 5 ml 2M roztworu 

NaCl i wytrząsać intensywnie przez 

10 minut, aż do wytworzenia jednorodnej mieszaniny. Probówkę z mieszaniną wstawić do 

łaźni wodnej o temperaturze 90 0 C i przez 7 minut mieszać zawartość probówki, cały ten czas 

utrzymując temperaturę 90 0 C w łaźni. Po wyjęciu z łaźni probówkę ochłodzić w łaźni 

lodowej, a po ochłodzeniu, przelać zawartość probówki do dwóch probówek wirówkowych 

i wirować przy 4000 obr/min. przez około 20 minut. Oddzielić osad od supernatantu. Osad 

zawiera białka, a supernatant RNA. 

Wykonać na części osadu próbę biuretową wykazującą obecność białka. Część osadu 

przenieść do szklanej probówki chemicznej i rozpuścić w 1 ml wody destylowanej, dodać 

1 ml 2N roztworu NaOH i wkroplić dwie krople 1% roztworu CuSO4, wymieszać. Fiołkowa 

barwa roztworu świadczy o obecności związku zawierającego wiązania peptydowe. 

Przelać supernatant zawierający RNA do dwóch czystych probówek wirówkowych i wstawia 

do łaźni lodowej. Po ochłodzeniu zawartości probówek, dodawać powoli! kroplami 2 ml 60% 

roztworu HClO4,, wcześniej ochłodzonego!, ciągle mieszając. Probówki pozostawić w łaźni 

lodowej na 10 minut. Po tym czasie zawartość probówek należy wirować 15 minut przy 

4000 obr/min. Supernatant odrzucić, a osad zawierający rozpuszczalne kwasy 

rybonukleinowe rozpuścić 4 ml wody destylowanej. 

Wyjaśnienie 

Podczas ogrzewania komórek drożdżowych w 1M roztworze NaCl rozpuszczalne kwasy 

rybonukleinowe, w niewielkim stopniu zanieczyszczone białkami przechodzą do roztworu. 

Zawarte w roztworze kwasy rybonukleinowe wytrąca się w niskiej temperaturze (w celu 

uniknięcia rozpadu RNA) poprzez zastosowanie 60% roztworu HClO3. 

75

4) CHARAKTERYSTYKA KWASÓW RYBONUKLEINOWYCH OTRZYMANYCH 

Z DROŻDŻY 

a. Hydroliza RNA i wykrywanie obecności fosforanów i zasad purynowych 

Hydroliza RNA 

Do szklanej probówki chemicznej odpipetować 2 ml roztworu kwasów rybonukleinowych 

(z powyższej preparatyki RNA), następnie dodać 1 ml stężonego H2SO4, i wymieszać. 

Po wymieszaniu probówkę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na okres 15 minut, cały ten 

czas utrzymując temperaturę wrzenia w łaźni. Po tym czasie probówkę wyjąć i ochłodzić. Po 

ochłodzeniu roztwór hydrolizatu kwasów rybonukleinowych zobojętnić wobec papierka 

lakmusowego stężonym roztworem NH4OH (ostrożnie roztwór żrący!) i wykonać próby na 

obecność fosforanów i zasad purynowych. 

Wykrywanie obecności fosforanów 

Do szklanej probówki chemicznej odpipetować 1 ml hydrolizatu kwasów rybonukleinowych, 

dodać 0,5 ml stężonego HNO3 i 2 ml molibdenianu amonu. Następnie probówkę z roztworem 

wstawić do wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać, aż do momentu kiedy w próbówce pojawi się 

żółte zabarwienie. Po ostygnięciu może wypaść żółty osad fosfomolibdenianu amonu. 

Wykrywanie obecności zasad purynowych. 

Do szklanej probówki chemicznej odpipetować 2 ml hydrolizatu kwasów 

rybonukleinowych, następnie kroplami dodawać 0,1N roztworu AgNO3 ciągle mieszając. 

Po pewnym czasie pojawi się biały osad soli srebrowych zasad purynowych, które są 

nierozpuszczalne w amoniaku. Rozpuszczalność osadu sprawdzić przez dodanie w 

nadmiarze rozcieńczonego roztworu NH4OH. 

Wyjaśnienie 

Kwasy rybonukleinowe pod wpływem stężonego kwasu siarkowego ulegają hydrolizie do 

nukleotydów, które z kolei dalej rozpadają się na zasady purynowe, rybozę i reszty kwasu ofosforowego. 

W tych warunkach nukleotydy pirymidynowe nie ulegają rozpadowi. 

Reszty kwasu fosforowego z molibdenianem amonu tworza żółty osad fosfomolibdenianu 

amonu. 

Zasady purynowe z azotanem srebra tworzą biały osad soli srebrowych 

nierozpuszczalnych w amoniaku. 

b. Wykrywanie obecności cukru w roztworze RNA nie poddanego hydrolizie 

Ogólna reakcja na wykrywanie cukrów (Reakcja Molischa) 

Do szklanej próbówki chemicznej odpipetować 1 ml roztworu niehydrolizowanych kwasów 

rybonukleinowych, następnie dodać 0,5 ml roztworu α-naftolu, wymieszać i podwarstwić 

stężonym H2SO4 . 

Na granicy cieczy pojawi się fioletowy pierścień świadczący o obecności cukru. 

Wykrywanie obecności rybozy 

Do szklanej próbówki chemicznej odpipetować 1 ml roztworu niehydrolizowanych kwasów 

rybonukleinowych, następnie dodać 1 ml odczynnika orcynolowego, wymieszać. Po 

wymieszaniu próbówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 15 minut, cały ten czas 

utrzymując temperaturę wrzenia w łaźni. Po tym czasie roztwór zabarwi się na zielono, co 

świadczy o obecności rybozy. 

76

Wyjaśnienie 

Pentozy wolne oraz związane w nukleozydach ogrzewane ze stężonym HCl przechodzą 

w furfural, który z orcyną i jonami Fe +3 tworzą kompleks o zielonej barwie. Dodatni odczyn 

na pentozy dają jedynie nukleozydy i nukleotydy purynowe, nie dają zaś pirymidynowe. 

5) ILOŚCIOWE OZNACZANIE ZAWARTOŚCI KWASU MOCZOWEGO 

W SUROWICY KRWI 

Przygotowanie próby kontrolnej 

Do szklanej probówki chemicznej odpipetować 0,9 ml wody destylowanej, następnie dodać 

4,5 ml 2% roztworu Na2WO3 oraz 3,6 ml 0,16 N roztworu H2SO4 i wymieszać. Po 

wymieszaniu, odpipetować 3 ml powyższego roztworu do drugiej szklanej probówki 

chemicznej, następnie dodać 0,6 ml roztworu Na2CO3 z mocznikiem oraz 0,15 ml odczynnika 

Folina-Denisa i wymieszać. 

Przygotowanie próby badanej 

Do probówki wirówkowej odpipetować 0,9 ml surowicy, następnie dodać 4,5 ml 2% roztworu 

Na2WO3 oraz 3,6 ml roztworu 0,16 N H2SO4 i wymieszać. Po wymieszaniu wirować 5 minut 

przy 3000 obr/min. 

Supernatant zlać do szklanej probówki chemicznej, następnie odpipetować 3 ml supernatantu 

do drugiej szklanej probówki chemicznej i dodać 0,6 ml roztworu Na2CO3 z mocznikiem oraz 

0,15 ml odczynnika Folina-Denisa, wymieszać i pozostawić na 10 minut w temperaturze 

pokojowej. Po 10 minutach oznaczyć ekstynkcję próby badanej wobec próby kontrolnej przy 

długości fali 635 nm. 

Zawartość kwasu moczowego odczytać z krzywej kalibracyjnej. 

Wyjaśnienie 

Kwas moczowy jest końcowym produktem katabolizmu nukleotydów purynowych u ssaków. 

Kwas moczowy redukuje kwas fosforowolframowy w obecności węglanu sodowego do 

tlenku wolframu barwy niebieskiej. Intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do 

zawartości kwasu moczowego. 

77

WITAMINY 

ROZDZIAŁ XVI 

WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 

Autor: dr Stanisława Szymonik-Lesiuk 

Nazwą witaminy określamy takie niskocząsteczkowe związki organiczne, których 

obecność w organizmie – nawet w bardzo małych ilościach mikrogramowych lub 

miligramowych – decyduje o prawidłowym przebiegu wielu procesów metabolicznych. 

Witaminy nie są wytwarzane w ustroju człowieka, dostarczane są z pożywieniem. 

Zapotrzebowanie na witaminy zależy od płci, wieku, masy ciała i stanu fizjologicznego 

organizmu. 

Niektóre witaminy mogą być syntetyzowane z prekursorów zwanych prowitaminami 

np. witamina A z karotenoidów, witamina D3 z 7-dehydrocholesterolu, czy witamina PP na 

jednej z dróg przemiany tryptofanu. 

Witamina K i niektóre witaminy z grupy B mogą być syntetyzowane przez florę 

bakteryjną przewodu pokarmowego. 

Budowa chemiczna witamin jest bardzo zróżnicowana i dlatego trudno je zaliczyć do 

określonej grupy związków, chociaż w oparciu o obecność azotu w cząsteczce możemy je 

podzielić na dwie grupy; na grupę zawierającą azot obejmującą witaminy z grupy B, 

i niezawierającą azotu, do której zaliczamy witaminy rozpuszczalne w tłuszczach. 

Klasyfikację witamin opiera się przede wszystkim na właściwościach fizycznych, 

dzieląc witaminy na rozpuszczalne w tłuszczach (A, D, E, K) oraz rozpuszczalne w wodzie 

(kompleks witamin grupy B i witamina C). 

Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach są cząsteczkami polarnymi, hydrofobowymi, 

pochodnymi izoprenu mogą być magazynowane w organizmie nie muszą, więc być 

dostarczane w diecie codziennie a ich dostępność zależy od prawidłowego wchłaniania 

tłuszczów. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach uczestniczą między innymi w regulacji 

gospodarki wapniowo-fosforanowej, regulacji procesu krzepnięcia krwi, pełnią funkcję 

antyoksydacyjną, są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania tkanki nabłonkowej 

i procesu widzenia. 

Nadmiar witamin rozpuszczalnych w tłuszczach zgromadzony w tkankach 

(hiperwitaminoza) może prowadzić zaburzeń metabolicznych spowodowanych toksycznym 

działaniem określonej witaminy (przedawkowanie witaminy A lub D). 

Witaminy rozpuszczalne w wodzie nie są magazynowane w organizmie, ich nadmiar 

wydalany jest z moczem, dlatego istotne jest ich codzienne dostarczanie z pożywieniem. 

Witaminy rozpuszczalne w wodzie pełnią głównie funkcję koenzymów bądź 

kofaktorów wielu układów enzymatycznych uczestnicząc w metabolizmie cukrów, tłuszczów, 

białek oraz w gospodarce mineralnej organizmu. 

Przyczyną niedoboru witamin mogą być: nieprawidłowa dieta, zaburzenia 

wchłaniania, wydalania, zaburzenia metaboliczne, zwiększone zapotrzebowanie zaburzenia, 

wynikające z działania określonych leków, antywitaminy. 

Ich niedobór w organizmie prowadzi do zaburzeń określanych mianem 

hipowitaminozy, brak nosi nazwę awitaminozy. Długotrwały niedobór poszczególnych 

witamin (awitaminoza) może prowadzić do takich zespołów chorobowych jak pelagra, 

krzywica, osteomalacja, szkorbut, beri-beri, miażdżyca czy niedokrwistości. 

Metody badań witamin oparte są głównie na testach biologicznych, 

mikrobiologicznych i chemicznych. 

Testy biologiczne przeprowadzane są na zwierzętach a w badaniach wykorzystuje się 

głównie dwa testy; test leczniczy i test profilaktyczny. 

78

W testach mikrobiologicznych wykorzystuje się fakt,że niektóre bakterie wymagają do 

swojego wzrostu określonych witamin (np. witamina B2 jest niezbędna dla wzrostu bakterii 

kwasu mlekowego). 

Metody chemiczne opierają się na oznaczeniach kolorymetrycznych, 

spektrofotometrycznych, fluorymetrycznych, czy miareczkowych. Wybór metody zależy od 

badanej witaminy i jej stężenia w badanym materiale. Stężenie witamin oznacza się 

najczęściej w osoczu lub moczu. 


1. Ekstrakcja i wykrywanie witamin rozpuszczalnych w tłuszczach i w wodzie. 

2. Ilościowe oznaczanie witaminy C w ziemniaku i cebuli. 

3. Ilościowe oznaczania wapnia w surowicy krwi. 

4. Interpretacja i analiza uzyskanych wyników. 

1. BADANIE ROZPUSZCZALNOŚCI KAROTENOIDÓW W TŁUSZCZACH 

I ROZPUSZCZALNIKACH ORGANICZNYCH 

Karotenoidy obejmują liczną grupę związków, głównie barwników roślinnychczerwonych, 

pomarańczowoczerwonych pomarańczowych lub żółtych i zwierzęcych, których 

wspólnym elementem budulcowym jest izopren lub produkty jego uwodornienia. Barwa jest 

uwarunkowana obecnością sprzężonych wiązań podwójnych. Karotenoidy są rozpuszczalne 

w tłuszczach i rozpuszczalnikach organicznych, należą do frakcji niezmydlających się. 

Niektóre karotenoidy występujące w świecie roślinnym np. karoteny są 

prowitaminami witaminy A (akseroftolu). Większość jednak karotenoidów np. 

pomarańczowa likopina występująca w pomidorach nie wykazuje właściwości witaminy A. 

Wykonanie 

Ekstrakt lipidowy i chloroformowy karotenoidów przygotować według poniższego schematu: 

Przygotowanie ekstraktu lipidowego 

1. Do probówki wirówkowej odmierz 1ml soku pomidorowego. 

2. Dodaj 3 ml oleju i wytrząsaj przez 5 minut. 

3. Odwiruj przy 3000 obrotów przez 10 minut. 

W obecności karotenoidów (likopina) warstwa olejowa barwi się na 

pomarańczowo. 

