hayvan sağlığı araştırmaları program değerlendirme toplantısı - Tagem
hayvan sağlığı araştırmaları program değerlendirme toplantısı - Tagem
hayvan sağlığı araştırmaları program değerlendirme toplantısı - Tagem
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
T.C.<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü<br />
HAYVAN SAĞLIĞI ARAŞTIRMALARI<br />
PROGRAM DEĞERLENDİRME<br />
TOPLANTISI<br />
25-28 ŞUBAT 2008<br />
Otium Hotel Zeynep – ANTALYA
YENİ TEKLİF PROJELERİN GÖRÜŞÜLMESİ Enstitüsü Proje Lideri Sayfa<br />
Araştırma Programı : Büyükbaş Hayvan Hastalıkları<br />
Fırat Doç. Dr. Aykut<br />
Üniversitesi ÖZDARENDELİ<br />
1. Elazığ ve Çevresinde Yetiştirilen Sığır, Koyun ve Keçilerde<br />
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü IgG Antikor Varlığının<br />
Rekombinant KKKA Virüs Nükleoproteini Kullanılarak İndirekt<br />
İmmunofloresan (IIF) Tekniği ile Araştırılması.<br />
2. Kuzeydoğu Anadoludaki Sığır Atıklarında İnfeksiyöz Bovine<br />
Rhinotracheitis (IBR) ve Bovine Viral Diarrhae (BVD)<br />
Etkenlerinin Araştırılması.<br />
3. Erzurum yöresinde farklı <strong>hayvan</strong> türlerinde Campylobacter<br />
jejuni ve Campylobacter coli’nin izolasyonu, antibiyotik<br />
dirençliliklerinin belirlenmesi, izole edilen suşların PCR ile<br />
moleküler analizi<br />
4. Kuzey Doğu Anadolu Bölgesindeki sığırlarda Neospora<br />
caninum ve Toxoplasma gondii ‘nin varlığının ve yaygınlığının<br />
serolojik olarak araştırılması.<br />
5. Adana bölgesinde görülen neonatal buzağı enfeksiyonlarının<br />
morbidite ve mortaliteleri ile bunları etkileyen risk faktörlerinin<br />
belirlenmesi<br />
6. Çukurova yöresinde sığırlarda görülen granülomatöz<br />
pneumonilerin etiyolojisinin histopatolojik ve moloküler<br />
yöntemlerle belirlenmesi<br />
Araştırma Programı : Küçükbaş Hayvan Hastalıkları<br />
7. Marmara bölgesindeki koyunlarda pestivirus prevalansının<br />
saptanması<br />
8. Kuzey Doğu Anadolu Bölgesinde Ortaya Çıkan Koyun ve Keçi<br />
Çiçeği olgularının Virolojik ve Epizootiololojik Yönden<br />
İncelenmesi<br />
9. Erzurum yöresinde koyunlarda Clostridium perfringens<br />
toksinlerinin ELISA ve Lateks Aglutinasyon Test yöntemleri ile<br />
araştırılması.<br />
10. Küçük Ruminant Vebası Virusu ile Doğal Olarak Enfekte<br />
Koyunlarda Apoptozisin İmmunohistokimyasal Yöntemlerle<br />
İncelenmesi.<br />
11. Merinos ve Ile de France x Akkaraman ( G2 melezi)<br />
koyunlarında laktasyonun değişik dönemlerinde yapağı, serum<br />
ve süt iz element düzeylerinin karşılaştırılması<br />
12. Zeranolün Kastre Edilen Kıl Keçisi Oğlaklarında Bazı Besi<br />
Performansları, Reprodüktif Özellikler, Lipid Peroksidasyon ve<br />
Antioksidan Düzeylerine Etkisinin Araştırılması.<br />
Erzurum Ömer Faruk<br />
KÜÇÜKKALEM<br />
Erzurum Serap KILIÇ<br />
ALTUN<br />
2<br />
8<br />
13<br />
20<br />
Erzurum Zekai BASTEM 25<br />
Adana Cemal KURT 30<br />
Adana Dr. Mehmet<br />
Tuzcu<br />
Pendik Dr. Nesrin<br />
TURAN<br />
Erzurum İbrahim<br />
SÖZDUTMAZ<br />
Erzurum Şenay<br />
SEYİTOĞLU<br />
Samsun Ömer Can<br />
GÜRCAN<br />
41<br />
48<br />
59<br />
68<br />
73<br />
Etlik G. Işıl BEKTAŞ 82<br />
Elazığ Dr. Mehtap<br />
ÖZÇELİK<br />
88
Araştırma Programı : Kanatlı ve Küçükevcil Hayvan Hastalıkları<br />
13. Ege Bölgesi İllerinde Balarılarının Önemli Bakteriyel ve<br />
