MEME KANSERLİ HASTALARDA CYP19 GENİ KODON 39 Trp/Arg ...

11- Diğer kuyulara sırayla 1 µl yükleme tamponu (EK 4.3) ile karıştırılmış olan hasta
örneklerine ait 5 µl PCR ürünleri uygulandı.
12- Elektroforez tankının kapağı kapatıldı ve yaklaşık 45 dakika akım uygulandı.
13- Süre sonunda jel tankın içinden alınarak Uvitec görüntüleme cihazının içine
yerleştirildi ve görüntü incelendi (Çizelge 7).
Çizelge 7: Amplifikasyon sonunda beklenen amplikon büyüklükleri
CYP19 C (Arg) alleli 264 bç.
CYP19 T (Trp) alleli 200 bç.
CYP19 Common bant 427 bç.
Amplikonun Büyüklüğü
Primerler için birden fazla tanıma bölgesi olması, DNA’nın saf olmaması yada
hazırlanan PCR karışımındaki çözeltilerden birinde kontaminasyon olması gibi
durumlarda PCR gerçekleşemeyebilir. Bu nedenle bant görülemeyebilir yada çok sayıda
nonspesifik bant gözlenebilir. Agaroz jelde yürütülerek amplifikasyonun istenen
özelliklerde olmadığı tespit edilen ve amplifikasyona göre genotiplendirme yapılamayan
örnekler için sadece common bölge primerleri kullanılarak PCR tekrar edildi ve PCR
ürünleri kesim (RFLP) reaksiyonuna tabi tutularak değerlendirme yapıldı.
3.2.2.4. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) Analizi ile PCR
Ürünlerinin Kesimi ve Görüntülenmesi (EK 5):
PCR amplifikasyonu yapılan ve agaroz jelde görüntülenen toplam 100 örnekten,
20 hastada, net bant görülemediği için genotiplendirme yapılamadı. Bu amplifikasyonlar
için tekrar PCR yapıldı, PCR ürünleri kesim (RFLP) reaksiyonuna tabi tutuldu ve agaroz
jel elektroforezinde yürütülerek jel üzerindeki bantlara göre değerlendirme yapıldı. Enzim
miktarı sınırlı olduğu için sadece bu örneklere kesim işlemi uygulandı.
26