133-140 Asli Cakar - Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi

DERLEME REVIEW Hacettepe T›p Dergisi 2011; 42:133-140
SNARE proteinler ve mikroorganizma iliflkisi
Asl› Çakar 1 , Cumhur Özkuyumcu 2
1 Uzm. Dr., Hacettepe
Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
Ankara
2 Prof. Dr., Hacettepe
Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
Ankara
ÖZET
SNARE proteinler maya ve memeli hücrelerinde 60’tan fazla çeşidi bulunan büyük bir protein süperailesidir.
SNARE proteinlerin en önemli rolleri, veziküllerin plazma membranıyla ya da vezikülün
diğer bir vezikülle füzyonuna aracılık ederek madde geçişini sağlamaktır. SNARE proteinler;
veziküllerin membranında bulunan veziküler (v-SNARE) ve plazma membranı gibi hedef
kompartımanda bulunan target (t-SNARE) olmak üzere iki sınıf altında toplanmaktadır. Veziküler
SNARE proteinler hedef membranda bulunan target-SNARE proteinler ile etkileşime girerek
SNARE kompleks oluşumuna ve membran füzyonuna neden olur. Bugüne kadar sinaptik vezikül
ile presinaptik membran arasındaki sinir ileticilerinin geçişinde SNARE proteinlerin rolü üzerinde
çok durulmuştur. Bu SNARE proteinler botulizm ve tetanoza neden olan bakteriyel nörotoksinlerin
hedefidir.
Anahtar Kelimeler: SNARE proteinler, ekzositoz, botulizm, tetanoz.
ABSTRACT
SNARE proteins and the interaction with the microorganisms
SNARE proteins are a large protein superfamily consisting of more than 60 members in yeast and
mammalian cells. The primary role of SNARE proteins is to mediate vesicle fusion, that is, the
exocytosis of cellular transport vesicles with the cell membrane or with a target compartment.
SNAREs can be divided into two categories: vesicle or v-SNAREs , which are incorporated into the
membranes of transport vesicles, and target or t-SNAREs, which are located in the membranes of
target compartments. Vesicular SNAREs (v-SNAREs) interact with their target SNAREs (t-SNAREs)
to form SNARE complexes which mediate membrane fusion. The best-studied SNAREs are those
that mediate docking of synaptic vesicles with the presynaptic membrane. These SNAREs are the
targets of the bacterial neurotoxins responsible for botulism and tetanus.
Key Words: SNARE proteins, exocytosis, botulism, tetanus.
Prokaryot ile ökaryot hücreler arasındaki en büyük fark ökaryot hücrelerde organellerin
bulunmasıdır. Hücre içinde gerek bu organeller arasında gerekse plazma
membranıyla bu kompartımanlar arasında madde alışverişine dayanan sürekli bir
trafik akışı vardır. Bu alışveriş iki membranın füzyonu ile meydana gelir [1].
Ökaryotik hücrelerde organeller arası ve organeller ile plazma membranı arasındaki
füzyonda temel görev alan proteinler SNARE (soluble N-ethylmaleimidesensitive
factor activating protein receptor) proteinlerdir [2].
Cilt 42 • Say› 3 • 2011
133

Çakar ve Özkuyumcu
SNARE proteinler 18-32 kDa ağırlığında integral
membran proteinler olup, N terminal bölge, C terminal
bölge ve ortada SNARE motif olarak adlandırılan tekrarlayan
heptad ünitelerinden oluşan bir bölge olmak üzere
üç kısımdan oluşmaktadır. SNARE proteinlerde C terminal
kısım membranda, kısmen korunmuş olan amino
terminal kısım sitoplazmada bulunmaktadır. Amino
terminal sonrasında bulunan ve SNARE motif olarak
adlandırılan yaklaşık 70 aminoasitten oluşan bölge korunmuş
bölgedir [3].
SNARE proteinlerin özgüllük ve kompleks oluşturabilme
olmak üzere iki önemli özelliği bulunmaktadır;
Özgüllük: Her SNARE proteinin yer aldığı hücre ve
hücredeki lokalizasyonu farklı ve özgüldür. Vezikülde
bulunan SNARE proteini daima vezikülde, plazma
membranında bulunan SNARE proteini ise daima plazma
membranında yer alır. Bu nedenle hücredeki lokalizasyonlarına
göre vezikülde bulunan SNARE proteinlerine
v-SNARE, plazma membranında bulunan SNARE
proteinlerine ise t-SNARE (target-SNARE) proteinleri adı
verilir. SNARE proteinlerin özgüllüğü sadece lokalizasyonlarıyla
sınırlı değildir. Bir SNARE proteini daima belirli
SNARE proteinleriyle bağlanabilir [4].
Kompleks oluşturma: SNARE proteinlerin diğer bir
özelliği de kompleks oluşturabilmeleridir. Bu fonksiyon
da özgüllük gibi sıkı kurallara bağlıdır.
Oluşan SNARE kompleksi her zaman dört SNARE
proteininden oluşmaktadır. Bir SNARE proteini vezikül
membranında, diğer üç SNARE proteini ise plazma
membranında yer almaktadır. Kompleks oluşumu
SNARE proteinin distal ucundan, diğer bir deyişle N-
terminal bölgesinden başlar. SNARE proteinleri birbiri
üzerine kıvrılarak çok sıkı bir sarmal oluşturur. Oluşan
bu yapı sodyum dodesil sülfata (SDS) dirençli ve termostabildir.
SNARE kompleksin erime derecesi
90°C’dir. Oluşan SNARE kompleksinde 16 katman ayrıştırılmıştır.