Paraziter Hastalıklarının Yaygınlığının Araştırılması.<br />
14. Orta ve Doğu Karadeniz Bölgesinde Tavukçuluk işletmelerinde<br />
ve satış noktalarında Helicobacter pylori’nin epidemiyolojisi ve<br />
kontaminasyon noktalarının konvansiyonel metodlar ve PCR ile<br />
araştırılması<br />
15. Elazığ ve çevresindeki broiler, damızlık ve yumurtacı<br />
işletmelerde İnfeksiyöz bronşitisin patolojik, virolojik ve<br />
moleküler metotlarla araştırılması<br />
16. Kafeik Asit Fenil Ester’in Ornithobacterium rhinotracheale ile<br />
enfekte edilen broylerlerde lipid peroksidasyon ve antioksidan<br />
enzim aktiviteleri üzerine etkisi<br />
17. Pekin Ördeklerinde Yerleşim Sıklığının Büyüme Performansı,<br />
Karkas Özellikleri, Lipid Peroksidasyon ve Antioksidanlar ile<br />
Bazı Biyokimyasal Kan Parametreleri Üzerine Etkisi<br />
18. Elazığ Yöresindeki Tavuk ve Sineklerden Campylobacter jejuni<br />
ve Campylobacter coli’nin İzolasyonu ve İzolatların Moleküler<br />
Tiplendirilmesi<br />
Bornova Dr. Ayşen<br />
BEYAZIT<br />
3<br />
94<br />
Samsun Yunus GÜR 105<br />
Fırat<br />
Üniversitesi<br />
Doç. Dr. Necati<br />
Timurkaan<br />
Elazığ Dr. Fulya<br />
BENZER<br />
Fırat<br />
Üniversitesi,<br />
SHMYO<br />
Fırat<br />
Üniversitesi,<br />
SHMYO<br />
Yrd. Doç. Dr.<br />
Zeki ERİŞİR<br />
Yrd.Doç.Dr.<br />
Gökben ÖZBEY<br />
Araştırma Programı : Hayvan Aşıları ve Biyolojik Maddeler<br />
19. İnaktif Mavidil Aşı Üretimi. Etlik Özden KABAKLI 137<br />
20. Mavidil Virus İzolatlarının Attenüasyon Çalışmaları Etlik Elvin ÇALIŞKAN 146<br />
21. İnaktif EHV-1 (Equine Rhinopneumonitis) aşısı Üretimi.<br />
Etlik Özden KABAKLI 156<br />
113<br />
118<br />
125<br />
130
SONUÇLANAN PROJELERİN GÖRÜŞÜLMESİ Enstitüsü Proje Lideri Sayfa<br />
Araştırma Programı : Büyükbaş Hayvan Hastalıkları<br />
1. Doğal enfekte ve aşılı sığır ve koyunlarda brusellozisin<br />
teşhisinde competitif ELISA tekniğinin uygulanması<br />
2. Türkiye’de Atlarda Babesia Etkenlerinin Saptanmasında PCR<br />
Tekniğinin Uygulanması<br />
3. Aydın ve İzmir İllerindeki Sığırlardan Pasteurella multocida’nın<br />
İzolasyonu, Tiplendirilmesi ve Antibiyotiklere Duyarlılıkları<br />
4. Çukurova Yöresinde Subklinik Mastitise Neden Olan<br />
Mikroorganizmaların Belirlenmesi ve Antibiyotiklere Olan<br />
Duyarlılıklarının Saptanması<br />
Araştırma Programı : Kanatlı ve Küçükevcil Hayvan Hastalıkları<br />
5. Tavuklarda Kronik Solunum Sistemi Hastalığının (CRD)<br />
Teşhisinde PCR Tekniğinin Kullanılması<br />
6. Tavuklarda Ornithobacterium rhinotracheale İle Oluşturulan<br />
Deneysel Enfeksiyonlarda Etkenin Kültür, PCR ile Tespiti ve<br />
Biyokimyasal Parametrelerdeki Değişikliklerin Saptanması<br />
7. Tavuklarda Deneysel Salmonella enteritidis ile Oluşturulan<br />
Deneysel Enfeksiyonlarda Etkenin Saptanması ve Antibiyotik<br />
Kullanımının Bazı Biyokimyasal Parametreler Üzerine Etkisi<br />
8. Yeme Soy İsoflavin İlavesinin Bıldırcınlarda Kendiliğinden<br />
Oluşan Yumuşak Doku Tümörü (Leiomyoma ve<br />
Leiomyosarcoma) Üzerine etkileri<br />
Araştırma Programı : Hayvan Aşıları ve Biyolojik Maddeler<br />
9. Vero Hücre Kültüründe Üretilen Koyun-Keçi Çiçek Aşısının<br />
Bağışıklık Süresinin Saptanması<br />
Araştırma Programı : Su Ürünleri Sağlığı<br />
10. Kültürü Yapılan Alabalıklarda Bakteriyel Böbrek Hastalığı’nın<br />
