ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...

3. MATERYAL ve METOT Kadir Uğurtan YILMAZ
olarak, 94 0 C’de 2 dk. ön denatürasyon işleminden sonra, 35 döngü boyunca örnekler,
denatürasyon için 94 0 C’de 1 dk., primerin DNA’ya yapışması için 36 0 C’de 1 dk. ve
uzama safhası için 72 0 C’de 2 dk. tutulmuşlardır. Ayrıca, örnekler son uzama safhası
için 72 0 C’de 5 dk. bekletilmişlerdir.
Araştırmada OPERON firmasının 20’şer adet RAPD primerinden oluşan
OPA, OPB, OPC, OPE, OPK, OPL, OPM, OPN, OPO ve OPP serilerinden toplam
160 RAPD primeri ön tarama reaksiyonları için 7 genotipte taranmıştır. Bu tarama
sonucunda en polimorfik seçilen 20 adet primer (OPA01, OPA02, OPA03, OPA04,
OPA07, OPA09, OPB11, OPC02, OPC05, OPC06, OPK14, OPL15, OPL17, OPL18,
OPM02, OPN01, OPN02, OPN08, OPO12 ve OPP10) 96 adet kayısı genotipinin
karakterizasyonunda kullanılmıştır (Çizelge 3.4.). Bu primerlere ait baz dizilimleri
Çizelge 3.4.’te verilmiştir.
3.2.4.5. SSR Analizleri
25 µl amplifikasyon reaksiyonu 75 mM Tris-HCl, pH=8.8, 20 mM
(NH4)2SO4, 2 mM MgCl2, 0.1% Tween 20, 100 µM dATP, 100 µM dTTP, 100 µM
dGTP, 100 µM dCTP, her bir primerden 0.2 µM, 1.0 unite Taq DNA polymerase ve
30 ng DNA içermektedir. Sıcaklık ve döngü koşulları olarak, 94 0 C’de 2 dk. ön
denatürasyon işleminden sonra, 35 döngü boyunca örnekler denatürasyon için
92 0 C’de 45 sn. primerin DNA’ya yapışması için 55 0 C’de 1 dk. ve uzama safhası için
72 0 C’de 2 dk. tutulmuşlardır. Ayrıca örnekler son uzama safhası için 72 0 C’de 5 dk.
bekletilmişlerdir (Hormaza, 2002).
SSR yönteminde Sosinski ve ark. (2000), Cipriani ve ark. (1999),
Testolin ve ark. (2000) ve Downey ve Iezzoni (2000) tarafından geliştirilen 16 adet
primer kullanılmıştır. Bu primerler aynı zamanda Hormaza (2002) tarafından
İspanya, ABD ve Kanada, Fransa, Yunanistan, Macaristan ve Çin orijinli 48 kayısı
genotipinin karakterize edildiği bir çalışmada 37 primer arasından, polimorfik ve
tekrarlanabilir olma özellikleri bakımından seçilmiş ve kullanılmıştır. Bu primerlerin
bir başka özelliği de ürettikleri markörlerin yüksek çözünürlükteki agaroz jelde
belirlenebilir olmasıdır. Araştırmada kullanılacak primerlerin baz dizilimleri Çizelge
3.5.’te verilmiştir.
45