Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot

Elektroforez, Western Blot,Southern Blot, Northern BlotDr. Gaye Güler TezelHacettepe Üniversitesi Tıp FakültesiPatoloji Anabilim Dalı

ElektroforezDNA, RNA ve protein moleküllerinibüyüklük, şekil ve topolojik özelliklerine göreayıran bir yöntem

ElektroforezÇözünmüş durumdaki moleküllerin elektrikyüklerinin kitlelerine oranıyla belirlenenhızlarda elektriksel alanda göç etmeleriprensibine dayanır.Nükleik asit ya da protein karışımlarınısaflaştırmakta ve analiz yapmakta geniş çaptakullanılır.

ElektroforezAnaliz yapılacak örnek destek ortamınauygulanır.Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibidüşük molekül ağırlıklı olan moleküller için,Jeller ise nükleik asit ve proteinler gibi büyükmoleküller için destek ortamı olarakkullanılır.

Jel matriksi jelöz kıvamlı, makromolekülleriçin elek görevi yapan porlu bir materyalAgaroz ve akrilamid olarak iki tip matriks

Horizontal Agaroz Jel ElektroforeziDNA/RNAVertikal poliakrilamid Jel ElektroforeziDNA/RNA/Protein

Jelin sahip olduğu porların çapı; jelinkimyasal özelliklerine bağlıdır.Dokudan hazırlanan makromolekülün (DNA,RNA, protein) ekstreleri tank içinde jelüzerinde elektroforetik olarak koşturulur.

Jel elektroforezi ile DNA ayırımıbüyük orta küçükElektroforez sonrası

Büyük moleküller porlardan küçükmoleküllere göre daha yavaş geçerler.Bu boyuta göre ayrılmayı sağlar, buna görebüyük moleküller kuyucuklara yakın kalırken,küçükler daha uzakta yerleşir.

Farklı miktarlarda agaroz içeren jellerin ayırım gücüJel içerisindekiagarozun miktarı(%, w/v)0.30.60.70.91.21.52.0Lineer DNA (bp)moleküllerinin etkinayırım aralığı5.000 - 60.0001.000 - 20.000800 - 10.000500 - 7.000400 - 6.000200 - 3.000100 - 2.000

Örnek yükleme boyaları ile DNA migrasyonuAgarozkonsantrasyonu(%)KsilenSiyanolBromofenolMavisi0.5-1,52.0-3.04.0-5.04-5 kb750 bp125 bp400-500 bp100 bp25 bp

Etidyum bromid ile boyanmış agaroz jelin UV-transilluminator’daki görüntüsü

Proteinlerin jelde ayrımı sadece molekülerağırlıklarına göre değil hacimlerine göre olur.

Aynı molekül ağırlığa sahip molekülden birisekonder yapıda ise primere göre daha küçükve dolayısıyla daha hızlı olacaktır.Bu nedenle jelde ayrım sekonder/tersiyeryapılar uzaklaştırıldıktan sonra primer yapıiçerenler arasında yapılır.Elektroforez için DNA, RNA ve proteinörnekleri hazırlanırken farklı teknikler buamaçla kullanılır.

PAGE

Poliakrilamid jelde DNA ayırımının etkin aralığıAkrilamid(% [w/v])Etkin ayırımaralığı (bp)Ksilen siyanolBromofenolmavisi3.55.08.012.015.020.01.000-2.000 80-50060-40040-20025-1506-1004602601607060451006545201512

Poliakrilamid jelde protein ayırımının etkin aralığıJel (%)Protein büyüklüğü(kDa)5-155-208-158-2010-2020-20010-20010-1008-1506-150

Örnek 1: tek bir sınıf makromolekül (plazmid, pür mRNA, pürifiye proteinÖrnek 2: restriksiyon enzimi ile kesilmiş total DNA, total RNA veya total protein)

Kullanım AlanlarıNükleik Asit analizi• PCR ürünlerinin görüntülenmesi• Mutasyon analizi ( RFLP, SSCP)• Dizileme• Southern, Northern blotProtein Analizi• Western blotNükleik asit ve proteinlerin saflaştırılması

Moleküler AğırlıkDNA: Baz çifti ya da bp, sıklıkla kilobazçifti(1000bp),ya da kbpRNA: Nükleotid olarak ya da nt, sıklıklakilonükleotid (1000nt), ya da knt [Bazen, baz,ya da b veya kb]Protein: Dalton ya da Da, veya sıklıklakiloDalton (1000Da), ya da kDa olarak ifadeedilirler.