Teşhisi<br />
Etlik VKAE Dr. Asiye<br />
DAKMAN<br />
Etlik VKAE Dr. Bengi<br />
DÜNDAR<br />
Bornova VKAE Dr. Göksel<br />
ERBAŞ<br />
Adana VKAE Nevin TURUT<br />
166<br />
186<br />
201<br />
212<br />
Konya VKAE Kamile<br />
KESLER<br />
215<br />
Elazığ VKAE Dr. Ayşe KILIÇ 225<br />
Elazığ VKAE Dr. Fulya<br />
BENZER<br />
Elazığ VKAE Doç.Dr. Nurhan<br />
ŞAHİN<br />
Pendik VKAE Dr. Veli<br />
GÜLYAZ<br />
Etlik VMKAE Dr. Sibel<br />
ÖZKÖK<br />
243<br />
256<br />
262<br />
271<br />
4
DEVAM EDEN PROJELERİN GÖRÜŞÜLMESİ Enstitüsü Proje Lideri Sayfa<br />
Araştırma Programı : Büyükbaş Hayvan Hastalıkları<br />
1. Türkiye’de Sığırlarda B. bovis ve B. bigemina’nin<br />
Epidemiyolojisi<br />
2. Aşılı <strong>hayvan</strong>larda ve Enfekte Hayvanlarda Şap Virusu Yapısal<br />
Olmayan Proteinlerine Karşı Oluşan Antikor Profilinin<br />
İncelenmesi<br />
3. Atık Sığır Fetuslarında Brucella, Leptospira, Listeria,<br />
Campylobacter ve Klamidia Etkenlerinin İmmunohistokimyasal,<br />
Mikrobiyolojik ve Moleküler Yöntemlerle İncelenmesi<br />
4. Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin<br />
Bir Multipleks Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin<br />
Geliştirilmesi<br />
5. Marmara bölgesinde yeni doğan buzağı ishallerinde Bovine<br />
Coronavirusların saptanması ve patojenite çalışması<br />
6. Akdeniz Bölgesinde Mavi dil Hastalığı ve Culicoides Türlerinin<br />
Araştırılması<br />
Araştırma Programı : Küçükbaş Hayvan Hastalıkları<br />
7. İzmir İli ve Çevresindeki İshalli Kuzu ve Oğlaklarda Rotavirus,<br />
Coronavirus, Enterotoksinojenik Escherichia coli ve<br />
Cryptosporidium spp. Yaygınlığının Araştırılması<br />
8. Kuzu Pnömonilerinde Parainfluenza 3 Virus (PI3V) ve<br />
Respiratory Syncytial Virus (RSV) Enfeksiyonlarının Teşhisi<br />
Üzerine Virolojik ve Patolojik Çalışmalar<br />
9. Marmara Bölgesinde koyunlarda abort vakalarında pestivirus<br />
infeksiyonunun saptanması.<br />
10. Elazığ ve Civar İllerde Atık Yapmış Koyun ve Keçilerde<br />
Chlamydophila abortus (Chlamydia psittaci Serovar 1)<br />
Enfeksiyonunun Mikrobiyolojik, Patolojik ve Moleküler<br />
Yöntemlerle Saptanması.<br />
11. Pnömonili Koyun ve Kuzuların Akciğerlerinde Mikoplazma<br />
Etkenlerinin Kültür, PCR ve İmmunoperoksidaz Yöntemleri ile<br />
Saptanması ve Moleküler Tiplendirilmesi.<br />
Pendik VKAE Dr. Taraneh<br />
ÖNCEL<br />
Şap Enst Dr. Can<br />
ÇOKÇALIŞKAN<br />
Adana VKAE Dr. Mehmet<br />
TUZCU<br />
Elazığ VKAE Dr. Murat<br />
KARAHAN<br />
Pendik VKAE Züleyha<br />
PESTİL<br />
APUHAN<br />
Etlik VKAE Dr. Arife<br />
ERTÜRK<br />
Bornova VKAE Dr. Seza<br />
ESKİİZMİRLİLER<br />
Konya VKAE Dr. Ertan<br />
ORUÇ<br />
Pendik VKAE Selma<br />
ÖZDEMİR<br />
Elazığ VKAE Doç. Dr. Hakan<br />
KALENDER<br />
Elazığ VKAE Doç. Dr. Hakan<br />
KALENDER<br />
Araştırma Programı : Kanatlı ve Küçükevcil Hayvan Hastalıkları<br />
12. Hastalıktan Şüpheli Kovanlardan Alınan Bal ve Balmumu<br />
Örneklerinde Amerikan Yavru Çürüklüğü Hastalığı Etkeni<br />
Paenibacillus larvae’nin Kültür ve PCR ile Teşhisi<br />
Elazığ VKAE Dr. Ayşe KILIÇ 298<br />
13. Infeksiyöz Bursal Hastalığı Saha ve Aşı Viruslarının Antijenik Bornova VKAE Dr. Olcay TÜRE 299<br />
ve Patojenik Özellikleri Yönünden Moleküler Analizi<br />
GÖKSU<br />
14. Solunum sistemi hastalığı olan tavuklardan Mycoplasma<br />