Przygotowanie ekstraktu chloroformowego 

1. Do probówki wirówkowej odmierz 1ml soku pomidorowego 

2. Dodaj 5 ml chloroformu i wytrząsaj przez 5 minut. 

W obecności karotenoidów (likopina) warstwa chloroformowa barwi się na 

pomarańczowo. 

Wykaż obecność karotenoidów w uzyskanych (punkt A i B) ekstraktach. 

1. Przygotuj dwie suche probówki A i B. 

2. Do probówki A dodaj 1ml ekstraktu uzyskanego wg punktu A 

3. Do probówki B dodaj1ml ekstraktu uzyskanego wg punktu B 

4. Do obu probówek A i B dodaj po 1ml odczynnika Carra-Price’a i obserwuj 

przebieg reakcji. 

5. Przeanalizuj uzyskane wyniki. 

79

Wyjaśnienie 

Karotenoidy można ekstrahować z materiału roślinnego, alkoholem, acetonem lub 

chloroformem. Wszystkie karotenoidy dają intensywne niebieskie zabarwienie z chlorkiem 

antymonawym. Obecne w warstwie chloroformowej karotenoidy dzięki obecności w ich 

budowie podwójnych sprzężonych wiązań tworzą w obecności chlorku antymonawego 

(odczynnik Carra-Price’a-nasycony chloroformowy roztwór chlorku antymonawego) 

chromofory barwy niebieskiej. 

2. WYKRYWANIE WITAMINY A i D3 W TRANIE Z WĄTROBY DORSZA 

Organizm człowieka pobiera z pożywieniem nie tylko karotenoidy będące 

prekursorem witaminy A ale i witaminę A. Witaminą A określa się substancje wykazujące 

aktywność biologiczną właściwą dla tej witaminy a należą do nich formy alkoholowa-retinol, 

aldehydowa-retinal i kwasowa-kwas retinolowy. Pełną aktywność witaminy A wykazuje 

głównie retinol. Zalecana średnia dobowa dawka witaminy A wynosi 5000 j.m.(3-5 mg 

karotenu). 

Witamina A odpowiedzialna jest między innymi za wzrost i różnicowanie komórek, 

potranslacyjną modyfikację białek, stabilizację błon biologicznych, proces widzenia, 

biosyntezę sterydów, i glikozaminoglikanów, zapobiega wysychaniu spojówki i rogówki oka, 

wzmaga odporność organizmu na zakażenie wykazuje działanie przeciwnowotworowe. Brak 

witaminy A wywołuje między innymi zaburzenie procesu widzenia, keratynizację nabłonków 

w wielu narządach, zaburzenia w ośrodkowym układzie nerwowym. Nadmiar podanej i 

zmagazynowanej witaminy prowadzi do stanu hiperwitaminozy. 

Witamina D należy do grupy związków o budowie sterydowej. Fizjologiczną formą 

witaminy D jest witamina D3, której prowitaminą jest 7-dehydrocholesterol. Optymalne 

zapotrzebowanie na witaminę D3 u małych dzieci określa się dawką 700 j.m. lub 0,01- 

0,015mg. Duże ilości witaminy D3 występują w tranie (szczególnie w tranie tuńczyków), w 

mleku, maśle i żółtku jaja. Witamina D3 odpowiedzialna jest za prawidłowy metabolizm 

wapnia i fosforu. Niedobór witaminy D3 u dzieci prowadzi do nieprawidłowości w 

gospodarce wapniono-fosforanowej a w efekcie do rozwoju choroby zwanej krzywicą. 

Osteomalacja jest wynikiem niedoboru witamy D występującego u dorosłych. Stosowanie 

wyższych od leczniczych dawek witaminy D prowadzi do rozwoju objawów 

hiperwitaminozy. 

Wykonanie 

1. Do szklanej probówki pobierz 1,0 ml tranu dodaj 9 ml chloroformu zatkaj korkiem 

i całość wytrząsaj energicznie przez 10 minut. 

2. Przygotuj 2 suche szklane probówki i oznacz A i B. 

3. Do probówki A i B odmierz po 1ml odczynnika Carra-Price’a 

4. Do probówki A dodaj 2 krople 10% chloroformowego roztworu witaminy A+D3 

5. Do probówki B pobierz 2,0 ml z powierzchni roztworu uzyskanego w punkcie 1 

6. Próby wstaw do łaźni wodnej i porównaj zabarwienie próby badanej B z próbą 

wzorcową A 

7. Powstanie niebieskiego a następnie czerwono-fiołkowego zabarwienia 

świadczy o obecności witaminy A+D3. 

80

Wyjaśnienie 

Witaminy A i D3 ekstrahuje się z badanego materiału za pomocą rozpuszczalników 

organicznych najczęściej chloroformu. Obecne w warstwie chloroformowej witaminy dzięki 

obecności w ich budowie podwójnych sprzężonych wiązań tworzą w obecności chlorku 

antymonawego (odczynnik Carra-Price’a-nasycony chloroformowy roztwór chlorku 

antymonawego) chromofory barwy niebieskiej w obecności witaminy A i barwy fiołkowoczerwonej 

w obecności witaminy D3. 

Natychmiast po zmieszaniu chloformowego wyciągu witamin z odczynnikiem Carra- 

Price’a powstaje niebieskie zabarwienie pochodzące od witaminy A, które szybko zwłaszcza 

po ogrzaniu przechodzi w zabarwienie fioletowo-czerwone wskazujące na obecność witaminy 

D3. 

Reakcja Carra-Price’a jest również stosowana do ilościowego oznaczania witaminy A 

metodą kolorymetryczną. 

3. FLUORYMETRYCZNE WYKRYWANIE WITAMINY B1 (TIAMINA). 

Witamina B1 łatwo rozpuszcza się w wodzie trudniej w etanolu i nie rozpuszcza w 

eterze czy acetonie. Chemicznie jest związkiem zawierającym pierścień pirymidynowy i 

tiazolowy. Jest prekursorem pirofosforanu tiaminy, który pełni funkcje jako koenzym w 

reakcjach dekarboksylacji α-oksokwasów oraz reakcjach katalizowanych przez transketolazy. 

Niedobór witaminy B1 w organizmie prowadzi do zaburzeń metabolicznych, np. 

przemiany węglowodanowej, do uszkodzeń w układzie naczyniowo-sercowym i nerwowym 

zwanego u ludzi chorobą beri-beri. Przy dużych niedoborach witaminy, który występuje 

głównie u alkoholików może rozwijać się zespół Wernickiego-Korsakowa. 

Wykonanie 

Przygotowanie próby wzorcowej: 

1. Jedną tabletkę witaminyB1 zawieś w 2 ml wody i wytrząsaj 10 minut. 

2. Odmierz do szklanej probówki 1 ml uzyskanego roztworu witaminy dodaj 1 ml 

1% roztworu K3Fe(CN)6 i 1 ml 20% NaOH, wymieszaj i odstaw na 10 minut. 

3. Następnie dodaj 5 ml alkoholu butylowego zamknij probówkę korkiem i 

zawartość probówki wytrząsaj przez 5 minut. 

4. Po oddzieleniu warstw fazę alkoholową przenieś do suchej probówki. 

Przygotowanie próby badanej 

Uwaga:, Jeśli roztwór drożdży jest gotowy, próbę zaczynamy od punktu 2 

1. Przygotowaną porcję drożdży zawieś w 5 ml wody i wytrząsaj 10 minut. 

2. Odmierz do szklanej probówki 1 ml uzyskanego roztworu drożdży, dodaj 1 ml 

1% roztworu K3Fe(CN)6 i 1 ml 20% NaOH, wymieszaj i odstaw na 10 minut. 

3. Po 10 minutach dodaj 5 ml alkoholu butylowego zamknij probówkę korkiem i 

zawartość probówki wytrząsaj przez 5 minut. 

4. Po oddzieleniu warstw fazę alkoholową przenieś do suchej probówki 

Po przygotowaniu próby wzorcowej i badanej: 

1. Obserwuj fluorescencję fazy alkoholowej próby wzorcowej i badanej w świetle 

lampy UV. 

81

Wyjaśnienie 

2. Z fazy alkoholowej próby wzorcowej i badanej pobierz po 50 µl nanieś na 

bibułę filtracyjną, wysusz i obserwuj fluorescencję w świetle lampy UV. 


Wodny roztwór tiaminy utlenia się cyjanożelazianem potasowym do tiochromu, który 

w świetle ultrafioletowym wykazuje niebieską, fluorescencję. Ponieważ tiochrom silniej 

fluoryzuje w alkoholu butylowym należy przeprowadzić go z roztworu wodnego w 

alkoholowy. W roztworze wodnym pozostają nie rozpuszczalne w butanolu fluoryzujące 

zanieczyszczenia. 

Intensywność fluorescencji roztworu tiochromu można też mierzyć fluorymetrycznie i 

porównać ze standardowym roztworem przygotowanym przez utlenienie określonej ilości 

czystej tiaminy. 

4. WYKRYWANIE I BADANIE OKSYDOREDUKCYJNYCH WŁAŚCIWOŚCI 

WITAMINY B2 (RYBOFLAWINA). 

Witamina B2 (ryboflawina) pod względem chemicznym jest związkiem 

dwuskładnikowym. Składa się z izoalloksazyny i z reszty rybitolu. W organizmie występuje 

w formie mononukleotydu flawinowego FMN i dinukleotydu flawinowego FAD związanych 

z białkami. Nukleotydy te są koenzymami enzymów z klasy oksydoreduktaz. Objawy 

niedoboru witaminy i awitaminozy cechują się między innymi, zapaleniem kącików ust i 

czerwieni wargowej, zapaleniem jamy ustnej i języka, zmianami w obrębie rogówki, 

łojotokowym zapaleniem skóry. 

A. FLUORYMETRYCZNE WYKRYWANIE WITAMINY B2 

Wykonanie 

Wyjaśnienie 

1. 1 tabletkę witaminy B2 zawieś w 10 ml wody i wytrząsaj przez 10 minut. 

2. Do 1 ml uzyskanego roztworu dodaj 1ml 1N NaOH i wytrząsaj przez 2 minuty. 

3. Zakwaś 5 kroplami 10% kwasu octowego i zmieszaj z równą objętością 

chloroformu. Wytrząsaj 5 minut. 

4. Po oddzieleniu się warstw, fazę chloroformową oglądaj w świetle lampy UV. 

5. Porównaj fluorescencję fazy chloroformowej z fluorescencją roztworu 

serwatki. 


Ryboflawina to związek o zabarwieniu żółto-pomarańczowym, łatwo rozpuszczający 

się w roztworach zasadowych, trudniej w wodzie.. Nie rozpuszcza się w większości 

rozpuszczalników organicznych. W wodnych alkalicznych roztworach pod wpływem światła 

i tlenu ryboflawina ulega rozpadowi na lumiflawinę i tetrozę. Lumiflawina fluoryzuje żółtozielono 

w świetle lampy UV i w tej postaci jest rozpuszczalna w chloroformie. 

Reakcja ta służy najczęściej do wykrywania i ilościowego oznaczania witaminy B2. 

82

B. BADANIE OKSYDOREDUKCYJNYCH WŁAŚCIWOŚCI WITAMINY B2 

Wykonanie 

Wyjaśnienie 

1. Do 1 ml roztworu witaminy B2 uzyskanego w ćwiczeniu poprzednim dodaj 10 

kropli stężonego HCl a następnie 2 ziarenka metalicznego cynku. 

2. Obserwuj i posłuchaj przebieg reakcji. 

Podczas wydzielania się pęcherzyków wodoru żółto zabarwiony roztwór 

stopniowo staje się różowo-pomarańczowy a następnie powraca do 

barwy żółtej. 

Utleniona forma witaminy B2 ma żółte zabarwienie. Żółto zabarwiony roztwór 

witaminy B2 pod wpływem czynników redukujących przyjmuje w pierwszej fazie reakcji 

zabarwienie różowo-pomarańczowe, a następnie w wyniku zachodzącej reakcji powraca do 

barwy wyjściowej. 

5. ILOŚCIOWE OZNACZANIE WITAMINY C W ZIEMNIAKU/CEBULI. 

Witamina C kwas L/+/ askorbowy zwana potocznie kwasem askorbinowym jest 

dobrze rozpuszczalna w wodzie i stanowi ważny układ oksydoredukcyjny działający w 

środowisku kwaśnym. Podczas reakcji jej forma endiolowa oddaje 2 atomy wodoru i 

przechodzi w kwas dehydroaskorbinowy. Atomy wodoru wykorzystywane są w procesach 

hydroksylacji np.proliny w hydroksyprolinę, w syntezie hormonów sterydowych, w 

przemianie fenyloalaniny i tyrozyny. 

Witamina C uczestniczy też w procesach regulujących potencjał oksydoredukcyjny w 

komórce (kwas askorbinowy/kwas dehydroaskorbinowy), utrzymuje równowagę między 

formami jonów Fe 2+/ Fe 3+ i Cu + /Cu 2+, jest niezbędna w biosyntezie mukopolisacharydów i 

kolagenu. Witamina C jest antyoksydantem chroniąc komórki organizmu przed 

wolnorodnikowymi uszkodzeniami. 

Przeciętna zawartość witaminy C we krwi wynosi 0,2 mg%. Niedobór witaminy C 

powoduje kruchość i łatwe pękanie naczyń włosowatych, prowadząc do krwawych 

wybroczyn błon śluzowych objawiających się częstym krwawieniem z dziąseł oraz 

krwawymi wylewami w stawach. Uszkodzone miejsca ulegają łatwo zapaleniom 

prowadzącym do powstania schorzenia zwanego szkorbutem. 

Wykonanie 

1. Wlej do kuwety porcelanowej 50 ml kwasu metafosforowego i następnie 

zetrzyj na tarce do kuwety 50 g ziemniaka lub cebuli. 

2. Uzyskaną miazgę przenieś do moździerza porcelanowego i ucieraj 10 minut. 

3. Przenieś przecier ilościowo do cylindra przepłukując moździerz kwasem 

metafosforowym i uzupełniając objętość do 100 ml. 

4. Zawartość cylindra przesącz przez gazę, następnie przez bibułę filtracyjną, lub 

odwiruj (3000 obrotów przez 10 minut). 

