kanda hplc yöntemiyle alfa amanitin analizi - Akademik Personel ...

KANDA HPLC YÖNTEMYNTEMĐYLEALFA AMANĐTĐN N ANALĐZĐErtuğrul rul Kaya 1Selim Karahan 1Mustafa Hancı 1Sait Bayram 1Ozan A Alkoç 2DüzceÜniversitesi Tıp T p Fakültesi1Tıbbi Farmakoloji,2Anatomi Anabilim Dalıertugrulkaya@duzce.edu.tr

Giriş ve Amaç Ölümle sonuçlanan mantar zehirlenmelerinde ensık k etken Amanita phalloides Toksin alfa amanitin Ayırıcı tanıda kanda alfa amanitin varlığı1

Alfa amanitin molekül l yapısı

Alfa amanitin ölçümü Kanda alfa amanitin ölçümü için in tanımlanmmlanmışbazıyöntemler bulunmaktadır. Bu ölçümler HPLC cihazında yapılmaktadlmaktadır 2,3 Mevcut yöntemlerde ybazı değişiklikler iklikler yapılarak,daha verimli bir alfa amanitin ölçüm m yöntemi ybelirlenmesi ve bu yöntemin yvalidasyonuçalışmamızda amaçlanmlanmıştır.

Gereç ve YöntemY A- Alfa amanitin izolasyonu B- Ratlara alfa amanitin uygulaması C- Kandan alfa amanitin ekstraksiyonu D- HPLC cihazında alfa amanitin ölçümü E- Hesaplamalar

A- Alfa amanitin izolasyonu 4– Alfa amanitin pahalı olduğundan undan mantardan izole edildi– Mantar toplama: 12/10/2010 tarihinde DüzceDzce-Gümüşova-Yeşilyayla ormanlık k alandan toplandı.– Sınıflandırma:Taksonomik sınıflandsflandırılması yapıldldı.– Kurutma: 60 C’de Chava akımı altında 24 saat kurutuldu– Öğütme:Kuru mantarlar bitki öğütücüdeöğütüldü– Ekstraksiyon: Sokshlet ekstraksiyonu (180 g, 4 saat, çözücü%100 metanol). Çözücü uçuruldu uruldu (50 C)– Hazırlama:Ekstre 10 mL saf suda çözüldldü, , filtre edildi.– Saflaştırma:Semipreparatif HPLC sistemine 100 µL L enjekteedildi, 5 kez tekrarlandı– Doğrulama:Alfa amanitin standardı ile karşışılaştırıldı– Ölçüm:Saflık k oranı (%98) ve miktarı ölçüldü, 1mg deneyealındndı (1mg—10mL 10mL de stok solüsyon= syon= 100µg/mL)

A- Alfa amanitin izolasyonu: Amanita Phalloides Taksonomi (5): Makroskopik özellikler:– Zeytin yeşili (sarı-kahve) parlakşapka– Belirgin volva– Đntakt annulus (1-1,5 1,5 cm)– 5-15 cm dairesel şapka– Beyaz radyal serbest lamel– Beyaz, zigzag çizgili sap (8-15 /1-2cm)Mikroskopik özellikler:– Elipsoid yapı– 6-99 / 8,5-11µm m boyutlar

A- Alfa amanitin izolasyonuAlfa amanitinstandardı (analitik)Amanita phalloidesektresi kromatogramı(semipreparatif)Đzole alfa amanitin +standart (analitik)Fraksiyonbaşlangıç ve bitişnoktaları

B- Ratlara alfa amanitin uygulaması Etik kurul izni alındndı (DÜ-HADYEK 2011/07) 6 sıçan skullanıldldı Anestezi altındaki ratların n batını açıldı, , vena cavainferiordan 2 mL kan alındndı Saf suda çözünmnmüş alfa amanitin 1mL iv verildi(100 µg) 5 dakika sonra kalpten 1 mL kan alındndı

B- Ratlara alfa amanitin uygulaması Aynı sıçandan alınan 3 mL kandan eldeedilen serumlar:– 1. grup: 0,5 mL boş serum– 2. grup: 0,5 mL bo0,5 mL boş seruma 10 µg/mL final konsantrasyontoksin eklendi (55 µL L stok solüsyon)syon)– 3. grup: 0,5 mL serum (iv. 100 µg g toksin sonrası)

D- HPLC cihazında alfa amanitin ölçümü 3 UV dedektör, 303 nm dalgaboyu C18 ters faz kolon, 4,6x250 mm (5µm m partikül) 1 mL/dak akışhızı 10 µL L enjeksiyon Mobil faz:– Amonyumasetat(50mM)/asetonitril/metanolmetanol (80/10/10/10, , v/v/v)– Amonyumasetat pH=5 (asetik asit)

E- Hesaplamalar HPLC tayin limiti 5 ng/mL (S/N:3) Ölçüm m limiti 16,7 ng/mL Kalibrasyon eğrisi: e0,2/0,4/0,6/1//0,4/0,6/1/2 µg g (10µL L için) i in) (20-200200 µg/mL) R 2 : 0,9993 Kalibrasyon eğrisi edenklemi: y=352476x + 17338 (pik alanı) 10 µL L deki toksin ölçüldü, µg/mL olarak hesaplandı.800.000700.000600.000Alfa amanitin standardı kalibrasyon eğrisiy = 352476x + 17338R 2 = 0,9993500.000400.000300.000200.000100.00000 0,5 1 1,5 2 2,5

Bulgular 1. grup (negatif kontrol): 0 mg (

Boş serumAlfa amanitinstandart5,423Pozitif kontrolDeney grubu5,4375,432

Tartışışma ve Sonuç Boş kanlarda toksin bulunmayışıyönteminözgüllüğü hakkında bilgi vermektedir. Pozitif kontrol grubunda tüm t örneklerde toksinbulunması seçicilik hakkında bilgi vermektedir. Geri kazanım m oranı %98,6 Alfa amanitinin çevre piklerden ayrımı oldukçaverimlidir. Analiz süresi skısadksadır.

Tartışışma ve SonuçYeniyöntemTutulmazamanı(dk)Analizsüresi(dk)Tayinlimiti(ng/mL)r 2Mobil faz5,43 7 16,7 0,9993 Amony.Aset.AsetonitrilMetanolDiğer 12,15 15 10 Amony.Aset.yöntem 2 AsetonitrilDiğer 15,28 18 10 0,9966 Fosforik asityöntem 3 AsetonitrilKolon ve akış hızı tüm yöntemlerde aynıdır