En ortadaki katman SNARE proteinlerinin
motiflerinin biraraya gelmesinden oluşmaktadır. Bu
bölgeye iyonik merkez ya da 0 noktası adı verilir. v-
SNARE proteinlerinde motifin tam ortasında arjinin
aminoasidi, diğer membranda bulunan SNARE proteinlerin
motiflerinin tam ortasında ise glutamin aminoasidi
bulunur. Dolayısıyla bir SNARE kompleksi oluştuğunda
iyonik bölgede bir arjinin (R), üç glutamin (Q)
aminoasidi bulunur. Bu oran yani 1R/3Q oranı tüm
SNARE kompleksler için geçerlidir. Bu özellik göz önüne
alınarak SNARE proteinleri farklı bir şekilde sınıflandırmak
da mümkündür. İyonik bölgede arjinin aminoasidi
içeren proteinlere R-SNARE, glutamin aminoasidi
içeren proteinlere ise Q-SNARE adı verilebilir. Aslında
bu sınıflama daha doğru bir yaklaşımdır. Zira füzyon
her zaman vezikül ile plazma membranı arasında
olmaz. İki vakuolün füzyonu sırasında bir vakuolde R-
SNARE diğer vakuolde ise üç adet Q-SNARE proteini
bulunmak zorundadır. Q-SNARE proteinlerinin membrandaki
yerleşimleri de özgüldür. Üç protein her zaman
aynı pozisyonda yer alır. Hedef membranda bulunan
üç Q-SNARE proteininin lokalizasyonu a, b ve c
olarak isimlendirilir. Bir protein eğer a pozisyonunda
ise her zaman bu pozisyonda yer alır. Diğer bir deyişle
SNARE proteinleri arasındaki hem bağlanma hem de
lokalizasyonlar son derece özgüldür [5]. Kompleks oluşumu
sırasında SNARE proteinleri membranın distal
ucundan kıvrılmaya başlar. Transmembran domaine
kadar devam eden bu kıvrılma iki membranı birbirine
yaklaştırır. Oluşan kompleks, membranı strese sokarak
füzyona hazırlar. SNARE kompleksler her zaman
membrana paralel yer alır. Bu organizasyon füzyon reaksiyonunda
lipid tabakaların birbirine yakınlaşması
için önem taşımaktadır (Şekil 1). SNARE kompleks oluşumu
sırasında açığa çıkan enerji transmembran domainlerden
geçerek lipid tabakasının stabilizasyonunu
bozar ve füzyonun gerçekleşmesine yardımcı olur [6].
Sinir hücrelerinde yer alan SNARE proteinleri
SNARE proteinler, sinir hücreleri arasında sinir ileticilerinin
iletilmesinde son derece önemli bir rol alır. Sinir
ileticileri nöronlar içinde sinaptik veziküllerde bulunur
ve diğer sinapsa ekzositoz yoluyla gönderilir. Nöronal
aksonun presinaptik membranı hücre uyarımı ile
hızlı ekzositik olayların meydana geldiği bölgedir. Uyarımı
takiben sinir ileticisi taşıyan sinaptik veziküller
presinaptik membranla füzyona girerek içeriklerini sinaptik
boşluğa bırakır ve postsinaptik hücrede sinir ileticilerine
özgül reseptörler aracılığıyla hücre içine girer
[7]. Sinaptik veziküllerde bulunan SNARE proteini
VAMP veya synaptobrevin adını alır. Plazma membranında
ise Syntaxin ve SNAP-25 olmak üzere iki SNARE
protein bulunmaktadır (Şekil 2). SNAP-25 proteini tam
orta noktasında bulunan sistein aminoasidi ile membrana
tutunur. N- ve C- terminal bölgeleri tekrarlayan
heptad dizilimlerini içerir ve iki farklı SNARE proteini
gibi işlev görür [8-10].
Füzyonun olabilmesi için ne kadar SNARE kompleksinin
oluşmasına ihtiyaç vardır? Her oluşan SNARE
kompleks 35 kcal/mol enerjinin açığa çıkmasına neden
olur. Füzyon için gereken enerji ise yaklaşık 50-100
kcal/mol’dür. Dolayısıyla oluşan yaklaşık üç SNARE
kompleksi membran füzyonu için yeterlidir [11].
Füzyon hızını belirleyen etmenler
SNARE proteinlerin oluşturduğu komplekse bağlı
gelişen füzyonun hızı değişkendir. Bazı hücrelerde füz-
134
H ACETTEPE T IP D ERG‹S‹

SNARE proteinler ve mikroorganizma iliflkisi
Şekil 1. SNARE proteinlerine bağımlı membran füzyonu sırasında plazma membranında bulunan üç SNARE proteini ile veziküler membranda
bulunan SNARE proteininin kompleks oluşturarak iki membranı füzyona hazırlaması [2].
Şekil 2. Sinaptik vezikül ve plazma membranında yer alan SNARE
proteinleri [17].
yon kinetiği 1 milisaniye gibi çok kısa sürelerde gerçekleşirken,
bazı hücrelerde 10 saniye ile dakikalar arasında
değişmektedir. Bu farklılığın altta yatan sebebi, lokal
membran yapısı ya da SNARE proteinlerinin konsantrasyonu
olabileceği gibi, diğer regülatör proteinlerin
de füzyonda rol oynadığı bir gerçektir. Konstütif
yolakta, hücre içi veziküller plazma membranına ulaştıklarında
spontan olarak ekzositoza yol açar. Oysa nöronal
hücrelerde meydana gelen regülatif sekresyonda
veziküller önce plazma membranında akümüle olarak
füzyona hazırlanır ve bir uyarım sonucu (serbest kalsiyum
miktarının lokal olarak artmasıyla) füzyon gerçekleşir.
Füzyon sırasında veziküller içinde taşınan sinir
ileticileri, vezikülle hedef membranın tamamen
füzyonu yerine, geçici bir por oluşturularak salınır. Bu
fenomene “kiss and run” fenomeni adı verilir. Bu şekilde
sinir ileticileri 1 milisaniye içinde salınırken, konstütif
yolakta bu süreç 1000 kat daha yavaş işler [12].
“Kiss and run” fenomeni dışında regülatif ekzositozun
bu kadar hızlı olmasının farklı nedenleri de bulunmaktadır.
SNARE proteinler füzyonun özünü oluşturmakla
birlikte füzyonun gerçekleşebilmesi için başka
proteinlere de ihtiyaç duyulmaktadır. Bu nedenle SNARE
proteinlerine minimal füzyon makinesi adı verilmektedir
[13]. Füzyonu kontrol eden diğer proteinler, füzyonu
tetikleyen proteinler ve spontan füzyonun oluşmasını
engelleyen proteinlerden oluşmaktadır [14].
