Boyama kapama

Patoloji laboratuvarınıkurduk: (Daha) Đyi bir kesitve yayma için i in ne yapmalıyız?8-99 Mayıs s 2010, ĐZMĐRBu sunumda yer alan resimler yazarın n izniolmadan kullanılamaz.lamaz.

Zeki KARABULUTA.Ü.TIP Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı

HEMATOKSĐLEN-EOZĐN BOYASIHistopatolojik tanı için ençok kullanılan boyakombinasyonu Hemotoksilen ve eozin (H.E.)dir.Tercih edilmesinin en önemli sebebi çok çeşitlihücreleri ortaya koyabilmesidir.Çekirdek ve kromatin ayrıntısını çok iyi ortayakoymaktadır.

Çekirdek ve Sitoplazma detayı örnek preparatlar

Haematoxylum campechianumlog ağacıHematoksilen “log ağacı” (Haematoxylumcampechianum)veya “ kalp ağacı” adıverilen meksika kaynaklı bir bitkininkabuklarının sıcak su ile işlenmesi ve üreile karıştıtılarak suda çözünür halegetirilmesiyle hazırlanır.http://waynesword.palomar.edu/ecoph4.htm

Hemotoksilen bazik bir boya olarak kullanılsa da aslında bir boyadeğildir.Boya olarak etki etmesi için zincirlerinden birinde bulunan guioid'in hematein' e okside olması gerekir.Ana oksidasyon ürünü olan Hematein asıl reklendirme işindensorumlu maddedir.OKSİDASYON1-Doğal oksidasyon (ripening):Işık ve havayla maruz bırakılarak yapılır. Aylar süren uzun bir süreçtir. Buşekilde okside olan boyalarda dayanıklılık da daha fazladır. (Ehrlich veDelafield)2- Kimyasal oksidasyon:Sodium iodat (Mayer’s) veya civa choloride ( Harris) kullanılarak çok hızlıgerçekleşir. Bunların hazırlandıktan sonra kısa süre içinde kullanılmasıgereklidir. Ömürleri doğal okside hematoksilene göre daha kısadır.

Kimyasal okside hematoksilenlerde hava ve ışıkla temas nedeniyleoksidasyon devam eder ve zaman içinde hematein parçalanarakboyanma yeteneğini kaybeder.Hematein zayıf, anyon yüklü, kırmızımtırak - sarı bir boyadır.PH sı nötrale yakın 6,5' tur. Dokulara bağlanma kapasitesi düşüktür.Boyanın dokulara bağlanmasında kovalen bağların bulunması boyanmasının etkinliğiniarttırmaktadır. Burada metal iyonlarıyla mordantlamanın rolü olduğu kabul edilmektedir.Mordant kullanılmadığı takdirde çekirdek boyaması başarılı değildir. Metal kompleks boyalargenellikle hidrofiliktir. Bu nedenle alkolik dehidratasyonlara dirençlidir.En sık Mordant olarak :aluminyum tuzları,Demir,TungstenMolybdenumKurşun (seyrek argyrofil çekirdeklerin gösterilmesinde )Kullanılan mordantın özelliği de dokunun çekirdeğin boyanma özelliğini etkiler..Günümüzde artık çoğu laboratuarın tercihi olarak kullanılan hazır solüsyon şeklindekiboyalarda hemateinle mordant olarak kullanılan maddeler genellikle Aliminyum ve demirtuzları, Aliminyum ve demir şaplar ( alum) dır.

En çok kullanlan şaplarPotasyum alum: K2S04Al2 (SO4)3 24 H2OAmmonium alum : (NH4)2 SO4'A12 (SO4)324 H2ODemir alum : (NH4)2SO4 Fe2(SO4)324 H20 dur.Aliminyum ile demirin verdiği renk morluğu birbirindenfarklıdır. Aliminyum mavi-mor bir renk verir. Suda erir,dokuya temas ettikten sonra ne su ne de etil alkol onutekrar çıkartabilir.Aliminyum hematein, bazik boya gibi etki eder (yanikatyonik bir boya vazifesi görür).Demirli hematein ise siyah veya lacivert renk verir , fakatetkisi birincisi kadar bazik değildir.