83

Wyjaśnienie 

5. Odmierz 5 ml przesączu do kolbki stożkowej i miareczkuj mianowanym 

roztworem 2,6-dichlorofenoloindofenolu do trwałej barwy różowej 

utrzymującej się przez 60 sekund. 

6. Przygotuj próbę kontrolną: odmierz 5 ml kwasu metafosforowego do kolbki 

stożkowej i miareczkuj mianowanym roztworem 2,6-dichlorofenoloindofenolu 

do trwałej barwy różowej utrzymującej się przez 60 sekund 

7. Odejmij wartość uzyskaną dla próby kontrolnej od wartości próby badanej. 

8. Wylicz zawartość witaminy C w 100 g ziemniaka/cebuli wiedząc, że: 

1ml 2,6-dichlorofenoloindofenolu zużytego do miareczkowania 

odpowiada 0,04 mg witaminy C (kwasu askorbinowego) 

Do najbardziej dostępnych składników pożywienia bogatych w witaminę C należą 

cebula i ziemniaki. Metoda oznaczania witaminy C polega na wykorzystaniu właściwości 

redukujących tej witaminy. Witamina C redukuje niebieski związek 2,6dichlorofenoloindofenol 

do produktu barwy różowej sama utleniając się do kwasu dehydro Laskorbinowego. 

Barwnik 2,6-dwuchlorofenoloindofenol utlenia kwas askorbinowy a sam 

redukuje się do formy, która jest bezbarwna. Barwnik ten jest jednocześnie indykatorem, 

który w środowisku kwaśnym przybiera barwę różową a w zasadowym niebieską. Ilość 

kwasu askorbinowego oznacza się miareczkując badany roztwór mianowanym roztworem 

barwnika aż do zabarwienia różowego utrzymującego się przez 60 sekund. Ekstrakcję 

witaminy z badanego materiału i miareczkowanie przeprowadza się w środowisku kwaśnym, 

ponieważ samoutlenianie się kwasu askorbinowego tlenem z powietrza w tych warunkach jest 

bardzo wolne, tkankowe enzymy utleniające są nieaktywne, a związki zawierające grupy SH 

utleniają się wolniej od kwasu askorbinowego. 

SKŁADNIKI MINERALNE 

Mimo niewielkiej ilości składników mineralnych w organizmie (około 4% masy ciała), 

są one niezbędne dla wielu procesów życiowych. Źródłem składników mineralnych jest 

pożywienie. Możemy je podzielić ze względu na zapotrzebowanie i funkcje, jakie pełnią w 

organizmie. 

Ze względu na zapotrzebowanie składniki mineralne dzielimy na makroelementy 

(podstawowe pierwiastki mineralne), których zapotrzebowanie dobowe wynosi powyżej 100 mg 

i mikroelementy (pierwiastki śladowe), których zapotrzebowanie dobowe wynosi poniżej 100 

mg na dobę. 

Do makroelementów zaliczamy: sód, potas, chlor, wapń, fosfor i magnez i siarkę. Do 

mikroelementów zaliczamy: żelazo, miedź, mangan, molibden, jod, cynk, selen, kobalt chrom i 

fluor. 

W zależności od funkcji, jaką pełnią w organizmie składniki mineralne możemy 

podzielić na kilka grup np.: 

• Składniki odgrywające kluczową rolę w regulacji ciśnienia koloido-osmotycznego, 

gospodarce wodno-elekrolitowej i regulacji pH (np. sód, potas,chlorki) 

• Składniki stanowiące materiał budulcowy tkanki kostnej, zębów, włosów i skóry (np. 

wapń, fosfor, siarka, fluor). 

84

• Składniki utrzymujące pobudliwość nerwowo-mięśniową (np. sód, potas, wapń) 

• Składniki mineralne wchodzące w skład związków o różnej funkcji metabolicznej (np. 

jod, kobalt, miedź, cynk, magnez). 

• Składniki związków o wysoko wyspecjalizowanych funkcjach (np. hemoglobina, 

enzymy, hormony) 

• Składniki uczestniczące w procesie trawienia, wchłaniania i przemianie pośredniej białek 

tłuszczów i węglowodanów (np. chlor, cynk, żelazo, magnez, miedź) 

• Składniki będące kofaktorami enzymów (np. magnez, cynk, mangan, molibden, selen, 

żelazo) 

1. ILOŚCIOWE OZNACZANIE WAPNIA W SUROWICY KRWI 

Wapń zaliczany do makroelementów (u dorosłego człowieka w ilości około 1200 g) 

występuje we wszystkich narządach i tkankach i stanowi około 40% ogólnej ilości związków 

mineralnych organizmu. Prawie cały wapń (99% całkowitej zawartości w ustroju człowieka) 

uczestniczy w budowie szkieletu kostnego i zębów głównie jako apatyt i hydroksyapatyt. 

Pozostała ilość wapnia, która nie wchodzi w strukturę kostną, znajduje się w płynach 

ustrojowych. 

W warunkach fizjologicznych średnia zawartość wapnia w osoczu wynosi 4,5-5,5 

mEq/l (2,2-2,8 mmol) a jon wapniowy występuje w osoczu pod postacią 2 frakcji dializującej 

i niedializującej. Frakcja dializująca oznacza, że jon wapniowy może przenikać przez błony 

półprzepuszczalne. Niedializująca frakcja wapnia związana jest z białkami osocza i nie może 

dyfundować przez błony półprzepuszczalne. Dializująca frakcja wapnia składa się z wapnia 

zjonizowanego związanego w kompleksy z cytrynianem i innymi związkami. 

Frakcja wapnia zjonizowanego (Ca 2+ ) jest najbardziej aktywna biologicznie i odgrywa 

zasadniczą rolę w pobudliwości nerwowo-mięśniowej, przepuszczalności błon komórkowych, 

procesie krzepnięcie krwi, przekazywaniu sygnałów komórkowych, aktywacja wielu enzymów 

i pracy serca. Obniżony poziom tej frakcji wapnia prowadzi do tężyczki. 

Na przemianę wapniową organizmu wpływają hormony i witaminy. Do hormonów 

uczestniczących w regulacji gospodarki wapniowej należą, parathormon produkowany przez 

przytarczyce, kalcytonina wytwarzana przez komórki C tarczycy, hormony sterydowe 

nadnerczy i gonad a z witamin pochodna hydroksylowa witaminy D3 - 1.25 (OH)2D3 

(kalcytriol), witamina C i witamina A. Zmiany stężenia jonów wodorowych, mogą również 

wpływać na funkcje fizjologiczne wapnia w organizmie. 

85

Wykonanie 

Przygotuj próby według poniższego schematu: 

Odczynniki 

Badana 

Próby 

Kontrolna 

Surowica 2,0 ml ─ 

4% szczawian 

amonu 

2,0 ml 2,0 ml 

Woda destylowana ─ 2,0 ml 

1. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 minut 

2. Odwirować przy 3000 obrotów przez 10 min. 

3. Po odwirowaniu supernatant odrzucić. 

4. Do osadu zawierającego szczawian wapnia dodać: 

2% roztwór 

amoniaku 

2,0 ml 2,0 ml 

5. Wymieszać, odwirować jw., supernatant odrzucić 

6. Procedurę powtórzyć dwukrotnie. 

7. Do osadu dodać 

1N H2SO4 2,0 ml 2,0 ml 

8. Próby umieścić w łaźni wodnej o temp. 70°C na 5 minut 

9. Miareczkować próby: kontrolną i badaną na ciepło 0,01N KMO4 do barwy 

różowej. 

Następnie: 

10. Odejmij wartość uzyskaną dla próby kontrolnej od wartości próby badanej. 

11. Przedstaw uzyskane wyniki mg% mEq/l i mmol/l 

Pamiętaj, że: 1ml 0,01N KMO4 zużytego do miareczkowania próby do barwy 

różowej odpowiada 0,2 mg wapnia. 

Wyjaśnienie 

Metoda oznaczania stężenia wapnia w surowicy krwi polega na ilościowym 

wytrącaniu wapnia za pomocą jonu szczawiowego do szczawianu wapnia. Wapń wytraca się 

ze znanej objętości surowicy przez dodanie nadmiaru szczawianu amonu. Osad szczawianu 

wapnia oddziela się przez odwirowanie, odmywa od reszty wolnego szczawianu amonu 

roztworem amoniaku i następnie rozpuszcza w kwasie siarkowym, który wypiera kwas 

szczawiowy ze szczawianu wapnia. Uwolniony kwas szczawiowy miareczkuje się 

nadmanganianem potasu (KMnO4). Ilość KMnO4 zużytego do miareczkowania jest wprost 

proporcjonalna do ilości wypartego przez kwas siarkowy kwasu szczawiowego ze szczawianu 

wapnia. 

1ml 0,01N KMn04 zużytego do miareczkowania odpowiada 0,20 mg wapnia 

Poziom wapnia w osoczu wynosi 4,5-5,5 mEq/l (2,2-2,8 mmol) 

86

ROZDZIAŁ XVII 

HORMONY 


Mechanizmy, dzięki którym zewnątrzkomórkowe sygnały wywołują specyficzną 

odpowiedź biologiczną, są istotne dla regulacji wszystkich funkcji komórek, w tym także 

regulacji ich wzrostu, różnicowania, czy odpowiedzi na zmiany środowiska. Każda komórka, 

żeby żyć i pełnić swoje biologiczne funkcje, musi mieć zdolność odbierania i reagowania na 

sygnały, które docierają do jej powierzchni. 

Związki chemiczne produkowane przez wyspecjalizowane gruczoły dokrewne lub 

komórki organizmu wykazujące zdolność do przenoszenia informacji (sygnałów) do innych 

komórek a tym samym do regulowania i koordynowania procesów fizjologicznych i 

biochemicznych tych komórek nazywa się hormonami. 

Hormony endokrynne (np. insulina, glukagon, wazopresyna) są syntetyzowane przez 

gruczoły dokrewne i z krwią transportowane do komórek docelowych. Hormony parakrynne 

(prostaglandyny, neurotransmitery, histamina) są syntetyzowane w pobliżu komórek 

docelowych, na które oddziałują. Hormony autokrynne działają na komórki, w których są 

syntetyzowane. 

Na podstawie struktury chemicznej hormony możemy zaliczyć do: białek lub 

peptydów (np. insulina, glukagon), pochodnych aminokwasów (np. katecholaminy, hormony 

tarczycy), pochodnych kwasów tłuszczowych (np. eikozanoidy), pochodnych cholesterolu 

(np. steroidy) lub gazów (np. tlenek azotu). 

Odbieranie informacji, płynących ze środowiska zewnętrznego do wnętrza komórki 

oraz tych przesyłanych pomiędzy różnymi przedziałami komórki niesionych przez hormony, 

jest możliwe dzięki receptorom. Warunkiem biologicznego działania hormonów jest, więc 

połączenie ze swoistymi receptorami obecnymi w komórkach docelowych. 

Wiele hormonów (hormony hydrofilowe) np., parathormon, insulina, glukagon, 

hormon wzrostu, neurotransmitery, cytokiny, nie wnika do komórki, lecz wiąże się z 

białkowymi receptorami umiejscowionymi na jej powierzchni (receptory błonowe), 

uruchamiając w ten sposób kaskadę zdarzeń, w wyniku, których dochodzi do końcowego 

efektu biologicznego. Sygnał pierwotny odebrany przez odpowiedni receptor zostaje 

następnie przekazany na jeden z enzymów, nazywanych efektorami, które katalizują 

wytworzenie wtórnych przekaźników informacji (second messenger) działających już 

wewnątrz komórki. Do efektorów zaliczamy cyklazę adenylanową, cyklazę guanylanową i 

fosfolipazę C. Rolę przekaźników wtórnych pełnią: cykliczny AMP, cykliczny GMP, 

diacyloglicerol, trisfosfoinozytol, jony wapnia. Przekaźniki te modulują aktywność kinaz i 

fosfataz białkowych, ważnych regulatorów wielu procesów zachodzących w organizmie. 

Hormony hydrofilne wywołują szybką odpowiedź i mają krótki czas działania-od kilku 

sekund do kilku godzin. 

Hormony nierozpuszczające się w wodzie (hormony lipofilne) wnikają do komórki i działają 

za pośrednictwem receptorów wewnątrzkomórkowych, uczestnicząc w wielu procesach 

metabolicznych, wpływają na wzrost, różnicowanie, czy podział komórek. 

Zaliczamy do nich syntetyzowane z cholesterolu hormony steroidowe 

(glikokortykoidy, mineralokortykoidy, androgeny i hormony płciowe żeńskie: progesteron i 

estrogeny), pochodną witaminy D3-kalcytriol, witaminy A -kwas retinowy oraz pochodną 

aminokwasu tyrozyny-tyroksynę. 

Hormony lipofilne działają wolniej-od kilku godzin do kilku dni. 

Niektóre gruczoły dokrewne są sterowane bezpośrednio przez układ podwzgórzeprzysadka 

(np. tarczyca, kora nadnerczy, gonady). 

87

Wydzielanie hormonów przez gruczoły dokrewne może być również dostosowane do 

zapotrzebowania fizjologicznego: np. podwyższenie poziomu glukozy w krwi (np. po 

posiłku) jest bodźcem wyzwalającym wydzielanie insuliny, która obniża poziom cukru w 

krwi, obniżony poziom wapnia w osoczu pobudza uwalnianie parathormonu. 

Choroby wynikające z zaburzeń układu endokrynnego są najczęściej spowodowane 

nadmierną lub niedostateczną syntezą hormonów. 


1. Wykazanie obecności w 17-ketosteroidów w alkoholowym wyciągu preparatów 

hormonalnych. 

2. Wykazanie obecności estrogenów w alkoholowym wyciągu preparatów 

hormonalnych. 

