Genişlemiş Spektrumlu beta-laktamazlar, AmpC ve ...

Genişlemiş spektrumlu betalaktamazlar,AmpC veKarbapenemazların tanımlanmasıZeynep GülayDokuz Eylül Üniversitesi Tıp FakültesiTıbbi Mikrobiyoloji AD

Beta-laktamaz üretimi Gram negatif bakterilerin beta-laktamdirencinde önde gelen mekanizmadır. Beta-laktamaz genleri kromozom,plazmid, transpozon veya integronlardabulunabilir

Beta-laktamazlara bağlı dirençfenotipi Gen ekspresyonu Hidrolitik etkinlik ve substrat tercihi Beta-laktam direncinde önemli olan diğermekanizmalara (örneğin, OmpK35 kaybı,aktif pompa sistemleri) bağlıdır.Dolayısıyla direnç düzeyiaynı mekanizmayı taşıyaniki suşta farklı olabilir

Beta-laktamazların sınıflandırılması Moleküler yapılarına göre: A, B, C, D İşlevsel özelliklerine göre: 1,2,3 Bush ve Jacoby Antimicrob AgentsChemother Jan 2010 www.lahey.org/Studies

Grup 1, 2, and 3 {beta}-laktamazlarda artış (1970 – 2009)>890www.lahey.org/studiesGSBL (2be),KPC (2f)OXA (2de,2df)AmpC (1)MBL (3a)Bush, K. et al. 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54(3):969-976

Genişlemiş spektrumlu betalaktamazlar Penisilinler, 1-4. Kuşaksefalosporinler, monobaktamlarıhidrolize eden enzimlerdir(sefamisinler ve karbapenemleretkilenmez) ÇOĞU Beta-laktamaz inhibitörleri ileinaktive olurlar(Klavulanat/tazobaktam>sulbaktam)

Genişletilmiş Spektrumlu Betalaktamazlar(GSBL) > 250 Temel gruplar:I. TEM-türevi GSBLlerII. SHV-türevi GSBLlerIII.TEM ve SHV dışı GSBLlerI. CTX-M -YENİ GSBL: 101 tipi varII.GES (IBC)(Karbapenemaz)Grup2be;sınıf AIII. OXA GSBL (grup 2de, sınıf D):OXA-10 ve 2türevleriIV. VEB,PER,BEL, BES-1, TLA1/2, SFO-1

CLSI: Yeni öneriler Sınır değerler düşürüldü GSBL tanımlaması sadece enfeksiyonkontrolü amacıyla öneriliyor. Rutin hizmet için GSBL tanımlamaya gerekyok! deniyor…• Zaman kaybına gerek yok: MĠK ne kadardüşükse; tedavi olasılığı o kadar yüksektir.• Bazı mikroorganizmalarda tanımlama içinzaman kaybedilmektedir

AntibiyotikEski M100-S19 (2009) MİK değerlerimg/LDuyarlı (S) I Dirençli(R)Yeni M100-S20 (2010) MİKdeğerleri mg/LDuyarlı (S) I Dirençli (R)Sefazolin≤8 16 ≥32 ≤1 2 ≥4Sefotaksim≤8 16-32 ≥64 ≤1 2 ≥4Seftizoksim≤8 16-32 ≥64 ≤1 2 ≥4Seftriakson≤8 16-32 ≥64 ≤1 2 ≥4Seftazidim≤8 16 ≥32 ≤4 8 ≥16Aztreonam≤8 16 ≥32 ≤4 8 ≥16

AntibiyotikEski M100-S19 (2009) Disk difüzyonzon çapları (mm)Duyarlı (S) I Dirençli(R)Yeni M100-S20 (2010) ) Diskdifüzyon zon çapları (mm)Duyarlı (S) I Dirençli (R)Sefazolin≥ 18 15-17 ≤14 - - -Sefotaksim≥23 15-22 ≤14 ≥ 26 23-25 ≤ 22Seftizoksim≥20 15-19 ≤14 ≥25 22-24 ≤21Seftriakson≥ 21 14-20 ≤13 ≥23 20-22 ≤19Seftazidim≥18 15-17 ≤14 ≥21 18-20 ≤17Aztreonam≥22 16-21 ≤15 ≥21 18-20 ≤17