Regülatif ekzositozda füzyonun gerçekleşmesi için bir
uyarıma ihtiyaç vardır. Bu uyarım lokal kalsiyum miktarının
artışıdır. Nöronal hücrelerde kalsiyum sensör
proteini synaptotagmindir. Synaptotagminin kalsiyuma
bağlanabilme yeteneği ekzositozu hızlandırır.
Synaptotagminin N terminali vezikül membranına
bağlıdır ve sitoplazmada iki kalsiyum bağlanma bölgesi
bulundurur. Synaptotagmin kalsiyuma bağlandığında
t-SNARE proteinlerine bir sinyal ileterek, bu proteinlerin
v-SNARE proteini ile bağlanmalarını sağlar. Veziküller
sinapslarda kalsiyum giriş bölgelerinin hemen
yakınında toplanır. Bu lokalizasyon füzyonun hızlı olmasının
nedenlerinden biridir. Synaptotagmin düşük
hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda, SNARE kompleksine
bağlanarak bir tür kıskaç görevi görür. Ancak
dışarıdan kalsiyum sinyalinin alınması sonucu hücre
içi kalsiyum yoğunluğu arttığında synaptotagmin
SNARE kompleksinden ayrılarak kalsiyuma bağlanır ve
Cilt 42 • Say› 3 • 2011
135

Çakar ve Özkuyumcu
SNAP proteinlerin SNARE kompleksine bağlanmasına
neden olur [15].
Synaptotagmin dışında SNARE proteinlerin yer aldığı
membran füzyonunda SNARE proteinlerine bağlanarak
füzyonu kontrol eden farklı proteinler de bulunmaktadır.
Bunlardan biri SM proteinlerdir. SM proteinler
isimlerini mayalarda bulunan Sec1 ve memeli proteini
olan Munc18’den almıştır. Memeli hücrelerinde üç
farklı Munc proteini bulunur. Munc18 nöronlarda bulunan
izoformdur [16].
SM proteinleri, aynı SNARE proteinde farklı bölgelere
bağlanarak füzyonu pozitif veya negatif yönde regüle
eden proteinlerdir. SM protein, bir tür t-SNARE
olan syntaxin’in N terminal bölgesinde bulunan Habc
bölgesine bağlanarak bu bölgenin geriye doğru katlanmasına
ve SNARE motifine bağlanmasına neden olur.
Bu bağlanma syntaxin proteinini kapalı konuma getirerek
kompleks oluşturabilme kabiliyetini engeller. SM
proteininin bu fonksiyonu füzyonu engeller ve negatif
regülasyona neden olur. Ancak SM proteini aynı zamanda
pozitif bir regülatör olarak da fonksiyon gösterebilir.
SM proteini N-terminal ucu ile syntaxin’in N-
terminal bölgesine bağlanır. Bu bağlanma sonucu motifi
kapalı olan Syntaxin üzerindeki inhibitör etki kalkarak
syntaxin açık hale gelir ve kompleks oluşturmaya
hazır durumdadır. Diğer bir deyişle SM proteinine bağlı
negatif regülasyon; SM’nin syntaxin’in SNARE motifine
bağlanmasıyla, pozitif regülasyon ise SM’nin
syntaxin’in N-terminaline bağlanmasıyla gerçekleşir.
Bu regülasyon SNARE kompleks oluşumunu her zaman
tetikte tutmakta ve koşullar uygun olduğunda baskılayıcı
etkinin ortadan kalkması sonucu füzyonun hızla
gerçekleşmesine neden olmaktadır [17-19].
Diğer bir SM proteini de kompleksindir. Kompleksin,
kalsiyum hücre içine girip synaptotagmine bağlanana
kadar oluşmuş SNARE komplekse bağlanarak bu
kompleksi dondurur. Synaptotagminin kalsiyuma bağlanmasını
takiben SNARE kompleks üzerinden ayrılan
kompleksin, hali hazırda oluşmuş olan SNARE kompleksinin
hızlı bir şekilde füzyonu başlatmasına yol açar
[20,21].
Özetle, kalsiyumun hücre içine girmesiyle uyarımı
alan hücre, synaptotagminin pozitif etkisiyle füzyona
hazır hale gelir. SNARE proteinler üzerindeki negatif regülasyonun
ortadan kalkması sonucunda oluşan SNARE
kompleksi ile sinir ileticilerinin ekzositozu gerçekleşmektedir.
Ekzositozu takiben füzyona girmiş hücrenin
ve SNARE proteinlerinin tekrar eski hallerine gelmeleri
gerekmektedir. SNARE proteinlerin biraraya gelmesi ve
tekrar ayrılması ATP’ye bağımlı olarak gerçekleşir. Füzyonda
SNARE kompleks oluşumu enerjinin açığa çıkmasına
neden olmaktadır. Ancak SNARE kompleksin tekrar
eski haline gelmesi için enerjiye ihtiyaç vardır. Hücre
içinde kalsiyum konsantrasyonunun artması sitozolik
proteinler olan α ve γ-SNAP’ın [çözünür N-ethylmaleimide
sensitive fusion protein (NSF) bağlayan proteinler]
SNARE kompleksine bağlanmasına ve NSF’nin aktive
olmasına yol açar. NSF tarafından hidrolize edilen
ATP, SNARE kompleksin bozulmasına yol açarak SNARE
proteinlerin eski haline dönmesini sağlar [1].
SNARE proteinler ve mikroorganizmalarla ilişkisi
Günümüz bilgileri ışığında, birçok mikroorganizmanın
konakta canlılığını sürdürebilmesi ve infeksiyon
oluşturabilmesi için SNARE proteinlerine ihtiyaç duyduğu
bilinmektedir. SNARE protein ve mikroorganizma
ilişkisi söz konusu olduğunda öncelikli olarak Clostridium
cinsi bakteriler akla gelmektedir. Clostridium cinsi
içinde yer alan Clostridium botulinum ve Clostridium tetani
konakta salgıladıkları toksinler ile infeksiyona yol
açar. Bu toksinlerin işlev görmesi ise SNARE proteinlerine
bağlıdır. C. botulinum tarafından üretilen botulinum
toksini (BoNT), gerek hayvanlarda gerekse insanlarda
gevşek paralizlerle seyreden hayatı tehdit edici nörolojik
hastalığa neden olur. Botulinum toksinleri A, B, C1,
D, E, F ve G olmak üzere yedi serotipten oluşmaktadır
[22,23].
