Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz

Sprzęt:
MATERIAŁY I METODY
Aparat do elektroforezy (wersja mini), płytki szklane o wymiarach10 x 10 cm, zasilacz stabilizowany
(do 150 V).
Odczynniki:
A) Odczynniki do Ŝelu rozdzielającego
• Roztwór IA (Akrylamid) – rozpuścić 39 g akrylamidu i 1 g bis-akrylamidu w wodzie, dodać
20 ml glicerolu, całość uzupełnić wodą do 100 ml.
UWAGA: akrylamid jest neurotoksyną wchłanianą przez skórę, dlatego naleŜy unikać kontaktu z
roztworami tego związku i uŜywać rękawiczek lateksowych
• Roztwór IB (0.75 M Tris-HCl) – rozpuścić 9,15 g Trisu w wodzie, dodać 3 ml HCl, całość
uzupełnić wodą do 100 ml.
• Roztwór IC (0.2 % (w/v) nadsiarczan amonu) – rozpuścić 0,2 g nadsiarczanu amonu w
100 ml wody.
• Roztwór ID (0.4 % (v/v) TEMED) – 0,4 ml TEMEDu uzupełnić do 100 ml wodą.
B) Odczynniki do Ŝelu zagęszczającego
• Roztwór IIA (Akrylamid) – rozpuścić 38 g akrylamidu i 2 g bis-akrylamidu w wodzie,
dodać 20 ml glicerolu i uzupełnić wodą do 100 ml.
• Roztwór IIB (0.75 M Tris –HCl) – rozpuścić 1,5 g Trisu w wodzie, dodać 1 ml HCl i
uzupełnić wodą do 100 ml.
• Roztwór IIC (0.4 % (w/v) nadsiarczan amonu) – rozpuścić 0.4 g nadsiarczanu amonu w
100 ml wody.
• Roztwór IID (2.0 % (v/v) TEMED) – 2 ml TEMEDu uzupełnić wodą do 100 ml.
C) Bufor do elektroforezy (pH 8.3) – rozpuścić 1,5 g Trisu i 7,2 g glicyny w 1 L wody.
D) Roztwór do wybarwiania białek – 0,004% błękit brylantowy – rozpuścić 20 mg Coomassie
Brillant Blue G-250 w 500 ml 3,5 % kwasu nadchlorowego z 20 % metanolem.
E) Roztwór odbarwiający – 10% (v/v) kwas octowy
F) Roztwór AEC (3-amino-9-etylokarbazol) do wykrywania aktywności peroksydazy – syntetycznym
substratem utlenianym przez peroksydazy w obecności H2O2 moŜe być 3-amino-9etylokarbazol
o wzorze:
5