EUCAST Sefotaksim Seftazidim Sefepim Seftriakson≤1 (S)>2 (R) (CTX, CRO)>4 (R) (CAZ,FEP,ATM)Ancak öneriler CLSI gibi uygulanacaktır.

Çekinceler Daha önceki klinik başarısızlık örnekleri Daha önce yorum yapılıyordu: şimdi tümbeta-laktamlar rutinde kullanılacak mı? MĠK değerlerinde + 1 dilüsyon fark zatennormal kabul ediliyor: Kesin ve doğrusonuç verilmesi ??? Tedaviye yansıması??? Gerek yok denince laboratuvarlartanımlama yapacak mı? Enfeksiyonkontrolü yönü!!!CLSI notu. 2010 kriterleri lab.a girene kadarM100-S19 kriterleri uygulanabilir

GSBL saptama problemleri:İnokulum etkisiMĠK g/ml: SHV-3 üreten Citrobacter freundiiCFU/ml Sefotaksim Seftazidim Aztreonam Sefepim5 x2 1 0.5 0.510 55 x 256 32 32 51210 7(CLSI duyarlılık sınırı 8 g/ml)KS Thomson and ES Moland, Creighton University

GSBL TanımlanmasıĠki basamaklıdır:1- Tarama: Ġndikatör sefalosporinlerle(oksimino sefalosporinler;seftazidim, sefotaksim,sefpodoksim) duyarlılık testi2- Doğrulama: Taramada şüpheliolanlara uygulanır• Beta-laktamaz inhibitörlerine duyarlılıktemellidir

GSBL saptanması/CLSI önerileriAntibiyotik*Disk tarama(mm)MĠK tarama(mg/L)Sefpodoksim 17 8 (2)**Seftazidim 22 2Sefotaksim 27 2Seftriakson 25 (NA)** 2 (NA)**Aztreonam 27 (NA)** 2 (NA)***: Disk içeriği 30g ( )**: Proteus mirabilis için özelCLSI M100 S19, 2009

Doğrulama testleriDisk içeriği Yorum MĠK dağılımı(mg/L)CAZ 30g -- 0.25-128 --CAZ +klav 30g+ 10g5mm=GSBL0.25/4-128/4CTX 30g -- 0.25-128 --Yorum3 log 2dil= GSBLCTX+klav 30g+ 10g5mm=GSBL0.25/4-128/43 dil=GSBL=8 kat azalma

Kombinasyon diskleri: CAZ+ klavCTX+ Klav (Ticari olarak bulunuyor)= 32 mmGenişleme > 5mm= 22 mmGenişleme herhangi birinde olabilir

Çift disk sinerji (Jarlier V, 1988)

GSBL için ETest TMSefotaksimCT/CTLTZ/TZLPM/PMLMİKdeğerinde >8kat azalmaSefotaksim+KlavulanikA.

“Fantom zon” = GSBL

GSBL RaporlanmasıGörülen antibiyogram:Sefepim (S), sefotaksim(S)aztreonamR, seftazidimR,sefoksitinSSonuç: GSBL pozitif E.coliVerilen antibiyogram: Sefepim,sefotaksim, aztreonam, seftazidim,diğer 3.kuşak vb (R),sefoksitin: raporlanmazKarbapenemlerdışındaki tüm betalaktamlardirençliolarak bildirilir