Fırat Ü. Vet. Doç. Dr. Fethi 300<br />
synovia ve Mycoplasma gallisepticum’un kültür, PCR ve<br />
immunohistokimyasal yöntemle saptanması<br />
Fak. YILMAZ<br />
284<br />
286<br />
289<br />
290<br />
291<br />
292<br />
293<br />
294<br />
295<br />
296<br />
297<br />
5
Araştırma Programı : Hayvan Aşıları ve Biyolojik Maddeler<br />
15. Şap Virusu Üretimi Amacıyla Soy Bean Peptonlu Vasatlarda<br />
BHK 21 Hücre Kültürlerinin Üretilmesi<br />
16. A/Aydın 98 Şap Virusuna Karşı Monoklonal Antikor Panelleri<br />
Oluşturulması ve Karakterizasyonu<br />
17. Şap Enstitüsü Müdürlüğünde Kullanılan Aşı Suşlarının<br />
Koruyucu Doz50 (PD50: Protective Dose50) Değerleri İle<br />
İmmunite Sürelerinin Belirlenmesi<br />
18. İnaktif Konsantre Şap Aşı Antijeni 146 S Partiküllerinin Stabilite<br />
Çalışmaları<br />
19. Mevcut Şap Aşısının Etkinliğinin Yeni Adjuvant Sistemi<br />
Oluşturularak İyileştirilmesi<br />
Şap Enst Dr. Şükran<br />
YILMAZ<br />
Şap Enst Berrin M.<br />
ALPAY<br />
301<br />
302<br />
Şap Enst Şeref AKYÜZ 304<br />
Şap Enst Dr. Nedret<br />
ÇELİK<br />
Şap Enst Tunçer<br />
TÜRKOĞLU<br />
20. Vero Hücrelerinde Isıya Dayanıklı Sığır Vebası Aşı Üretimi Etlik VMKAE Dr. Özden<br />
KABAKLI<br />
21. Türkiye’de Kullanılan Canlı İnfeksiyöz Bursal Hastalığı<br />
(Gumboro) Aşılarının Patojenite Düzeylerinin Moleküler Marker<br />
ile Analizi<br />
Bornova VKAE Dr.Olcay TÜRE<br />
GÖKSU<br />
Araştırma Programı : Su Ürünleri Sağlığı<br />
22. Orta ve Doğu Karadeniz Bölgesinde Alabalık Çiftliklerinde Viral Samsun Harun 309<br />
Hemorajik Septisemi (VHS) Virusunun İzolasyon ve<br />
İdentifikasyonu<br />
ALBAYRAK<br />
23. A Sınıfı Avlanma/Üretim Alanlarından Çıkarılan Çift Kabuklu<br />
Yumuşakçalardan ve Deniz Sularından Listeria monocytogenes<br />
İzolasyon ve İdentifikasyonu<br />
Bornova VKAE Necla TÜRK 310<br />
24. Infeksiyöz Pankreatik Nekrozis (IPN) virusun üç farklı serotipine Bornova VKAE Dr. Gülnur 312<br />
karşı tavşanlarda nötralizan antiserum üretimi<br />
KALAYCI<br />
25. Kerevit Vebası etkeni Aphanomyces astaci’nin Konvansiyonel<br />
ve Moleküler Tanı Yöntemleri ile Araştırılması<br />
Bornova VKAE Lütfi AVSEVER 314<br />
26. Karadeniz Bölgesinde Kültürü Yapılan ve Doğal Balıklardan<br />
Trabzon Hakan IŞIDAN 315<br />
Viral Hemorajik Septisemi Virüs (VHSV) İzolasyon Çalışmaları<br />
ve Elde Edilecek İzolatların Patojenitesini Belirleyen Genetik<br />
Yapı Üzerine Çalışmalar<br />
SÜMAE<br />
27. Orta ve Doğu Karadeniz Bölgesinde Gökkuşağı Alabalığı<br />
(Oncorhynchus mykiss) Çiftliklerinde Flavobacterium<br />
psychrophilum’un Epidemiyolojisinin Polimeraz Zincir<br />
Reaksiyonu ile Belirlenmesi ve Antibiyotik Dirençliliğinin Ortaya<br />
Konulması<br />
Samsun VKAE Yüksel<br />
DURMAZ<br />
316<br />
AB 6. Çerçevesi (fp6) kapsamında ortak olunan projeler (Bilgi amaçlı) 317<br />
Tübitak Projeleri (Bilgi amaçlı) 324<br />
305<br />
306<br />
307<br />
308<br />
6
YENİ TEKLİF<br />
PROJELER<br />
7
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı :<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1.PROJE ADI:<br />
Elazığ ve Çevresinde Yetiştirilen Sığır, Koyun ve Keçilerde Kırım Kongo Kanamalı Ateşi<br />
Virüsü IgG Antikor Varlığının Rekombinant KKKA Virüs Nükleoproteini Kullanılarak<br />
İndirekt İmmunofloresan (IIF) Tekniği ile Araştırılması.<br />