3. Ilościowe oznaczanie testosteronu. Wyliczenie zawartości testosteronu w dobowej 

ilości moczu 

4. Ilościowe oznaczanie aktywności fosfatazy zasadowej metodą Kinga-Armstronga. 

WYKRYWANIE I ILOŚCIOWE OZNACZANIE HORMONÓW STERYDOWYCH 

W korze nadnerczy i gruczołach płciowych wytwarzane są hormony steroidowe, 

wśród których wyróżnia się hormony kory nadnercza: mineralokortykoidy i glikokortykoidy 

(kortykoidy) oraz hormony płciowe: estrogeny, progesteron, androgeny. 

Produkcję glikokortykosteroidów regulują przede wszystkim podwzgórze i przysadka. 

Glikokortykoidy (kortyzol i kortykosteron) wywierają istotny wpływ na procesy 

metaboliczne: przemianę białkową, lipidową a szczególnie węglowodanową. 

Wytwarzanie mineralokortykoidów (aldosteron) jest regulowane przede wszystkim przez 

układ renina-angiotensyna reagujący na stężenie Na + w osoczu krwi. 

Estrogeny są związkami sterydowymi o nienasyconym pierścieniu A (pierścień 

aromatyczny) układu cyklopentanoperhydrofenantrenowego z fenolowową grupą 

hydroksylową przy C-3. 

Estrogeny produkowane są w ustroju przez jajniki i łożysko, jak również w bardzo małych 

ilościach przez męskie gruczoły płciowe i korę nadnerczy. Z trzech głównych estrogenów 

(estron, estriol, estradiol) nie wszystkie posiadają jednakową aktywność biologiczną. 

Najbardziej aktywny jest estradiol, estron mniej, a estriol słabo aktywny biologicznie. Estron 

przekształca się łatwo w estradiol, który należy uważać za właściwy żeński hormon płciowy. 

W obrębie narządu rodnego estrogeny warunkują ukształtowanie II-rzędowych i IIIrzędowych 

kobiecych cech płciowych, pobudzają rozwój macicy, jajowodów, pochwy, 

zewnętrznych narządów płciowych oraz sutka. 

Estrogeny wykazują ponadto wielokierunkowe oddziaływanie metaboliczne: hamują 

osteolityczny wpływ parathormonu i pobudzają działanie osteoblastyczne, zwiększają 

biosyntezę białek wiążących hormony gruczołu tarczowego i nadnerczy;wpływają na proces 

krzepnięcia krwi, są kofaktorami transhydrogenazy NADPH/NAD, działając w ten sposób na 

biosyntezę tłuszczów, białek oraz zasad purynowych i pirymidynowych, wspomagają 

mobilizację i dystrybucję glukozy, pobudzając procesy energetyczne, wpływają na 

zmniejszenie stężenia cholesterolu całkowitego i cholesterolu LDL odgrywając tym samym 

ważną rolę w powstrzymywaniu miażdżycy. 

Najważniejszym przedstawicielem androgenów jest testosteron. Powstaje on zarówno w 

jądrach jak i nadnerczach oraz jajnikach. Z testosteronu powstają także estrogeny, estron, 

88

estradiol i estriol. W rozwoju embrionalnym powstanie jąder jest zdeterminowane 

genetycznie (przez chromosom Y); późniejsze zróżnicowanie męskich narządów płciowych w 

okresie życia płodowego i po urodzeniu oraz ukształtowanie się wtórnych cech płciowych w 

okresie pokwitania jest również uwarunkowane działaniem androgenów. W dojrzałym 

organizmie męskim nieprzerwana produkcja hormonu ma istotne znaczenie dla dojrzewania 

plemników, jak również dla czynności dodatkowych narządów płciowych (prącie, worek 

mosznowy). 

Oprócz tego specyficznego działania na narządy płciowe androgeny wywierają wpływ na 

przemianę materii, ułatwiają syntezę białek i zwiększają retencję azotu. Określa się to jako 

działanie „anaboliczne". 

W okresie pokwitania androgeny działają synergistycznie z estrogenami, pobudzają 

rozwój drugo- i trzeciorzędowych cech płciowych, w tym przede wszystkim owłosienia 

łonowego i pachowego. 

Hormony sterydowe ulegają przekształceniu w wątrobie w produkty wydalinowe. 

Przekształcenia obejmują redukcję nienasyconych wiązań, wprowadzenie grup 

hydroksylowych i sprzęganie z kwasem glukuronowym lub siarkowym. Powstające związki 

są lepiej rozpuszczalne, co ułatwia ich wydalanie. Około 30% powstających metabolitów 

hormonów sterydowych przechodzi z żółcią do jelit i wydala się z kałem, pozostała część 

wydalana jest z moczem. 

Hormony sterydowe i ich metabolity dobrze rozpuszczają się w rozpuszczalnikach 

organicznych, dlatego wstępnym etapem technik analitycznych jest ekstrakcja tych związków 

rozpuszczalnikami organicznymi z materiału analitycznego. 

W praktyce klinicznej hormony sterydowe i ich metabolity (17-ketosterydy) wykrywa 

się lub oznacza w ekstraktach z moczu.. Cechą charakterystyczną dla tej grupy związków jest 

grupa ketonowa w pozycji 17-sterydu, która daje czerwone zabarwienie w środowisku 

alkalicznym z n-dwunitrobenzenem (reakcja Zimmermanna). Grupa ketonowa w pozycji 

innej niż 17-tej daje tę reakcję barwną o wiele mniej intensywną i odmiennym zabarwieniu. 

Oznaczanie poziomu 17-ketosteroidów w moczu ma istotne znaczenie kliniczne z 

uwagi na częste zaburzenia w funkcji gruczołów dokrewnych i związaną z tym zmianą 

poziomu ketosteroidów w moczu. Obniżoną zawartość wydalanych 17-ketosteroidów 

obserwuje się w różnych schorzeniach prowadzących do dysfunkcji kory nadnerczy np. w 

chorobie Simmondsa (niedoczynność przysadki) czy w chorobie Addisona (niedoczynność 

nadnerczy). Wzrost wydalania 17-ketosteroidów jest przede wszystkim wynikiem przerostu 

lub raka kory nadnerczy. 

1. WYKRYWANIE ESTROGENÓW METODĄ KOBERA 

Wykonanie 

Przygotuj próby: 

Próba badana: 0,5 ml alkoholowego roztworu estrogenu 

2,0 ml odczynnika Kobera 

Próba kontrolna 0,5 ml alkoholu etylowego 

2,0 ml odczynnika Kobera 

Próby badaną i kontrolną ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. 

Porównaj zabarwienie próby badanej i kontrolnej. 

89

Wyjaśnienie 

Estrogeny obejmują C-18 sterydowe hormony płciowe żeńskie charakteryzujące się 

aromatycznym pierścieniem A. Wszystkie estrogeny tworzą w obecności kwasu siarkowego i 

hydrochinonu (odczynnik Kobera) chromogeny barwy brunatnej. 

2. WYKRYWANIE 17-KETOSTEROIDÓW PRÓBĄ ZIMMERMANNA 

Wykonanie 

Przygotuj próby: 

Próba badana: 1,0 ml alkoholowego roztworu androsteronu 

1,0 ml 2% roztworu m-dwunitrobenzenu w etanolu 

5 ml 3N roztworu KOH 

Próba kontrolna: 0,5 ml alkoholu etylowego 

1,0 ml 2% roztworu m-dwunitrobenzenu w etanolu 

5 ml 3N roztworu KOH 

Próby badaną i kontrolną zostaw w ciemnym miejscu na 5 minut. 

Porównaj zabarwienie próby badanej i kontrolnej. 

Wyjaśnienie 

Reakcja Zimmermanna jest charakterystyczna dla 17-ketosteroidów z grupą ketonową 

w pozycji 17 i wolną grupą metylenową w pozycji 16. 

W środowisku zasadowym n-dwunitrobenzen tworzy z 17-ketosteroidami związek 

kompleksowy o barwie czerwonofioletowej. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do 

ilości 17-ketosterydów w próbie 

3. ILOŚCIOWE OZNACZANIE TESTOSTERONU 

Wykonanie 


Odczynniki 

Badana 

Próby 

Kontrolna 

Roztwór testosteronu 0,2 ml — 

Alkohol etylowy — 0,2 ml 

n-Dwunitrobenzen 0,2 ml 0,2 ml 

5M KOH w metanolu 0,2 ml 0,2 ml 

1. Inkubuj próby badaną i kontrolną 30 minut w temperaturze pokojowej. 

2. Dodaj: 

Alkohol etylowy 7,0 ml 7,0 ml 

90

3. Odczytaj absorbancję próby badanej wobec próby kontrolnej przy długości fali 520 nm. 

4. Oblicz zawartość testosteronu w próbie badanej z krzywej kalibracyjnej. 

5. Oblicz zawartość testosteronu w dobowej ilości moczu (1,5l). 

U mężczyzn zawartość w moczu 17-ketosterydów jest odzwierciedleniem aktywności 

jąder (1/3) i nadnerczy (2/3). U kobiet wydalane z moczem 17-ketosterydy są metabolitami 

hormonów syntetyzowanych przez korę nadnerczy i ich ilość świadczy o funkcji tego 

gruczołu. 

Wydalanie testosteronu w moczu wynosi: u mężczyzn 280±140 nmol (80±40 µg/d) i u 

kobiet 35±10 nmol (10±13 µg/d) 

Stężenie testosteronu w osoczu wynosi: u mężczyzn 21-35 nmol/l (0,6-1,0 µg/100ml) i u 

kobiet 1,0-4,0 nmol/l (0,03-0,1 µg/100 ml) 

Wyjaśnienie 

Testosteron, najważniejszy androgen, może być oznaczany ilościowo w moczu lub we 

krwi. W celu oznaczenia testosteronu w moczu, przeprowadza się ekstrakcję tego hormonu za 

pomocą chloroformu. 

Reakcja Zimmermanna jest charakterystyczna dla 17-ketosteroidów będących 

metabolitami męskich hormonów płciowych i sterydów W środowisku zasadowym ndwunitrobenzen 

tworzy z 17-ketosteroidami związek kompleksowy o barwie 

czerwonofioletowej 

Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do ilości 17-ketosterydów w próbie. 

Maksimum absorpcji uzyskuje się przy długości fali 520nm. 

4. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI FOSFATAZY ZASADOWEJ (AP) METODĄ 

KINGA-ARMSTRONGA 

Fosfatazy są to enzymy, które odszczepiają kwas fosforowy z połączeń organicznych. 

W świecie zwierzęcym i roślinnym istnieje bardzo wiele różnych fosfataz. Największe 

znaczenie kliniczne posiada badanie zachowania się w płynach ustrojowych dwu 

fosfomonoesteraz, fosfatazy zasadowej i kwaśnej. 

Fosfataza zasadowa (3.1.3.2. fosfohydrolaza monoestrów ortofosforanowych) 

katalizuje reakcję hydrolizy monoestrów ortofosforanowych według schematu: 

R—O—PO3H2 + H2O → R—OH + H3PO4 

Optimum pH enzymu leży w zakresie silnie alkalicznym (8,5—10,0). Fosfataza 

zasadowa jest aktywowana przez jony magnezu, manganu i kobaltu, hamowana przez 

fosforany i rodniki alkoholowe wielu substratów. Jest enzymem heterogennym. Izoenzymy 

różnią się między sobą: ruchliwością elektroforetyczną, wrażliwością na temperaturę, 

działaniem neuraminidazy, aktywatorów i inhibitorów, budową części białkowej. Izoenzymy 

AP przyjmują zazwyczaj swą nazwę od tkanki, z której pochodzą. 

Ludzka fosfataza zasadowa jest odwracalnie hamowana w środowisku kwaśnym. Im 

dłuższe działanie kwaśnego pH, tym trudniejszy jest powrót do aktywności w środowisku 

zasadowym. Izoenzym kostny jest bardziej wrażliwy niż jelitowy i wątrobowy. 

Fosfataza zasadowa znajduje się nie tylko w wątrobie, jelicie, kościach, łożysku, ale 

bogate w AP są: też nerki, nadnercza, gruczoł mleczny i krwinki białe. Aktywność 

fosfatazową wykazują także płyny ustrojowe: surowica, limfa, płyn mózgowo-rdzeniowy, 

ślina i mocz. Surowica ludzi dorosłych zawiera głównie izoenzymy wątrobowy, śladowe 

ilości kostnego (zmienność osobnicza) oraz mniejszą lub większą ilość izoenzymu jelitowego 

(średnio 20%). Jest wytwarzana przez osteoblasty kości, stamtąd przenika do krwiobiegu i 

91

wydzielana jest przez wątrobę wraz z żółcią. Fosfataza zasadowa pochodzenia kostnego 

występuje w większych ilościach w surowicy krwi u dzieci. 

Izoenzym wątrobowy związany z organellami komórek zlokalizowany jest głównie w 

jądrach, mitochondriach i lizozomach. Znaleziono go w ścianie naczyń oraz w komórkach 

nabłonkowych kanalików żółciowych. Izoenzym jelitowy zawarty jest głównie w 

protoplazmie komórek. Występowanie izoenzymów w surowicy krwi jest uwarunkowane 

genetycznie i sprzężone z występowaniem grup krwi. 

Fizjologicznie wzrost czynności fosfatazy zasadowej w surowicy krwi jest miarą 

intensywności procesów kostnienia. 

Aktywność całkowita AP surowicy wzrasta w chorobach układu kostnego: krzywicy, 

osteomalacji, chorobie Pageta, Recklinghausena i innych. Wartości przekraczające 20-40krotnie 

normę spotyka się w osteosarcoma i przerzutach nowotworów gruczołu krokowego do 

kości. Różnicowanie izoenzymów wykazuje, że w chorobach kości wzrasta w surowicy krwi 

aktywność izoenzymu kostnego. 

Aktywność fosfatazy zasadowej wzrasta też w ostrym zapaleniu wątroby i u 

niektórych pacjentów z marskością wątroby. Duży wzrost aktywności enzymu towarzyszy 

żółtaczce zastoinowej i stanom zapalnym dróg żółciowych oraz żółtaczkom na tle 

nowotworowym. 

Obniżenie aktywności fosfatazy alkalicznej w surowicy krwi obserwuje się w 

chorobach przebiegających z zaburzeniem wzrostu, chorobie Cushinga, chronicznym 

zapaleniu nerek. 