GSBL doğrulama testleri (fenotipik)AvantajDezavantajÇift Disk Sinerji(ÇDS)Kombine DiskETestUcuz, kolayuygulanır, rutinantibiyogramaalınırUcuz, duyarlı,özgül;kantitatifsonuçDuyarlı, kolay,kantitatif-Diskler arasıuzaklıkayarlanması-DeğerlendirenindeneyimiKontroller doğruuygulanmalıPahalı, K1 ileyalancı pozitiflik

GSBL saptanması: Manuel veotomatize sistemlerYöntem Duyarlılık Özgüllük PPV NPVMicroscan 83.4 72.9 81.6 75.5Phoenix 98.8 52.2 75.0 96.6Vitek 2 85.9 78.0 84.9 79.3ÇDS 94.1 81.4 87.9 90.6Kombine 92.9 96.6 97.5 90.5DiskETest 94.1 84.7 89.9 90.9Wiengand JCM 2007;45:1167

CLSI Kombine disk yöntemiPlazmid Kökenli AmpC aşırı üretenbir bakteri: GSBL de yapıyor mu?Zon genişlemesi= 2 mm

EVETKloksasilin AmpC’yiinhibe eder. Sonuçlargörülür

AmpC yapan türlerde GSBL AmpC’den etkilenmeyen substratlarınkullanılması• Sefepim (ÇDS veya ETestTM) AmpC inhibitörlerinin kullanılması• Kloksasilin ( MHA 200 mg/ml veya 100/500g/disk ile ÇDS)• Boronik asit ve türevleri (300-500-600g/disk): Kombine disk veya ÇDS

Kombine disklere boronik asit eklenmesi

Duyarlılık %98-Enterobacter spp %100Özgüllük % 60 ( K.oxytoca K1’i atlamış)

Enterobacter cloacae; AmpCdereprese + GSBL üretiyorMHA-BelirsizsonuçMHA + kloksasilin(200 mg/L)

AmpC ile beraber GSBLsaptandığında Enterobacter cloacae üredi- İzolat GSBLüretmektedir. Temas izolasyonu önerilir• AmikacinS• CefazolinR• Ampicillin R• Ceftazidime I R• CefepimeS R• Ceftriaxone S R• Gentamicin S• LevofloxacinS

AmpC Beta Laktamazlar• Karbapenemler ve sefepim dışındaki tümbeta-laktamları hidrolize edenSefalosporinazlar,• Klavulanat ve tazobaktamdanetkilenmezler• Kromozomal ve plazmid kökenli olabilir• Bazısı indüklenebilirdir:•Normalde düşük düzey yapılırken, bazı betalaktamlarlamiktarı artar:• Kromozomal olanlar; bazı plazmid kökenliler (DHA,ACC)

İndüklenebilir Beta-laktamazı olantürler Enterobacter spp. Hafnia alvei Citrobacter freundii Serratia marcescens Morganella morganii Providencia spp Pseudomonas aeruginosa Aeromonas sppAyrı testyapılmasına gerekyoktur:Bazı türlerdebulunduğubilinmelidir

CTXSefoksitinCAZ

Bush Grup 1 veya AmpCİndüklenebilir Beta-LaktamazlarLaboratuvar rapor notu• Duyarlılık sonuçları değiştirilmez amaĠndüklenebilir Beta-laktamaz uyarısı yapılır:• Örnek uyarı: Bu bakteri indüklenebilir betalaktamazüretmektedir. Tedavi sırasında 2-3.kuşak sefalosporinler, aztreonam,üreidopenisilinlere direnç gelişebilir. B-laktaminhibitörlerinden kaçınmak gereklidir.

