Bakteriler

In vitro (Laboratuvarda ve steril şartlarda) doku kültüründe en kritik nokta, sterilizasyon
işlemleridir. Haçırlanan besin ortamları, bitki dokuları için olduğu kadar mikroorganizmalar için
de besleyici ve gelişmeyi sağlayıcı niteliktedir. Nefes aldığımız havada bulunan
mikroorganizmalalar, besin ortamlarında gelişip çoğalarak, bitki dokusu ile rekabete geçerler,
normalde patojen olmayan bu canlılar in vitro koşullarda eksplantın ölümüne yol açabilirler.
Bakteriler en yaygın kontaminasyon kaynağıdırlar.
En çok rastlanılanlar; Agrobacteriım, Bacillus, Lactobacillus, Pseudomanas,
Stapbyllococcus, Enterobacter ve Xanthomonas türlerine ait bakterileridir.
Bu tür mikroorganizmalar çoğulukla bitki materyalleriyle gelirler ve iyi yüzey
sterilizasyonu yapılmadığı müddetçe problem olurlar.
Bacillus spp.
KONTAMİNASYON KAYNAKLARI
Pseudomonas
spp.
Staphylococcus spp. Lactobacillus spp. Enterobacter spp.

Besin Ortamı İçinde ve Yüzeyinde Gelişerek
Yayılmış Bakteri Enfeksiyonu
Bakteriler, besin ortamının üzerinde veya içinde beyaz, krem,
pembe veya sarı renkte genellikle şeffaf koloniler halinde ortaya
çıkarlar.

Penicillium spp.
Botrytis spp.
Alternaira spp.
Funguslar, en az bakteriler kadar yaygın kontaminasyon kaynağıdır.
Eksplantla birlikte besin ortamına gelerek bulaşmaya neden
olabileceği gibi, kültür sonrasında alt kültürlere alma aşamasında
hava kaynaklı olarak bulaşabililirler veya akarlar (mite) tarafından
ortama taşınabilirler.
Değişik renkte ve lifli görünümde olup genellikle besin ortamının ve
kültürlerin üzerini ağ gibi sararlar.

Virüsler ve mikroplazma türü organizmalar kolaylıkla tespit edilemezler.
Bu nedenle en tehlikeli olanlarıdır. Çünkü tespit edilemeden kültürden
kültüre geçebilirler ve çok uzun süreli bir çalışma boşa gidebilir.
Akut bakteriyel veya fungal kontaminantlar kültürden birkaç gün sonra
çıkabilir. Bu nedenle sterilizasyon işlemi bütün laboratuvar düzeyinde ele
alınmalıdır.
Sterilizasyon, sterilize edilecek yer ve materyale göre 3 kısımda
değerlendirilebilir:
1) Çalışma alanının sterilizasyonu,
2) Kullanılacak alet, ekipman, kapların ve besin ortamlarının sterilizasyonu,
(ısı ile bozulabilenler, ısı ile bozulmayanlar)
3) Bitki materyalinin sterilizasyonu.

Asepsinin sağlanması gereken tüm
işlemler, steril hava sirkülasyonu bulunan
laminar akışlı kabinlerde yapılır. HEPA
filtre sisteminden geçirilen ortam havası,
yukarıdan aşağıya (vertikal) veya karşıdan
yatay biçimde (horizontal) çalışma alanına
verilir.
Tek kişilik veya iki kişinin çalışabileceği
büyüklükte kabinler bulunmaktadır.

Steril çalışma alanında kullanılacak yüzeyler (steril kabın içi) kullanımdan en az 10-15 dk önce
%10’luk ticari sodyum hipoklorit solüsyonu ( %5 NaOCl içeren ) veya %70’lik alkolle silinir.
Klorun insan sağlığı açısından olumsuz etkisinden kaçınmak için bu tür işlemlerde alkol kullanımı
tercih edilir, fakat bu amaçla kullanılan etil alkolün %70’likten daha yüksek konsantrasyonda
olmamasına dikkat edilmelidir. Aksi taktirde yanıcı özelliği nedeniyle hayati risk taşıyabilir.
Eğer kabin içinde bir UV lambası varsa, çalışma öncesinde açılabilir. Çalışmaya başlama anında
UV lambası kapatılmalıdır. Burada dikkat edilmesi gerekli husus, çalışma anında hiçbir şekilde
UV lambasının açık vaziyette bulunmaması gerektiğidir. Cilt yanıkları ve özellikle göz dokularının
ciddi derecede zarar görmesi gibi bir risk bulunmaktadır.
UV lambası açık olduğu sırada, kabin içinde hiçbir iş yapılmaz ve canlı bitki materyali
bulundurulmaz.

