Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz

0,1 g AEC rozpuścić w 25 ml dwumetyloformamidu. 3,35 ml roztworu AEC uzupełnić do 50 ml
0.1 M buforem octanowym pH 5,2. Roztwór przesączyć. TuŜ przed reakcją zmieszać 10 ml roztworu
AEC i 10 µl 30% nadtlenku wodoru (H2O2).
G) Bufor do homogenizacji tkanki – 50 mM bufor fosforanowy pH 7,0 zawierający 5 mM βmerkaptoetanol
(17,5 μl/50 ml buforu)
Polimeryzacja Ŝelu
WYKONANIE
A) Przygotowanie płytek do polimeryzacji Ŝelu: płytki odtłuścić, dokładnie wymyć i wysuszyć.
ZłoŜyć razem 2 płytki (jedna krótsza), uszczelnić i spiąć ściskaczami do papieru. Ustawić pionowo.
Przygotować dwa komplety płytek – jeden do wykrywania aktywności peroksydazy,
drugi do wybarwienia białek.
B) Polimeryzacja Ŝelu rozdzielającego 8% – w małej zlewce (25–50 ml) naleŜy zmieszać: 2 ml
roztworu IA, 2,5 ml roztworu IB, 1,25 ml roztworu IC, 1,25 ml roztworu ID i 3 ml wody.
Wszystkie składniki dobrze wymieszać i wlać ostroŜnie między dwie płytki przy pomocy pipety,
do wysokości 2,5 – 3 cm od górnej krawędzi krótszej płytki. Na powierzchnię Ŝelu ostroŜnie
nawarstwić około 100 μl wody (dostęp tlenu utrudnia polimeryzację) i całość pozostawić
do spolimeryzowania (30 – 40 minut). Usunąć wodę znad spolimeryzowanego Ŝelu przy pomocy
bibuły, uwaŜając by nie uszkodzić powierzchni Ŝelu.
C) Polimeryzacja Ŝelu zagęszczającego 4% − w małej zlewce (25–50 ml) naleŜy zmieszać: 0,5
ml roztworu IIA, 1,25 ml roztworu IIB, 0,625 ml roztworu IIC, 0,625 ml roztworu IID i 2 ml
wody. Dokładnie wymieszać składniki i wlać mieszaninę między dwie płytki. OstroŜnie wło-
Ŝyć grzebień tak aby nie pozostały pod nim pęcherzyki powietrza, a roztwór wypełnił wycięcia
miedzy zębami. Pozostawić Ŝel do polimeryzacji.
Próby do elektroforezy
A) Homogenizacja tkanki − odwaŜyć po 1 g koleoptyli owsa (etiolowanych oraz naświetlanych),
zamrozić w ciekłym azocie i homogenizować w buforze do homogenizacji w stosunku 1:2 (1g
tkanki:2 ml buforu). Homogenaty odwirować w mikrowirówce przez 5 min.
B) Przygotowanie prób – do oznaczonych probówek Eppendorfa napipetować po 200 μl odpowiedniego
supernatantu po wirowaniu, dodać po 25 μl roztworu błękitu bromofenolowego zawierającego
glicerol.
6