Rutin teknikte, kesitler önce mordantladır sonra boya ilehematein muamele edilir, fazla mordant solüsyondadifferansiye edilir.Bu şartlar altında hematin bazik boya olarak tesir eder.Differansiyasyon işlemi genellikle % 1 lik HCL solüsyonu ileberaber çeşme suyu ya da amonyaklı su ile sağlanır.

Differansiyasyon işleminin uygulandığı veuygulanmadığı preparat örnekleriDifferansiyon uygulanan preparatDifferasiyon uygulanmayan preparat

Differasiyon sorunlu preparatNormal preparat

Günümüzde histopatoloji laboratuarlarında en sık iki tiphematoksilen kullanılmaktadır:Mayer ve Harris metodları. Ortopedik örnekler çalışanlaboratuarlarda regressif bir metod olan Harris metodukullanılır.Dekalsifikasyon genellikle çekirdeğin bazofilik boyanmasınıazalttığı için bu metod tüm hücre kısımlarını boyar örneğinçekirdek sitoplazma bağ doku vs. ve bu boyamayı optimumçekirdek boyanması için kontrollü renk çıkarma ve “bluing”işlemi takip eder.Diğer laboratuarlar Mayer hematoksilen kullanırlar bu sadeceçekirdeği boyayan progresif bir yöntemdir. Mavi rengiarttırmanın yolu lamelleri akan su altında tutmaktır.

HEMATOKSİLEN EOZİNBOYAMA YÖNTEMİ VEBİLİMSEL KONTROLÜ

Histolojik olarak H-E boyamanın kesin kimyasal reaksiyonlarla vemetotlarla başarılabildiği gösterilmiştir,Fakat daha az kesinlik kazanmış kimyasal ve fiziksel yöntemlerlede başarılmaktadır.Bu boyama yöntemlerinin çok sayıdaki farklı faktörlere göreoldukça değişeceği anlamına gelmektedir.Bu aynı zamanda geliştirilen boyama tekniklerinin çokluğununnedenini ortaya koymaktadır.Fakat her patoloji teknisyeninin bu yöntemlerde başarısızlığauğradığı olmuştur.Bunun nedenleri şunlar olabilir:

BOYANMA SORUNLARIl-Dokuların kendine ait boyanma yetersizliği (boya için dokunun yeterlimiktarda reaktif olmaması)2-Uygun olmayan fiksasyon,3-Boyaların kompozisyonundaki ve çözünürlüğündeki farklılıklar,4-Boya solüsyonunun yetersiz olgunlaşma veya bozulması,5-Boyanın ve çeşme suyunun PH' sındaki veya ısısındaki değişmeler,6-Kalın kesit.7-Dekalsifikasyon yetersizliği8-Deparafinizasyon yetersizliği9-Diğer faktörler

BOYAMA SORUNLARI İLE İLGİLİ ÖRNEKPREPARATLARDoku takip sorunlu preparat

Kalın kesit sorunlu preparat

Deparafinizasyon sorunlu preparat

Hematoksilen boyasını iyi almamış preparat

Doku takip sorunlu preparat

Đnce ve güzel kesilmiş bir preparat

Normal dokuDeparafinizasyon sorunu

Boyamadaki kesinliğin veya yorumlanabilir bir preparateksikliğinin nedeni teknisyenin en iyi sonuçları eldeetmek için kendi yöntemlerini kontrol etmesigerektiği anlamına gelmektedir.Eğer çeşme suyunun PH' sı veya yapısı değişirse veyaiklimsel durumlar farklıysa, ya da farklı markalı bir boyaalındı ve içeriğine bakılmadan boyama yapıldı iseboyamızdaki oksidasyon süresi farklık gösterebileceği içinbir ülkede iyi çalışan bir yöntem diğer bir ülkede hatta aynıülkenin bir başka bölümünde tatminkâr olmayabilir.Bir boyama yönteminde verilen direktifler dikkatli olaraktakip edilmelidir ancak değiştirilemez diye dedüşünülmemelidir.

