Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar

Patoloji laboratuvarınıkurduk: (Daha) Đyi bir kesitve yayma için i in ne yapmalıyız?8-99 Mayıs s 2010, ĐZMĐRBu sunumda yer alan resimler yazarın n izniolmadan kullanılamaz.lamaz.

Daha Đyi Bir KesitDaha Đyi Bir BoyaProf.Dr.Öner DoğanĐstanbul Tıp FakültesiPatoloji Anabilim Dalı

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarĐyi bir mikrotomi kaliteli bir kesitin olmazsa olmaz aşamasıdırÇok sayıda, farklı kategoride olumsuzluklar sıralanabilirBazı nedenler sınıflandırılamayabilirBazen nedenin saptanması veya giderilmesi mümkün olmayabilirĐyi bir kesit alma işlemi için1-Çok iyi şekilde tesbit ve takip edilmiş kesime uygun bir parafin içinegömülmüş ve uygun şekilde soğutulmuş doku bloğu2-Uygun bir mikrotom3-Dokunun ve mikrotomun titreşimsiz bir bütün oluşturması.4-Kaliteli uygun ve keskin bir bıçak5-Tecrübeli, sabırlı, dikkatli teknisyen6-Diğer aksesuvar ürünler ve faktörler.

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarOlumsuzlukların nedenlerini gruplamak gerekirse1-Mikrotom kesit aşamasına kadar geçen sürece ait olumsuzluklar2-Mikrotoma ait olumsuzluklar3-Mikrotom aksesuvarlarına ait olumsuzluklar4-Teknisyene ait olumsuzluklarBu konudaki en önemli olumsuz etkenTecrübesiz veya beceriksiz/eğitilemez veya isteksiz teknisyenNasıl anlaşılır? Genellikle yüzüne bakarakNasıl önlenir? Đşten kovarakNasıl giderilir? Başka bir teknisyene kestirilerekKonu insan kaynakları konusuna giriyor. Hiç sevmediğim bir konudur.

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarBloğun yeterli düzeyde sabit tutulamamasıBlok, blok yuvasına tam olarak oturmamıştır.Kaset standartlardan küçüktür. (Korsan kasetçilik sektörü)Kaset yeterince sert değildir (Oynak kasetçilik sektörü)Kaset ile kaset yuvası arasında parafin artığı vardır.(Tıraşsız kaset sektörü)Mikrotom kaset yuvası formunu yitirmiştir (Sıkıştırma vidası yalama, deforme)Teknisyen bloğu iyi yerleştirmemiş, vidayı iyi sıkmamıştır.(Dalgacı teknisyen)Dokunun ileri derecede sert olması, klasik mikrotom kesitine uygun olmamasıNasıl anlaşılırTeknisyelerin kesim ve bakım sırasındaki gözlemleriKesit sırasında kesitlerin düzensiz kalınlıkta gelmesi (Đnce/kalın)Bir kesitin değişik kalınlıkta şeritler halinde gelmesi (Ekoseli kesit)Mikroskopta venedik panjuru artefaktıNasıl önlenirKaset satın alırken korsana dikkat etKaset kenarlarındaki parafin kalıntılarını tıraşla, yuvayı temiz tutKaset tutucuya nazik davran periyodik muayenesini yap, gerekirse emekli etTeknisyenle görüş, sarı kart (x2), kırmızı kartDoku ile görüş, doğrudan kırmızı kart

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarBıçağın yeterince sabit olmamasıNedenleri nelerdirBaskı-sıkıştırma plakaları deformedir (Çarpma, düşürme)Bıçak yuvası kirlidir (parafin kalıntıları), bıçak tam oturmamıştırBıçak sıkıştırma mandalı ve sıkıştırma mekanizması yetersizdirBıçak taşıyıcı sistemi sabitleyen mekanizmalarda aksaklık vardırTeknisyen, sistemi sabitleyen işlemleri yapmayı ihmal etmektedirBıçak, yuvaya uygun değildir, standarttan daha incedirDoku, bu mikrotomla kesilemeyecek derecede serttir.Nasıl anlaşılırTeknisyelerin kesim ve bakım sırasındaki gözlemleriKesit sırasında kesitlerin düzensiz kalınlıkta gelmesi (Đnce/kalın)Bir kesitin değişik kalınlıkta şeritler halinde gelmesi (Ekoseli kesit)Mikroskopta Venedik panjuru artefaktıNasıl önlenirĐlgili parçaların günlük ve periyodik bakımlarla kontrol edilmesi, bakılmasıTeknisyenle görüş, sarı kart, kırmızı kart (2xsarı, doğrudan)Doku ile görüş, faklı mikrotom/farklı bıçak, high profil bıçak, doğrudan kırmızı

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarKesit kalınlığının değişkenlik göstermesi, ince kesit alamama, kesitin hiç gelememesiNedenleri nelerdirPekçok neden olabilir, mikrotomi işleminden kaynaklananlar şunlardır.Mikron ilerletme mekanizmasındaki kalıcı hatalarMikron ilerletme mekanizmasının kalibrasyon yetersizliğiOrtam sıcaklığındaki değişikliklere bağlı olarak bloğun genleşmesi/ büzülmesiNasıl anlaşılırKesit sırasında veya mikroskop başında gözlemle anlaşılırBir türlü kesit gelmez (ilerletme mekanizması çalışmıyor)Đnce kesit hiç alınamaz (ilerletme mekanizmasında hata)Düzensiz kalınlıkta kesitler (ilerletme mekanizmasında hata)Zamanla kesitin kalınlaşması (bloğun ısınması)Kesitin giderek incelmesi veya alınamaması (bloğun buz ile soğutulmuş olması)Nasıl önlenir-GiderilirMikrotom bakımında mikron ilerletme fonksiyonlarının kontrolü, ayarlanmasıBlok sıcaklığının değişimlerinde duruma göre davranılması (Bloğu soğut)

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarKesitin çok kırışık- katlı gelmesi suda yeterince düzgün açılamamasıNedenleri nelerdirTesbit-takip ile ilişkili nedenler söz konusudurAşırı ince kesmeye çalışıyorsunBıçağın körlenmiştirKesim açısı çok düşüktür.Bıçak açısı fazladırBıçak türü uygun değildirDoku serttir.Doku çok kurudurParafin gereğinden fazla yumuşaktırParafinin elastikiyet derecesi yetersizdir.Ortam sıcaklığı yüksektir; bıçak, blok ve kesit kaydırma plakası ısınmıştırBıçak veya kaydırma plakasında kesitin açılmasını engelleyen kalıntı vardırKesim vuru hızı uygun değildir(genellikle yavaştır)

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarKesitin çok kırışık- katlı gelmesi suda yeterince düzgün açılamamasıNasıl önlenir-giderilir•Tesbit-takip ile ilgili sorunları gider•Kesiti çok ince almaya çalışıyorsun, kendini kanıtlamaktan vazgeç•Đnad etme bıçağı değiştir•Kesim açısını arttır•Bıçak açısı düşük bıçak dene (22º)•Kullandığın bıçak türünü değiştir•Sert dokulara uygun mikrotomda dene•Doku çok kuru ise buz sür, gliserol sür•Parafini buzla soğut. Uygun parafin kullan•Daha elastik parafin kullan•Parafini, bloğu, plakayı, ortamı soğut•Bıçak ağzı ve kaydırma plakasını temiz tut•Kesim vuru hızını değiştir•Kesitin başlangıç ucu pensetle tutulup kesit yukarı geriye kaldırılır•Suda açma işleminde alkolve yüzey gerilimini azaltıcı sistemler kullan

Sert, kırılgan parafin; kesitte ince çatlaklar

Kenarları traşlanıp kesit yapmaya hazırhale gelmiş blokların kesim anına kadarsoğuk olarak muhafazası önerilir

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarKesitin rulo oluşturacak şekilde gelmesiNeden KaynaklanırKesim açısı; doku türü, parafin sertliği ve vuru hızı açısından gereğinden fazladırParafin gereğinden fazla yumuşakOrtam, parafin gereğinden fazla sıcakKesit gereğinden fazla kalındırNasıl anlaşılırGelen kesit kendi üstüne dönerek rulo yapma eğilimi gösterirNasıl önlenir-GiderilirKesim açısını azaltDaha ince kesit al