Sorun nedir ? Ġndüklenme sorun değil:• Biliyoruz• Ġlaç varsa indükleniyor; ortadan kalkınca geridönüşüyor• 3. -4.kuşak sefalosporinler zayıf indükleyiciler• Karbapenemler iyi indükleyici ama etkilenmiyor Sorun: Bu türlerde bulunan derepresemutantların seçilmesi• Sürekli yüksek miktarda enzim sentezi• 3. kuşak sefalosporin tedavisi sırasındaseçilirlerTedaviBaşarısızlığı

E. cloacae İBLİndüksiyon değilderepresyonsorundur.

E. cloacae dereprese mutant

Yüksek düzey AmpC üretimi varsa Enterobacter cloacae üredi• Amikasin S• Ampisilin R• Sefazolin R• Seftazidim R• Sefepim S• Seftriakson R• Gentamisin S• Levofloksasin S

Plazmid kökenli Amp C tipi enzimler En sık K.pneumoniae, E.coli, Salmonellaspp. Proteus mirabilis gibi ĠBL özelliğibulunmayan türlerde görülür. Salgınlaryapabilir. >100: CMY (1-59), FOX (1-8),LAT-1, MOX(1-8), DHA (1-7), ACT (1-8), ACC (1-4),MIR (1-5),CFE-1 Çoğu sürekli olarak yüksek düzey Amp Cyapımına neden olur. DHA , ACT ve ACC indüklenebilirenzimlerdir.

Plazmid kökenli AmpC tipi enzimtanımlanması Ġndüklenebilir AmpC tipi beta-laktamazı olmayantürlerde• sefoksitin ve beta-laktamaz inhibitörü direnci• Seftazidim, sefotaksim I/R, sefepim –S.• CAZ, CTX I/R ama GSBL negatif düşündürmelidir Porin mutasyonları ile karışabilir. GSBL’lerle beraber olabilir: Kloksasilin ve Boronikasit türevleri ile ayırım sağlanabilir.

AmpC saptanması içinEtest CN/CNISefotetan (0.5-32 mg/L) + kloksasilin stripleriMHA, 0.5 McFarland, 16-20 st;MİKde > 8 kat azalma

%91 duyarlı; %93 özgülBolstrom A et al, ICAAC 2006; D-0451

Altın standart:MoleküleryöntemlerPerez-Perez, Hanson. JCM 2002; 40: 2153

Kan Kültürlerinden üretilen Klebsiella pneumoniaeizolatlarındaKarbapenem Direnç Oranları (DEÜ2004-2010)403730% Direnç 20Karbapenem Direnci1006,84,92004200520062007200820092010Yıllar

KarbapenemazlarSınıf Enzim En sık görülen türSınıf AKPC, SME,IMI, NMC,GESEnterobacteriaceae(P. aeruginosa’da nadir)Sınıf B(metallo-blaktamaz)IMP, VIM,GIM, SPM,IND, NDM-1P. aeruginosaEnterobacteriaceaAcinetobacter spp.Sınıf D OXA Acinetobacter spp.Enterobacteriaceae(OXA-48)

Karbapenem direnç mekanizmalarıAyrıca• Sınıf A GSBL’ler (CTX-M) + geçirgenlikteazalma• Sınıf C (Yüksek düzey AmpC) + geçirgenlikteazalmaBu mekanizmalar ertapenem >>meropenem veya imipenem

KARBAPENEMAZLAR Saptanmaları çok önemli çünkü GSBL (+)se ilk tedavi seçeneği Bu direnç mekanizmalarını edinen bakterilertüm karbapenemlere dirençli olacaktır fakattestlerde duyarlı gözükebilirler. Plazmid ve integron kökenliler kolaycayayılmakta infeksiyon kontrolü içinsaptanmaları gereklidir GSBL (+) lerde atlanmamalı!

Metallo-beta-laktamazlar• Karbapenemleri ve aztreonam hariç tüm betalaktamajanları parçalayabilen enzimlerdir.• Stenotrophomonas maltophilia, Aeromonas,Chryseobacterium: tür özelliğidir• P. aeruginosa, A. baumannii, S. marcescens’deplazmid ve integron kökenliler bildirilmiştir:IMP-1-IMP-28; VIM-1- VIM-26, SPM-1, NDM-1, IND 1-7• Enterobacteriaceae’de daha nadir ama var

Metalloenzim tanımlanması Tanımlanmalarında aktif bölgedeki Zniyonuna bağlanarak enzimi inaktive edenEDTA, DPA, tiyol gibi bileşikler kullanılır.

