MEME KANSERLİ HASTALARDA CYP19 GENİ KODON 39 Trp/Arg ...

PCR reaksiyonlarının hazırlanmasında sırasıyla aşağıdaki basamaklar izlendi:
- Reaksiyonda kullanılacak DNA’lar ve çözeltiler kullanımdan hemen önce -20 °C’den
alınıp çözdürüldü.
- %70’lik alkolle temizlenmiş laminar flow kabini içinde üzerlerine örnek numarası
yazılarak 200 µl’lik PCR tüpleri hazırlandı.
- Tüm DNA örnekleri ve çözeltiler kısa bir süre vorteks ile karıştırıldı ve santrifüj edildi.
- Daha önceden hesaplanan miktarlarda MgCl2, tampon, dNTP, primerler ve Taq
Polimeraz 200 µl’lik bir PCR tüpüne eklenerek PCR karışımı hazırlandı.
- PCR karışımı kısa bir süre vortekslendi ve santrifüj edildi.
- Buz üzerinde, numaralandırılmış her bir PCR tüpüne, daha önceden hesaplanmış
miktarlarda PCR karışımı, DNA ve bidistile steril su eklendi.
- Tüpler kısa bir süre vortekslendi ve santrifüj edildi.
- Tüpler thermal cycler’a yerleştirildi ve önceden kaydedilmiş program başlatıldı.
- Program tamamlandıktan sonra PCR ürünleri +4 °C’de saklandı.
3.2.2.3. PCR Ürünlerinin Agaroz Jel Elektroforezi (EK 4) ve Yorumlanması:
%2’lik agaroz jel hazırlamak için sırasıyla aşağıdaki işlemler yapıldı:
1- 0,72 gr. agaroz tartıldı, dikkatli bir şekilde erlen içine döküldü.
2- Üzerine 36 ml. 1X TBE tamponu (EK 4.1) eklendi ve mikrodalga fırında yaklaşık 1
dakika tutularak agaroz eritildi.
3- Agaroz eridikten sonra erlen içine, stok EtBr solüsyonundan (EK 4.2) 3 µl eklendi.
4- Erlen el yakmayacak sıcaklığa gelene kadar (50-55°C) bekletildi.
5- Jel kabı ve jel tarakları saf suyla yıkandı, gazlı bezle kurulandı.
6- Jel kabının içine örnek sayısına göre taraklar yerleştirildi ve erlen içindeki jel
karışımı hava kabarcığı oluşturmadan dikkatli bir şekilde jel kabına döküldü.
7- Yaklaşık 30 dakika beklenerek jelin polimerize olması sağlandı.
8- Jel, elektroforez kabına alınarak üzeri örtülene kadar 1X TBE tamponu ilave edildi.
9- Kuyu oluşturması için yerleştirilmiş tarak jel zedelenmeden yavaşça çıkarıldı.
10- İlk kuyuya bant büyüklüklerini karşılaştırmak için 5 µl marker DNA, ikinci kuyuya
kontaminasyon olup olmadığını anlamak amacıyla DNA içermeyen PCR karışımı
eklendi.
25