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarSeri kesit/kurdale kesit alınamamasıNedenleri nelerdir•Tesbit ve takip ile ilgili sorunlar•Blok kenarlarının birbirine paralel olmaması•Traşlamanın asimetrik olması, bloğun üst ve alt kenarların paralel olmaması•Bıçak kenarının kirli olması•Blok kenarlarının pürüzlü oluşu•Kesit kaydırıcı plakanın kirli, pürüzlü veya sıcak olması•Bıçakta hata (pürüzlü, deforme, körleşmiş odak)•Parafin özelliğinin seri kesit almaya uygun olmaması•Ortam sıcaklığının ve parafinin özelliğinin seri kesit için uyumsuz olması•Kesim açısının fazla veya az olması•Mikrotomda retraksiyon fonksiyonunun olmaması•Kesitlerde statik elektrik vardır, kesit geri dönen bloğa yapışır,kesit dizisinden ayrılır•Kesit alma hızının ve vuru hızının uygun olmaması

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarSeri kesit/kurdale kesit alınamamasıNasıl önlenir-giderilir•Tesbit ve takip ile ilgili sorunları çöz•Blok kenarları birbirine paralel değilse bisturi ile düzelt•Traşlamatı derinleştir veya blok düzlemini bıçağa göre düzelt (x-y düzlemi)•Bıçak kesim kenarını temiz tut•Blok kenarlarındaki parafin kalıntılarını temizle•Kesit kaydırıcı plakanın yüzeyini temizle ve soğut•Bıçağın yerini değiştir veya yeni bıçak tak•Parafin cinsini değiştir. Daha elastik daha yumuşak parafin seç•Ortam ve blok sıcaklığının aşırı düşük olmaması gerekir, bloğu parmakla?!•Kesim açısını düzelt•Retraksiyon fonksiyonu olan mikrotom kullan•Mikrotomu toprakla, ortamı nemlendir, odayı ionize eden klima sistemi kullan•sakin ol, plastik ayakkabı giyme, bunzen beki kullan•Kesit alma hızı ve vuru hızını değiştirerek denemeler yap

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarKesitin çizikli-yarıklı gelmesiNedenleri nelerdirBıçak körelmiştir, çentiklenmişti, çapak vardır,Bıçağın üretimi hatalıdırDokuda sert partiküller vardır: (kalsiyum, kemik, kıkırdak, yabancı cisim vb)Parafin içinde yabancı partiküller vardırNasıl anlaşılırKesit yaparken veya mikroskopik inceleme sırasında anlaşılırBıçak kesim yüzeyinin homojen olmayışına bağlı artefaktan nasıl ayrılır.Nasıl önlenir-giderilirBıçağı kaydır, yeni bıçak takBıçağın seri numarasını kaydet, üretici firmaya bildir, bıçağı değiştirPartikülü dokuya fazla zarar vermeden çıkart veya traşlayarak derinleş,Mümkün değilse asit uygulaması veya geri takiple asit uygulaması yapYabancı partikülü çıkart, traşlayarak derinleş, temiz parafin kullanarak yeniden göm

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarKesitte Venedik panjuru artefaktıNeden kaynaklanırBlok mikrotoma sıkıca yerleşmemiştir (blok sabit değildir)Bıçak ve/veya bıçak tutucu sabit değildirDoku mevcut mikrotom ile kesilemeyecek derecede serttirNasıl anlaşılırMikroskopik incelemede dokunun, kesim doğrultusuna dik, birbirine paralelince ve kalın şeritler halinde görülmesi ile anlaşılırNasıl önlenir-giderilirMikrotomun blok yuvası, blok tutucusu, bıcak tutucu sistemi kontrol edilmeliBlok ve bıçağın sabit olarak sisteme monte edilmesini önleyen etkenler giderilmeli

Mikrotom Kesit Sırasındaki OlumsuzluklarKendinden şeritli (birbirine paralel ince-kalın şeritler halinde) kesitNedenleri nelerdirBıçak kesim kenarının homojen kalınlıkta olmaması (üretim/kaplama hatası)Dokuda sert ve yumuşak alanların yan yana/ard arda dizi halinde bulunmasıNasıl anlaşılırBıçak hatasında, kesim doğrultusuna paralel seyreden ince ve kalın kesim şeritleriDoku sertlik heterojenitesinde kesim doğrultusuna dik veya paralel seyreden ince vekalın kesim şeritleri gözlenirNasıl önlenir-giderilirBıçak değiştir, bıçak türünü değiştirMümkünse ek kaplamalar içermeyen bıçak kullanDokunun yapısına bağlı olgularda kesim açısını düşür,bloğun mikrotomdaki pozisyonunu değiştir (genellikle 90º)Başarılı olunamazsa sert dokuların kesimine uygun parafin (plastik gömme ) vemikrotom kullan

Bu dokuya neler olmuş

Kesitin sudan alma aşaması ile ilgili olumsuzluklarNedenleri nelerdirSu sıcaklığının gereğinden yüksek olmasıSu sıcaklığının gereğinden düşük olmasıSu banyosunun yabancı kesitlerle kontamine olmasıSuyun kirli olmasıParafinizasyon yetersizliği nedeniyle nedeniyle kesitin dağılmasıNasıl anlaşılırKesit suya atıldığı anda dağılır, bütün halinde lama alınamazKesit yeterince açılamaz, açılma süresi uzundur,lama alınan kesit kırışıktırMikroskopta yabancı-ilişkisiz kesitler görülür, tanı hatasına yol açabilirMikroskopta, özellikle müsinöz alanlarda pigmet birikimleriKesit dağılır, parafin ve doku bütün halde kalamazNasıl önlenir-giderilirSu sıcaklığını düşürSu sıcaklığını arttır veya alkolle açma yöntemi kullan veya sabretHer kesit alımından sonca su yüseyini filtre ederek temizleFilter edilmiş su, distile su kullan, mikrobiyolojik üremelere karşı timol kristaliTakip ve parafinizasyon hatası var, geri takip yap

Kesitin kurutulması aşamasındaki olumsuzluklarNedenleri nelerdir•Nemli kesitlerin yüksek sıcaklıktaki inkübasyon etüvlerine konması•Nemli kesitlerin sıcak plakalarda kurutulması•Aşırı yüksek sıcaklıkta kurutma•Kurutma süresinin yetersiz olması, kurutmanın yetersiz yapılmasıNasıl anlaşılır•Mikroskopta kesitte buharlaşma, nukleuslarda bubbling artefakları•Benzer artefaklar daha belirgin olarak görülür, toz kontaminasyonu,ksilenler çabuk kirlenir•Kavrulma artefakları•Kesitin iyi yapışmaması, boya sırasında dökülme artefaklarıNasıl önlenir-giderilir•Kesitler öncelikle oda sıcaklığında eğik pozisyonda bekletilmeli•Đnkübasyon etüvlerinde değil, kurtma etüvlerinde kurutulmalı•Kurutma için yeterli süre ayrılmalı, kesit yüzeyinde nem kalmamalı

Kesitlerin KurutulmasıSudan lam üzerine alınankesitler dik konumda, odasıcaklığında 20-30 dakika bekletilerek yüzeyindekisuyun sızması beklenirDaha sonra 35-40ºC derecedeki kurutma etüvlerinealınır.

Kesitlerin KurutulmasıPatoloji laboratuvarlarında yaygınolarak kullanılan ve etüv olarakadlandırılan cihazlar aslında sıcakhava inkübatörleridir ve parafinkesitlerin kurutulması işlemine tamolarak uygun değildir.

Yüksek sıcaklıkta hatalı kurutma artefaktı

Kesitlerin deparafinizasyonu aşamasındaki olumsuzluklarNedenler nelerdirParafinin tam olarak giderilememiştir• yetersiz ksilen inkubasyon süresi• yetersiz ksilen banyo sayısı,• kirli ksilen, kalitesiz ksilen• kötü parafinNasıl anlaşılır•Lam absolu alkole girildiğinde kesit yüzeyinde parafin kalıntıları fark edilir•Boya homojen olmaz,lekeli olur boyanmayan veya yetersiz boyanan yama tarzında alanlar olurya da tüm kesit yetersiz düzeyde boyanır-boyanmaz.Nasıl önlenir-giderilir•Yeterli sayıda ve yeterli sürede ksilen banyosu kullan•Ksilenler temiz ve kaliteli olmalı•Kullanılan parafin yeterince saflaştırılmış olmalı, katkı maddeleri ksilende erimeli•Erken saptanırsa ksilen inkubasyonuna geri dön