Sinir kas kavşağında asetilkolin salınımı meydana
gelmektedir. Bu nedenle sinaptik veziküller devamlı
oluşmakta, asetilkolin ile dolmakta, füzyona girerek
asetilkolin salınımını gerçekleştirmekte ve tekrar döngüye
katılmaktadır. Botulinum nörotoksini, periferal
kolinerjik terminallere tutunarak içeri girer ve asetilkolin
salınımını bloke ederek yumuşak paralizlere neden
olur. Eğer paraliz solunum kaslarına kadar ilerlerse solunum
yetmezliğinden hasta kaybedilir. Ancak dışarıdan
solunumun desteklenmesiyle veya hafif olgularda hastalık
geri dönüşümlüdür. C. tetani tarafından üretilen
tetanoz toksini (TeNT) ise tek bir serotip içerir. Tetanoz
toksini motor nöron terminale bağlanır ve retrograt
yolla akson boyunca ilerleyerek spinal korda ulaşır. Spinal
kordda periferal motor nöronların dendritlerinden
inhibitör nöronlara geçer. Burada inhibitör sinir ileticilerinden
olan glisin ve γ-aminobütirik asit (GABA) salınımını
bloke ederek spastik paralizlere neden olur. Tetanoz
toksini ile meydana gelen hastalık çoğu zaman
fatal seyirli olup, ölüm solunum ya da kalp yetmezliği
sonucu gelişir. Tetanoz ve botulinum toksinlerinin birbiriyle
tam ters etki göstermelerine rağmen, nörotoksinler
aynı nöronal fonksiyonu inhibe ederler; diğer bir
deyişle nöroekzositoz inhibe olur [24-26].
136
H ACETTEPE T IP D ERG‹S‹

SNARE proteinler ve mikroorganizma iliflkisi
Clostridium toksinlerinin yapısı
Clostridium toksinleri (CNT) 150 kDa ağırlığında tek
bir polipeptid zinciri şeklinde sentez edilir. Bu zincir daha
sonra bakteriyel ve doku proteazları tarafından 50
kDa’luk hafif zincire (LC) ve 100 kDa’luk ağır zincire
(HC) ayrılır. Proteazlar ile kırılma sonrasında oluşan iki
zincir birbirine disülfid bağlarıyla kovalent bağlı kalır.
Bu bağlanma geri dönüşümlüdür ve toksin nöronal sitozole
geçtiğinde birbirinden ayrılır. Toksinin ağır zincir
(HC) bölgesi nöronlarda hücre yüzeyine bağlanarak
hafif zincir (LC) parçasının sitozole girişine neden olur
[27,28]. Metalloproteaz aktivitesine sahip olan bu toksinlerin
aminoasit sekansları düşük homoloji göstermekle
beraber her iki toksinin hafif zincirinde çinkoendopeptidazların
katalitik bölgesinde yer alan ortak
bir motif (His-Glu-x-x-His) bulunmaktadır. Çinko, nörotoksinlerin
hücre içi aktivitesi için gereklidir. Toksin
motifinde bulunan histidin çinko atomuna bağlanır.
Glu234 ise su molekülünün polorizasyonunu gerçekleştirmektedir
[29].
Toksinin sinir hücrelerinde etki göstermesi; membrana
bağlanma, internalizasyon ve proteoliz aktivitesi
basamaklarını içermektedir. Sinir hücre membranlarında
bol miktarda bulunan glinkospingolipid sınıfında
yer alan kompleks gangliyosidler CNT’lerin bilinen reseptörleridir
[30]. Polisialogangliyosidlerin oligosakkarid
kısmı, toksinin ilk bağlanmasında görevlidir. Bu oligosakkaridler
birer anten görevi görerek intersinaptik
sıvıda bulunan toksin molekülünü yakalar. Toksinlerde
bulunan HC bölgesi bu özgül bağlanmadan sorumludur.
Daha sonra her bir toksin kendisi için özgül olan
diğer bir reseptöre bağlanır. Bu çift reseptöre bağlanma,
toksinin bağlanma afinitesi ve özgüllüğünü belirler. Bu
özgül bağlanma TeNT ve BoNT için bundan sonraki hedefin
belirlenmesinde önem taşır. TeNT’nin bağlandığı
özgül reseptörler, toksini vezikül içinde retrograt yolla
motor nöronlara taşırken, BoNT synaptotagmin gibi
transmembran sinaptik vezikül proteinlerine bağlanarak
periferal sinir ucuna doğru ilerler. Toksin endositik
vakuol içinde hücre içine alındıktan sonra etkisini gösterebilmesi
için hafif zincirin sitoplazmaya ulaşması gerekmektedir.
Vezikül içindeki asidik pH nedeniyle toksinde
bulunan translokasyon bölgesi vezikül membranının
hidrofobik yapısına ekspoze olmak amacıyla konformasyonel
değişime uğrar ve bir iyon kanalı oluşturarak
LC’nin sitozole geçişini sağlar. Sitoplazmada toksinin
hafif zincir kısmının ayrılmasıyla hedef SNARE proteinlerin
proteolizi gerçekleşir [31]. Botulinum ve tetanoz
toksinleri nöronal SNARE proteinlerde özgül peptid
bağlarını kırar. BoNT/A ve BoNT/E özgül olarak
SNAP-25, B, D, F ve G serotipleri, tetanoz toksini ise
synaptobrevin üzerine etkilidir. BoNT/C1 ise syntaxin
ve SNAP-25 olmak üzere iki SNARE proteinini substrat
olarak kullanır. Görüldüğü gibi bazı botulinum toksinleri
ile tetanoz toksini aynı protein üzerine etki göstermektedir.
Etki mekanizması aynı iken tetanoz ve botulinum
toksinlerinin etkilerinin farklı olmasının nedeni
etki ettikleri hücrelerin farklı olmasından kaynaklanmaktadır
[32,33].
