Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz
Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz
0,1 g AEC rozpuścić w 25 ml dwumetyloformamidu. 3,35 ml roztworu AEC uzupełnić do 50 ml 0.1 M buforem octanowym pH 5,2. Roztwór przesączyć. TuŜ przed reakcją zmieszać 10 ml roztworu AEC i 10 µl 30% nadtlenku wodoru (H2O2). G) Bufor do homogenizacji tkanki – 50 mM bufor fosforanowy pH 7,0 zawierający 5 mM βmerkaptoetanol (17,5 μl/50 ml buforu) Polimeryzacja Ŝelu WYKONANIE A) Przygotowanie płytek do polimeryzacji Ŝelu: płytki odtłuścić, dokładnie wymyć i wysuszyć. ZłoŜyć razem 2 płytki (jedna krótsza), uszczelnić i spiąć ściskaczami do papieru. Ustawić pionowo. Przygotować dwa komplety płytek – jeden do wykrywania aktywności peroksydazy, drugi do wybarwienia białek. B) Polimeryzacja Ŝelu rozdzielającego 8% – w małej zlewce (25–50 ml) naleŜy zmieszać: 2 ml roztworu IA, 2,5 ml roztworu IB, 1,25 ml roztworu IC, 1,25 ml roztworu ID i 3 ml wody. Wszystkie składniki dobrze wymieszać i wlać ostroŜnie między dwie płytki przy pomocy pipety, do wysokości 2,5 – 3 cm od górnej krawędzi krótszej płytki. Na powierzchnię Ŝelu ostroŜnie nawarstwić około 100 μl wody (dostęp tlenu utrudnia polimeryzację) i całość pozostawić do spolimeryzowania (30 – 40 minut). Usunąć wodę znad spolimeryzowanego Ŝelu przy pomocy bibuły, uwaŜając by nie uszkodzić powierzchni Ŝelu. C) Polimeryzacja Ŝelu zagęszczającego 4% − w małej zlewce (25–50 ml) naleŜy zmieszać: 0,5 ml roztworu IIA, 1,25 ml roztworu IIB, 0,625 ml roztworu IIC, 0,625 ml roztworu IID i 2 ml wody. Dokładnie wymieszać składniki i wlać mieszaninę między dwie płytki. OstroŜnie wło- Ŝyć grzebień tak aby nie pozostały pod nim pęcherzyki powietrza, a roztwór wypełnił wycięcia miedzy zębami. Pozostawić Ŝel do polimeryzacji. Próby do elektroforezy A) Homogenizacja tkanki − odwaŜyć po 1 g koleoptyli owsa (etiolowanych oraz naświetlanych), zamrozić w ciekłym azocie i homogenizować w buforze do homogenizacji w stosunku 1:2 (1g tkanki:2 ml buforu). Homogenaty odwirować w mikrowirówce przez 5 min. B) Przygotowanie prób – do oznaczonych probówek Eppendorfa napipetować po 200 μl odpowiedniego supernatantu po wirowaniu, dodać po 25 μl roztworu błękitu bromofenolowego zawierającego glicerol. 6
Elektroforeza A) Umieszczenie płytek z Ŝelem w aparacie do elektroforezy – po spolimeryzowaniu Ŝelu zagęszczającego ostroŜnie wyjąć grzebień uwaŜając aby powstałe studzienki nie uległy uszkodzeniu. Płytki z Ŝelem umocować w aparacie tak aby krótsza płytka była skierowana do wewnątrz aparatu. Oba naczynia elektrodowe wypełnić buforem do elektroforezy. Sprawdzić szczelność aparatu. B) Nanoszenie prób – oznaczone próby nanosić do kolejnych studzienek, podwarstwiąjąc je przy uŜyciu pipety automatycznej z kapilarną końcówką śel do wykrywania aktywności peroksydazy Studzienka 1 – 5 μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych Studzienka 2 – 10 μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych Studzienka 3 – 5 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę Studzienka 4 – 10 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę śel do wybarwienia białek Studzienka 1 – 15μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych Studzienka 2 – 30 μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych Studzienka 3 – 15 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę Studzienka 4 – 30 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę C) Warunki elektroforezy – po naniesieniu prób podłączyć aparat do elektroforezy do