Hidrasyon aşaması ile ilişkili olumsuzluklarNedenleri nelerdirSu bazına girmeden önce preparattaki ksilenin tamamen giderilmesi gerekirKsileni giderecek aşama absolü alkol istasyonlarıdırAbsolü alkol istasyon sayısı yetersizseAbsolü alkol inkübasyon süresi yetersizseAbsolü alkol kirli ise, absolü özelliğini yitirmişsePreparat yüzeyindeki ksilen giderilemezNasıl anlaşılırKesit suya geldiğinde preparatın yüzeyinin damlacıklar halinde yer yeryağlı(ksilenli)olduğu görülürKsilenin giderilemediği alanlar boya ile boyanmaz, mikroskopta boyanmamışbenek şeklinde alanlar halinde izlenirNasıl önlenir-giderilirGiriş alkollerinin ilk ikisi mutlaka absolü alkol olmalı, sık sık yenilenmeliAbsolü alkol süreleri yeterli olmalıSuya girerken kesit yüzeyi kontrol edilmeli, ksilen artığı varsa absolü alkolegeri dönülmeli, temiz absolü alkolde yeterince beklenmeli

Hidrasyon aşaması ve su ile ilişkili sorunlarNedenleri nelerdirSuyun çok fazla miktarda metal-ion-partikül içermesiSuyun pH sının aşırı yüksek veya aşırı düşük oluşuNasıl anlaşılırSuyun makroskopik görünümüMikroskopta bazı doku ve hücrelerde yoğunlaşan partiküllerBu partiküller bazı yanlış yorumlara yol açabilirPartiküllerin hangi aşamadan geldiğini nasıl anlarımpH uyumsuzlukları dokunun dökülmesini kolaylaştırabilirpH uyumsuzlukları hematoksilen ve eosine olan afiniteyi bozarNasıl önlenir-giderilirKullanılan suyun kimyasal analizi yapılabilirBu analize göre, filtre edilmiş su kullanmaya çalışSu kötü veya standardı düşükse, değişkense distile su kullan

Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlarAmaca uygun olmayan hematoksilen seçimiNedenler nelerdirSitolojik materyal için yoğun hematoksilen kullanımıHematopatolojik materyalde yoğun hematoksilen kullanımıRutin çalışmalarda zayıf hematoksilen kullanımıDekalsifikasyonu uygulanmış dokuda, asidik fiksatifle, eskimiş formalinle fiksedokularda kimyasal oksidasyonlu hematoksilen kullanımıNasıl anlaşılırHematoksilen kontrastlığı çok fazladırHematoksilen kontrastlığı çok fazladırHematoksilen kontrastlığı yetersizdirHematoksilen kontrastlığı yetersizdirNasıl önlenir-giderilirSitolojik ve hematopatolojik materyal için Mayer, Gill I vb kullanRutin çalışmalarda Harris, Gill II-III kullanAsidik dokularda doğal oksidasyonlu hematoksilen kullan

Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlarAşırı okside hematoksilen kullanımıNedenleri nelerdirOksidasyon sağlayan kimyasalların miktarı fazladırOkside edici kimyasal katıldıktan sonra geçen süre fazladır (eskimiş hematolsilen)Hematoksilenin ışık ve hava ile temas süresi fazladır (eskimiş hematoksilen)Nasıl anlaşılırHematoksilenin boyama gücü azalmıştır, istenen kontrastta boyanma olmazYüzeyde oksidasyon tabakası oluşurNasıl giderilir-önlenirHematoksilen hazırlarken tartımlara dikkat etOkside edici kimyasalları kaliteli ürünlerden seçHazırladıktan sonra en çok bir ay içinde tüket, her ay hematoksilen hazırlaHazırlanmış hematoksileni ışık ve hava ile temastan mümkün olduğunca koruHematoksileni her gün süz

Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlarHematoksilen kontrastlığının düşük olması, zayıf boyanmaNedenleri nelerdirOtolize uğramış dokuYetersiz fiksasyon, asidik formalin fiksasyonu, kötü fiksasyonAşırı dekalsifikasyonKesit aşırı derecede incedirKesit yeterince deparafinize edilmemiştirPreparat boya öncesi suda yeterince yıkanmamış, alkol tam olarak giderilmemiştirUygun olmayan hematoksilen ve boyama sistemi kullanılmaktadırHematoksilenin boyama gücü azalmıştır (kalıtesiz, fazla okside, eski, çok kullanılmış)Boyama süresi yetersizdir.Morartma işlemi yetersiz yapılmıştırYıkama suyunda veya çıkış serilerinde dekolerasyona yol açan özellikler vardırDestaining işlemi gereğinden uzun veya şiddetli yapılmıştır.Nasıl anlaşılırTümünde ortak sonuç, hematoksilen kontrastlığının zayıf-yetersiz oluşudur.Bazı özelliklere bakılarak ve kontroller yapılarak yukarıdaki sebepler araştırılır

Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlarHematoksilen kontrastlığının düşük olması, zayıf boyanmaNasıl önlenir-giderilir•Otolize izin verme•Yeterli, kaliteli fiksasyon yap•Dekalsifikasyonu nazik yap•Kesit çok ince ise hematoksilen süresini normalden daha uzun tut•Kesitte parafin artığı var mı bak, deparafinizasyonu dikkatli yap•Hematoksilene girmeden önce preparatın tam olarak su fazına gelmesine dikkat et•Uygun bir hematoksilen ve boyama sistemi seç (Harris, Gill II-III)•Hematoksileni değiştir•Hematoksilen süresini arttır•Yıkama suyunu alkali yap (Scott çözeltisi, amonyaklı su, lityum karbonat)•Yıkama suyunu kontrol et, dekolere edici nitelikte ise bu özelliklerini gider•Çıkış serilerinde dekolerasyona yol açaçak ortamları gider•Destaining işleminin süresini kısalt, asit oranını düşür, alkol bazlıları tercih et,alkol oranını arttır

Đnce kesitKalın kesit

Đnce kesit, hematoksilen kontrastı zayıfKalın kesit hematoksilen kontrastı fazla

Đnce kesit, hematoksilen kontrastı zayıfKalın kesit hematoksilen kontrastı fazla

Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlarHematoksilen kontrastlığının fazla olması, aşırı boyanmaNelerden kaynaklanırKoter artefaktlarıDokunun takip sırasında aşırı ısıya maruz kalmasıKesitlerin yüksek sıcaklıklara uzun süre maruz kalmasıKesitlerin hematoksilene girmeden önce havada kurumuş olmasıKesitin kalın olmasıHematoksilenin çok kuvvetli olmasıBoyama süresinin uzun olmasıDestaining işleminin yetersiz yapılmasıKesit yapıştırıcı maddenin aşırı kullanımıZamanla yüzeyde oluşan metalik tabakanın yarattığı boyanmalar.Nasıl anlaşılırOrtak sonuç nükleus ayrıntılarının incelenmesine olanak tanımayan koyuboyanmadır. Bazen nukleus dışı alanlarda ve lam üzerinde de boyanma vardırNedeni işaret eden bazı özellikler saptanabilir, koyu boyanmanın nedeni spesifiolarak anlaşılabilir.

Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlarHematoksilen kontrastlığının fazla olması, aşırı boyanmaNasıl önlenir-giderilir•Cerrahlara söyleyin aşırı koter kullanmasınlar (Emriniz olur komutanım, başüstüne)•Dokuları, özellikle küçük dokuları aşırı yüksek sıcaklıkta takip etme•Kesitleri kuruturken aşırı yüksek sıcaklık kullanma•Hematoksilene girmeden önce kesitlerin kurumasına izin verme•Đnce kesit almaya çalış(Đnce kesit alamazsa hileye başvur, hematoksilen süresini azalt,kesitin inceymiş gibi görünsün)•Hematoksilenin boyama gücü fazla, boyama süresini azalt, destaining i arttır•Boyama süresini kısalt•Destaining işleminin süresini arttır, asit oranını, su oranını arttır•Pozitif elektrik yüklü lam kullan•Boya yüzeyindeki metalik tabakayı gider

Boyanın Havadan /Sudan nedenlerle kötü olmasıNedenleri nelerdir, nasıl anlaşılırBoyanın kötülüğü bazen açıklanamaz“Bugün hava çok sıcaktı, bugün hava çok soğuktuBugün benim havam iyi değildi, bugün makinanın havası yokBugün sular kötüydü”Çoğu zaman bahanedir, bazen gerçeklik payı olabilir.•Suda aşırı demir bulunmasıDemir morartıcıdır. Hematoksilen beklenenden koyudur. Kesitte granüler artefak•Suda aşırı sülfür varlığıAğartıcıdır. Kesit suda morarmaz rengi açılır•Suda aşırı klorür, florür, ozon vb dekolorizan madde bulunmasıAğartıcıdır, kesit suya girince morarmaz rengi açılır•Dokuda aşırı miktarda partiküllü madde, metal ve diğer iyonların varlığıMikroskopta artefak kristaloid veya amorf granüller bulunur•Suyun asidik pHda olmasıAğartıcidır, kesit suya girince morarmaz rengi açılır•Suyun pHsının yüksek olmasıKesitlerin lamdan dökülmesine yol açar