Wykonanie 


Odczynniki 

Badana 

Próby 

Kontrolna 

Substrat (fenylofosforan 

dwusodowy) 

2,0 ml 2,0 ml 

Bufor węglanowy pH 10 2,0 ml 2,0 ml 

Osocze 0,2 ml ─ 

12. Wymieszaj, i inkubuj obie próby 15 minut w 37°C. 

13. Następnie dodaj: 

Odczynnik Folina-Ciocialteau 1,8 ml 1,8 ml 

Osocze ─ 0,2 ml 

14. Odwiruj przy 3000 obrotów przez 10 minut. 

15. Po odwirowaniu supernatanty badany i kontrolny przelej do suchych 

probówek. 

16. Z próby badanej i kontrolnej pobierz po 4 ml supernatantu i dodaj: 

25 % Na2CO3 1,0 ml 1,0 ml 

17. Próby umieść w łaźni wodnej o temp. 37°C na 10 minut 

18. Po oziębieniu dodaj: 

Woda destylowana 5,0 ml 5,0 ml 

19. Odczytaj na kolorymetrze absorbancję próby badanej wobec próby 

kontrolnej przy długości fali 650 nm 

20. Zawartość fosfatazy w jednostkach King-Armstronga odczytaj z krzywej 

kalibracyjnej. 

92

Wyjaśnienie 

Aktywność fosfatazy zasadowej oznacza się zazwyczaj za pomocą syntetycznych 

substratów. Najczęściej są nimi:, fenylofosforan, p-nitrofenylofosforan, p-glicerofosforan i 

inne. Spośród wielu metod oznaczania fosfatazy często stosowana jest metoda King- 

Armstronga. 

Zasada metody King-Armstronga polega na hydrolizie przez enzym fenylofosforanu 

dwusodowego do fenolu. Uwolniony przez enzym fenol z fenylofosforanu sodowego daje 

reakcję barwną z odczynnikiem Folina-Ciocalteau. Natężenie powstającego niebieskiego 

zabarwienia oznacza się kolorymetrycznie i jest ono proporcjonalne do aktywności enzymu. 

Wynik podaje się w jednostkach King-Armstronga. 

Jednostka King-Armstronga (KA) dla fosfatazy alkalicznej jest to taka ilość enzymu w 100 ml 

surowicy krwi, który w ciągu 15 minut w temperaturze 37°C przy pH 10 uwalnia l mg fenolu. 

Aby otrzymać wynik w jednostkach międzynarodowych, należy wynik uzyskany w j. KA 

pomnożyć przez współczynnik 7,1. 

Wartości prawidłowe fosfatazy zasadowej u osób dorosłych wahają się w granicach 4-10 

j.KA, u niemowląt 12-36 j.KA, u dzieci do l roku 10-25 j.KA, a u dzieci od 2 do 13 lat 5-16 

j.KA. 

93

WPROWADZENIE 

ROZDZIAŁ XVIII 

ANALIZA CHEMICZNA KRWI 


Krew obwodowa jest homogenną zawiesiną elementów morfotycznych w osoczu znajdującą 

się w obrębie zamkniętego układu krwionośnego. Całkowita objętość krwi u ludzi dorosłych 

wynosi 5 – 6 litrów , co stanowi 7 – 8% masy ciała. 

Około 45% objętości krwi stanowią elementy morfotyczne – krwinki czerwone (erytrocyty), 

krwinki białe (leukocyty) oraz płytki krwi (trombocyty). U osób dorosłych ilość erytrocytów 

wynosi: kobiety 3,6 – 5,0 x 10 12 / l, mężczyźni 4,2 – 5,4 x 10 12 / l, ilość leukocytów wynosi 

3,5 – 9,0 x 10 6 , a trombocytów 100 – 450 x 10 9 / l. 

Jeżeli wynaczynioną krew, zabezpieczy się przed skrzepnięciem za pomocą substancji 

hamujących krzepnięcie np. cytrynianów, szczawianów, heparyny lub EDTA, elementy 

morfotyczne mogą być oddzielone od części płynnej , którą stanowi osocze. Jeżeli krew 

ulegnie skrzepnięciu, to pozostała część płynna oddzielona od skrzepu jest określana jako 

surowica .Surowica nie ma w swoim składzie fibrynogenu i innych czynników krzepnięcia, 

które występują w osoczu i zużywają się w procesie krzepnięcia. 

Funkcje 

1.transport substancji odżywczych wchłoniętych w jelicie do wątroby oraz transport 

metabolitów do innych tkanek i narządów, 

2. transport zbędnych metabolitów do nerek, jelit, płuc i skóry w celu ich wydalenia, 

3. wymiana tlenu i dwutlenku węgla w cyklu oddechowym, 

4. rozprowadzanie hormonów, witamin i enzymów, 

5. utrzymywanie gospodarki wodno – elektrolitowej i równowagi kwasowo – zasadowej 

organizmu, 

6. regulacja temperatury ustrojowej, 

7. krew stanowi barierę obronną ze względu na obecność przeciwciał i komórek zdolnych do 

fagocytozy. 

Osocze zawiera 90 – 92% wody. Woda stanowi rozpuszczalnik dla organicznych i 

nieorganicznych substancji transportowanych w osoczu. Jest istotna dla regulacji temperatury 

ustrojowej oraz wymiany osmotycznej między przestrzeniami wodnymi organizmu. 

Stężenie białka całkowitego w osoczu ludzkim wynosi 7,0 – 7,5 g % . 

Osocze obok białek zawiera związki drobnocząsteczkowe organiczne i nieorganiczne. 

Do związków organicznych azotowych, określanych jako reszta azotowa lub azot 

pozabiałkowy zalicza się: 

aminokwasy, mocznik, kwas moczowy, kreatynę, kreatyninę, bilirubinę. 

Do związków organicznych bezazotowych zalicza się: 

lipidy – wolne kwasy tłuszczowe, triacyloglicerole, fosfolipidy, cholesterol wolny 

i zestryfikowany, 

węglowodany – glukoza, 

inne składniki organiczne np. kwas mlekowy, kwas pirogronowy, związki ketonowe. 

Krwinki czerwone (erytrocyty) odpowiedzialne są za transport tlenu do tkanek, uczestniczą 

w procesie wydalania dwutlenku węgla oraz protonów wytwarzanych w metaboliźmie 

94

tkankowym. Te funkcje krwinki czerwonej są związane z obecnością hemoglobiny. 

Prawidłowa zawartość hemoglobiny we krwi wynosi u kobiet 12,0 – 16,0 g% i u mężczyzn 

14,0 – 18 g%. 

Aktywność metaboliczna erytrocytów jest głównie związana z utrzymaniem hemoglobiny 

w stanie czynnościowym. Hemoglobina jest białkiem złożonym- chromoproteiną składającą 

się z hemu i części białkowej. Właściwość odwracalnego wiązania tlenu przez hemoglobinę 

jest związana z obecnością w każdej cząsteczce hemu żelaza Fe 2+ . W procesie utlenowania 

stopień utlenienia żelaza nie zmienia się, powstaje oksyhemoglobina (Hb-O). 

Oksyhemoglobina łatwo dysocjuje na hemoglobinę i tlen przy zmniejszeniu ciśnienia 

parcjalnego tlenu. Cząsteczka hemoglobiny może przyłączyć 4 cząsteczki tlenu 

atmosferycznego, a 1 g hemoglobiny wiąże 1,36 ml tlenu. 

Pod wpływem utleniaczy np. KFe(CN), błękitu metylenowego hemoglobina przekształca się 

w methemoglobinę, w której zamiast hemu występuje hematyna zawierająca trójwartościowe 

żelazo. Barwniki hematynowe nie wiążą tlenu, CO i dają barwne pochodne z cyjankami. 

Z hemoglobiną 300-krotnie silniej niż tlen łączy się tlenek węgla i wyłącza hemoglobinę 

z udziału w transportowaniu tlenu. 


1. Badanie wpływu czynników chemicznych i fizycznych na trwałość erytrocytów. 

2. Wykrywanie oraz oznaczanie hemoglobiny i jej pochodnych. 

3. Wykrywanie niektórych, niebiałkowych składników organicznych oraz składników 

nieorganicznych krwi. 

4. Ilościowe oznaczanie poziomu glukozy we krwi. 

WYKONANIE 

1.Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na trwałość erytrocytów. 

Do 4 suchych próbówek dodać 0,5 ml krwi odwłóknionej, ponadto: 

a) do pierwszej probówki dodać 5 ml H2 O, dokładnie zmieszać. 

b) do drugiej dodać 5 ml 0,9% NaCl. 

c) do trzeciej dodać 5 ml 0,9% NaCl, a następnie 1,0 ml chloroformu lub acetonu. 

d) do czwartej dodać 5 ml 2,0% NaCl. 

Wyjaśnienie: 

Otoczka krwinek czerwonych, zbudowana z połączeń białkowo-lipidowych zachowuje się jak 

błona półprzepuszczalna, warunkując zjawisko osmozy. Przepuszcza ona łatwo wodę, aniony, 

mocznik i glukozę, dla kationów Na + i K + jest nieprzepuszczalna. 

W roztworze izotonicznym z osoczem krwinki nie ulegają zmianom morfologicznym. Takim 

roztworem jest 0,9% NaCl- roztwór fizjologiczny soli. 

Roztwór hipertoniczny powoduje kurczenie się krwinek czerwonych na skutek przejścia 

wody z krwinki do roztworu hipertonicznego. 

Roztwór hipotoniczny powoduje pęcznienie krwinek, a gdy zostanie przekroczona granica 

oporności krwinki, krwinka pęka. Prawidłowe krwinki ulegają hemolizie w wodnych 

roztworach NaCl o stężeniu 0,45 –0,32%. 

Hemolizę krwinek w roztworach izotonicznych można wywołać środkami chemicznymi, 

które rozpuszczają składniki otoczki krwinek (aceton, eter, sole kwasów żółciowych) lub 

wchodząc z nimi w reakcję powodują zanik półprzepuszczalnych właściwości otoczki. 

95

2. Wykazanie złożonego charakteru hemoglobiny 

2.1 Do 10 ml acetonu dodać 2 krople stężonego HCl i wymieszać. Do uzyskanej mieszaniny 

wprowadzić 10 kropli zawiesiny erytrocytów, wymieszać i pozostawić na okres 15 minut, 

a następnie przesączyć. 

Osad rozpuścić w 10 ml wody i wykazać obecność białka metodą biuretowa. 

2.2 Wykrywanie żelaza w hemoglobinie: do tygielka wprowadzić 0,5 ml zawiesiny krwinek 

czerwonych, dodać 4- krotną objętość mieszaniny utleniającej (NaNO3 i Na2 CO3) i 

ogrzewać do zupełnego utlenienia substancji organicznej. Po oziębieniu do pozostałości 

dodawać stęż. HCl do momentu aż roztwór przestanie się pienić i odczyn powinien być 

kwaśny. Przesączyć i do przesączu (2 ml) dodać kroplami rodanku amonu. Czerwone 

zabarwienie pochodzi od Fe (CNS)3 . 

Wyjaśnienie: 

Hemoglobina należy do białek złożonych – chromoprotein. Grupa prostetyczna hemoglobiny- 

hem zawiera dwuwartościowe żelazo. 

3. Wykrywanie anhydrazy węglanowej w erytrocytach 

Do 2 cylindrów o pojemności 50 ml wlać po 25 ml wody destylowanej, po 1,0 ml 5% 

NaHCO3 i 1,0 ml 0,02% błękitu bromotymolowego. Do jednego cylindra dodać kroplę krwi. 

Zawartość cylindrów dokładnie wymieszać i umieścić w łaźni lodowej. Po upływie 15 minut 

do obu cylindrów zanurzyć rozgałęzioną rurkę i wdmuchiwać powietrze z płuc. Zanotować 

czas po którym płyn przyjmie barwę zielono-żółtą w każdym z cylindrów. (pH 6,6) 

Wyjaśnienie: 

Krwinki czerwone zawierają enzym anhydrazę węglanowa, który przyśpiesza osiągnięcie 

stanu równowagi chemicznej następującej reakcji: 

CO2 + H2 O �-----------� H2 CO3 . 

W obecności enzymu reakcja zachodzi znacznie szybciej, a wytworzony kwas węglowy 

powoduje obniżenie pH roztworu co można zaobserwować na podstawie zmiany barwy 

wskaźnika. 

Obecność anhydrazy węglanowej w erytrocytach ma istotne znaczenie dla transportu CO 

przez krew i utrzymania stałego pH krwi. 

4. Wykazanie właściwości peroksydatywnych krwi- próba piramidonowa 

Do 1 ml rozcieńczonej krwi dodać roztworu piramidonu i 0,5 ml 3% roztworu nadtlenku 

wodoru. Roztwór zabarwia się na kolor niebiesko-fiołkowy lub na niebiesko-zielono. 

Wyjaśnienie: 

Hemoglobina, podobnie jak peroksydaza, utlenia substraty w obecności H2 O2 np. piramidon 

do barwnych połączeń, ponieważ posiada podobnie jak peroksydaza żelazoporfirynowa grupę 

prostetyczną. W odróżnieniu od właściwej peroksydazy, hemoglobina działa również i po 

ogrzaniu, ponieważ nie jest właściwym enzymem, który w czasie gotowania ulega 

zniszczeniu. 

96

5. Wykrywanie katalazy 

Do rozcieńczonej krwi dodać kilka kropli HO. Wydzielają się banieczki gazu. 

Wyjaśnienie: 

Katalaza jest enzymem hemoproteinowym, zawierającym 4 układy hematyny, powszechnie 

występujacym w komórkach roślinnych i zwierzęcych. Szczególnie dużo zawierają jej 

erytrocyty. Rozkłada ona nadtlenek wodoru do tlenu i wody ( w reakcji jedna cząsteczka H2 

O2 ulega utlenieniu, a druga redukuje się do wody), chroniąc komórki przed jego szkodliwym 

działaniem. 

