ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...

3. MATERYAL ve METOT Kadir Uğurtan YILMAZ
paylaştırılır ve herbir eppendorf tüp içerisine 0.7 ml CTAB tampon çözeltisi (100
mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, %2 CTAB, %2 PVP, β-
mercaptoethanol, %0.1 Na2S2O5) ilave edilir ve sıcaklığı 65 0 C’de olan su
banyosuna konur. İçerisinde ezilmiş yaprak örnekleri bulunan eppendorf tüpler her
10 dakikada bir karıştırılmak suretiyle 60 dakika boyunca su banyosunda tutulur. Su
banyosundan çıkarılan örnekler oda sıcaklığında 5-10 dk bekletilir. Daha sonra herbir
eppendorf tüp içerisine, ekstraksiyon buffer ile eşit oranda, 0.7 ml kloroform:isoamyl
alkol (24 : 1) ilave edilir. Tüpler her 3 dakikada bir karıştırılarak oda koşullarında 15
dk tutulur. Daha sonra 13.000 rpm’de 15 dk süre ile santrifüj edilir. Üstteki faz yeni
bir eppendorf tübe aktarılır ve içerisine eşit oranda soğuk (-20 0 C’de bekletilmiş)
isopropanol ilave edilir ve tüp yavaşça çevrilerek DNA’nın çökelmesi sağlanır. Daha
iyi bir çökelme sağlamak için örnekler 2 saat –70 0 C’de veya 1 gece –20 0 C’de
bekletilir. Daha sonra tüpler 10.000 rpm’de 10 dk süre ile santrifüj edilerek tüp
içerisindeki isopropanol boşaltılır. Tüpün içerisine, içerisinde 10 mM amonyum
asetat bulunan, 0.5 ml %76’lık etanol yani yıkama tampon çözeltisi ilave edilir ve 1-
2 saat +4 0 C’de bekletilir. Yıkanan DNA kurutularak saf suda çözdürülür. İzole edilen
DNA’nın miktarı, konsantrasyonu belli lambda DNA ile jel-elektroforesis
yöntemiyle UV altında karşılaştırılarak belirlenir. Bu aşamada %0.8’lik agaroz jel
kullanılır.
Elde edilen PCR ürünleri 1xTBE tampon çözeltisinde (89 mM Tris-Cl, 89
mM borik asit, 20 mM EDTA) %1.5’luk agaroz jelde elektroforez edilmiş ve
etidyum bromit ile boyanarak ve UV altında fotoğrafları çekilmiştir.
3.2.4.3. ISSR Analizleri
ISSR analizleri Zietkiewicz ve ark. (1994)’na göre yapılmıştır. 25 µl
amplifikasyon reaksiyonu 75 mM Tris-HCl, pH=8.8, 20 mM (NH4)2SO4 2 mM
MgCl2, 0.1% Tween 20, 100 µM dATP, 100 µM dTTP, 100 µM dGTP, 100 µM
dCTP, 0.2 µM primer, 1.0 unite Taq DNA polymerase ve 10-20 ng DNA
içermektedir. Sıcaklık ve döngü koşulları olarak, 94 0 C’de 2 dk. ön denatürasyon
işleminden sonra, 40 döngü boyunca örnekler denatürasyon için 94 0 C’de 1 dk.,
primerin DNA’ya yapışması için 44-60 0 C 1 dk., ve uzama safhası için 72 0 C’de 2 dk.
42