Morartma/mavileştirme aşaması ile ilişkili sorunlarMavileştirme işlemi nedir, ne değildirMavileştirme işleminin yetersiz yapılmasıNedenleri nelerdirKullanılan çözeltinin pHı yeterince alkali değildirĐşlemin çok kısa yapılmasıNasıl anlaşılırKesitin rengi mavileşmemiştir, kızıl-mor renktedirMikroskopta, hematoksilen kontrastlığı yetersizdir, renk istenen mavilikte değildirNasıl önlenir-giderilirKullanılan suyun veya morartma çözeltisinin pHı 8 en az 8 düzeyinde olmalıdırMusluk suyu bu işlem için yetersiz veya standart değilseScott çözeltisi, amonyaklı su, Lityum karbonatlı su kullanĐşlemin süresi bir miktar uzatılabilir

Morartma/mavileştirme aşaması ile ilişkili sorunlarMavileştirme işleminin gereksiz yere fazla yapılmasıNedenleri nelerdirMavileşmenin artması umudu ile işlemin gereksiz yere uzatılması.Mavileşmenin gerçekleştiği noktadan sonra işleme devam edilmesi yarar sağlamazMavileşmenin, hematoksilen kontrastlığının artmasını sağlamazSu-mavileştirme çözeltisinin pHı gereğinden fazla yüksekSu-mavileştirme çözeltisinin pHı mavileşme sağlayamayacak derecede düşükNasıl anlaşılırMavileşme artmazKesitte dökülmeler başlayabilirNasıl önlenir-giderilirAsıl neden kesitteki hematoksilen miktarının azlığıdır. Buna yol açan nedenleri giderMavileştirme çözeltisinin pHsını ayarlaMavileştirme işleminin süresini gereksiz yere uzatma

Renk giderme işlemi ile ilgili sorunlarAşırı hematoksilenin asidik çözeltiler ile giderilmesi işlemidirĐşlemin aşırı düzeyde yapılmasıNedenleri nelerdirÇözeltinin asit konsantrasyonu yüksektir.Çözelti agresif asitlerle yapılmıştırAlkol bazında hazırlanan çözeltilerde su oranı yüksektir.Uygulama süresi uzundur.Dekolorasyon çözeltisi daha sonra yeterince yıkanıp giderilmemiştir.Nasıl anlaşılırÇözeltiden çıkılınca mavilik istenenden fazla düzeyde azalmıştırMikroskopta hematoksilen yetersizliği vardırĐşlem çok uzun ve agresif yapılmışsa kesit dökülmeleri olabilir.Nasıl önlenir-giderilirAsit konsantrasyonu düşürülürDaha yumuşak asitler kullanılabilir(asetik asit)Alkol bazlı çözeltiler kullanılır veya alkol oranı arttırılırSüre kısaltılırÇözeltiden çıkıldıktan sonra yıkama çözeltisinde asit artıkları iyice giderilir

Renk giderme işlemi ile ilgili sorunlarYetersiz renk giderme işlemiNelerden kaynaklanır•Asit konsantrasyonu düşüktür, çözelti eskimiştir•Uygulama süresi kısa•Slide üzerinde aşırı albumin/ jelatin vardır.•Alkol bazlı çözeltilerde alkol konsantrasyonu yüksek/su oranı düşüktürNasıl anlaşılır•Kesit gereğinden fazla (koyudur)koyu mavidir•Mikroskopta nükleuslar çok koyudur, kromatin-nukleolus ayrıntısı seçilemez•Nukleus dışı kompartmanlarda, hematoksilenin boyamaması gereken yerlerdelamın kesit dışı alanlarında hematoksilen boyanmaları gözlenirNasıl önlenir-giderilir•Çözeltinin konsantrasyonu arttırılır, çözelti yenilenir•Uygulama süresi uzatılır•Lam kaplama işlemi hatalıdır, sudan kesit alma banyo suyu hatalıdır, lmakontaminedir, temiz değildir. Lamları değiştirRenk giderme çözeltisinde su oranını arttır, alkol oranını düşür.

Renk giderme işlemi ile ilgili sorunlarAşırı renk giderme işlemiNelerden kaynaklanır•Asit konsantrasyonu yuksektir•Uygulama süresi uzundur•Çözelti tamamen su bazlıdır veya alkol oranı düşüktürNasıl anlaşılır•Kesitin rengi istenenden daha fazla açılmıştır-solmuştur, uçuk mavidir•Mikroskopta nükleuslar zayıf boyanmıştır, kontrastlık yeterli değildirNasıl önlenir-giderilir•Çözeltinin konsantrasyonu azalt•Uygulama süresi kısalt•Renk giderme çözeltisinin su azalt, alkol oranını arttır.

Eosin boyama ile ilgili sorunlarEosin kontrastlığı-yoğunluğu patoloğun tercihine ve vakanın özelliklerine görelaboratuvardan laboratuvara değişkenlik gösterirEosine Y (eosine yellowish, watersol.) Ethyl eosine (eosine s, alcohol sol.)Eosine B (eosine bluish, erythrosin B)Eosin boyanmanın istenilen düzeyden fazla olmasıNedenleri nelerdir•Kesit kalındır•Boyanma süresinin uzun olması•Eosin pH ının çok düşük olması•Boyanın kuvvetli-konsantre olması (hazırlama şekli veya buharlaşmaya bağlı)•Civalı fiksatif kullanımı•Çıkış serilerinde su ve sulu alkol istasyonunun olmaması, varsa kalış süresinin kısalığı•Çıkış serilerinde serilerinde isopropil alkol kullanımıNasıl anlaşılır•Ksilene getirilen kesit alışılmıştan daha pembedir•Mikroskopta nüve dışında hemen her yer pembedir. Tonlama farkı azdır, yetersizdir

Eosin boyama ile ilgili sorunlarEosin boyanmanın istenilen düzeyden fazla olmasıNasıl önlenir-giderilir•Daha ince kesit kullan•Eosinde kalma süresini kısalt•Eosinin daha az asidik olmasını sağla•Eosini daha düşük konsantrasyonda hazırla, laboratuvarı klimatize et•Civalı fiksatif kullanıyorsan eosini daha hafif yap•Çıkış serilerine su ve sulu alkol istasyonu koy, varsa kalış süresini uzat•Çıkış serilerinde isopropil alkol kullanıyorsan eosin süresini kısalt

Eosin boyama ile ilgili sorunlarEosin boyanmanın istenilen düzeyden az olmasıNedenleri nelerdirKesitin çok ince olmasıBoyama süresi yetersizdir.Eosinin pH ı çok yüksektirEosinden sonra girilen çalkalama ve alkol serilerinde su oranı yüksektir.Eosinden sonraki çalkalama ve alkolik dehidratasyon serilerindegereğinden fazla süre kalınmıştır.Nasıl anlaşılırBoyadan çıkış serilerinde pembe rengin çok hafif olmasıMikroskopta eosinin yetersiz olduğunun görülmesiNasıl önlenir-giderilirKesit daha kalın alınabilirEosinde kalma süresi arttırılırEosine asetik asit katılarak asidite arttırılırEosinden sonra su ve sulu alkollerden hızlı geç

Boyama sonrası Dehidratasyon serisi ile ilişkili sorunlarDehidratasyonun yetersiz yapılmasıNelerden kaynaklanır•Alkollerin sulu oluşu, absolu alkolün bulunmayışı-yetersizliği•Absolu alkolde bekleme süresinin kısa olması•Đsopropil alkol kullanılması•Denatüre alkol içindeki ek maddelerin boyaya etkileriNasıl anlaşılır•Preparattaki su giderilemez, suyu ksilen de gideremez, kapatmada bulanıklık•Mikroskopta bulanık buzlu cam görünümü, çift kırıcılık oluşur•Alkoller içinde ilerlerken boyanın giderek solduğu görülebilirNasıl önlenir-giderilir•Son alkoller mutlaka absolu olmalı, sık değiştirilmelidir, ortam neminden koru•Son alkolde kalma süreleri yeterli olmalı•Absolu alkolden çıkan kesitler gözle kontrol edilmeli, gerekirse geri dönülür•Denatürasyonu sağlayan maddeler boyaları solduruyorsa kullandığın alkolmarkasını değiştir