Genellikle bir kuyucuk molekül ağırlığıbilinen bir DNA, RNA veya protein marker(belirleyici) ile yüklenir. Bu markerlar aynızamanda kalibrasyonu sağlar.

Daha sonra jel belli sınıf makromolekül içinspesifik ancak sequence spesifik olmayan birboya ile boyanır (Problar sequencebağımlıdır).

DNA----Southern blotRNA----Northern blotProtein—Western blot

Southern Blot• 1975 Edward Southern• Hedef DNA’ya nükleik asit hibridizasyonu• DNA restriksiyon enzimleriyle kesilir veyaPCR• DNA parçaları agaroz jelde ayrılır• Prob ile hedef gen/DNA dizisi hibridize edilir• Görüntüleme

DNA• İlk zincir GGGTTTAAACCC• İkinci zincir CCCAAATTTGGG

Baz çiftlerinin Chargaff kuralı•A ile T: Bir pürin olan adenin (A) her zaman birpirimidin olan timin (T) ile eşleşir•C ile G: Bir pirimidin olan sitozin (C) her zaman birpürin olan guanin (G) ile eşleşir

Southern BlotRestriksiyonenzimiDNAfragmanlarıElektroforezJelDenatürasyon - transferblot

lotProbe ile hibridizasyonGörüntüleme

Southern blottingDNA fragmanları agaroz jelelektroforezi ile ayrılırAyrılan DNA fragmanları membranüzerine aktarılırAyrılan DNA fragmanları ile işaretliDNA probu hibridize edilirİşaretli DNA probu ile bağlananDNA bantları görünür hale getirilir

Sourthern Blot Uygulaması1. DNA’nın kesimi/PCR2. Agaroz jelde ayırım3. DNA’nın denatürasyonu ;0.5M NaOH ile dsDNAssDNAsadece ssDNA transfer olabilir4. Opsiyonel olarak (>15 kb) 0.2MHCl ile depürinasyon yapılır.5. Yüksek tuz konsantrasyonunda(3M NaCl) nötralizasyonre-hibridizasyonu önlemek6. Kapiller transfer7. Fikzasyon (UV 254 nm veya 80˚C1-2 saat)8. Hibridizasyon9. Görüntüleme (Biotin/streptovidin)

DNA fragmanlarınıagaroz jele yükleSouthern blottingElektroforez uygulaDNA fragmanlarınıagaroz jelden membranatransfer etHedef diziye bağlananprobun yerini görüntülemeyöntemi ile açığa çıkarDNA bantlarını mebranafikse etMembrana işaretli bir probe ekle(Buffer içinde)

Farklı sınıf makromoleküller için farklıboyalar ve boyama prosedürleriDNA boyanması• Nükleik asitlere bağlanan ethidium bromide (EtBr)kullanılır, DNA-EtBr kompleksi UV ışık altındafluoresan verir.RNA boyanması• Nükleik asitlere bağlanan ethidium bromide (EtBr)kullanılır, RNA-EtBr kompleksi UV ışık altındafluoresan verir.Protein boyanması• Protein Coomassie Blue (CB) ile boyanır. Protein-CBkompleksi koyu mavidir ve normal ışıkda görülebilir.

DNA,RNA ve Proteinin membranabağlanmasında başlıca iki yol vardır:

1) Negatif yüklü moleküller içinavantaj olan elektroforez

2) Islak filtre kağıdından kuruya doğrubuffer akımı olan kapiller blotting

Western Blot (Immunoblotting)1979 yılında Towbin tarafındantanımlanmış protein analiz yöntemiJelde ayırımı yapılmış proteinlerinmembrana emdirilerek ilgilenilen proteininradyoaktif izotopla ya da başka şekildeişaretlenmiş özel antikor yardımıylamembran üzerinde belirlenmesidir.