Toksinlerdeki hafif zincirin aktif bölgeleri son derece
benzer olmasına karşın, LC’nin SNARE proteinleri
kırma bölgeleri seçicilik gösterir. Örneğin; BoNT/A
SNAP-25’te Gln197-Arg198 aminoasitler arasındaki bağı
keserken, BoNT/C1 bir aminoasit sonra bulunan
Arg198-Ala199 arasını keser. Bu seçiciliğin nedeni ne
olabilir? SNARE protein toksinin etrafını sararak enzimle
substratı arasındaki etkileşimin aktif bölge etkileşimiyle
sınırlı kalmamasını sağlamaktadır. Ayrıca, SNAP-
25’in N-terminalinin alfa heliks yapısı ve C-terminalinin
beta-sheet yapısı etkin substrat bağlanma ve kırılma
bölgelerinin oluşmasına neden olmaktadır. Toksin
tarafından kullanılan bu alışılmadık substrat enzim etkileşimi
enzimin konformasyonel olarak kendini düzenleyerek
SNARE proteinindeki hedef bölgeyi kesmesini
sağlar [34].
Enzim seçiciliğinin diğer bir nedeni de hedef proteinde
yüksek düzeyde korunmuş olan motiflerin bulunmasına
bağlıdır. VAMP’da V1 ve V2 olmak üzere iki motif,
SNAP-25’te S1’den S4’e kadar dört motif, syntaxin’de
ise X1 ve X2 olmak üzere iki motif bulunmaktadır
[35].
Botulinum toksinlerinde, toksinin aktivitesini gösterdiği
aktivasyon bölgesi (AS) ve SNARE proteinlerine
bağlanmadan sorumlu B bölgesi bulunmaktadır. Botulinum
toksin serotip A ve serotip E, etkilerini aynı SNARE
protein üzerinde göstermektedir. Diğer çinko proteazların
aksine BoNT SNAP-25’te geniş bir bölgeyi substrat
olarak tanıyabilir. Toksinin AS bölgesinde bulunan, P1,
P2, P3, P4 ve P5 rezidüleri SNAP-25 için kesim bölgelerini
oluşturur. Botulinum toksin serotip A, SNAP-25’in
156-202. aminoasitleri arasındaki dokuz aminoasitten
oluşan bölgeyi keser. Kesim sonrasında SNAP-25’ten kopan
dokuz aminoasitten oluşmuş C-terminal bölgesi
toksinden uzaklaştırılır ve toksin yeni hedefine yönelir.
Botulinum toksin serotip A ile kırılmış SNAP-25’in N-
terminali syntaxin ile heterodimer oluşturabilir ancak
oluşan bu heterodimer fonksiyonel değildir [36,37]. Botulinum
toksin serotip E ise SNAP-25’in C-terminal bölgesinde
26 aminoasitlik bir bölgeyi keserek SNAP-
25’ten ayırır [38].
Botulinum A toksini ile intoksikasyonun iyileşme
süreci 3-12 ay arasında değişirken, bu süreç E toksini ile
Cilt 42 • Say› 3 • 2011
137

Çakar ve Özkuyumcu
intoksikasyonda yaklaşık bir aydır. İyileşme süreçleri
arasındaki bu farkın nedenine yönelik çeşitli yaklaşımlar
bulunmakla birlikte, iki yaklaşım ön plana çıkmaktadır.
BoNT/A ve BoNT/E ile meydana gelen ekzositoz
inhibisyon sürelerinin farklı olmasının nedenlerinden
biri toksinin hücre içindeki lokalizasyonu ile ilgili olabilir.
Botulinum A ve E toksinleri nöronal hücrelerde
farklı bölgelerde bulunur. En uzun etki süresine sahip
olan A toksininin LC’si plazma membranında, daha az
süre etki gösteren E toksininin LC’si ise sitoplazmada
lokalizedir. Olası bir açıklama; BoNT/A toksinin LC’sinin
hücre içindeki lokalizasyonunun plazma membranında
olması, nöronal hücrelerde var olan normal degredatif
yolaktan kaçabilmesine neden olur [39]. Ancak
bu farklılığın daha önemli bir nedeni bulunmaktadır.
Botulinum A toksini tarafından kesilen SNAP-25, syntaxin
ile heterodimer oluşturabildiği gibi SNARE kompleks
oluşumunu da engellemez. Ancak oluşan bu kompleks
fonksiyonel değildir. Ayrıca, hasarlı SNAP-25’in
kompleks içinde olması hücre temizleme mekanizmaları
tarafından ortamdan uzaklaştırılmasına engel olmaktadır.
Diğer taraftan E toksini ile kesilen 26 aminoasitlik
bölge nedeniyle hasara uğramış SNAP-25 syntaxin
ile heterodimer oluşturamadığı gibi SNARE kompleks
formasyonunda da yer alamaz. Savunmasız kalan hasarlı
SNAP-25 hücrenin temizleme mekanizmalarıyla
bölgeden uzaklaştırılır ve yerine yeni sentezlenen
SNAP-25 gelir. BoNT/A ve BoNT/E intoksikasyonu sonucunda
iyileşme sürelerindeki farklılığın en önemli
nedeni olarak bu mekanizma düşünülmektedir [40-42].
SNARE proteinler ve
diğer mikroorganizma etkileşimleri
SNARE proteinler ile mikroorganizma ilişkisi üzerine
yapılan çalışmaların büyük bir çoğunluğu Clostridium
toksinleri ile ilgili olmakla birlikte son yıllarda diğer
mikroorganizmalar ile SNARE protein arasındaki etkileşimi
araştıran çalışmalar yayınlanmaya başlamıştır.
SNARE proteinler ile mikroorganizma ilişkisi incelendiği
zaman doğal olarak hücre içi yerleşim gösteren
mikroorganizmalar akla gelmektedir. Hücre içi patojen
mikroorganizmalar infekte ettikleri konak hücresinde
mevcudiyetlerini sürdürebilmek için hücrenin degredatif
enzimlerinden korunmak zorunda olduğu gibi bir taraftan
da çoğalmak ve hücre içinde yaşamlarını sürdürebilmek
için konak hücrenin bazı kompartımanlarıyla
füzyona girerek kendileri için gerekli olan madde alışverişini
yapmak zorundadır. Bu amaçla hücre içi patojenlerde
bazı ökaryotik hücre kompartımanlarıyla füzyonu
engelleyecek, bazılarıyla ise füzyona girebilecek
SNARE benzeri proteinlerin bulunduğu saptanmıştır.