Kapatma öncesi şeffaflandırma işlemi ile ilişkili olumsuzluklarŞeffaflandırmanın yetersiz yapılmasıNedenleri nelerdir•Başarılı bir şeffaflandırma için öncelikle absolu alkol ile tam bir dehidratasyonsağlanmalıdır. Yeterli dehidratasyon sağlanmamışsa (absolu alkolde yeterincebeklememişse) ksilende bekletmekle şeffaflandırma olamaz•Ksilende bekleme süresi yetersizdir, ksilen istasyon sayısı yetersizdir, bu yüzdenkesitteki absolü alkol tam olarak giderilememiştir•Ksilen yeterince saf değildirNasıl anlaşılır•Ksilenden çıkarılan preparat homojen olarak şeffaf değildir, küçük damlalar şeklindekialanlarda bulanıklık, matlık vardır, bulanıklık kapatma maddesi ile kapatıldıktan sonrada devam eder, mikroskopta ise çift kırıcılık vardır.•Alkol özellikle eosin olmak üzere boyanın sabitliğini bozar, kapatmadan sonra eosindağılır solmaya başlar.•Ksilenin içindeki maddenin türüne göre boyada bozulma, solma meydana gelir

Kapatma öncesi şeffaflandırma işlemi ile ilişkili olumsuzluklarŞeffaflandırmanın yetersiz yapılmasıNasıl önlenir, giderilir•Absolu alkolde yeterince beklemeden (dehidrate etmeden) ksilene geçme,eğer geçtiysen preparatı absolu alkole geri al,yeterince bekleyerek tam dehidratasyonu sağladaha sonra ksilene ve kapatmaya geç•Ksilende yeterince beklemeden (şeffaflaştırmadan)kapatmaya geçme,eğer geçtiysen ksilene geri dön, yeterince bekleyerek alkolü gider,daha sonra kapatmaya geç•Ksilenin saflık derecesinden emin ol, kaliteli ksilen kullan

Kapatma işlemi ile ilişkili olumsuzluklarNedenler nelerdir, Nasıl anlaşılır, Nasıl önlenir-giderilir•Dehidratasyon işlemi yetersiz yapılmıştır.•Preparat parlamaz, mattır, yer yer buzlu cam görünümü vardır, çift kırıcıdır•Dehidratasyon aşamasına geri dön, yeni-absolu alkolde yeterince bekle•Seffaflaştırma işlemi yetersiz yapılmıştır•Preparat parlamaz, mattır, boyada bozulmalar yayılmalar oluşur•Temiz ksilene geri dön yeterince bekle•Kapatma maddesinin viskozitesi çok yüksektir (hava ile temas, kuruma)•Damlatılması, preparata yayılması zordur, yavaştır, bazı bölgeler kapanmadan katılaşır•Kapatma maddesinin kapağını açık bırakma, az ksilenle sulandırıp kullanmayı dene.

Kapatma işlemi ile ilişkili olumsuzluklarNedenler nelerdir, Nasıl anlaşılır, Nasıl önlenir-giderilir•Kapatma maddesi kısmen kristalize olmuş-opaklaşmıştır (havada kuruma)•Kapatma imkansız hale gelir, mikroskopta incelenemez•Kapatma maddesini at, sulandırmaya kalkma•Kapatma maddesinde aşırı miktarda çözücü vardır.(ksilen ile sulandırmayapılmıştır)•Hızla yayılı, preparattan taşabilir, kuruduktan sonra hava kabarcıkları oluşur•Ksilene dön, kaliteli kapatma maddesi ile kapat•Kapatma maddesinin kırma indeksi uygun değildir.•Mikroskopta çift kırıcılık gözlenir•Kapatma maddesini değiştir

Kapatma işlemi ile ilişkili olumsuzluklarNedenler nelerdir, Nasıl anlaşılır, Nasıl önlenir-giderilir•Kapatma maddesi kalitesizdir, zamanla değişim gösterir•Kapatma maddesi zamanla sararır, matlaşır, opaklaşır, kristalize olur, hava girer•Kapatma maddesini değiştir, üreticiye bildir, nedenini araştır•Kapatma işleminde dikkatsizlik•Hava kabarcıkları•Kapatma tekniğini iyi öğren, dikkatli uygula, preparatı aç-tekrar kapat•Kapatma maddesinin gereğinden fazla veya az kullanılması•Preparattan taşma, çevreye yapışma; tam kapatmama, hava kabarcığı oluşumu•Kapatılacak alanın miktarı, kesitin kalınlığı, kapatma maddesinin viskozitesigöz önüne alınarak uygun miktarda kapatma maddesi damlatılır

Formaldehid Çözeltileri•Bu konuda ülkemizdeki patoloji topluluğu yeterince bilgilendirilmiş değil•Konuyla ilgili yazılmış Tükçe literatürde de hatalar var•Burada aldehid fiksasyonunun tartışmalı moleküler mekanizmalarına girilmeyecek,pratikte gerekli bazı temel özelliklere değinilecektirAldehitler•Formaldehitin yer aldığı organik bileşikler grubudur•Yüksek sıcaklıkta alkollerin dehidrojenasyonundan elde edilebilir•Birincil alkollerin yükseltgenmesi ile de aldehitleri verir•Formaldehitten farklı olarak güzel kokulu doğal aldehitler de vardır.(benzaldehit bademde, vanilin vanilyada, sinnamaldehit tarçında)•Kimyasal reaksiyonlara çok kolay girerler.• Yükseltgenerek karboksilli asitleri, indirgenerek alkolleri verirler•Kolayca polimerleşirler•Formaldehid ile fenolün polimerik ürünü bakalit•Formaldehit ile ürenin polimerik ürünü formikadır

Formaldehid Çözeltileri•Aldehitlerin en küçük üyesidir.•IUPAC sistemindeki ismi metanaldir•Kimya endüsrisinde formik aldehit ve metil aldehit de denilir.•Karbonil grubunun boş olan iki bağına H bağlanmıştır. CH2O•Erime noktası -29, kaynama noktası -21ºC dir.•Normal sıcaklık ve basınçta renksiz ,özel kokulu bir gazdır.•Ticari olarak metanol buharının hava oksijeni ile oksitlenmesi,•Metan gibi doğal gazların uygun oksidasyonu sonucu elde edilir.•Metanol ise karbonmonoksit ve hidrojenin reaksiyonundan elde edilipmagnezyun kullanılarak suyu çekilir•Ticari piyasada %35-40 lık sulu çözelti halinde bulunur ve depolanır.•Bu çözeltiye formalin denilir.•Formaldehid miktarı %35-38 w/w, %39-41 w/v değişkendir•Mol ağ. 30.03 özgül ağırlığı 1,07/1,09g/ml•Değişik oranda metanol vardır. (%8-12)•Değişik oranda formik asit içerir (%0,03-%0,1)•Değişik oranda metilen glycol içerir

Formaldehid ÇözeltileriPiyasada satılan formalin kimyasal olarak ne durumdaFormaldehit molekülü stabil bir madde değil,Polimerleşir, küçük veya büyük polimerleri oluşur (polioksimetilen)Su ile reaksiyona girer ve metilen glycol halini alır. H2C=O+ H2O CH2(OH)2Đndirgenerek metanole dönüşürYükseltgenerek formik aside dönüşür.Đçinde neler varFormaldehit monomerleriFormaldehit polimerleriMetilen glycolMetanolFormik asitAz miktarda diğer kimyasallarNeler yaparlarMonomerleri çapraz bağ fiksasyonuPolimerler, fiksasyon?, beyaz çökeltiMetilen glycol, fiksasyon?Metanol, koagulatif ve dehidratan etkiFormik asit, pH düşüşü, koagülasyonDiğerleri, takip ve boyamada etkili olabilir

Formaldehid ÇözeltileriKullanmakta olduğumuz formalinin özellikleri nedirĐçindeki serbest aldehit miktarını bilmiyoruzÜretim aşamasındaki formaldehit konsantrasyonuna güven yokturBeklemekle serbest aldehitin bilemediğimiz bir miktarı dönüşürSerbest aldehit miktarı giderek düşerĐçinde stabilizatör olarak metanol vardır (%8-12?)Üretim aşamasındaki nedenlerle metanol miktarına güven yokturBeklemekle metanol miktarı artarBeklemekle aldehit fiksasyonu yerine koagulatif fiksasyon ve dehidratan etkiBilmediğimiz oranda metilen glycol bulunurÜretim aşamasında bilmediğimiz miktardadırBeklemekle giderek artarFiksatif etkisi var mı? Varsa bile çapraz bağ oluşturarak değilBilmediğimiz oranda polimerik aldedit molekülü bulunurBeklemekle polimerik moleküller artarFiksasyon gücü çok düşüktürBilmediğimiz oranda formik asit bulunurBeklemekle formik asit miktarı artarTamponlama işlemi formik asit oluşumunu önler, geciktirir.