Antikor spesifik antijenini tanıdığındanimmunoblotting olarak da isimlendirilirWestern blotting kompleks karışım içindenspesifik proteinin tanınması ve bu proteinhakkında kalitatif ve semikantitatif veri eldeedilmesinde kullanılır

YöntemJel elektroforezi ile proteinlerin ayrılmasıJelde ayrılmış proteinlerin membrana transferiblotlamaNonspesifik bağlanma bölgelerinin blokajı-bloklamaPrimer ve sekonder antikor aşamalarıİşaretleyiciye uygun substrat ile reaksiyonGörüntüleme

Birinci basamak• Jel elektroforezi kullanılarak makromoleküllerinayrılmasıdır(Çözünmüş durumdaki moleküllerin elektrikyüklerinin kitlelerine oranıyla belirlenen hızlardaelektriksel alanda göç etmeleri prensibinedayanır)

Pipet ucuÖrnek yükleme kılavuzu

İkinci basamak• Ayrılmış moleküllerin ikinci bir matrikse (geneldenitroselüloz ya da polivinilidin difluorid-PVDFmembrana) transferi ya da blotlanmasıdır

Proteinin Membrana TransferiJelden matrikse elektroforetik transfer(blotting) protein içeren poliakrilamid jel ilenitroselüloz ya da protein bağlayıcı başka birdesteğe direkt teması ve sandwich modelişeklinde gerçekleşirDNA, RNA, veya protein membranasequence-bağımsız olarak yapışır.

Membran filtrelerÇok küçük gözenekleri olan polimeryapıdaki filtrelerdir.1. Eylemsiz (inert)2. Saf selüloz esterleri

UltrafiltrasyonMoleküller boyut, biçim ve yüklerine göreayrılabilir.Por çapları 1-20nm arasındadır.Kullanılacak zarın por çapı çalışılanmolekülün geçmesine izin vermeyecekşekilde olmalıdır.NMWC (Nominal Molecular Weight Cut Off)değeri zardan geçemeyen molekülünağırlığına eşdeğerdir.

Bu amaçla kullanılan filtreler genelde ikitabakalıdır. Birinci tabaka selüloz asetat,naylon veya polivinilidinden yapılmış zar,ikinci tabaka daha kalın inert destek tabanıdır.Selüloz nitrat ve polivinilidin fluorid filtreleriözellikle protein ve nükleik asit bağlamakapasitesine sahiptir.

Nitroselüloz membranProtein blottingi için en popüler matrikslerdenbiridirÇoğu protein 0.45 µm pore büyüklüğünesahip membran kullanılarak başarıylablotlanabilirDüşük molekül ağırlıklı proteinler ya dapeptidler için 0.2 µm pore büyüklüğü tavsiyeedilir

PVDF MembranPVDF membranların por büyüklükleri 0.2 yada 0.45 µmBu membranlar proteinler ve nükleik asitleriçin yüksek bağlanma afinitesine sahiptir veWestern, Southern, Northern ve dot blotçalışmaları için uygundur

Filtre kağıdıElektroforez jelinden membrana proteinlerin hızlı veetkili transferi için kullanılırProtein içeren poliakrilamid jel membran ile filtrekağıdı arasında direkt temasta olacak şekildeyerleştirilir ve en dışta sünger destekler kalır.

Blotting Ünitesi

kapakJel tutucu kasetElektrot modülüSoğutma ünitesiBuffer tankı

süngerfiltre kağıdımembranjelfiltre kağıdısünger

Elektrik uygulandığında proteinlerpoliakrilamid jelden sıkıca bağlandıklarımembran yüzeyine hareket ederlerMembranda jeldeki protein paterninin aynenkopyası olur

Transfer etkinliği proteinin jelden migrasyonyeteneği, membrana bağlanma özelliği, jel vemembranın komplet teması, elektrotlarınpozisyonu, transfer süresi, proteinlerinbüyüklüğü, alan direnci ve deterjanlarınvarlığına bağlıdırOptimal transfer düşük-iyon dirençli bufferlarve düşük elektrik direncinde olur

Üçüncü basamak-BloklamaMembran üzerindeki nonspesifik bağlanmabölgelerinin bloke edilmesi gerekmektedirBu amaçla süt veya normal serumkullanılabilirHangi bloklama ajanının kullanılacağıantijen ve enzim konjugata bağlıdırAlkalen fosfataz kullanıldığında bufferolarak tris-buffered salin seçilmelidir

BloklamaSüt değişen oranlarda biotin içerdiğindenavidin-biotin sisteminde bloklama amaçlı sütkullanılmazHer sistem için optimal tek bir bloklama ajanıyok.