6. Wykrywanie jakościowe składników krwi 

Odbiałczanie krwi: przeprowadzamy przez dodanie do 5 ml krwi 20 ml wody destylowanej, 

a następnie dodajemy kroplami, stale mieszając 3 ml 50% kwasu trójchlorooctowego 

(TCA).Wytrąca się brunatny osad białka, który po 10 minutach należy odsączyć przez miękki 

sączek. Otrzymany przesącz zawiera pozostałe rozpuszczalne składniki krwi. Niektóre z nich 

można wykryć. Przesącz można odparować do 1/3 wyjściowej objętości w parowniczce 

umieszczonej na wrzącej łaźni wodnej. 

Do 7 probówek wlać po około 1 ml przesączu i wykonać następujące próby: 

6.1 wykrywanie jonów chlorkowych: do przesączu dodać po 2 krople 2 n HNO3 i 0,1n 

AgNO3 .Wytrąca się serowaty osad AgCl 

6.2 wykrywanie jonów siarczanowych: do przesączu dodać po 2 krople 2 n HCl i 5% BaCl2. 

Zmętnienie pochodzące od BaSO4 świadczy o obecności jonów siarczanowych. 

6.3 wykrywanie jonów fosforanowych: do przesączu dodać 0,5 ml roztworu molibdenianu 

amonu ((NH4 )2 MoO4 ) i 0,5 ml stężonego HNO3. Po zagotowaniu powstaje żółty osad 

fosfomolobdenianu amonowego. 

6.4 wykrywanie jonów wapniowych: do przesączu dodać 0,5 ml roztworu szczawianu amonu 

i kilka kropli stężonego NH4 OH. Zmętnienie roztworu pochodzi od szczawianu wapnia. 

6.5 wykrywanie mocznika: do przesączu dać po 0,5 ml 2 n NaOH i NaBrO. Mocznik rozkłada 

się według równania: 

CO(NH2)2 + 3NaBrO + 2NaOH � N2 + 3NaBr + Na2CO3 + 3H2O 

Wydzielające się pęcherzyki azotu świadczą o obecności mocznika. 

6.6 wykrywanie kreatyniny (reakcja Jaffego): do przesączu dać 0,5 ml 2n NaOH i 1 ml 

nasyconego roztworu kwasu pikrynowego. Powstaje czerwony pikrynian kreatyny. 

6.7 wykrywanie kwasu moczowego (reakcja Folina Denisa): do przesączu dodać odczynnika 

Folina Denisa i kilka kropli 2 n NaOH. Pod wpływem kwasu moczowego następuje 

redukcja kwasu fosforowolframowego do niebieskich tlenków wolframu. 

97

Wyjaśnienie: 

Krew jest tkanką transportującą w organizmie gazy, wodę, organiczne i nieorganiczne 

substancje odżywcze, końcowe produkty przemian. Skład chemiczny krwi odzwierciedla 

procesy metaboliczne, odbywające się w organizmie. W diagnostyce lekarskiej składniki 

chemiczne krwi oznacza się ilościowo, a wartości stężeń składników krwi pozwalają na 

ocenę aktualnej sytuacji zdrowotnej i rozpoznawanie chorób. Krew stanowi materiał łatwo 

dostępny do badań. 

7. Ilościowe oznaczanie hemoglobiny 

Odmierzyć 5 ml odczynnika Drabkina (trucizna – zawiera KCN) i dodać 0,02 ml krwi za 

pomocą mikropipety, którą trzykrotnie płuczemy odczynnikiem. Mieszamy i odstawiamy na 

10 minut. Odczytujemy wartość absorbancji przy 540 nm wobec odczynnika Drabkina. 

Stężenie hemoglobiny odczytać z krzywej kalibracyjnej dla wzorca cyjanomethemoglobiny 

lub z odczytanej absorbancji przyjmując wartość 44 dla milimolowego współczynnika 

absorbcji przy 540 nm. 

A x masa molowa Hb x rozcieńczenie krwi 

Hb (g/100ml)=- ------------------------------------------------------ = A x 36,7 

Współczynnik absorpcji x 10 x 1000 

Wyjaśnienie: 

Hemoglobina i jej pochodne (z wyjątkiem sulfohemoglobiny) pod wpływem odczynnika 

Drabkina ulegają przekształceniu w trwałą pochodną cyjanową - cyjanomethemoglobinę, 

wykazująca maksymalna absorbcję przy 540 nm. 

Oznaczanie hemoglobiny we krwi jest jednym z podstawowych badań klinicznych. 

Stężenie hemoglobiny wynosi 7,4 -9,9 mmola/l (12 – 16 g/dl) u kobiet i 8,0 – 11,0 mmola/l 

(13 18 g/dl) u mężczyzn. 

8. Zastosowanie filtracji żelowej do analizy pochodnych hemoglobiny. 

Na kolumnę z żelem Sephadex G-25 (1cm x 8 cm) w 20 mM buforze fosforanowym pH 7,6 

wprowadzić 0,2 ml świeżo przygotowanej mieszaniny zawierającej równe objętości: 

20 mM roztworu FeSO 4, 80 mM Na2 EDTA (czynnik chelatujący), 0,2 mM Na2 HPO4 . 

Po wsiąknięciu w żel na kolumnę wprowadzić około 0,5 ml buforu fosforanowego, 

a następnie 0,5 ml rozcieńczonej odwłóknionej krwi do której dodano żelazicyjanek potasu 

(5mg/ml). 

Po wsiąknięciu w żel methemoglobiny przemyć ostrożnie ścianki kolumny 0,2 ml buforu, 

a następnie prowadzić elucję. Obserwować zmianę barwy methemoglobiny. 

Wyjaśnienie: 

Żelazicyjanek potasu utlenia żelazo hemoglobiny do Fe III i przeprowadza ją do brunatnej 

Met-Hb. Methemoglobina przechodząc na kolumnie przez warstwę soli żelaza II 

wartościowego (żółty prążek) ulega redukcji do purpurowej hemoglobiny. Następnie w 

kontakcie z buforem nasyconym powietrzem hemoglobina ulega utlenowaniu do jasno 

czerwonej oksyhemoglobiny. Można zaobserwować moment w którym górna warstwa 

naniesionej na kolumnę próbki ma kolor brunatny, środkowa purpurowy, a dolna jasno - 

czerwony. 

98

9. Oznaczanie stężenia glukozy we krwi metodą kolorymetryczną Samogyi-Nelsona 

Do dwóch probówek wirówkowych odmierzyć po 0,9 ml wody destylowanej. Do jednej 

probówki wprowadzić mikropipetą 0,1 ml H2 O ( próba ślepa) a do drugiej 0,1 ml krwi 

(próba właściwa ). Do obu probówek dodać po 0,5 ml 2% Na2 WO4 i 0,4 ml 0,16 n H2 SO4 . 

Wymieszać i odwirować w ciągu 5 minut przy 3000 obr/min. 

Pobrać z każdej probówki po 1,0 ml płynu znad osadu i dodać 1,0 ml odczynnika 

miedziowego. Probówki ogrzewać we wrzącej łażni wodnej przez 10 minut. Po ochłodzeniu 

prób pod bieżącą wodą dodać do każdej po 1,0 ml odczynnika arsenomolibdenowego i 7,0 ml 

wody destylowanej. 

Zawartość probówek dokładnie wymieszać i odstawić na 10 minut. Ekstynkcję odczytać 

wobec próby ślepej przy długości fali 520 nm. Stężenie glukozy w próbce odczytać z krzywej 

kalibracyjnej. 

Wyjaśnienie: 

Próbkę krwi odbiałcza się wolframianem sodu i kwasem siarkowym. Znajdująca się w próbce 

glukoza w obecności winianu sodowo-potasowego redukuje jon miedziowy do czerwonego 

tlenku miedziawego. Tlenek miedziawy wchodzi w reakcję z kwasem arsenomolibdenowym, 

który ulega łatwo redukcji do niebieskiego błękitu molibdenowego. Natężenie niebieskiej 

barwy jest proporcjonalne do ilości glukozy w próbce. 

Zawartość ważniejszych składników w surowicy krwi ludzkiej 

Glukoza 66 - 110 mg/dl Sód 135 - 145 mmol/l 

Mocznik 15 - 43 mg/dl Potas 3,5 - 5,1 mmol/l 

Kreatynina 0,7 - 1,5 mg/dl Wapń całk. 8,6 - 0,2 mg/dl. 

Cholesterol 120 - 200 mg/dl 

Bilirubina całk. 0,2 - 1,3 mg/dl 

. 

99

ROZDZIAŁ XIX 

ANALIZA MOCZU FIZJOLOGICZNEGO 

I PATOLOGICZNEGO 


Nerki odgrywają istotną rolę w zachowaniu homeostazy ustrojowej. Do najważniejszych 

funkcji nerek należy: 

• regulacja gospodarki wodno- elektrolitowej i równowagi kwasowo- zasadowej 

• wydalanie końcowych produktów przemiany materii oraz substancji obcych dla 

organizmu 

• a także czynność wewnątrzwydzielnicza np. sekrecja erytropoetyny i reniny, 

powstawanie kalcytriolu. 

Wyrazem tych regulacji środowiska wewnętrznego są wahania składu moczu przy 

niezmienionym składzie krwi. Podstawową jednostką morfologiczno - czynnościową nerki 

jest nefron składający się z kłębuszka nerkowego, kanalika bliższego (proksymalnego), pętli 

nefronu (Henlego), kanalika dalszego (dystalnego) i kanalika zbiorczego. 

Mechanizm wytwarzania moczu jest złożony i ogólnie obejmuje następujące procesy: 

• przesączanie osocza w kłębuszkach 

• wybiórcze wchłanianie zwrotne cennych dla organizmu substancji w kanalikach 

• sekrecja i wydalanie przez kanaliki związków zbędnych 

W wyniku przesączania się w torebkach kłebuszków nerkowych gromadzi się tzw. mocz 

pierwotny. Zawiera on te same składniki drobnocząsteczkowe które wystepują we krwi. Są to 

zarówno substancje potrzebne jak i końcowe produkty przemian które mają być wydalone z 

organizmu np. mocznik, kwas moczowy, kreatynina. 

Dopiero w czasie przepływu przez kanaliki nerkowe przesącz kłębuszkowy ulega istotnym 

zmianom. Zmiany te dotyczą objętości, składu, molalności, stężenia jonów wodorowych. W 

efekcie z całości wytworzonego moczu pierwotnego w ciągu doby powstaje 1- 1,5 litra moczu 

ostatecznego. Zarówno ilość jak i skład moczu ostatecznego są zmienne i zależne od składu 

diety, intensywności procesów metabolicznych oraz utraty wody na innej drodze. 

Badanie moczu, obok badań krwi należy do najczęściej wykonywanych badań 

laboratoryjnych i ma dużą wartość diagnostyczną. Do ilościowej oceny składu moczu 

przeprowadzana jest jego zbiórka dobowa, natomiast do wykrycia jego składu jakościowego 

wystarczy jednorazowo oddana porcja moczu. Badanie ogólne moczu obejmuje ocenę 

właściwości fizycznych oraz analizę chemiczną czyli wykrywanie i oznaczanie składników 

prawidłowych jak i patologicznych. 

Badania fizyczne moczu zwykle ograniczają się do oznaczenia jego dobowej ilości, gęstości 

(ciężaru właściwego), odczynu (pH) a także barwy, przejrzystości i woni. 

Ilość dobowa moczu ściśle zależy od diety, ilości wypitych płynów w ciągu doby, utraty 

wody innymi drogami np. poty, wymioty, biegunka, oraz od czynności wydzielniczej nerek, 

stanu krążenia i innych czynników. U ludzi zdrowych dobowa ilość moczu wynosi 1 – 1,5 

litra co stanowi ok. 60% przyjętej wody. Za patologiczne uznaje się ilości poniżej 500 ml 

(oliguria) i powyżej 2 l (poliuria). 

Ciężar właściwy moczu dobowego wynosi 1,010 – 1.030 g/ml i zależy od ilości 

rozpuszczonych w nim ciał stałych oraz ilości wydalonej z moczem wody. Gęstość moczu 

pozostaje w prostym stosunku do ilości rozpuszczonych składników stałych i odwrotnym do 

ilości wydalonej wody czyli np. wzrasta przy niedoborze wody i podczas wydalania 

większych ilości cukrów. 

100

Odczyn moczu człowieka zdrowego, pozostającego na diecie mieszanej odpowiada pH 5,5 – 

6,5. Odczyn lekko kwaśny jest wynikiem udziału nerek w zaoszczędzaniu zasad i 

spowodowany jest wydalaniem niektórych kwasów organicznych będących produktami 

metabolizmu np. kwas mlekowy, pirogronowy czy związki ketonowe oraz zamianą 

fosforanów II- rzędowych na I- rzędowe. 

Związki wydalane przez nerki można podzielić na progowe i bezprogowe. Związki progowe 

ulegają w kanalikach nerkowych całkowitej resorpcji, o ile ich stężenie we krwi nie 

przekroczy pewnych granicznych stężeń zwanych progiem nerkowym. Z kolei związki 

bezprogowe ulegają bardzo nieznacznej resorpcji i są wydalane z moczem proporcjonalnie do 

ich stężenia we krwi. 

Wśród składników chemicznych moczu prawidłowego wyróżniamy: 

• związki organiczne azotowe (mocznik, kwas moczowy, kreatynina, urobilinogen, 

aminokwasy, kwas hipurowy, indykan moczowy i inne) 

• związki organiczne bezazotowe (kwasy np. szczawiowy, mlekowy, cytrynowy, 

produkty metabolizmu i detoksykacji, leki i inne związki) 

• składniki nieorganiczne ( woda i związki mineralne np. jony amonowe, sodowe, 

potasowe, magnezowe, chlorki, fosforany, wodorowęglany, związki siarkowe). 

Mocznik – stanowi około 80-90 % azotu wydalanego z moczem w ciągu doby. Mocznik 

powstaje w wątrobie w cyklu mocznikowym i jest końcowym produktem przemiany 

białkowej. 

Kreatynina – jest drugim co do ilości związkiem azotowym moczu, wydalanie jej jest 

osobniczo charakterystyczne i związane z płcią oraz wielkością masy mięśniowej. Kreatynina 

jest bezwodnikiem powstającej w mięśniach kreatyny. 