Ökaryotik hücrelerde zorunlu hücre içi patojenlerinden
biri olan Chlamydia, plazma membranının invajinasyonu
sonucunda oluşan inklüzyon içinde üremesine
devam ederken bazı konak hücre kompartımanlarıyla
füzyonu gerçekleştirken, bazılarıyla ise füzyonu engelleyerek
kendini konak hücrenin degredatif fonksiyonundan
korur. İnklüzyon membranında Chlamydia’nın sentez
ettiği IncA proteini bulunmaktadır. Vakuoler membran
proteini olan IncA proteinleri SNARE proteinler ile
etkileşime girmek için önemli bir aday olarak karşımıza
çıkmaktadır. IncA proteini Chlamydia’nın farklı türleri
arasında düşük benzerliğe sahiptir. Ancak bu düşük benzerliğin
aksine tüm IncA proteinlerinde SNARE proteinlerinde
olduğu gibi tekrarlayan ve yüksek düzeyde korunmuş
bir motif bulunmaktadır. Bu motifin merkezinde
glutamin aminoasidi yer almaktadır. Bu nedenle IncA
proteini bir tür Q-SNARE olarak değerlendirilebilir ve
veziküler membranda bulunan R-SNARE proteini ile
kompleks oluşturduğu düşünülmektedir [43]. IncA proteininin
N-terminal bölgesinde bulunan SNARE benzeri
motif Chlamydia’nın içinde bulunduğu inklüzyon cisimciğinin
endozomal ve lizozomal kompartımanlarla
füzyonunu engeller [44]. Diğer taraftan Chlamydia hücre
içinde gelişebilmek ve üreyebilmek için ekstra lipide
ihtiyaç duymaktadır. Lipid kaynaklarından biri golgi cisimciğinde
sentezlenen spingomiyelin, diğeri de kolesteroldür.
IncA proteini oluşturduğu trimer ile golgi cisimciğinde
bulunan ve R-SNARE özelliğine sahip VAMP
3 veya 7 ile kompleks oluşturarak füzyona girer ve sentezlenen
spingomiyelinin ve kolesterolün inklüzyona
geçmesine neden olur [45].
Benzer mekanizmaları kullanarak infekte ettiği konak
hücresinde üremeye devam ederken, konak hücrenin
degredatif enzimlerinden korunabilen diğer bir
hücre içi patojen Legionella’dır. Chlamydia ile benzer şekilde
Legionella pneumophila vakuolleri de lizozomal
füzyondan kaçarken mitokondri ve endoplazmik retikulum
gibi hücrenin diğer kompartımanlarıyla füzyona
girebilir. L. pneumophila’da tanımlanmış pek çok SNARE
benzeri protein bulunmaktadır. Bu proteinlerden “Legionella
ökaryotik gen benzeri (Leg)” ailesinden LegC7,
LegC2 ve LegC3 proteinleri Dot/Icm sekresyon sistemiyle
bakterinin sitozolünden bakterinin içinde bulunduğu
vakuol yüzeyine taşınır. Bu proteinler SNARE proteinler
gibi kompleks oluşturabilmekte ve Legionella’nın
içinde bulunduğu vakuolün endolizozomal füzyonuna
engel olmaktadır [46].
SNARE proteinleriyle etkileşim sadece bakterilere ait
bir özellik değildir. Bugünkü bilgilerimiz ışığında bazı
virüslerin de SNARE proteinler ile ilişkide oldukları ya
da konak hücre membranı ile füzyona girebilmek için
SNARE proteinleri taklit ettikleri bilinmektedir.
138
H ACETTEPE T IP D ERG‹S‹

SNARE proteinler ve mikroorganizma iliflkisi
Zarflı virüsler konak hücre membranı ile füzyona girerek
viral genomu konak hücreye transfer eder. Zarflı virüslerde
bulunan glikoproteinler konak hücre ile füzyonu
sağlayan peptidlerdir. Bu peptidlerde SNARE proteinlere
benzer şekilde C-terminal bölge virüs membranında
bulunmaktadır. Zarf glikoproteinlerini füzyon peptidleri
olarak kullanan virüsler arasında ortomiksovirüslerden
influenza ve parainfluenza, filovirüslerden ebola ve retrovirüslerden
insan immünyetmezlik virüsü (HIV) sayılabilir.
Bu virüslerde bulunan zarf glikoproteinleri füzyon
öncesi proteolitik kırılmaya uğrar. Bu kırılma sonucu influenza
virüsünde HA1 ve HA2, parainfluenza virüsünde
F2 ve F1, Ebola’da GP1 ve GP2, HIV’da gp120 ve gp41
adı verilen peptidler oluşur. Glikopeptidlerin konak hücre
membranında reseptörlerine tutunmalarını takiben
virüs membranı ve konak hücre membranı birbirine yaklaşır.
Füzyon peptidleri olarak adlandırılan HA2, F1, GP2
ve gp41 proteinleri füzyon sırasında, tıpkı SNARE proteinler
gibi N-terminal bölgeden başlayarak birbirleri üzerine
kıvrılarak sıkı bir sarmal oluşturarak konak hücre
membranında bulunan reseptörleriyle kompleks bir yapı
oluşturur. Bu kompleks yapı SNARE proteinlerde gördüğümüz
gibi membrana paralel uzanmaktadır. Daha önce
de belirtildiği gibi bu organizasyon füzyon reaksiyonunda
lipid tabakaların birbirine yakınlaşması için önem taşımaktadır
[47,48].
Zarfsız virüslerin hücrede infeksiyon oluşturma yolu;
hücreye bağlanıp endositoz ile hücre içine alındıktan
sonra hedef organele gitmesidir. Virüslerin endositoz
sırasındaki primer amacı viral kapsidin soyulacağı
uygun bir bölgeye gitmek ve kapsid soyulmasını takiben
açığa çıkan viral DNA’nın çekirdeğe ulaşmasıdır.
Son yıllarda virionların endoplazmik retikuluma doğru
hareket ettiği ve soyulmanın burada gerçekleştiği saptanmıştır.
