MEME KANSERLİ HASTALARDA CYP19 GENİ KODON 39 Trp/Arg ...

11. Pellet üzerine 100 µl TE tamponu (EK 1.6) eklendi, 65 °C’de 15 dakika
bekletilerek DNA’nın çözünmesi sağlandı.
12. DNA’ların saflığı ve konsantrasyonu spektrofotometrede ölçüldü (EK 2) ve
DNA’lar kısa sürede kullanım için +4°C’ye, uzun sürede kullanım için -20°C’ye
kaldırıldı.
3.2.1.2. İzolasyon Kiti (E.Z.N.A. Blood DNA Isolation Kit) ile DNA Eldesi
DNA izolasyon kitinin, doymuş tuz çözeltisiyle çöktürme yöntemine göre
avantajı daha az miktarda kan kullanılarak çok daha kısa sürede DNA’nın izole
edilmesidir. Kit özel olarak formüle edilmiş tampon sistemi ile DNA’ların spin-kolona
tutunmasını sağlamaktadır. DNA’lar kolona tutunurken, hemoglobin, hücresel artıklar
ve diğer proteinler yıkama solüsyonu ile uzaklaştırılmaktadır.
1. Elüsyon tamponundan örnek başına 220 µl olacak şekilde bir tüp içine alındı ve 70
°C’de, kullanılıncaya kadar bekletildi.
2. 1.5 ml’lik steril tüpe 250 µl kan, 250 µl BL tamponu, 20 µl proteaz enzimi eklendi.
10-15 saniye vortekslendi. 45 °C’de 20 dakika bekletildi. (Kan miktarı az ise
elüsyon tamponu ile 250 µl’ye tamamlanabilir. )
3. Tüplere 260 µl saf etanol ilave edildi, 10 –15 saniye vortekslendi.
4. Tüp içeriği 2ml’lik santrifüj tüpüne yerleştirilmiş spin kolona aktarıldı. 10000
rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
5. Kolon yeni bir santrifüj tüpüne yerleştirildi, üzerine 500 µl HB tamponu ilave
edildi. 10000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
6. Tüp içindeki sıvı döküldü, kolon üzerine 650 µl yıkama tamponu ilave edildi.
10000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
7. Alttaki tüpler atıldı, kolon yeni bir santrifüj tüpüne yerleştirildi, tekrar 650 µl
yıkama tamponu eklendi. 10000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
8. Kolon 1.5 ml’lik tüpe yerleştirildi, üzerine 100 µl elüsyon tamponu eklendi. 10000
rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
9. Tüpler değiştirilmeden tekrar 100 µl elüsyon tamponu eklendi, 10000 rpm’de 1
dakika santrifüj edildi.
10. Kolonlar atıldı, tüp içinde kullanıma hazır DNA solüsyonu kaldı.
20