Formaldehid ÇözeltileriNe yapalım, fiksasyon için ne kullanalım1-Formalinden vaz geçelim2-Mümkün olduğunca daha kaliteli-daha standart formalin kullanalımKaliteli standart formalini nasıl temin edelim1-Paraformaldehitten taze hazırlayıp kullanmak2-Güvenilir firmaların güvenilir? ürünlerini alıp tamponlayarak kullanalım3-Güvenilir firmaların tamponlanmış ürünlerini alıp kullanalımParaformaldehit nedir, paraformaldehitten formalin nasıl elde edilirFormalin çözeltisinden düşük basınç altıda suyu buharlaştırarak elde edilen beyaz bir toz.Formaldehitin özel bir polimeridir. (CH2O)n olarak formüllenir. Polimerdekiformaldehit molekül sayısını belirten n değeri 30 civarındadır.%2,26 lık NaH2PO4 41,5 ml%2,52 lik NaOH 8,4 mlKapalı kapta 60-80ºC ye kadar ısıtParaformaldehit (analitik grade) 2gr ekleTamamen çözünüp berrak bir çözelti haline gelinceye kadar karıştırFiltre et, soğut, pH ını 7,2-7,4 e ayarla ve o gün kullan

Formaldehid ÇözeltileriGüvenilir firmaların güvenilir ürünlerinin kullanılmasıKısmen geçerli bir yöntemdir. Ancak başka da yapacak birşey yoktur.1-En güvenilir yol, havası alınmış ampuller içinde pazarlanan 100ml lik ürünler.Bir kullanımlık. Ampul kırılıp çıkan çözelti hemen kullanılır.Ülkemizde yok. ABD de var, doku fiksasyonu amacı ile üretilmiş. Pahalı.Klasik şekilde pazarlanan ürünlerden almak durumundayız.2-Üretici firmaların katologları gözden geçirilmeliFirma ve ürünlerin, kalite sertifika programlarından onayı var mı?Katologda saflık derecesi, içerik özellikleri incelenmeliMutlaka w/v, w/w olarak konsantrasyon verilmiş olmalıMetanol oranı belirtimiş olmalıFormik asit oranı belirtilmiş olmalı3-Satınalma işlemini küçük partiler halinde yap.( 4-6 aylık ihtiyaçlar halinde)Mümkün olduğunca küçük şişeler halinde al100ml-2,5lt lik şişeler halindedir . Günlük ihtiyacı belirle.Bu ihtiyaca uygun şişeler halinde satınal

Formaldehid ÇözeltileriGüvenilir firmaların güvenilir ürünlerini hangi ambalajlarda almalıyım4 litre kazanlı 300 kasetlik makinayı her akşam çalıştırıyorsun.Her gün 2x4=8 litre %10 formalin kullanıyorsunBu durumda her gün 800ml formalin e ihtiyacın varFormalin alımını 1 litrelik şişeler halinde yapmalısınPahalı geliyorsa en çok 2,5 lt lik şişelerle al, üç günde bitirirsinUzun sürede tüketilebilecek büyük volümlü ürünlerde, şişe açıldıktan sonra zamaniçinde kalite bozulacaktır.(10, 25, 50 litrelik ambalajlarda alma)Sulandırdığın ürünü o gün kullanMümkünse kliniklere her gün taze sulandırılmış %10 formalin gönder veyaKlinikler her sabah kendi kullanacakları kadar %10 formalini kendileri hazırlasınlarBunu başarabilir misin?Hayır!, Zaten başarmama da gerek yok. Şu andaki takibimden memnunumKendi fiksasyonuma ve sonuçlarıma alıştım. Yaptığım aldehit fiksasyonu olmayabilir.Đlla ki aldehit fiksasyonu yapmam mı gerekiyor!Formalin patoloğu gibi görünüp etanol patoloğu olmaya alıştım, beni rahatsız etme!Kısmen! Patoloji laboratuvarımda uygularım ama klinikleri kontrol etmem güç

Formaldehid ÇözeltileriPiyasadan küçük partiler halind sertifikalı formalin aldım, her gün bir şişe açtımBundan sonra ne yapayım1- Tamponsuz %10 formalini günlük olarak hazırlayıp günlük tüket.Sulandırmada kullandığın suya dikkat etAra sıra pHını ölç. Kullandığın suya da bağlı olarak pH 5-6 düzeyindedir2-Nötral tamponlu %10 luk formalini günlük olarak hazırla, günlük tüketTamponsuz %10 formaline göre 2 kat pahalıya gelir.Hazır tamponlu formalinin maliyeti ise yaklaşık 20 kat fazladır.Kullanıma hazır tamponlu formalin almak pek uygun değildir.Sertifikalı formalin al, günlük tamponlu %10 formalini kendin hazırlaTakip makinalarında tampon tuzları kanalları tıkayabilir, uyanık ol, bakım yaptır.Tamponlu formalin veya formalin salin vb deki tuzlar,alkol ile karşılaşınca çökerler. Bazı ticari formalin ürünlerinde istenmeyenbu etkinin giderilmişolduğu belirtilmektedir3-Katkılı %10 formalin hazırla, günlük tüketFormol-kalsiyum (Litreye 1 gr CaCl2 ekle, formen pigmentini önler)Formalin zink (Litreye 10 gr ZnCl2.7H20 ekle, antijenik ve morfolojik iyileşme)

Etanol-Etil alkolC2H5OH olarak formüle edilir. Kaynama derecesi 78ºC dirPatolojide doku takibinde dehidratan olarak kullanılırKonsatrasyon ve saflık derecesine göre türleri bulunurKonsantrasyona göre, %70 v/v, %96v/v ve absolute (%99.8v/v) formda bulunur.Doğal formu ve endüstriyel olarak metillenmiş/denature edilmiş formları vardır.Metilasyon işleminde eklenen maddeler çeşitlidir (metanol, butanan, diethyl phthalate,Đsopropanol,cyclohexane vb)Doğal formlarının üretim ve pazarlaması özel lisanslarla mümkündür, pahalıdırPatolojide denatüre alkol kullanılır. Metanol oranını yüksek olmamasına dikkat etPatolojide doku takibinde %70lik (bazen %30 luk) etanol ile dehidratasyon başlarDerecesi yükselen alkollerden geçilir.En sonunda mutlaka absolute alkolden geçirilerek dehidratasyon tamamlanır.Dokunun sulu kalması durumunda şeffaflandırma ve parafinizasyon yeterincegerçekleşemezAlacağınız alkol iki tür olacaktır1-%95-96 etanol2-Absolute alkol (En az %99,5)

Etanol-Etil alkol•1, 2.5, 5,10, 25 litrelik ambalajlarda satılmaktadır•Eskiden Tekel idaresi resmi üretimin ve piyasanın tek hakimiydi•Absolu alkol oldukça pahalıydı. Bu nedenle patolojide dehidratasyonun sonaşamasında absolu alkol kullanım geleneği yaygınlaşamadı. Bu özellik boyaçıkışlarında da kendini halen belli etmektedir•Günümüzde ithali ve pazarlaması alkol kurulunun denetiminde serbest bırakılmıştır.•Fiatlar ucuzlamıştır.•Piyasadan etanol alırken alkol piyasası kurulundan sertifikalı firma ve ürünleri alın.•Đthal ürünlerde üretici firmanın yerel resmi otoriteden aldığı sertifikayı isteyin•Şişe ve etiketlerin orjinal olduğuna kanaat getirin. (Nasıl olacaksa?)•Ürün ve firmaya ait özellikleri içeren etiket olmasına dikkat edin•Alkolometre ile kabaca dansitesini ölçün•Mümkünse bir analiz laboratuvarı ile anlaşın. Özellikle konsantrasyon ve metanolyoğunluğu konusuna dikkat edin

Etanol-Etil alkol•1, 2.5, 5,10, 25 litrelik ambalajlarda satılmaktadır•Özellikle absolu alkol absolu özelliğini çok çabuk yitirir. Bu nedenle günlükkullanımınızı karşılayacak küçük ambalajlarda satın alın•Günlük kullanım miktarınızı belirlerkenDoku takibinin son alkolüBoya giriş serisinin ilk alkolüBoya çıkış serisinin son alkolüMümkünse absolu düzeyinde, yüksek konsantrasyonda olmalıdır.Bu nedenle bu alkoller kullanım yoğunluğuna bağlı olarak arttırılmak üzere gündeen az bir kez değiştirilmelidir.•Alkollerin değiştirilmesi gerektiğini nasıl anlarız.AlkolometreSusuz bakır sülfat testiDokuyu sıkarak suyunu çıkarma testiBulanıklık/şeffaflık testi