Syntaxin 18, endoplazmik retikulumda bulunan
ve vezikülleri endoplazmik retikuluma ya da endoplazmik
retikulumdan dışarı doğru yönlendiren bir
SNARE proteinidir. Syntaxin 18’in hangi proteinler ile
kompleks oluşturduğu henüz bilinmemektedir. Zarfsız
bir virüs olup, kütanöz ve genital sistemde çeşitli lezyonlara
yol açan papillomavirüslerde L1 ve L2 olmak
üzere iki kapsid proteini bulunmaktadır. Viral infeksiyon
için gerekli olan L2 proteininde 41-44. aminoasitler
arasında korunmuş bir bölge bulunmaktadır. Bu bölgeden
yoksun mutantlar infeksiyon oluşturamadıkları
gibi, papillomavirüs ile gelişen infeksiyonun bu aminoasitlere
karşı geliştirilen antikorlarla nötralize olduğu
belirlenmiştir. Korunmuş olan bu dizi papillomavirüslerin
tüm genotiplerinde bulunmaktadır [49].
Papillomavirüs virionunu endoplazmik retikuluma
yönlendiren minör kapsid proteini olan L2’dir. L2 proteini
ile syntaxin 18 arasındaki etkileşimin virüsün
hücre çekirdeğine taşınmasında rolü olduğu düşünülmektedir.
Elektron mikroskobik görüntüler sonucunda,
minör kapsid proteini olan L2’nin syntaxin 18 ile etkileşime
girerek virüsün endoplazmik retikuluma geçmesini
sağladığı ve virionun endoplazmik veziküle ulaşması
engellendiğinde infeksiyonun gelişmediği saptanmıştır
[50].
Bazı mikroorganizmalarda SNARE benzeri proteinlerin
bulunduğunun ya da etkilerini SNARE proteinler
üzerinde gösterdiklerinin anlaşılması konak-mikroorganizma
etkileşiminin çözümlenmesi konusunda büyük
bir adım teşkil etmektedir. SNARE benzeri proteinler
hakkında bilgi sahibi olmamız patogenez konusunda
karanlıkta kalan kısımların açığa çıkmasına faydalı olacaktır.
Patojenin hayatta kalabilmesi için SNARE benzeri
proteinlere ihtiyaç duyuyor olması bu mikroorganizmaların
eradikasyonunda ortak bir hedef belirlememize
yardımcı olmaktadır. Terapötik ajan geliştirilmesinde
hedef seçilecek SNARE benzeri proteinler, mikroorganizmanın
konak hücre içinde savunmasız kalmasına
neden olarak mikroorganizmayı fagozomal temizlemeye
duyarlı kılabilir. Dolayısıyla SNARE benzeri proteinlerin
ayrıntılı olarak araştırılması terapötik hedef seçiminde
yol gösterici olacaktır.
Kaynaklar
1. Shukla A, Berglund L, Nielsen LP, Nielsen S, Hoffmann HJ.
Regulated exocytosis in immune function: are SNARE-proteins
involved? Respiratory Medicine 2001; 95:773-80.
2. Martens S, McMahon HT. Mechanisms of membrane fusion:
disparate players and common principles. Nature Rev
2008; 9:543-56.
3. Weimer RM, Jorgensen EM. Controversies in synaptic vesicle
exocytosis. J Cell Science 2003; 116:3661-6.
4. Ungar D, Hughson FM. SNARE protein structure and function.
Annu Rev Cell Dev Biol 2003; 19:493-517.
5. Duman JG, Forte JG. What is the role of SNARE proteins in
membrane fusion? Am J Physiol Cell Physiol 2003;
285:237-49.
6. Mayer A. Membrane fusion in eukaryotic cells. Annu Rev
Cell Dev Biol 2002; 18:289-314.
7. Südhof TC, Rothman JE. Membrane fusion: grappling with
SNARE and SM proteins. Science 2009; 323:474-7.
8. Sorensen J. SNARE complexes prepare for membrane fusion.
Trends in Neurosciences 2005; 28:453-5.
9. Jarousse N, Kelly R. Endocytotic mechanisms in synapses.
Cur Opin in Cell Biol 2001; 13:461-9.
10. Montecucco C, Schiavo G, Pantano S. SNARE complexes
and neuroexocytosis: how many, how close? Trends in Biochemical
Sciences 2005; 30:367-72.
11. Zhang F, Chen Y, Su Z, Shin YK. SNARE assembly and
membrane fusion, a kinetic analysis. J Biol Chem 2004;
279:38668-72.
12. Rizzoli S, Jahn R. Kiss-and-run, collapse and “readily retrievable”
vesicles. Traffic 2007; 8:1137-44.
Cilt 42 • Say› 3 • 2011
139

Çakar ve Özkuyumcu
13. Verhage M, Toonen R. Regulated exocytosis: merging ideas
on fusing membranes. Curr Opin Cell Biol 2007; 19:402-8.
14. Giraudo CG, Garcia-Diaz A, Eng WS, Chen Y, Hendrickson
WA. Alternative Zippering as an on-off switch for SNAREmediated
fusion. Science 2009; 323:512-6.
15. Rickman C, Davletov B. Mechanism of calcium-independent
synaptotagmin binding to target SNAREs. J Biol Chem
2003; 278:5501-4.
16. Burgoyne R, Barclay JW, Ciufo L, Graham M, Handley M,
Morgan A. The functions of Munc18-1 in regulated exocytosis.
Ann NY Acad Sci 2009; 1152:76-86.
17. Hay J. SNARE complex structure and function. Exp Cell Res
2001; 271:10-21.
18. Sun W, Yan Q, Vida T, Bean AJ. Hrs regulates early endosome
fusion by inhibiting formation of an endosomal SNARE
complex. J Cell Biol 2003; 162:125-37.
19. Ludger J, Galli T. Exocytosis: SNAREs drum up. Eur J Neurosci
1998; 10:415-22.
20. Cai H, Reim K, Varoqueaux F, Tapechum S, Hill K, Sorensen
JB, et al. Complexin II plays a positive role in Ca2+-triggered
exocytosis by facilitating vesicle priming. PNAS 2008;
105:19538-43.