2.YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ: Elazığ Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü<br />
3.PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Doç. Dr. Aykut ÖZDARENDELİ<br />
Kurumu : Fırat Üniversitesi - Elazığ<br />
4 . Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı: Büyükbaş Hayvancılık X<br />
Araştırma Programı: Büyükbaş Hayvan Hastalıkları X X<br />
5.PROJE SÜRESİ: 24 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi: Ocak 2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : Ocak 2011<br />
6.PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu çalışmada, Elazığ ve çevresinde yetiştirilen sığır, koyun ve keçilerden 250’şer adet<br />
kan serumu toplanacak, bu serumlarda KKKA Virüs antikor varlığı, İndirekt İmmun Floresan<br />
(IIF) tekniği ile araştırılacaktır. Bu amaçla KKKA Virüsüne ait Nukleoprotein, rekombinant<br />
olarak elde edilecek bu nukleoprotein antijen olarak kullanılacaktır. Antijen lam üzerinde<br />
bulunan kuyucuklara karbonat buffer (pH;9,6) ile yapıştırılmak suretiyle toplanan 750 adet<br />
kan serumu ile lam üzerinde birleştirilecek, oluşan reaksiyon Fluorescein isotiocyonat (FITC)<br />
ile işaretlenmiş Anti Sığır, anti koyun ve anti keçi immunglobulin konjugatlar ile görünür hale<br />
getirilerek Floresan mikroskopta incelenecektir.<br />
SUMMARY: In this study, We will collect 250 sera from cattle, sheep and goats in Elazig<br />
province and all these sera will investigate to detect antibody against Crimean Congo<br />
Hemorrhagic Fever virus (CCHFV) by indirect immunofluorescence (IIF). To do this, the<br />
recombinant NP protein of CCHFV will be produced. Then, the recombinant antigen will be<br />
coated onto the chamber slides by using carbonate buffer (pH; 9.6). After then, 750 sera from<br />
cattle, sheep and goats will be analysed by IIF. The reaction will be visible by fluorescein<br />
isotiocyonat (FITC) and investigasted under fluorescence microscope.<br />
8
7.ANAHTAR KELİMELER:<br />
KKKAV, Rekombinant Nükleoprotein, IIF, Sığır, Koyun Keçi,<br />
Key words: CCHFV, Recombinant Nucleoprotein, IIF, Cattle,Sheep, Goats<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1. Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
KKKA hastalığı, tüm dünyada yaygın olarak görülen, insanlar için yüksek oranda<br />
öldürücü olan ve kenelerle nakledilen viral bir hastalıktır. Virüs, tüm yabani ve evcil<br />
<strong>hayvan</strong>larda da görülmekte ve 1 haftalık bir geçici viremiye neden olmaktadır. Özellikle evcil<br />
ruminantlar olan sığır, koyun ve keçilerde de bulunmakta ancak ya subklinik seyretmekte veya<br />
atipik semptomlarla seyrederek <strong>hayvan</strong> popülasyonlarında varlığını sürdürmektedir. Etkenin<br />
yayılmasında Hyalomma soyuna bağlı keneler birinci önceliği almakla birlikte 30 kadar kene<br />
türünün bu hastalığı bulaştırabileceği bildirilmektedir. Virüs kenelerde, transovarial ve<br />
transstadial pasajlarla idame olur; keneler arasında veneral bulaşmanın da olduğu<br />
bildirilmektedir. Henüz erginleşmemiş Hyalomma soyuna bağlı keneler, küçük omurgalılardan<br />
kan emerken virüsleri alır, gelişme evrelerinde muhafaza eder. Keneler, insan veya<br />
<strong>hayvan</strong>lardan kan emerken virüsleri de bulaştırırlar.<br />