Etanol-Etil alkolC2H5OH olarak formüle edilir. Kaynama derecesi 78ºC dirPatolojide doku takibinde dehidratan olarak kullanılırKonsatrasyon ve saflık derecesine göre türleri bulunurKonsantrasyona göre, %70 v/v, %96v/v ve absolute (%99.8v/v) formda bulunur.Doğal formu ve endüstriyel olarak metillenmiş/denature edilmiş formları vardır.Metilasyon işleminde eklenen maddeler çeşitlidir (metanol, butanan, diethyl phthalate,Đsopropanol,cyclohexane vb)Doğal formlarının üretim ve pazarlaması özel lisanslarla mümkündür, pahalıdırPatolojide denatüre alkol kullanılır. Metanol oranını yüksek olmamasına dikkat etPatolojide doku takibinde %70lik (bazen %30 luk) etanol ile dehidratasyon başlarDerecesi yükselen alkollerden geçilir.En sonunda mutlaka absolute alkolden geçirilerek dehidratasyon tamamlanır.Dokunun sulu kalması durumunda şeffaflandırma ve parafinizasyon yeterincegerçekleşemezAlacağınız alkol iki tür olacaktır1-%95-96 etanol2-Absolute alkol (En az %99,5)

Etanol-Etil alkolAlkol serilerini kaydırarak kullanıyorsanız ve absolu alkol alabiliyorsanız%95-96lık alkole fazla ihtiyacınız olmayabilir. Đhtiyacınızın %80 kadarını absolualkol %20 kadarını %96 lık alkol olarak karşılayabilirsiniz. Özellikle geri dönüşümmakinanınız varsa %95 alkol ihtiyacınız çok azalacaktırEğer absolu alkol fiatı yüksek ve temininde güçlük varsa yerine asetonkullanabilirsiniz. Aseton daha güçlü bir dehidratandır. Đnkubasyon süreleri alkolegöre kısa tutulmalıdırAseton da kullanmıyorsanız %96 lık alkolle idare edilecektir. Bu durumda absolualkol yerine kullanacağınız alkolleriniz mutlaka daha önce kullanılmamış alkololmalıdır. Bu alkollerde bekleme süreleri uzun tutulmalıdır. Gerekirse bu alkolistasyonların sayısı ikiye çıkarılmalıdırAbsolu alkol kullanmayanlar için diğer bir seçenek şu andakigeleneksel uygulamayı aynen devam ettirmek,Patoloji kuru kuruya hiç çekilmez, biraz sulu olmasında sakıncayoktur. demektir

Etanol-Etil alkol•Önemli bir uyarı, takip makinası firmalarının uyguladıkları takipşemalarında son alkollerin süresi uzun tutulmuş.•Absolu alkole göre değil %96 lık alkole göre düzenlenmiş.•Bu programları doğrudan alıp son alkolleri %96 yerine absolu alkololarak uygularsanız özellikle küçük dokularda kuruma artefaktıoluşuyor.•Absolu alkol kullanan şemalarda absolu alkol süresi 1 saatten fazlaolmamalıdır. Aksi durumda özellikle küçük dokular takırdar

Etanol-Etil alkolEtil alkolün denatürasyonunda kullanılan pekçok madde vardırBu katkı maddeleri boyama işleminin değişik kademelerinde beklenmeyen etkilereve sonuçlara yol açabilir.Boyanın sonradan solması, boyanın zayıf olması söz konusu olabilir. (denaturanmaddelerin oksidasyon veya reduksiyona yol açması sonucu).Denaturant maddenin suda erimeyen özellikte olması sonucu sulandırılmışalkollerin bulanıklaşması söz konusu olabilir.Eğer denature alkol kullanılıyorsa formülasyonu bilinmeli. Yapabileceği etkilertest edilerek gözlenmelidir.

XyleneHem dehidratan alkollerde hem de parafinde eriyebilen ara maddeler gerekiyorBunlar hidrokarbon çözücülerdir.Bu maddelerin ışığı kırma indeksi proteinlere çok yakındır.Bu nedenle doku yeterince doyduğunda doku ışığa tutulunca şeffaflaşmış görünürBu maddelere clearing agent, şeffaflandırıcı denilirPatolojide kullanılacak maddeAlkol ve parafinle hızla yer değişimi yapabilmelidir.Dokuya mümkün olduğunca az zarar vermelidirParlayıcılık tehlikesi ve toksisite düzeyi düşük olmalıdırUcuz olmalıdırTüm koşulları tam olarak yerine getiremese bilegeleneksel uygulamada en çok kullanılan ürün xylen dir

Xylene•C6H4(CH3)2, C8H10 formülünde bir hidrokarbon. Kaynama derecesi 138 º•Parlayıcı bir maddedir•Toksik özelliği fazladır, kötü kokuludur•Tinercilere sormayın, bu hoş bir kokudur, kafa buldurması önemlidir•P, m, o isoformları bulunur. Patolojide kullanılan çözelti bir karışımdır•MW takip için uygun değildir. (Polar özellik az, kaynama derecesi yüksek)•Klasik takip sisteminde şeffaflandırıcı olarak yaygın kullanılıyor•Toksik etkileri önemli. Suda erimiyor, lavaboya dökemiyoruz•Ancak takip ve boyama makinelerindeki düzenekler sayesinde bu etki kalktı•Đnkubasyon süreleri arttıkça dokularda sertleşme ve kırılganlık artışı gözlenir•Parafinizasyon sırasında vakum uygulaması ksilenin dokudan uzaklaştırılmasındayararlı olabilir•Sonuç olarak•Klasik takipte ve boyada şeffaflandırıcı ve deparafinizan olarak olarak ksilen kullanılır•Sertifikalı, etiketli ürünler alınmalıdır•En az, doku takibinde 2 istasyon, boya çıkışında 3 istasyon uygundur•Đnkubasyon süresi şeffaflık testi ile belirlenebilir•Çözeltiler ne sıklıkla değiştirilmelidir?

Đsopropil alkol•C3H7OH, (CH3)2-CH-OH, kaynama derecesi 82 ºC dir.•Hem dehidratan etkiye hem de şeffaflaştırıcı etkiye sahiptir.•Dehidratan etki etanole göre daha zayıf ve yavaştır•Dokuya penetrasyon hızı etanole göre düşüktür•Polar yağların giderilmesinde etanole üstündür•Dezavantajları nedeniyle klasik takipte dehidratan olarak yaygınlaşmadı•Ancak etanolün pahalı olduğu ve kullanımının kanuni olarak kısıtlandığıülkelerde kullanılmaktadır•Ayrıca dezavantajlı özellikleri MW ışınlama ile ortadan kalkabilmektedir•Aynı zamanda şeffaflandırıcı özelliği vardır.•Ksilene göre daha az toksik olması nedeniyle tercih edilebilir•Ancak reaksiyon hızının yavaş olması nedeniyle klasik takipte kullanımı kısıtlıdır•Ancak MW takipte ksilenin bipolar özelliğinin zayıf olması,ve kaynama derecesinin çok yüksek olması sorun yaratmıştır.•Bu nedenlerle isopropil alkol klasik takip sisteminden ziyade MW takipte yaygınlıkkazanmıştır

Parafin waxMikrotom kesiminde, gerekli destek ortamını sağlayan bir maddye ihtiyaç vardırĐki aşamada gerçekleşir. Infiltration/impregnation ve embeddingGünümüzde bu amaç için kullanılan ürün parafin ve türevleridirPetrol-mineral yağ rafinerizasyonu sırasında elde edilen hidrokarbon karışımıdır.Kömürden sentetik olarak da elde edilirPatoloji laboratuvarında kullanımını daha uygun hale getirmek amacıyla1-Üst düzeyde saflaştırılmalıdır.Bu işlem sırasında yağ oranı belirgin şekilde düşer2-Bazı maddeler eklenir

Parafin wax1-Erime derecesi50-64ºC arasında olmalı (56-58 ºC)Takip ve gömme makinalarının önerdiği sıcaklık değerleri göz önüne alınmalıdırSert dokular için yüksek, yumuşak dokular için düşük erime sıcaklığı uygundurErime ve donma süreleri çok uzun olmamalıSıcak iklim koşullarında yüksek erime derecesi tercih edilir2-Çok iyi filtre edilmiş olmalı, partikül içermemeli3-Saflaştırma işleminden geçmiş olmalı, yağsız, kokusuz, renksiz olmalı4-Eridiğinde berrak olmalı, gömme sırasında bulanıklık oluşmamalı5-Donduğunda içindeki dokunun kısmen de olsa izlenebileceği şeffaflıkta olmalı6-Donduğu zaman zeminden kolay ayrılabilmeli, yapışmamalı, temizliği kolay olmalı7- Base mold dan kolayca ayrılabilmeli8-Sıcaklık değişimine uyum sağlamalı. Donunca ve soğuğa maruz kalınca çatlamamalı9-Kullanılan plastik kaset ile genleşme özelliği açısından uyumlu olmalı10-Sıcaklık artışı, aşırı ve hızlı genleşmeye yol açmamalı