21. Maximov A, Tang J, Yang X, Pang Z, Südhof TC. Complexin
controls the force transfer from SNARE complexes to
membranes in fusion. Science 2009; 323:516-21.
22. Whelchel D, Brehmer TM, Brooks P, Darragh N, Coffield JA.
Molecular targets of botulinum toxin at the mammalian
neuromuscular junction. Mov Dis 2004; 19:7-16.
23. Rosetto O, Seveso M, Caccin P, Schiavo G, Montecucco C.
Tetanus and botulinum neurotoxins: turning bad guys into
good by research. Toxicon 2001; 39:27-41.
24. Humeau Y, Doussau F, Grant N, Poulain B. How botulinum
and tetanus neurotoxins block neurotransmitter release. Biochimie
2000; 82:427-46.
25. Brunger AT, Jin R, Breidenbach MA. Highly specific interactions
between botulinum neurotoxins and synaptic vesicle
proteins. Cell Mol Life Sci 2008; 65:2296-306.
26. Montecucco C, Rosetto O, Schiavo G. Presynaptic receptor
arrays for clostridial neurotoxins. Trends in Microbiol
2004; 12:442-6.
27. Rossetto O, Rigoni M, Montecucco C. Different mechanism
of blockade of neuroexocytosis by presynaptic neurotoxins.
Toxicology Letters 2004; 149:91-101.
28. Tsukamato K, Kozai Y, Ihara H, Kodha T, Mukamoto M, Tsuji
T, et al. Identification of the receptor-bindingsites in carboxyl-terminal
half of the heavy chain of botulinum neurotoxin
types C and D. Microbial Pathogenesis 2008;
44:484-93.
29. Rigoni M, Caccin P, Johnson E, Montecucco C, Rosetto O.
Site-directed mutagenesis identifies active-site residues of
the light chain of botulinum neurotoxin type A. Biochem
Biophys Res Commun 2001; 288:1231-7.
30. Grumelli C, Verderio C, Pozzi D, Rossetto O, Montecucco
C, Matteoli M. Internalization and mechanism of action of
clostridial toxins in neurons. NeuroToxicology 2005;
26:761-7.
31. Fernandez-Salas E, Ho H, Garay P, Steward LE, Aoki KR. Is
the light chain subcellular localization an important factor
in botulinum toxin duration of action? Mov Disorders
2004; 19:23-34.
32. Baldwin M, Barbieri J. Associstion of botulinum neurotoxin
serotypes A and B with synaptic vesicle protein complexes.
Biochem 2007; 46:3200-10.
33. Foran P, Davletov B, Meunier FA. Getting muscles moving
again after botulinum toxin: novel therapeutic challenges.
Trends Mol Med 2003; 9:291-9.
34. Brunger A, Rummel A. Receptor and sustrate interactions of
clostridial neurotoxins. Toxicon 2009; 1-11.
35. Chen S, Hall C, Barbieri J. Substrate recognition of VAMP-2
by botulinum neurotoxin B and tetanus neurotoxin. J Biol
Chem 2008; 283:21153-9.
36. Bajohrs M, Rickman C, Binz T, Davletov B. A molecular basis
underlying differences in the toxicity of botulinum serotypes
A and E. EMBO reports 2004; 5:1090-5.
37. Foran PG, Mohammed N, Lisk GO, Nagwaney S, Lawrence
GW, Johnson E, et al. Evaluation of the therapeutic usefulness
of botulinum neurotoxin B, C1, E, and F compared
with the long lasting type A. Basis for distinct durations of
inhibition of exocytosis in central neurons. J Biol Chem
2003; 278:1363-71.
38. Chen S, Kim J, Barbieri JT. Mechanism of substrate recognition
by botulinum neurotoxin serotype A. J Biol Chem
2007; 282:9621-7.
39. Chen S, Barbieri JT. Multiple pocket recognition of SNAP 25
by botulinum neurotoxin serotype E. J Biol Chem 2007;
282:25540-7.
40. Bajohrs M, Rickman C, Binz T, Davletov B. A molecular basis
underlying differences in the toxicity of botulinum serotype
A and E. EMBO 2004; 5:1090-95.
41. Chen S, Barbieri JT. Unique substrate recognition by botulinum
neurotoxins serotypes A and E. J Biol Chem 2006;
281:10906-11.
42. Rickman C, Meunier F, Binz T, Davletov B. High affinity interaction
of syntaxin and SNAP-25 on the plasma membrane
is abolished by Botulinum toxin E. J Biol Chem 2004;
279:644-51.
43. Delevoye C, Nilges M, Dautry-Varsat A, Subtil A. Conservation
of the biochemical properties of Inc A from Chlamydia
trachomatis and Chlamydia caviae. J Biol Chem.
2004;279:46896-906.
44. Paumet F, Weselowski J, Garcia-Diaz A, Delevoye C, Aulner
N, Schuman H, et al. Intracellular bacteria encode inhibitory
SNARE-like proteins. Plos One 2009; 4:e7375.
45. Delevoye C, Nilges M, Dehoux P, Paumet F, Perrinet S, Dautry-Varsat
A, et al. SNARE protein mimicry by an intracellular
bacterium. Plos Pathogens 2008; 4:e1000022.
46. de Felipe K, Glover R, Charpentier X, Anderson O, Reyes M,
Pericone C, et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates
interfere with organelle trafficking. Plos Pathogens
2008; 4:e1000117.
47. Söllner TH. Intracellular and viral membrane fusion: a uniting
mechanism. Curr Opin Cell Biol 2004; 16:429-35.
48. Shekel JJ, Wiley DC. Coiled coils in both ıntracellular vesicle
and viral membrane fusion. Cell 1998; 95:871-4.
49. Bossis I, Roden R, Gambhira R, Yang R, Tagaya M, Howley
P, et al. Interaction of tSNARE Syntaxin 18 with the Papillomavirus
minor capsid protein mediates infection. J Virol
2005; 79:6723-31.
50. Laniosz V, Nguyen C, Meneses P. Bovine Papillomavirus
Type 1 infection is mediated by SNARE Syntaxin 18. J Virol
2007; 81:7435-48.
140
H ACETTEPE T IP D ERG‹S‹