Laboratuarda, patolojik değişiklikler, bakteriler, metaller gibimaddeler içerdiği bilinen dokulara ait kapatılmış boyanmamışparafin kesitlerin stoku bulundurmalıdır.Bunlar kontrol kesitler olarak kullanılmalıdır. İncelenecekkesitle aynı anda ve aynı yolla boyanmalıdır.Her laboratuar çalışanı boyama tekniğinin kontrol edilmişvaryasyonlarını yapma becerisinde olmalıdır.Bir boyama yönteminin rastlantılara dayanan çok sayıdakifarklı şekilleri, şans eseri mükemmel sonuçlar verebilir, fakatsonradan genellikle tekrar aynı sonucu almak mümkündeğildir.

Aynı doku bloğundan çok sayıda kesit alınmalı veyöntemin her basamağındaki değişikliklerin bir serisi,teker teker ve her kesitte sadece bir değişiklik yapılarakyapılmalıdır.Tekniğin geri kalan bölümünü sabit tutarak, bu kesitlerleyöntemin hangi kısmının kusurlu olduğu ve nasıldüzeltilebileceği daha kolay görülecektir.

H-E BOYAMA VE KAPAMAİŞLEMİ SIRASINDA TEKNİSYENİNYAPMASI GEREKENLER

Hematoksilen pH’ı düzenli olarak kontrol edilmelidir.Mavileştirme solüsyonundan (amonyaklı su gibi) çıktığında kesitlermikroskopta kontrol edilmeli, hematoksileni aldığı ve fazlalığınuzaklaştırıldığından emin olunmalıdır.Boyama sonrası ise H-E boyası tam olarak kontrol edilmelidir.Nükleus ve sitoplazma doğru ve yeterli boyanmış mı?Şeffaflanma tam mı?Kabarcık, kir, parmak izi, boya çökeltisi var mı?Doğru etiketlenmiş mi?Hafta içerisinde boyanan preparat sayısına göre solüsyonlardeğiştirildi mi?

BOYAMA YÖNTEMİ Lamları parafinden arındır (deparafinizasyon) ve su ile muamele et1-Xylen3dk2-Xylen3dk3-Xylen3 dk4-Alkol %70 2dk deparafinizasyon5-Alkol%802dk6-Alkol%90 2dk7-Alkol%100 2 dk Harris hematoksilen ile 6 ila 15 dakika boyayın. Akan musluk suyunda 2 ila 5 dakika yıkayın.

%1’lik asit alkolle 1-2 kez batırarak ayırın Musluk suyunda yıkayın. Zayıf amonyak solüsyonu ya da doymuş lityum karbonatsolüsyonu ile preparatlar parlak mavi bir rengeboyanıncaya kadar bekletin. Akan musluk suyunda 5dakika süreyle yıkayın. %80 etil alkolde 1-2 dakika bekletin . Eozin-phloxine solüsyonunda 2 dakika zemin boyama(counterstain) yapın.

1-%95 lik Alkol 3dk2-%95 lik Alkol 3dk3-Absolü Alkol 3 dk4-Absolü Alkol 3 dk şeffaflanma5-Xylen2dk6-Xylen2dk7-Xylen2 dk Kapama işlemi

A.Ü.Tıp Fakültesi Patoloji Laboratuvarında Kullanılan H-EBoyama YöntemiXylen2dkXylen2dkXylen2dkXylen2dkAlkol2dkAlkol2dkAlkol2dkYıkama2dkAmonyaklı su1 dkYıkama 2 dk%1 lik asitAlkol 1 dkYıkama 5 dkHematoksilen 7 dkYıkama 2 dkAlkol1 dkEozin11 dkAlkol 2dkAlkol 2dkAlkol2 dkXylen2dkXylen2dkXylen2dkKurutma5 dk

KAPAMA İŞLEMİ

Preparasyondaki son aşama lam üzerindeki dokuyuüzerine lamel kapatarak yapılan kapama işlemidir. Bu işlem lamın kalıcı olarak kapatılmasına vemikroskobik olarak incelenmesine izin verir. Lameli sabitlemek için üç tip kapama maddesikullanılabilir: doğal reçine, sentetik reçine ve suiçerikli media.