MBL Etestİmipenem/EDTA ileMİK’de>8 veya >3log2dilüsyonazalmaSonuçlar türe, genekspresyon düzeyine,klona göre değişebilir.www.ijmm.org

MBL Etest TMYalancı pozitiflik=EDTA Membrangeçirgenliğini arttırır Diğer metalloenzimleriinhibe eder OprD ekspresyonunuazaltan Zn’yi bağlar OXA tipi enzimlerleçapraz reaksiyon-Acinetobacter OXA-48,KPC, ESBL ileYalancı PozitiflikSegal, Elisha JAC 2005; Giske CMI 2010;ChuYW IJAA 2005Yalancı negatiflik Besiyerindeki çinkodüzeyi etkiler. Gen ekspresyonunabağlı olarakkarbapenem MĠKleristripin dışındakalabilir:Enterobacteriaceae:DPA, MEM/EDTA A.baumannii atlıyor:Tiyol bileşikleriIkonmidis JCM 2008; Loli A AAC 2008

IP 4-256 mg/L; IPI 1-64mg/LDuyarlılık Özgüllük PPV NPV1 94 95 - -2(Çin) 85.7 100 100 98.83(Belçika) 100 86.4 86.9 1001- Walsh T JCM 2002; suş koll. ; 2-Qu TT: Çin 21 VIM-2 ve IMP-9 P.a 3-Berges L JAC2007: Belçika 2004-2005 587 P.aeruginosa (42 MBL pozitif- çoğu VIM);

Besiyerinin etkisi- Zn +2 etkisiAcinetobacter spp. CI 17-9-45 (IMP-1 pozitif)Isosensitest agar (%9-Çok büyük hata)Etest ÇDS KDMBL (27)MHA 4 12 3MHA+Zn 27 18 26BelirsizPozitifZn 2+Zn 2+ uygunVIM-2 içeren P.aeruginosaizolatlarında, besiyerineZn +2 eklenmesinin etkisiGiakkoupi P et al JCM2008;46:156855Mueller Hinton Agar

OXA-tipi karbapenemazlar Serin beta-laktamazlardır Klavulanik asit ile inhibe olmazlar Ġn vitro olarak NaCl ile inhibe olurlar Karbapenemleri genellikle düşük düzeydeetkilerler 3. Kuşak sefalosporinleri etkilemezler* En sık Acinetobacter spp. FakatEnterobacteriaceae’de de yayılmayabaşladı.

Klebsiella PneumoniaeCarbapenemase (KPC) Sınıf A beta-laktamazlar (KPC 2-11)• Karbapenemler ve 3. Kuşak sefalosporinler dahil olmaküzere TÜM beta-laktamlara dirence yol açar Özellikle ABD’de Enterobacteriaceae üyelerindebildirilmiş---- Tüm dünya Saptanması güç: imipenem ve meropenem (S)olabilir; ertapenem daha iyi bir göstergedir. Boronik asit ile inhibe olur (Amp C tipi enzimlereDĠKKAT!: kloksasilin/oksasilin inhibisyonu*

No. of IsolatesKPC üreten izolatların ertapenem duyarlılığı60S I R504030201002 4 8 16 >16MIC (g/ml)İzolatların hepsi ertapeneme dirençli

Karbapenemaz saptanması1. Karbapenem duyarlılığının saptanmasıArama kriteri karbapenemlerden herhangi birine (ertapenem,imipenem, meropenem, doripenem) azalmış duyarlılık (I/R)olmalıdır.2. Karbapenem duyarlılığı azalmış izolatlarda Modifiye HodgeTesti yapılması.3. Modifiye Hodge Testi pozitif ise “ bakteri karbapenemazüretmektedir. Bazı karbapenemlere duyarlı gözükse de kliniktedavi sırasında direnç gelişebilir” notu ile raporlama4. İlgili klinik ve enfeksiyon kontrol hemşiresi uyarılırCLSI M100-S19/S20