Kwas moczowy – jest końcowym produktem rozkładu zasad purynowych. Pochodzi z 

nukleoprotein przyjętych z pokarmem oraz pochodzących z komórek organizmu. 

Urobilinogen – jest obok urochromu i urobiliny jednym z barwników moczu fizjologicznego. 

Powstaje z bilirubiny w jelitach, przy udziale enzymów bakteryjnych. Zwiększone ilości 

przechodzą do moczu przy niewydolności wątroby natomiast brak lub znaczne zmniejszenie 

ilości obserwuje się przy ciężkiej żółtaczce miąższowej. 

Amoniak – jest ważnym związkiem azotowym w 60 % pochodzącym z dezaminacji 

glutaminy a w 40 % z dezaminacji aminokwasów. Ilość wydalanego z moczem amoniaku w 

postaci jonów amonowych jest zmienna ponieważ związane jest to z udziałem nerki w 

utrzymaniu równowagi kwasowo – zasadowej organizmu. 

Mocz zawiera szereg końcowych produktów przemiany materii i dlatego jego badanie 

pozwala na ocenę zarówno nerek jak i innych narządów. W różnych stanach chorobowych 

pojawiają się w moczu tzw. składniki patologiczne. Związki te normalnie w moczu 

prawidłowym nie występują bądź występują jedynie w ilościach śladowych, które nie są 

wykrywalne metodami zwykle stosowanymi w analityce klinicznej. 

Badania patologicznych składników obejmują głównie obecność białka, cukrów, ciał 

ketonowych, krwi, barwników żółciowych oraz kwasów żółciowych a także zwiększonej 

zawartości urobilinogenu. 

Białko – białkomoczem (proteinurią) określa się stan gdy wydalane jest więcej niż 150 

mg/dobę. Białkomocz patologiczny pojawia się głównie w chorobach nerek, występuje też w 

stanach gorączkowych, chorobach krwi, zatruciach i innych. Z moczem wydalane są głównie 

albuminy, rzadziej zaś pojawiają się globuliny. 

101

W warunkach fizjologicznych, niewielki i krótkotrwały białkomocz może pojawić się np. po 

dłuższym wysiłku fizycznym, długim staniu, stresie. 

Cukier – w warunkach prawidłowych glukoza nie występuje w moczu ostatecznym ponieważ 

ulega całkowitej resorbcji zwrotnej w kanaliku proksymalnym nerki. Gdy jej zawartość we 

krwi przekroczy tzw. próg nerkowy – 180 mg/% lub gdy upośledzone jest wchłanianie 

zwrotne, glukoza wydalana jest z moczem (glukozuria). Szczególnie duże ilości glukozy 

występują w moczu w przebiegu ciężkiej cukrzycy. W pewnych warunkach związanych z 

dietą lub specyficznym stanem organizmu np. ciążą i karmieniem, mogą w moczu pojawiać 

się również inne cukry : pentoza, fruktoza, galaktoza czy laktoza. 

Związki ketonowe – w moczu prawidłowym nie występują wcale bądź tylko w ilościach 

śladowych ponieważ podobnie jak glukoza są związkami progowymi. Pojawienie się 

związków ketonowych w moczu (ketonuria) jest następstwem zaburzeń przemiany 

węglowodanów i lipidów. Dużo związków ketonowych wydalanych jest z moczem w 

cukrzycy, głodzeniu a także przy diecie ubogowęglowodanowej lub bogatotłuszczowej. 

Bilirubina – główny barwnik żółci jest produktem metabolizmu hemu. Ponieważ jest 

związkiem nierozpuszczalnym, we krwi przenoszona jest w połączeniu z albuminami i α2 – 

globulinami (tzw. bilirubina pośrednia) i w związku z tym nie występuje w moczu osób 

zdrowych. W żółtaczkach mechanicznych lub miąższowych, w których zwiększa się ilość 

tzw. bilirubiny bezpośredniej (tzn. sprzężonej z kwasem glukuronowym) następuje 

przechodzenie jej do moczu. Natomiast w żółtaczce hemolitycznej, gdzie wzrasta ilość 

bilirubiny pośredniej barwnik ten w moczu nie występuje 

Kwasy żółciowe – powstają w wątrobie i należą do głównych składników żółci. Związki te 

pojawiają się w moczu gdy wzrasta ich stężenie we krwi w wyniku zaburzeń w odpływie 

żółci do przewodu pokarmowego (żółtaczka mechaniczna) lub przy zapaleniu wątroby. 

Krew – obecność krwi w moczu (hematuria) związana może być z chorobami nerek, układu 

moczowo-płciowego, chorób krwi czy zatruć. W moczu może pojawiać się też sama 

hemoglobina (hemoglobinuria). Jest to najczęściej skutkiem hemoglobinemii czyli wzrostu 

stężenia hemoglobiny w osoczu na skutek zachodzącej w naczyniach krwionośnych hemolizy 

krwinek czerwonych. 


1) Zapoznanie się z podstawowymi własnościami fizycznymi moczu. 

2) Wykrywanie podstawowych składników chemicznych (nieorganicznych i organicznych) 

moczu prawidłowego. 

3) Wykrywanie najczęściej występujących składników moczu patologicznego. 

WYKONANIE: 

BADANIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYCZNYCH MOCZU. 

1) Określenie odczynu moczu 

Papierek wskaźnikowy zwilżyć moczem. Określić pH badanego moczu porównując 

zabarwienie ze skalą. 

102

Wyjaśnienie: 

Człowiek zdrowy, pozostający na diecie mieszanej ma pH moczu ok. 6. Odczyn moczu 

zależy od diety - dieta białkowa zakwasza, jarska alkalizuje go. 

2) Oznaczanie ciężaru właściwego moczu (gęstości względnej). 

Oznaczenie przeprowadza się za pomocą urometru. W tym celu mocz wlać do szklanego 

cylindra (gdy na powierzchni powstanie piana usunąć ją używając bibuły). Zanurzyć urometr 

nie dotykając ścianek cylindra. 

Odczytać na skali urometru (na podstawie dolnego menisku cieczy) wartość ciężaru 

właściwego. 

Wyjaśnienie: 

Gęstość względna jest miarą stężenia rozpuszczonych w moczu substancji stałych i związana 

jest z wielkością diurezy oraz funkcją kanalików nerkowych. Jeśli dwie ostatnie cyfry ciężaru 

właściwego pomnożymy przez współczynnik 2,3 otrzymamy w przybliżeniu ilość ciał stałych 

(g) w litrze moczu. Prawidłowy mocz zawiera 55- 70g stałych składników w ilości dobowej z 

czego 25 – 35 g przypada na mocznik. Prawidłowy ciężar moczu dobowego waha się w 

granicach 1,010 – 1,030 g/ml. 

WYKRYWANIE NAJWAŻNIEJSZYCH SKŁADNIKÓW NIEORGANICZNYCH I 

ORGANICZNYCH MOCZU PRAWIDŁOWEGO. 

1) Wykrywanie jonu wapniowego 

Do 2 ml moczu dodać 3–4 krople CH3COOH i ok. 1 ml szczawianu amonu, wymieszać. 

Pojawia się biały osad szczawianu wapnia. 

2) Wykrywanie jonu amonowego 

2 ml moczu zalkalizować dodając 30 % NaOH (wobec papierka wskaźnikowego). 

Probówkę ogrzewać łagodnie w łaźni wodnej umieszczając u jej wylotu papierek 

wskaźnikowy zwilżony wodą. 

Zmiana barwy papierka wskaźnikowego zachodzi na skutek ulatniającego się amoniaku. 

3) Wykrywanie jonu chlorkowego 

2 ml moczu zakwasić kilkoma kroplami 2 N HNO3 i dodać kilka kropli AgNO3. Powstaje 

zmętnienie lub biały osad chlorku srebra. 

4) Wykrywanie jonów fosforanowych 

Do 1 ml moczu dodać 1 ml stężonego HNO3 i 2 ml molibdenianu amonu. Próbę 

zagotować we wrzącej łaźni wodnej. Powstaje żółty osad fosforomolibdenianu amonu. 

5) Wykrywanie mocznika 

Do 1 ml moczu dodać 1 ml podbrominu sodu i 1 ml 2 N NaOH. Na skutek rozkładu 

mocznika wydzielają się pęcherzyki azotu. 

6) Wykrywanie kwasu moczowego (próba Folina – Denisa) 

Do 1 ml moczu dodać 1 ml 2 N NaOH i 1 ml kwasu fosforowolframoweg (odczynnik 

Folina-Denisa). 

Pojawia się niebieskie zabarwienie na skutek redukcji kwasu fosforowolframowego do 

tlenków wolframu. 

Podczas reakcji obecny w moczu kwas moczowy utlenia się do allantoiny. 

103

7) Wykrywanie kreatyniny 

a) próba Jaffego 

Do 1 ml moczu dodać 1 ml nasyconego kwasu pikrynowego i 0,5 ml 2 N NaOH. 

Pojawia się czerwone zabarwienie. Kreatynina ma właściwości redukujące. Pod jej 

wpływem kwas pikrynowy redukuje się do kwasu pikraminowego, który w środowisku 

alkalicznym ma zabarwienie czerwone. 

b) próba Weyla 

Do 1 ml moczu dodać 1 kroplę nitroprusydku sodu, a następnie kroplami dodawać 2 N NaOH 

do wystąpienia barwy czerwonej. 

Po dodaniu stężonego kwasu octowego próba odbarwia się. 

8) Wykrywanie urobilinogenu ( próba Ehrlicha ) 

(Uwaga! Próbę wykonywać tylko na świeżo oddanym moczu) 

Do 2 ml moczu dodać 0,5 ml odczynnika Ehrlicha ( 2% p-dwumetyloaminobenzaldehyd 

). Próbę ogrzewać w łaźni wodnej do pojawienia się czerwonego zabarwienia. 

Pojawienie się barwy czerwonej po ogrzaniu świadczy o prawidłowej zawartości 

urobilinogenu, natomiast przy jego zmniejszonej zawartości próba jest ujemna. 

Pojawienie się barwy w temperaturze pokojowej świadczy o zwiększonej zawartości 

urobilinogenu w moczu. 

Ponieważ pod wpływem powietrza urobilinogen utlenia się do urobiliny, mocz użyty do 

badania powinien być świeży. 

WYKRYWANIE NIEKTÓRYCH SKŁADNIKÓW PATOLOGICZNYCH MOCZU 

1) Wykazanie obecności białka 

a) próba koagulacyjna 

Do 5 ml klarownego moczu dodać 0,5 ml buforu octanowego o pH 4,7. Próbę ogrzewać 

do wrzenia w łaźni wodnej. Pojawia się biały osad zdenaturowanego białka. 

b) próba z kwasem sulfosalicylowym 

Do 1 ml moczu dodać 2 – 3 krople 10 % kwasu sulfosalicylowego. Powstaje biały osad 

zdenaturowanego białka. Czułość próby jest bardzo duża a kwas sulfosalicylowy jest 

rutynowo stosowanym odczynnikiem strącającym białko. 

c) próba Hellera ze stężonym kwasem azotowym 

Ok. 1 ml moczu podwarstwić dodając 1 ml stężonego HNO3, nie mieszać. Na granicy 

płynów powstaje biały pierścień zdenaturowanego białka. 

Wyjaśnienie: 

Białko w moczu wykrywamy zwykle metodami strąceniowymi np. koagulacji cieplnej 

lub z kwasami (sulfosalicylowym, azotowym czy trójchlorooctowym-TCA). Natomiast 

jego ilościowe oznaczanie można przeprowadzić metodą kolorymetryczną. 

2) Wykrywanie cukru (glukozy) 

Próba Nylandera 

Do 2 ml moczu dodać 1 ml odczynnika Nylandera (zasadowy azotan bizmutu). Próbę 

ogrzewać ok. 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. W obecności cukru powstaje czarny osad 

metalicznego bizmutu. 

104

Wyjaśnienie: 

Do wykazania obecności glukozy w moczu używamy metod redukcyjnych np. próba 

Nylandera, Fehlinga, Benedicta. Nie są to jednak odczyny swoiste dla glukozy bowiem 

dają je także inne cukry redukujące które mogą występować w moczu (fruktoza, 

galaktoza, pentozy, laktoza). Słabą redukcję dają także niektóre składniki moczu jak kwas 

moczowy, kreatynina, kwas glukuronowy, kwas askorbinowy). 

Ilościowe oznaczenie glukozy można wykonać metodą polarymetryczną, redukcyjną czy 

enzymatyczną. 

3) Wykrywanie ciał ketonowych 

Próba Legala 

Do 2 ml moczu dodać 1 – 2 kropli nitroprusydku sodu a następnie 1 ml 2 N NaOH. 

Powstaje czerwone zabarwienie. Po dodaniu 1ml lodowatego CH3COOH barwa pogłębia 

się do wiśniowo-czerwonej. 

Wyjaśnienie: 

Próbą Legala wykrywamy aceton i acetooctan. Związki te z nitroprusydkiem sodu dają w 

środowisku alkalicznym czerwone zabarwienie, które pogłębia się jeszcze po dodaniu 

kwasu octowego. 

Posługując się reakcją z nitroprusydkiem sodu można wykazać także obecność kreatyniny 

– stałego składnika moczu. Jednak w tym przypadku, po zakwaszeniu kwasem octowym 

barwa związana z obecnością kreatyniny znika. 

4) Wykrywanie bilirubiny 

a) próba Gmelina 

2 ml moczu podwarstwić dodając 1 ml stężonego HNO3. Na granicy płynów powstają 

kolorowe pierścienie pochodzące od powstających produktów utlenienia bilirubiny. 

b) próba Rosina 

2 ml moczu delikatnie nawarstwić dodając ok. 1 ml 0,05 % roztworu J2. W miejscu 

zetknięcia się obu płynów w wyniku utlenienia się bilirubiny powstaje szarozielone 

zabarwienie. 

Wyjaśnienie: 

Bilirubina bardzo łatwo utlenia się do kilku barwnych pochodnych z których najbardziej 

charakterystyczna jest zielono zabarwiona biliwerdyna. 