Parafin wax11-Seri kesit verebilmeli12-Đnce kesit verebilmeli13-Kesim sırasıda kırılma ve rulo oluşturma eğilimi az olmalı14-Boş blok kesim testi yeterki olmalı15-Kullanılan bıçak ile uyumlu olmalı16-Bıçak ve baskı plakası üzerinde kayabilmeli17-Su banyosunda dağılmamalı18-Deparafinizasyon işleminde sorun yaratmamalı, kısa sürede kolaycadeparafinizasyon sağlanmalı, artık kalmamalı, boyaya etkisi olmamalı19-Pellet/granül şeklinde olmalı20-Tercihan kücük paketler halinde olmalı21- Blok arşivlemede ve stoklanmada sorun yaratmamalı22-Fiatı uygun olmalıBöyle parafin bulursanız bana da haber verin

Parafin wax•Tüm koşulları tam olarak yerine getiren tek bir parafin bulmak mümkün değil•Đlk yapılması gereken mümkün olduğunca saf bir parafin elde etmektir•Bu tür bir parafin, erime sıcaklığı da uygunsa pekçok isteğe cevap verebilecektir.•Özel istek ve işlevlilik için parafinin içine katkı maddeleri eklenir•Erime sıcaklığı yüksek parafinler donunca sert,•Erime sıcaklığı düşük parafinler daha yumuşak bir doku oluştururlar•Sert dokular sert, yumuşak parafinlerler yumuşak parafinle daha iyi kesilir.•Parafin içine polimerik bazı maddeler katılarak sertlik arttırılmış,erime sıcaklığı sabit kalmıştır.•Polimerik madde miktarı arttıkça ince kesit olanağı artar, seri kesit imkanı azalır•Bu parafinler gömme ve kesim için elverişlidir.•Ancak bu parafinlerin diffüzyon hızı düşüktür.•Doku takibinde avantaj sağlamaz.•Doku takibinde saf-rafine-katkısız parafinler önerilir

Parafin waxParaffin waxSaflaştırılmış kaliteli parafinParafin infiltrasyonu iyi ve hızlıdırSorunsuz dokularda seri kesit verirParaplastSaflaştırılmış kaliteli parafin içine polyisobutylene katılmıştır.Parafin infiltrasyonu daha iyi ve hızlıdırKesim normal parafine göre daha başarılıdır. 4 µmlik seri kesit verirParaplast plusSaflaştırılmış kaliteli parafin içine polyisobutylene ve %0,8 oranında DMSO katılmıştırParafin infiltrasyonu daha iyi ve hızlıdırKesim normal parafine göre daha başarılıdır1 µmlik kısa seri kesitler, 2 µmlik uzun seri kesitler alınabilirParaplast X-traSaflaştırılmış kaliteli parafin içine düşük molekül ağırlıklı mikrokristal mum konurParafin infiltrasyonu için uygun değilKesimde 2µmlik seri kesit sağlayabilir

Parafin waxParfin alımında nasıl bir yol izlemeli1-Sertifikalı, saflaştırılmış ürünler incelemeye, değerlendirmeye alınmalı.Zamanınız bolsa diğer ürünleri de deneyebilirsiniz.Ama bunlar standart ürünler olmayabilir. Üsttekiler güzelalttakiler çürük çıkabilir.2-Dokularınız ve takibinizde sorun yoksa, çok çeşitli-farklı dokularla uğraşmıyorsanızhem takipte hem de gömmede aynı parafini kullanabilirsiniz. Her iki aşamada daYa kaliteli saf bir parafin seçin veyadokuya infiltrasyon özelliğini bozmayan, kesimi kolaylaştırıcı maddeler eklenmişözel üretim parafinler seçin3-Dokularınız ve takibinizde sorun yoksa,ancak çok çeşitli ve kesim zorluğu gösteren dokularla uğraşıyorsanızTakipte saf parafin veya takip amaçlı özel parafin kullanınGömmede ise dokuları gruplandırın(Sert dokular, yumuşak dokular)(tek tek, ince kesit gerektiren dokular; seri kesit istenen dokular)4-Aday parafinlerden numune getirtin, lot numaralarını kaydedinDaha önce belirttiğim özellikler açısından inceleyin, karşılaştırmalı tablo hazırlayınTabloda ilk madde parafinin fiatı olsun.Bazı adayları baştan eler, boşuna denemezsiniz

Alternatif Doku Takip Sistemleri1-Fiksasyondan formalini dışlayan klasik takipler2-Şeffaflandırmadan xyleni dışlayan klasik sistemler3-Manuel özellikte MW ışınlamalı takip sistemleri4-Yarı otomatik-tam otomatik MW ışınlamalı takip sistemleri

Alternatif Doku Takip Sistemleri1-Fiksasyondan formalini dışlayan klasik takiplera-Formalin fiksasyonun morfolojik sonuçlarını beğenmeyenlerBazı Avrupa ülkelerinde BouinHematopatologlar B5, formalin zink, HollandeTestis için Bouin vbb-Hız meraklılarıFormalin/alkol karışımı ile başlayıp fiksasyon ve dehidratasyonu beraber kotaranlarc-ÇevreçilerEthanol/polyethylen glycol (Kryofix, BoonFix)Glyoxal/buffer lı hidro alkolik karışım

Alternatif Doku Takip Sistemleri2-Şeffaflandırma işleminden xyleni dışlayan klasik sistemlerGenel olarak çevreciler ve pazardan pay almaya çalışan girişimcilerin etkisiBenzen de içerebilen aromatik bir hidrokarbon olan xylen yerinedaha az toksik alifatik hidrokarbonlar önerilmektedir.Xylene göre dokuya daha az zarar verdiği belirtilmektedirBoya sonrası çıkış serisinde klasik kapatma maddeleri ile sorun yaşandığındanuygun kapatma maddelerine ihtiyaç duyulmaktadırÖnümüzdeki yıllarda kullanımı artacaktır.Fiatlar uygunsa denemeye başlamak gerekiyor

Alternatif Doku Takip Sistemleri3-Manuel özellikte MW ışınlamalı takip sistemleri1-Formalin yerine ethanol/polyethylen glycol (Kryofix, BoonFix) tercih edilir2-Dehidratasyonda ethanol kullanılabilir3-Şeffaflandırmada xylene dışlanmıştır, isopropil alkol kullanılır4-Diğer bir seçenek ethanol/isopropil alkol/uzun zincirli hidrokarbon karışımıözel bir çözelti (JFC) hem dehidratasyon hemde şeffaflandırma aşamasında kullanılır

Alternatif Doku Takip Sistemleri4-Yarı otomatik-tam otomatik MW ışınlamalı takip sistemleri1-Formalin yerine ethanol/polyethylen glycol (Kryofix, BoonFix) tercih edilir2-Ethanol/isopropil alkol/uzun zincirli hidrokarbon karışımıözel bir çözelti (JFC) hem dehidratasyon hemde şeffaflandırma aşamasındakullanılır3-Takip süresi belirgin şekilde kısalır4-Şimdilik makinalar oldukça pahalı. Üretim ve pazarlamada tekel var.Diğer firmalar pazara mecburen girecekler. Fiatlar düşecektir. Bekleyip görelim.SGK ve benzeri sigortacılık sistemleri yürürlükte oldukça sağlık sistemi kazançtemeli üzerine yapılandıkça, patoloji laboratuvarlarının makina-fabrika düzenindeve anlayışında neredeyse vardiya usulü çalışması gerekecek. Zaman ve hızın önemiartacak. Bu makinalar ne yazık ki sisteme girecekler.

Ülkemizde sık rastlanan doku takip sistemiFiksasyon yeteneği düşükFormik asit düzeyi yüksekpH ı asidik düzeydeBelirsiz miktarda metanol içeren%10 formalin diye anılan bir çözeltideYüksek sıcaklıklarda4 saat gibi kısa bir süre ile fiksasyon !!!!Gradı yüksekHızlı ve şiddetli dehidratasyon yapabilen etanoldeGenellikle yüksek sıcaklıklardaDehidratasyon