Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz

Ryc. 3. Elektroforeza na Ŝelu poliakryloamidowym. A. Aparat do elektroforezy Ŝelowej. B. Pory Ŝelu po-
liakryloamidowego działają jak sito i rozdzielają białka w zaleŜności od wielkości ich cząsteczek (J.M.
Berg, J.L. Tymoczko, L.Stryer, Biochemia)
Najczęściej stosowanym Ŝelem jest Ŝel poliakryloamidowy, który posiada szereg zalet de-
cydujących o jego powszechnym uŜyciu jako nośnika. śel poliakryloamidowy jest chemicznie
obojętny, bezbarwny i pozbawiony ładunków elektrostatycznych, odznacza się duŜą wytrzymało-
ścią mechaniczną i termiczną oraz jest łatwy i szybki w przygotowaniu. Dodatkowo, dzięki moŜ-
liwości zróŜnicowanego sieciowania, moŜna uzyskać określone rozmiary oczek sita molekularne-
go (0,6 - 4 nm).Wielkość oczek sieci Ŝelu zaleŜy od proporcji między akryloamidem (H2C=CH–
CO–NH2 ) a N,N’-metyleno-bis-akryloamidem H2C=CH–CO–NH–CH2–NH–CO– CH=CH2 (po-
tocznie nazywanym bis-akryloamidem), które są substratami do polimeryzacji. Od ilości bis-
akryloamidu w mieszaninie zaleŜy liczba wiązań poprzecznych, decydująca o rozmiarach sita mo-
lekularnego. Do przeprowadzenia polimeryzacji konieczny jest dodatek nadsiarczanu amonu oraz
katalizatora – N,N,N’,N’-czterometyloetyleno-dwuaminy (TEMED). W wyniku katalizowanego
przez TEMED rozpadu nadsiarczanu amonu, powstają wolne rodniki tlenowe, pod wpływem któ-
rych tworzą się rodniki poliakryloamidowe dające polimer.
Dla uzyskania optymalnej rozdzielczości stosuje się Ŝel o odpowiedniej wielkości porów,
która zaleŜy od stęŜenia procentowego Ŝelu. Elektroforezę w Ŝelu poliakryloamidowym moŜna
wykonywać wieloma metodami, spośród których bardzo wygodną jest metoda wg Ogita i Markert
[1]. Elektroforezę wykonuje się w układzie dwóch Ŝeli (rozdzielający i zagęszczający) róŜniących
się stęŜeniem procentowym i pH. Zostanie ona zastosowana w opisywanym ćwiczeniu do analizy
porównawczej izoform peroksydazy z koleoptyli owsa.
4