Dördüncü basamakPrimer ve sekonder antikor ile reaksiyonTransfer edilmiş protein enzim-işaretliantikor ile kompleks oluştururEnzim için uygun substrat eklenir, böylecemembran üzerinde kromojenik ya dafluorojenik presipitat oluşur

Primer ve Sekonder AntikorlarPrimer antikor seçimi tanınacak antijenebağlıdırPoliklonal antikorlar daha ucuz, üretimi kolay,antijen için yüksek afiniteye sahiptirMonoklonal antikorlar yüksek spesifite vesaflığa sahiptir

Membranın yıkanmasıBağlanmamış ajanların elimine edilmesi içingerekli bir basamakdırYetersiz yıkama yüksek zemin etkisine, çokyıkama ise antikor veya antijenin blottankaybına neden olabilirYıkama için TBS ya da PBS bufferları,sıklıkla %0.05 Tween 20 gibi bir deterjaneklenerek kullanılır

Sekonder antikorun seçimi primer antikorungeliştirildiği canlıya bağlıdırOptimal dilüsyon denenerek saptanır

Biotin, fluoresan, rodamin, horseradishperoksidaz, alkalen fosfataz işaretleyicilerikullanılabilir

Kromojenik SubstratlarSeçilecek olan substrat istenen sensitivite,tanıma metodu, sinyalin şekline ve kullanılanenzim işaretleyicisine göre değişiklik gösterirBasit ve etkili bir yolBu substratlar uygun enzim ile birarayageldiğinde membran üzerinde çözünmeyenrenkli presipitatlar oluşturur ve ekgörüntülemeye ihtiyaç duymazlar

TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin), 4-CN (4-kloro-1-naftol) ve DAB (3,3’,-diaminobenzidintetrahidroklorid) HRP ileNBT (nitro-blue tetrazolium klorid) ve BCIP(5-bromo-4-kloro-3’indolilfosfat p-toluidintuzu) ise AP ile kullanılabilecek kromojeniksubstratlardır

HRP ile yapılacak kolorimetrik deteksiyoniçin substrata peroksid eklenmelidir

Kemiluminesan SubstratlarKemiluminesan substrat kullanımı en duyarlısaptama metodudurEnzim ile kombine olduğunda kimyasalreaksiyon ışık verirFilm banyosu sonrası siyah renkte spotlar(bant) izlenir

AvantajlarıEn iyi imaj yakalanana kadar film süresidenenebilirTüm blot “stripping” buffer ileuzaklaştırılabilir, aynı membrana başka problareaksiyona izin verirHerşeyden önemlisi herhangi bir deteksiyonyönteminden daha fazla sensitiviteye sahiptir

Olası Aksaklıklar ve Nedenleri-1Uniform olarak dağılmış yüksek zemin etkisi1. Yüksek antikor konsantrasyonları2. Yetersiz veya uygunsuz blokaj3. Yetersiz yıkama4. Film süresinin uzun olması5. Membranın kuruması

Olası Aksaklıklar ve Nedenleri-2Leke şeklinde yüksek zemin etkisi1. Yüksek antikor konsantrasyonları2. HRP da agregat formasyonu3. Yanlış bloklama bufferının kullanımı4. Membranın uygun olmayan ıslaklığı

Olası Aksaklıklar ve Nedenleri-3 Zayıf sinyal veya sinyalin yokluğu1. Proteinlerin membrana başarısız transferi2. Membrana yetersiz bağlanma3. Yetersiz antikor miktarı4. Yetersiz antijen miktarı5. Bloklama bufferının antijeni baskılaması6. Koruyucu olarak azidin kullanıması (HRP inhibeolur)7. İnkübasyon sürelerinin ve film süresinin kısaolması

Olası Aksaklıklar ve Nedenleri-4 Nonspesifik veya diffüz bantlar1. Yüksek antikor konsantrasyonları2. Jele çok fazla protein yüklenmesiSiyah bölgeler1. Jelden inkomplet transfer (transfer sırasındajel ve membran arasında hava kalmamalı)

Western BlottingSouthern Blot