Küçük omurgalılar ve özellikle yerde beslenen kuşlar, keneleri enfekte eden en önemli<br />
konak grubunu oluşturmaktadır. Keneler, biyolojik evrimlerinin çeşitli safhalarında bu<br />
canlılardan kan emerler.<br />
Virüsün insanlara bulaşmasında kenelerden sonra ikinci sırayı gizli enfekte <strong>hayvan</strong>ların<br />
veya hasta insanların vücut sıvıları veya kanlarıyla temas almaktadır. 2002 yılından bu yana<br />
ülkemizde de görülmeye başlayan bu hastalık günümüze kadar pek çok insanın ölümüne sebep<br />
olmuştur. Dünyada ve ülkemizde yapılan çalışmalarda virüsün insanlarda ve <strong>hayvan</strong>larda<br />
varlığı birçok araştırmada gösterilmiştir. Ancak ülkemizde <strong>hayvan</strong>lar üzerinde yeterli yayın<br />
yapılmamıştır.<br />
Evcil <strong>hayvan</strong>larda KKKAH virüsüne karşı oluşmuş antikorların periyodik olarak test<br />
edilmesi hastalıkla savaşımda ve erken uyarı sisteminin oluşturulmasında önemlidir. Virüse<br />
karşı evcil <strong>hayvan</strong>larda saptanan antikorlar, o bölgenin KKKAH yönünden riskli olduğunu ve<br />
virüsün o bölgede sirküle olduğunu göstermektedir. Bu bağlamda, Elazığ ve çevresindeki<br />
sığırlardan alınacak kan serum örneklerinin IIF yöntemiyle test edilerek hastalık riskinin olup<br />
olmadığı bu projeyle araştırılacaktır.<br />
IIF yöntemi diğer hassas serolojik testlerle (ELISA) karşılaştırıldığında özgüllüğünün<br />
daha yüksek olduğu bilinmektedir.<br />
8. 2. Literatür Özeti:<br />
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi, KKKA, Bunyaviridae ailesine bağlı Nairovirus<br />
genusunda bulunan bir virüs tarafından meydana getirilen ve şiddetli seyir gösteren, öldürücü,<br />
kenelerle bulaşan zoonoz bir hastalıktır. Hastalığın bulaşmasında Ixodidae familyasının<br />
Hyalomma soyuna bağlı keneler önemli rol oynamaktadır. Özellikle H. marginatum türü<br />
virüsün en önemli vektörüdür. Ancak yapılan çalışmalarda 30 farklı kene türünün bu hastalığı<br />
taşıdığı bildirilmiştir. Hastalık <strong>hayvan</strong>larda, insanlara nazaran daha yaygın olarak<br />
görülmektedir. Ancak hastalık <strong>hayvan</strong>larda, subklinik (asemptomatik) olarak seyretmekte<br />
insanlarda da klinik ve subklinik olarak, sporadik vakalar veya salgınlar şeklinde<br />
görülebilmektedir.<br />
9
Hastalık ilk defa 1944 yılında Kırım’da görülmüş ve Kırım Kanamalı Ateşi olarak<br />
tanımlanmıştır. Daha sonra 1956 yılında Kongo’da görülen hastalığın, 1969 yılında Kırım<br />
Kanamalı Ateşi ile aynı olduğunun farkına varılmış ve hastalık bu tarihten itibaren bu günkü<br />
bilinen ismiyle anılmaya başlamıştır. Hastalık 2002 yılında ilk kez Tokat ilinde görülmüş olup<br />
izleyen yıllarda sporadik vakalar şeklinde görülmeye devam etmektedir.<br />
Saijo ve arkadaşları, insan HeLa hücresinde çoğaltılmış KKKAHV rekombinant<br />
nükleoproteini ve doğal virüsle enfekte Vero E-6 hücre kültürü kullanarak yaptıkları<br />
çalışmada her iki sistemde de uygulanan IIF testinde KKKA hastalığının endemik olarak<br />
görüldüğü bölgelerde yaşayan 121 adet insana ait kan serumunu IgG antikorları yönünden<br />
incelemişler, 13’ünün pozitif 108’inde negatif olduğunu saptamışlar ve doğal antijenle<br />
kıyaslandığında rekombinant antijenin de IIF testinde doğal antijen kadar hassas ve özgül<br />
sonuç verdiğini saptamışlardır.<br />