zasilacza, włączyć zasilacz i ustawić takie napięcie aby natęŜenie prądu na jedną płytkę wynosiło około 10 mA. Po wniknięciu prób w Ŝel zwiększyć napięcie utrzymując natęŜenie nie przekraczające 20 mA. Elektroforezę naleŜy zakończyć kiedy błękit bromofenolowy znajdzie się około 0,5 cm od dolnej krawędzi Ŝelu. WYŁĄCZYĆ ZASILACZ. Wybarwianie białek w Ŝelu Płytki delikatnie podwaŜyć łopatką i rozdzielić. śel umieścić w kuwecie z roztworem barwiącym. Po 10 min barwnik zlać do butelki, nadmiar z Ŝelu wypłukać wodą, a następnie zalać 10% kwasem octowym w celu odbarwienia tła. Zmienić kilka razy roztwór odbarwiający, na koniec przepłukać wodą. Lokalizowanie izoform peroksydazy w Ŝelu Drugi Ŝel umieścić w kuwecie i zalać 50 ml roztworu AEC z nadtlenkiem wodoru. Obserwować pojawianie się prąŜków zredukowanego substratu. W odpowiednim czasie przerwać reakcję zlewając roztwór AEC i przemywając Ŝel wodą destylowaną. 7
- Page 1 and 2: ANALIZA PORÓWNAWCZA IZOFORM PEROKS
- Page 3 and 4: Ryc. 2. Antyoksydacyjny system ochr
- Page 5: Sprzęt: MATERIAŁY I METODY Aparat
Elektroforeza<br />
A) Umieszczenie płytek z Ŝelem w aparacie do elektroforezy – po spolimeryzowaniu Ŝelu zagęszczającego<br />
ostroŜnie wyjąć grzebień uwaŜając aby powstałe studzienki nie uległy uszkodzeniu.<br />
Płytki z Ŝelem umocować w aparacie tak aby krótsza płytka była skierowana do wewnątrz aparatu.<br />
Oba naczynia elektrodowe wypełnić buforem do elektroforezy. Sprawdzić szczelność<br />
aparatu.<br />
B) Nanoszenie prób – oznaczone próby nanosić do kolejnych studzienek, podwarstwiąjąc je przy<br />
uŜyciu pipety automatycznej z kapilarną końcówką<br />
śel do wykrywania aktywności <strong>peroksydaz</strong>y<br />
Studzienka 1 – 5 μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych<br />
Studzienka 2 – 10 μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych<br />
Studzienka 3 – 5 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę<br />
Studzienka 4 – 10 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę<br />
śel do wybarwienia <strong>białek</strong><br />
Studzienka 1 – 15μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych<br />
Studzienka 2 – 30 μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych<br />
Studzienka 3 – 15 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę<br />
Studzienka 4 – 30 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę<br />
C) Warunki elektroforezy – po naniesieniu prób podłączyć aparat do elektroforezy do zasilacza,<br />
włączyć zasilacz i ustawić takie napięcie aby natęŜenie prądu na jedną płytkę wynosiło około<br />
10 mA. Po wniknięciu prób w Ŝel zwiększyć napięcie utrzymując natęŜenie nie przekraczające<br />
20 mA. Elektroforezę naleŜy zakończyć kiedy błękit bromofenolowy znajdzie się około 0,5 cm<br />
od dolnej krawędzi Ŝelu. WYŁĄCZYĆ ZASILACZ.<br />
Wybarwianie <strong>białek</strong> w Ŝelu<br />
Płytki delikatnie podwaŜyć łopatką i rozdzielić. śel umieścić w kuwecie z roztworem barwiącym.<br />
Po 10 min barwnik zlać do butelki, nadmiar z Ŝelu wypłukać wodą, a następnie zalać 10% kwasem<br />
octowym w celu odbarwienia tła. Zmienić kilka razy roztwór odbarwiający, na koniec przepłukać<br />
wodą.<br />
Lokalizowanie izoform <strong>peroksydaz</strong>y w Ŝelu<br />
Drugi Ŝel umieścić w kuwecie i zalać 50 ml roztworu AEC z nadtlenkiem wodoru. Obserwować<br />
pojawianie się prąŜków zredukowanego substratu. W odpowiednim czasie przerwać reakcję zlewając<br />
roztwór AEC i przemywając Ŝel wodą destylowaną.<br />
7
Change language