streptokok enfeksiyonu ile ilişkili pediatrik otoimmün nöropsikiyatrik ...

• 432 µl Primer Karışımı, 1491 µl D- Karışımı ve 22 µl Taq Polimeraz karştırıldı ve
vortekslendi (çizelge 2).
• DNA içeren 96 kuyucuklu PCR plağına, her kuyucuğa 18 µl olacak şekilde
amplifikasyon karışımı dağıtıldı.
• Plağın ağzı kapatıldı .
• Thermal Cycler cihazında LABType® SSO PCR programı kulanılarak PCR yapıldı
(çizelge 3).
• Program bittikten sonra plak Thermal Cycler cihazından çıkartıldı ve amplifiye
edilmiş DNA örnekleri %2.5 agaroz jelde yürütüldü ve amplifikasyon olup olmadığı
kontrol edildi.
C. Denatürasyon ve Nötralizasyon Aşaması
• Temiz ince duvarlı 96 kuyucuklu PCR plağına her kuyucuğunda 2.5 µl olacak şekilde
denatürasyon tamponu eklendi.
• Amplifikasyonu yapılmış DNA örneklerinden bütün kuyucuklara 5 µl eklendi.
• Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi(20°C*25°C).
• Bu süre zarfında 96 kuyucuğa yetecek şekilde her lokusa özgü olan boncuk ve
melezleme tamponu karışımı hazırlandı (çizelge 4).
• Süre sonunda her kuyucuğa 5 µl nötralizasyon tamponu eklendi.
• Karışımın rengi solgun bir sarı range dönünceye kadar pipetlendi.
• Plak buza yerleştrildi.
D. Hibridizasyon veYıkama Aşaması
• Nötürlenmiş DNA’lara kuyucuk başına 38 µl olacak şekilde önceden hazırlanmış olan
melezleme tampon karışımı eklendi.
• Plağın ağzı kapatıldıktan sonra düşük hızda vortekslendi.
• Plak 15 dakika 60°C’ye ayarlı olan Thermal Cycler’da inkübe edildi.
31