Yine Saijo ve arkadaşları, yukarıdaki çalışmaya bağlantılı yaptıkları çalışmada<br />
KKKAH virüsü ile enfekte Vero E-6 hücre kültüründe IIF testiyle kontrol ettikleri ve 13<br />
tanesini pozitif 108 tanesini negatif olarak tespit ettikleri bu serumları, bu testi temel alarak,<br />
rekombinant KKKAH virüs nükleoproteini kullanarak geliştirdikleri IgG ELISA ile teste tabi<br />
tutmuşlar, 15 serum örneğininde pozitiflik, 107 serum örneğinde negatiflik tespit etmişler ve<br />
iki test arasında pozitiflikte % 87 negatiflikte % 99 gibi iyi bir korelasyon olduğu sonucuna<br />
ulaşmışlardır.<br />
Garcia ve arkadaşları, İran’da doğal KKKAHV ile çalışma esnasında BSL-4<br />
seviyesinde laboratuara ihtiyaç duyulması ve etkenin insanlar için çok patojen olması<br />
sebebiyle doğal antijen yerine Semliki Forest alfa virüs genine rekombine edilmiş KKKAHV<br />
antijeni (KKKAHV S segmenti) ile yaptıkları çalışmada; 29 insan kan serumunun 13’ünde, 37<br />
sığır kan serumunun 11’inde ve 54 koyun kan serumunun 24’ünde ELISA yöntemiyle hem<br />
rekombinant hem de doğal antijenle aynı oranda pozitiflik tespit etmişlerdir. ELISA ile test<br />
edilip pozitif bulunan numuneler yine rekombinant antijenle yapılan IFA testinde de pozitif<br />
bulunmuştur. Böylece rekombinant antijen kullanılarak yapılan ELISA ve IFA testlerinin<br />
teşhis amacıyla doğal antijen kullanılarak yapılan testlere göre daha hassas, daha özgül ve<br />
oldukça avantajlı olacağı sonucuna ulaşmışlardır.<br />
8. 3. MATERYAL VE METOT:<br />
Serumlar:<br />
Elazığ ve çevresinde yetiştirilen sığır koyun ve keçilerden 250’şer adet kan örnekleri<br />
toplanacaktır. Serumları ayrıldıktan sonra serum örnekleri 56 °C’de 30 dakika inaktive<br />
edildikten sonra kullanılıncaya kadar -20 °C’de saklanacaktır.<br />
Rekombinant NP Antijenin Elde Edilmesi ve Pürifikasyonu:<br />
pET23b prokaryotik vektörüne klonlanan virüsün NP geni (1449 baz çifti) BL-21<br />
(DE3) E. coli hücrelerine transforme edilecektir. Tek nokta ekimi yapılarak uygun vasat<br />
ortamında üretilecek ve IPTG ile 4-6 saat indüklenecektir. Daha sonra rekombinant proteini<br />
pürifiye etmek amacıyla bakteri peleti Ni-NTA kolum pürifikasyon kiti yardımıyla pürifiye<br />
edilecek ve SDS-PAGE ile proteinin varlığı teyit edildikten sonra bir spektrofotometre ile<br />
rekombinant proteinin miktarı tayin edilecektir.<br />
Rekombinant Antijenin Slaytlara Yapıştırılması ve İndirekt İmmun Floresan<br />
(IIF) tekniği:<br />
Pürifiye edilen ve miktarı belirlenen rekombinant antijen, slayt üzerinde bulunan her<br />
bir kuyucuğa 200 nanogram miktarında ve karbonat buffer içerisinde bir gece 4 o C’de<br />
yapışması sağlanacaktır.<br />
10
Üzerindeki kuyucuklara rekombinant antijenin yapıştırıldığı slaytlarda her serum<br />
numunesi uygun dilüsyon oranı belirlendikten sonra bilinen IIF prosedürleri doğrultusunda<br />
uygulanacak, reaksiyonun görünür hale getirilmesi amacıyla da FITC ile işaretlenmiş Anti<br />
sığır, anti koyun ve anti keçi immunoglobulinleri eklenerek Floresan mikroskopta sonuçlar<br />
değerlendirilecektir.<br />
ELISA Testi:<br />
KKKAH Virüsü IgG antikorlarına karşı geliştirilmiş ticari ELISA Kiti (Diagen)<br />
kullanılacaktır. Üretici firma tarafından belirlenen prosedür uygulanacaktır.<br />