Karbapenemazlar: Ne zaman şüphelenelim?Karbapenemlere duyarlılığıazalmış (inhibisyon zonuI/R; ERT 21 mm ve altı),Klebsiella pneumoniae (vediğer Enterobacteriaceae)Sıklıkla çoklu dirençgörülmektedirDisk difüzyon ve E testi

Modifiye HodgeTestiATCC 25922E.coliKlinikizolatKlinikizolatPozitifkontrolNegatifkontrol

Karbapenemazların doğrulanmasıBeta-laktamazlara özgü inhibitörler testeeklenerek duyarlılık düzeyinin değişimiincelenir.Karbapenemazlar için disk dif vemikrodilüsyon yöntemleri en iyiyöntemler• MBL EDTA ve dipikolinik asit,• KPC için boronik asit,• Amp C için kloksasilin veya oksasilinMoleküler testler ve dizi analiziTicari testlerThomson K AAC 2010; 48:1019 Miriagou V CMI 2010;16:112

MHT CTX-M /AmpC aşırı üretimi + ilacın hücreiçinde birikmesini engelleyen birmekanizma (porin/pompa): yalancıpozitiflik (ertapenemde de): Enterobacterspp.DĠKKAT! Bazı MBL(Enterobacteriaceae) yalancınegatiflik olabilir.

Otomatize sistemlerde saptamasorunu var

KPC(+) imipenemdirençli izolatlarınticari sistemlercetanınması sorun:%6.7-%87oranında atlanıyor

Otomatize sistemler (2010)Karbapenem dirençmekanizması belirliizolat sayısıSistem/panelKarbapenemazuyarısıKarbapenemaz(n=39)Karbapenemaz değil(n=16)Duyarlılık(%)Özgüllük(%)PhoenixNMIC/id-76EvetHayır390160100 0MicroScanNM36EvetHayır33615185 6MicroScanNBC39EvetHayır32713382 19Vitek 2AST-N054EvetHayır291010674 38Woodford et al JCM 2010; 48: 2999

PhoenixMicroScanNM36MicroScanNBC39Vitek 2PositiveNegativePositiveNegativePositiveNegativePositiveNegativeKPC (n=8) 8 0 8 0 8 0 8 0MBL (IMP,VIM,orNDM; n=20)20 0 19 1 b 20 0 16 4 bOXA-48 (n=11) 11 0 6 5 4 7 5 6E.coli/Klebsiellaspp.,ESBL,porin loss(n=10)Enterobacterspp.,AmpC/ESBL,porinloss (n=6)10 0 10 0 8 2 8 26 0 5 1 5 1 2 4

2010 yılı CLSI karbapenem sınırdeğerleri -M 100- S20-U (Haziran 2010)KarbapenemÖnceki sınır değerleriYeni sınır değerleri(2010)MİK mg/L Disk (mm) MİK DiskErtapenem ≤2- ≥8 ≥19-≤15 ≤0.25-≥1 ≥23-≤19İmipenem ≤ 4- ≥16 ≥16-≤13 ≤1-≥4 ≥23-≤19Meropenem ≤4≥16 ≥16 - ≤13 ≤1-≥4 ≥23-≤19Doripenem - - ≤1-≥4 ≥23-≤19MHT uygulanmasına gerek yoktur

• Özgüllük düşmüş, MHTuygulanmaması da sorun!

Yönteme göre karbapenem MİK’leri değişiyor. Etest –mikrodil uyumu %33 (imipenem)- %84 (ertapenem):Aynı inokulum kullanılsa bile!Yönteme göre meropenem MİK’leri değişiyor. Etest –BMDuyumu %82; Vitek 2 %30.4 (çok büyük hata %24)