Kullanılacak aletler ( bisturi, pens vb. ) kullanımdan önce etil alkol içine batırıldıktan sonra alevden
geçirilerek, alevle yüzey sterilizasyonuna tabi tutulur.
Bu durumda çok dikkatli olmak gerekir. Kızgın durumdaki
aletler asla alkole batırılmamalıdır.
Bistüri uçları, kullanım nedeniyle aşındıkça değiştrilmelidir.

Alkol ve alevin bir arada
bulunması nedeniyle dikkatli
çalışmak gereklidir. Eğer bu
durum rahatsız edici
bulunuyorsa, elektrikli ve
kullanılan aletlerin yüksek
sıcaklıkta birkaç saniye
tutulmasıyla sterilizasyonu
sağlayan cihazlardan da
yararlanılabilir.

Eksplantların kesiminin Petri kutuları içinde yapılması sağlıklı sonuçlar
vermeyebilir.
Bu iş için alüminyum folyo içine sarılarak otoklav edilmiş 10x10, 15x15
cm ebadındaki filtre kağıtlarının kullanılması daha sağlıklı sonuç
verebilir. Ayrıca bu amaçla steril edilen fayanslar kullanılabilir. Fayanslar
kabin içinde, yüzeyine dokunulmadan açılır ve aleve tutularak sterilize
edilen aletlerle üzerine konulan eksplantlar kesilerek kültüre alınırlar.
Geriye kalan parçalar tekrar folyo içine sarılarak uzaklaştırılır ve
otoklavdan sonra fayanslar yıkanarak ve otoklavlanarak tekrar kullanılır.
Fayanslar her bakımdan temizdir, sert bir destek verir ve daha az
maliyetlidir.

Besin ortamları,
1) Otoklav ve buhar (sıcak hava ) sterilizasyonu
2) Filtre sterilizasyonu
3) Mikrodalga sterilizasyonu ile mikroorganizmalardan arındırılabilir.
Otoklavlama, besin ortamları ve diğer tüm kullanılan malzemelerin
sterilizasyonunda kullanılabilen, doku kültüründe başrol oynayan işlemler
arasındadır.

Besin ortamlarının sterilizasyonu için standart bir işlem olarak otoklavda 15
dk boyunca 105 kPa basınçta 121 o C’de tutulması gerekmektedir. Bununla
birlikte bu değerler sabit bir hacim için yeterli olup değişik hacimlerdeki
ortamların sterilizasyon süreleri Tablo 1’de verilmiştir.

300 ml’den daha fazla besin ortamı içeren şişelerin kapakları
gevşek tutulmalıdır. Otoklav sonrası kapaklar hemen
sıkıştırılmalıdır.
Bütün ortamlar otoklav edildikten sonra 1-2 saat steril kabin
içinde bekletilmeli ve soğutulduktan sonra ( kap içinde
yoğunlaşma önlenir ) kullanılıncaya kadar ağızları streç filmle
kapatılarak kapalı dolaplarda saklanmalıdır.

Sterilize edilecek tüm ekipmanlar otoklav veya sıcak hava fırınında ( etüv )
sterilize edilebilirler.
Aletler ve boş kaplar ise otoklava dayanıklı poşetler içine konulduktan ve
ağızları kapatılıp, otoklav bandı ile yapıştırıldıktan sonra sterilize edilirler.
Özel otoklav bantları sterilizasyon sonrası renk değiştirirler.
Bu, içerisinde bulunan kapların veya ortamın sterilize edilip edilmediğinin en
iyi göstergesidir.

Polystyrene yapısındaki malzemeler steril
durumda satın alınır ve tek kullanımlık olarak
kullanılır, otoklavlanmaz

Hemen bozulabilen maddeleri ( hormonlar, vitaminler vb. ) içermeyen ve
buzdolabında saklanan ortamlar en geç 1-2 ay içerisinde, diğerleri ise
duruma göre en kısa zamanda kullanılmalıdır.
Sterilitenin hala korunduğundan emin olmanın en pratik yolu, ortam
kullanılacağı zaman kapak gevşetilirken basınçlı hava çıkışının
hissedilmesiyle olur.
Kapların ağızları mutlaka kullanılmadan önce aleve tutulmalıdır.

Erlenler, pipetler ( cam ) ve diğer kuru materyaller ağızları alüminyum folyo ile
kapatılarak veya uygun metal taşıyıcılar içine konularak bir sıcak hava
fırınında 1-4 saat süreyle 200oC’de tutularak sterilize edilebilirler.
Normal plastik malzemeler kesinlikle otoklavda veya fırında sterilize
edilmezler.

Belirli ortam bileşenlerinin yapıları, yüksek sıcaklıklara karşı duyarlıdır.
Bu tip maddeler, besin ortamına otoklavlama işleminden sonra ilave
edilmelidir.
Bu maddeleri çözündükten sonra 0.22μm delik çapına sahip filtreden
geçirmek gerekir. Hindistan cevizi sütü, otoklavlama yerine filtre yardımıyla
sterilize edilebilmektedir. Bunun için, önce 0.45μm por büyüklüğüne sahip
filtreler kullanılabilir, bundan sonra 0.22μm por çapındaki filtreler ile
sterilizasyon işlemi tamamlanır.