Oprócz oznaczania bilirubiny znaczenie diagnostyczne ma także oznaczanie 

urobilinogenu. W żółtaczkach mechanicznych w moczu obecna jest bilirubina ale brak 

jest urobilinogenu. Natomiast w żółtaczkach hemolitycznych stwierdza się w moczu 

wzrost urobilinogenu bez wzrostu bilirubiny. 

5) Wykrywanie kwasów żółciowych 

Próba Haya 

Na powierzchnię badanego moczu nasypać niewielką ilość kwiatu siarczanego 

(resublimowanej siarki). Siarka opada na dno probówki. 

105

Wyjaśnienie: 

W obecności kwasów żółciowych napięcie powierzchniowe moczu jest znacznie obniżone 

zatem siarka łatwo opada, natomiast w moczu nie zawierającym kwasów żółciowych 

kwiat siarczany utrzymuje się na powierzchni. 

6) Wykrywanie krwi w moczu 

Próba piramidonowa 

Do 2 ml moczu dodać 0,5 ml lodowatego CH3COOH i 0,5 ml 3 % H2O2 a następnie 

1,5 ml 5 % etanolowego roztworu piramidonu, wymieszać. Po 1 minucie pojawia się 

nietrwałe, fiołkowe zabarwienie utlenionego piramidonu. 

Wyjaśnienie: 

W próbie wykorzystuje się peroksydacyjne właściwości hemoglobiny, która podobnie jak 

enzym peroksydaza ma zdolność utleniania substratów (np. piramidonu) w obecności 

wody utlenionej. 

106

ROZDZIAŁ XX 

TKANKA MIĘŚNIOWA 


Ze względu na budowę morfologiczną i funkcje wyróżniamy trzy typy tkanki 

mięśniowej-mięśnie prążkowane, mięśnie gładkie oraz mięsień serca. Waga tkanki 

mięśniowej stanowi średnio 40-45% masy całego ciała. 

Skład chemiczny tkanki mięśniowej jest złożony, w mięśniach zawarte są następujące 

składniki: 

• białka (18-20% masy mięśni; rozpuszczalne (mioglobina, mioalbuminy, globuliny) i 

nierozpuszczalne (kolagen oraz inne skleroproteiny) 

• enzymy 

• związki azotowe rozpuszczalne w wodzie (np. kreatyna, kreatynina, fosfokreatyna, 

karnozyna, kwas adenozynotrójfosforowy) 

• związki bezazotowe rozpuszczalne w wodzie (np. glukoza, glikogen, kwas mlekowy, 

kwas pirogronowy, inozytol) 

• tłuszczowce np. (fosfolipidy, cholesterol) 

• sole mineralne (np. jony potasu, fosforanowe, wapnia, chlorkowe, sodu) 

• woda-70-80% 

Specyficzność biochemiczna tkanki mięśniowej polega na obecności w niej 

charakterystycznych układów strukturalnych, które determinują ich funkcję. Głównym 

zadaniem mięśni jest zamiana energii chemicznej w pracę mechaniczną. 

Najmniejszą jednostką strukturalną mięśnia szkieletowego jest komórka mięśniowa, której 

jednym ze składników są włókienka kurczliwe, miofibryle. Podstawowym składnikiem 

miofibryli są białka kurczliwe, do których zaliczamy miozynę, aktynę, tropomiozynę i 

troponinę. To właśnie one ułożone w odpowiedni sposób wewnątrz komórki mięśniowej 

stanowią o tym, ze mięsień może kurczyć się. 

Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za regulację skurczu i rozkurczu mięśni zależą 

od rodzaju komórki i tkanki danego organizmu. Istnieją dwa główne mechanizmy regulacji 

skurczu mięśni, oparty na aktynie i oparty na miozynie. Oparta na aktynie regulacja skurczu 

dotyczy mięśni poprzecznie prążkowanych (szkieletowe, sercowy). Skurcz mięśni gładkich, 

które pozbawione są troponiny inicjowany jest przez fosforylację lekkich łańcuchów 

miozyny. Jony wapniowe pełnią kluczową rolę w regulacji skurczu obu typów mięśni. 

Skurcz mięśnia sercowego podobny jest do skurczu mięśni szkieletowych, ma jednak 

swój automatyzm a w związku ze słabiej rozwiniętym układem kanalikowym siateczki 

sarkoplazmatycznej korzysta z pozakomórkowych źródeł jonów wapniowych. Mięsień 

sercowy korzysta z energii pochodzącej z utleniania kwasów tłuszczowych i ciał ketonowych. 

Procesy metaboliczne (glikoliza, glikogenoliza) związane z wytwarzaniem ATP na 

drodze oksydacyjnej fosforylacji dostarczają w czasie pracy mięśni niewystarczającej ilości 

energii, dlatego też dodatkowym źródłem wysokoenergetycznego fosforanu dla szybkiej 

resyntezy ATP jest fosfokreatyna. Dalsze źródło ATP w mięśniach związane jest z obecnością 

enzymu kinazy adenylanowej, który katalizuje przeniesienie wysokoenergetycznego 

fosforanu z jednej cząsteczki ADP na drugą z utworzeniem ATP i AMP. 

Znajomość biochemii mięśni szczególnie białek mięśniowych odgrywających 

kluczową rolę w mechanizmach ruchu w narządach i komórkach stanowi podstawy do 

diagnozowania i leczenia chorób tkanki mięśniowej. 

107

Cel ćwiczenia 

1. Otrzymywanie ekstraktu wodnego i solnego tkanki mięśniowej. 

2. Wykrywanie składników organicznych i nieorganicznych w uzyskanych ekstraktach. 

3. Wykazanie obecności kolagenu w tkance mięśniowej. 

Przygotowanie ekstraktu wodnego i solnego tkanki mięśniowej 

Schemat postępowania 

8 gramów tkanki mięśniowej z 20 ml wody rozcieraj w moździerzu przez 10 minut. 

wirowanie przy 3000 obrotów przez 10 minut 

SUPERNATANT I OSAD I 

(EKSTRAKT WODNY) 

Do wykrywania: 

• albumin Przenieś do moździerza, dodaj: 

• związków azotowych niebiałkowych 50 ml 8% NH4Cl i ucieraj przez 10 minut 

• związków bezazotowych 

• składników mineralnych 

wirowanie przy 

3000 obrotów10 minut 

SUPERNATANT II OSAD II 

(EKSTRAKT SOLNY) Zawiera resztki tkanki 

mięśniowej i kolagen 

Do wykrywania: 

• Frakcji globulinowej Do osadu dodaj 

20 ml H2O dest. 

10 ml 2N NaOH 

ogrzewaj we wrzącej łaźni 

wodnej przez 30 minut. 

Przesącz 

Materiał uzyskany w oparciu o schemat użyj do wykonania oznaczeń. 

SUPERNATANT III 

� Do wykrywania kolagenu 

108

1. WYKRYWANIE MIOALBUMIN W EKSTRAKCIE WODNYM 

(SUPERNATANT I) 

A. Próba biuretowa 

Do 1ml ekstraktu wodnego dodaj 1ml 10% NaOH i kilka kropli 1% CuSO4. 

Wyjaśnienie 

Obecne w białku wiązania peptydowe w środowisku zasadowym ulegają enolizacji i 

tworzą z jonami miedziowymi kompleksy barwy fiołkowo-niebieskiej. 

B. Próby denaturacyjne 

1. Do 1ml ekstraktu wodnego dodaj 1ml kwasu sulfosalicylowego. 

2. Do 1ml ekstraktu wodnego dodaj 1ml kwasutrójchlorooctowego (TCA). 

Obserwuj zmiany w badanym roztworze. 

2. WYKRYWANIE ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH SKŁADNIKÓW 

DROBNOCZĄSTECZKOWYCH W EKSTRAKCIE WODNYM MIĘŚNI 

(SUPERNATANT I) 

Przed przystąpieniem do oznaczania składników drobnocząsteczkowych 

ekstrakt wodny mięśni należy odbiałczyć. 

W tym celu: 

Do 15 ml ekstraktu wodnego dodaj 2 ml 10% kwasu trójchlorooctowego 

(TCA) i zagotuj we wrzącej łaźni wodnej. Wytracają się białka /osad/, które 

oddziel przesączając roztwór. 

Tak przygotowany roztwór służy do wykrywania drobnocząsteczkowych 

związków azotowych, bezazotowych oraz składników mineralnych. 

A. Wykrywanie kreatyny i kreatyniny. Próba Jaffego z kwasem pikrynowym. 

1. Do dwóch probówek (A i B) odmierzyć po 1 ml otrzymanego bezbiałkowego 

ekstraktu tkanki mięśniowej. 

2. Do probówki A dodaj 1 ml 5% roztworu kwasu siarkowego i ogrzewaj w łaźni 

wodnej w ciągu 30 minut 

3. Roztwór po oziębieniu przesącz i zobojętnij wobec papierka wskaźnikowego 30% 

roztworem NaOH. (około 1ml 30% NaOH). 

4. Sprawdź pH w probówce B. Jeśli jest kwaśne zobojętnij wobec papierka 

wskaźnikowego 30% roztworem NaOH. 

5. Do obu probówek (A i B) dodaj po kilka kropli nasyconego roztworu kwasu 

pikrynowego. 

6. W probówce A pojawia się zabarwienie pomarańczowe /reakcja Jaffego/, w 

probówce B lekko pomarańczowe ale najczęściej żółte. 

Wyjaśnienie 

W mięśniach znajduje się kreatyna i nieznaczne ilości kreatyniny. Kreatyna zawarta w 

pierwszej probówce w czasie ogrzewania z kwasem siarkowym przechodzi w kreatyninę, co 

powoduje zwiększenie jej ilości w przesączu. W probówce drugiej reakcja przekształcenia 

kreatyny w kreatyninę nie zachodzi, a ponieważ z kwasem pikrynowym reaguje nie kreatyna 

109

a kreatynina, intensywność zabarwienia jest większa w probówce pierwszej. Pomarańczowe 

zabarwienie roztworu powstaje na skutek utworzenia formy tautomerycznej kwasu 

pikrynowego z kreatyniną. 

B. Wykrywanie karnozyny (alanylohistydyny) 

1. Przygotuj odczynnik diazowy: 

a. Do 3 ml 0.5% roztworu kwasu sulfanilowego dodać równą objętość 

oziębionego 0.5% roztworu azotynu sodu. Odczynnik wstaw do lodu na 2-3 

minuty 

2. Do l ml otrzymanego odczynnika diazowego dodaj l ml bezbiałkowego ekstraktu 

tkanki mięśniowej, a następnie, po wymieszaniu, 9 kropli 10% roztworu węglanu sodu 

(do wyraźnej reakcji zasadowej) 

3. Obserwuj przebieg reakcji. 

Wyjaśnienie 

Pojawiające się czerwone zabarwienie jest wynikiem reakcji odczynnika diazowego 

(kwas diazobenzosulfonowy) z pierścieniem histydynowym karnozyny. 

C. Wykrywanie kwasu mlekowego. 

1. Przygotuj odczynnik Uffelmana: 

a. Do 10 ml 2% roztworu fenolu dodaj 1 kroplę 10% FeCl3 (zabarwienie 

jasnofiołkowe). 

2. Do probówki odmierz 2 ml przygotowanego odczynnika Uffelmana i dodawaj do 

niego kroplami bezbiałkowy ekstrakt tkanki mięśniowej. 

3. Obserwuj przebieg reakcji 

4. W obecności kwasu mlekowego następuje odbarwienie odczynnika Uffelmana i 

powstaje kolor żółty, a gdy ilość kwasu mlekowego jest duża żółtozielony. 

D. Wykrywanie związków mineralnych 

Wykrywanie jonu chlorkowego: 

Do 1ml bezbiałkowego ekstraktu tkanki mięśniowej dodaj kilka kropli 5% roztworu 

AgNO3. W obecności jonów chlorkowych powstaje osad chlorku srebrowego. 

Wykrywanie jonów siarczanowych 

Do 1ml bezbiałkowego ekstraktu tkanki mięśniowej dodaj kilka kropli stężonego 

kwasu azotowego (HNO3) i kilka kropli 5% BaCl2 W obecności jonów siarczanowych 

powstaje osad siarczanu baru (może wystąpić tylko zmętnienie). 

Wykrywanie jonów fosforanowych 

Do 1ml bezbiałkowego ekstraktu tkanki mięśniowej dodaj kilka kropli stężonego 

kwasu azotowego (HNO3) i 1ml molibdenianu amonu. Wstaw na 5 minut do wrzącej 

łaźni wodnej. 

W obecności jonów fosforanowych powstaje żółty osad fosforomolibdenianu amonu. 

110

4. WYKRYWANIE GLOBULIN W EKSTRAKCIE SOLNYM (SUPERNATANT II) 


a. Do 1ml ekstraktu solnego dodaj 1ml 10% NaOH i kilka kropli 1% CuSO4. 

b. Obserwuj przebieg reakcji 



B. Badanie rozpuszczalności frakcji globulinowej 

Do 1ml ekstraktu solnego dodaj kroplami H20 destylowaną do pojawienia się 

zmętnienia lub osadu nierozpuszczalnych w wodzie globulin. 

C. Wysalanie frakcji globulinowej 

Do 1ml ekstraktu solnego dodaj 1 ml (równą objętość) nasyconego roztworu siarczanu 

amonu. 

Przy połowicznym nasyceniu siarczanem amonu globuliny wypadają z roztworu. 

3. WYKRYWANIE KOLAGENU (SUPERNATANT III) 

W resztkach tkanki mięśniowej, pozostałych po ekstrahowaniu chlorkiem amonu, 

znajdują się białka tkanki łącznej. 


Do 1ml uzyskanego roztworu (supernatant III) dodaj 1ml 10% NaOH i kilka kropli 

1% CuSO4. 



B. Próby denaturacyjne 

a. Do 1ml uzyskanego roztworu (supernatant III) dodaj 1ml kwasu 

sulfosalicylowego. 

b. Do 1ml uzyskanego roztworu (supernatant III) dodaj 1ml 

kwasutrójchlorooctowego (TCA). 

Obserwuj zmiany zachodzące w badanym roztworze. 

111

S P I S T R E Ś C I

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?