Doğal reçineler arasında uzun kuruma süresi yüzündenrutin kullanımda pratik olmayan “Kanada Balzamı”geçmişte standart olmuştur. Kanada balzamı ile kapatılan kesitlerde eozin birkaç yıldasolar ve basit anilin boyalarının korunmasında yetersizdir.Ayrıca “Prusya mavisi” reaksiyonlarının erken solmasınasebep olur. Bu sebeplerden dolayı günümüzde laboratuarlardahematoksilen eozin boyama ve özel diğer boyamalardansonra sentetik reçineler kullanılır.(Entellan veya Balzam)

1. Örnek için uygun boyutta lamel seçin

2. lameli lama doğru yatırarak hava kabarcığı oluşmasınıengelleyin.

3. Tiftik içermeyen bir peçete ya da uygun solvent ile nemlendirilmişgazlı bez ile lamelin kenarlarından taşan kapama maddesini temizleyin.

LABORATUVARDA H-E BOYAMA VEKAPAMA İŞLEMİNDE RUTİNOLARAK YAPILMASI GEREKENİŞLEMLER

Boyama işlemine başlamadan önce farklı dokulardanpreparatlar alıp deneme boyası yapalım ve mikroskoptaÇekirdek ve sitoplazma boyamasının tam olup olmadığınabakalım Şeffalandırma yeterlimi ve artefak varmı kontrol edelim. Boyama cihazlarımızı kaplarını her hafta mutlaka temizleyelimve kapları uygun solüsyonda beklettikten sonra durulamaişlemini tam yapalım Boyama işlemi yaparken kapların hacmine göre kendimize alkolve ksilen değiştirme aralığı belirleyelim bir tablo hazırlayarakalkol ve ksilenleri değiştirip tablomuza işleyelim

Laboratuvarımız da her teknisyenin görebileceği bir yerdetablo bulunduralım ve tabloya Hematoksilen Eozindeğiştirme bilgilerini girelim. Kullandığımız boya solüsyonlarının içeriğini bilerekboyama prosedürümüzü belirleyelim. Hematoksilen çözeltisinde oksidasyon yavaş ve gündengüne düzensiz olarak devam eder, çökelti oluşur boyaçözeltisi süzülmelidir. Otomatik makinalarda bu çökelmeler tıkanıklıklara nedenolabilir.

Kapama işlemi yaparken otomatik makineler içinkuru kapamayı tercih edelim. Lamel seçimini iyi yapalım lamellerin etkalınlıklarının bile mikroskopta görüntüyüetkilediğini bilelim. Kapattığımız preparatları rutin olarak mikroskoptaincelelim parmak izi olup olmadığına mutlakabakalım.

Sonuç olarak boyama işlemine otomatik makineyapıyor benim bir şey yapmam gerekmiyor diyedüşünmeyip yukarıda benim yaşayarak gördüğüm vesıraladığım maddeleri bütün teknisyenlerinuygulaması gerektiğini düşünüyorum . Kalitenin sadece kaliteli malzemeyleyakalanamayacağını kaliteli ve iyi bir boya için kalitelive yetişmiş teknisyenler olması gerektiğinidüşünüyorum.

Sunuma katkılarından dolayıSn Prof.Dr.Işınsu KuzuSn Doç.Dr Aylin OKÇU HEPERSn Kaplan Firmasıçalışanlarına teşekkür ederim.