Doku kültüründe kullanılacak malzemelerin ve besin ortamlarının
sterilizasyonunda yoğun olarak kullanılan otoklav ve filtre sterilizasyonuna
alternatif bir diğer yöntemde mikrodalga sterilizasyonudur.
Çünkü özellikle filtre sterilizasyonu pahalı ve az miktarda ortam için uygun
olmakta, otoklav ile sterilizasyon ise uzun zaman almakta ve sterilize edilecek
malzemelere zarar verebilmektedir.
Tisserat ve ark. (1992), 700 W gücünde bir ev mikrodalga fırınını kullanarak % 3
sakkaroz içeren 100 ml besin ortamının 5 dk’da, 250 ml ortamın 10 dk’da ve 1
litre ortamın da 15 dk’da başarıyla sterilize edilebileceğini bildirmişlerdir.

Çalışan kişinin de kılık kıyafet ve temizlik bakımından bazı hususlara dikkat etmesi
gereklidir. Örneğin laboratuvarda çalışmak için önlük benzeri özel bir giysinin
giyilmesi, uzun saçların toplanması, gerekirse ince dokulu bir bone takılması, ellerin
temiz, tırnakların kısa olması, takı bulundurulmaması gerekmektedir. Eller çalışma
sırasında %70’lik alkolle sık sık dezenfekte edimeli, bunun için içinde yumuşatıcı
kremler bulunan özel alkoller de kullanılabilmektedir.

Doku kültüründe en uygun eksplant kaynağını, daha önceden sterilize edilmiş
tohumlardan elde edilen aseptik fideler oluşturur.
Çünkü bu şekilde elde edilen fidelerin sterilizasyona ihtiyacı
olmamakta ve yüzey sterilizasyonu işleminin zararlı etkilerinden
sakınılmaktadır.
Eğer böyle bir şans yoksa, dış şartlardan ( tarla, sera vb. ) alınan eksplantlar
( yumru, yaprak, gövde, sürgün ucu vb. ) öncelikle musluk suyu altında en az
yarım saat tutulurlar.

Tohum ve yumru gibi daha kaba parçalar 1-20 sn alkol içinde
tutulduktan sonra gerçek yüzey sterilizasyonu ortamına konulur.
Yüzey sterilizasyonu doku kültürü işlemleri arasında en önemli
aşamalardan biridir.
Yüzey sterilizasyonu için en fazla kullanılan maddeler etil alkol,
sodyum veya kalsiyum hipoklorit, civa klorür, gümüş nitrat ve hidrojen
peroksittir.
Bütün bu işlemler sırasında materyalin mikroorganizmalarca
kirlenmemesi için çaba sarf edilmelidir.

Bunun için şu konulara dikkat edilmelidir:
• Saçlar arkaya bağlanır.
Elbise kolları arkaya sıvanır ve saat mücevher gibi takılar çıkartılır.
Başlamadan önce eller iyice yıkanır, deri dezenfektanı ve koruyucusu ile
muamele edilir.
İstenilirse şeffaf eldivenler de takılabilir,
• Kabin içi alkolle (en az %70’lik) spreylenir ve steril bir bez ile silinir,
• Kullanılacak bütün malzemeler kabin içine veya yakın bir yere toplanır,

• Sterilize edilmiş kaptan yine steril olan bir pensle (kesinlikle el değmeden)
kullanılacak bitki gövdesinden bir parça alınır.
Her iki işlem arası bu aletler alkole batırılır ve alev ile tekrar sterilize edilir. 2-3 cm
uzunluğunda ve en az bir yaprağı bulunan parçalar kesilir ve gövde alt kısmı agarbesin
ortamına batırılarak kültüre alınır.
Eğer yapraklar çok geniş ve büyükse tamamen uzaklaştırılır veya bir kısmı kesilir.
Her kavanoza bir tane parça konulmalıdır çünkü bu işlem enfeksiyon çıkma
açısından önemlidir ve temiz kültür başarısını artırır.
Daha sonra kültür kabının kapatılır ve kültür odasında gelişme için inkübe edilir.

Eğer kültürlerde herhangi bir
bulaşma olduğu görülürse,
bunların kapağı açılmamalı,
otoklavlandıktan sonra yıkama
ünitesinde yıkanmalıdır.
Başarılı, temiz nice kültürlere...

Kaynak: Bitki Biyoteknolojisi I ( Doku Kültürü ve Uygulamaları ) Kitabı (2. Baskı 2002)
Mehlika Taşbakır ve Mihriban Keskin’in Bitki Doku Kültürleri I dersi kapsamında
yaptıkları ödevin düzenlenmesi ve revizyonu ile hazırlanmıştır.