MEME KANSERLİ HASTALARDA CYP19 GENİ KODON 39 Trp/Arg ...

3.2.2.2. PCR Amplifikasyonu (EK 3):
Örneklerimiz için uygun amplifikasyon koşullarının saptanması çeşitli
denemelerle belirlendi. Her denemede sadece bir değişken dışındakiler sabit tutularak,
optimal amplifikasyon koşulları sağlanana kadar, amplifikasyonda kullanılan tüm
kimyasal malzemelerin farklı konsantrasyonları ve PCR programının farklı ısı döngüleri
denendi ve optimal koşullar sağlanınca 2 ayrı PCR programı uygulandı.
1) Çalıştığımız common bölgenin, T allelinin ve C allelinin primerleri birarada
kullanılarak multiplex PCR (EK 3.1) yapıldı (Çizelge 5).
Çizelge 5: Optimal amplifikasyonun gerçekleştiği PCR reaksiyonu (multipleks PCR).
PCR bileşeni Final Konsantrasyon 25 µl reaksiyon karışımındaki miktar
Primer F1 (100 pmol) 100 pmol 0.25 µl
Primer R1 (100 pmol) 100 pmol 0.25 µl
Primer F2 (100 pmol) 100 pmol 0.25 µl
Primer R2 (100 pmol) 100 pmol 0.25 µl
MgCl2 2 Mm 2 µl
10X PCR Tamponu 1X PCR tamponu 2.5 µl
dNTP 0.2 mM 0.2 µl
Taq Polimeraz 1.25 U 0.25 µl
Genomik DNA 0.25 µg 1 µl
Bidistile su - 18.05 µl
Toplam 25 µl
23