8.3.Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Bu projeyle geliştirilecek olan IIF yöntemi ile gerek duyulduğu takdirde rutin olarak<br />
taramalar gerçekleştirilecek ve riskli bölgeler bu sayede ortaya çıkarılacaktır. Ticari ELISA<br />
kitlerinin maliyetinin yüksek olması geniş çaplı tarama yapılmasını engellemektedir. Ayrıca<br />
geliştirilecek olan IIF için kullanılacak olan antijenin ülkemizde sirküle olan virüsün NP<br />
antijenine karşı olması deneyin duyarlılığı ve özgüllüğü açısından önemli avantaj<br />
sağlayacaktır.<br />
9.ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı: Doç. Dr. Aykut ÖZDARENDELİ (Fırat Üniversitesi Veteriner<br />
Fakültesi Viroloji A.D.)<br />
9.2.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Turhan TURAN (Elazığ VKAE Viroloji Lab.)<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Yeterli<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım : Yok<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri: Laboratuara günlük<br />
gelen numunelerin rutin muayeneleri yapılmaktadır.<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ TOPLAM<br />
1-MAMUL MAL ALIMLARI<br />
2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI<br />
(YTL)<br />
Genel Dış İç<br />
Toplam Toplam Toplam<br />
06: 56.250 YTL<br />
6.2: 55.250 YTL<br />
6.5: 1000 YTL<br />
IV. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI:<br />
(ÜÇÜNCÜ VE DÖRDÜNCÜ DÜZEY EKLENECEK)<br />
06.1.3.04 Laboratuar gereçleri alımları:<br />
06.2.3.01 Gıda ürünleri, içecekler ve tütün alımları:<br />
06.2.6.01 Kağıt ve kağıt ürünleri alımı: 500 YTL<br />
06.2.7.01 Kimyevi madde ile kauçuk ve plastik ürün alımları: 52.750 YTL<br />
06.2.9.01 Diğer alımlar: 2.000 YTL<br />
06.5.4.01 Yakacak alımları:<br />
06.5.4.02 Akaryakıt ve yağ alımları: 1.000 YTL<br />
06.5.4.03 Elektrik alımları:<br />
06.5.5.01 Posta ve telgraf giderleri:<br />
11
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
Kasım 2008- Şubat 2009 Alt yapının hazırlanması ve sarf malzemelerinin alınması<br />
Mart 2009- Eylül 2009 Numunelerin toplanması<br />
Ekim 2009- Temmuz 2010 Numunelerin işlenmesi<br />
Ağustos 2010- Kasım 2010 Sonuçların değerlendirilmesi ve Proje sonuç raporunun hazırlanması<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1- Saijo, M., Qing, T., Niikura, M., Maeda, A., Ikegami, T., Sakai, K., Prehaud, C., Kurane, I. And Morikawa, S.<br />
Immunofluorescence Technique Using HeLa Cells Expressing Recombinant Nucleoprotein for Detection of<br />
Immunoglobulin G Antibodies to Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus. Journal of Clinical Microbiology,<br />
Feb. 2002. P. 372-375.<br />
2- Saijo, M., Qing, T., Niikura, M., Maeda, A., Ikegami, T., Sakai, K., Prehaud, C., Kurane, I. And Morikawa, S.<br />
Recombinant Nucleoprotein-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection of Immunoglobulin G<br />
Antibodies to Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus. Journal of Clinical Microbiology, May. 2002. P. 1587-<br />
3- Garcia, S., Chinikar, S., Coudrier, D., Billecocq, A., Hooshmand, B., Crance, J. M., Garin, D. And Bouloy, M.<br />
Evaluation of a Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus Rekombinant Antigen Expressed by SemlikiForest<br />
Suicide Virus for IgM and IgG Antibody detection in Human and Animal Sera Collected in Iran. Journal of<br />
Clinical Virology 35 (2006) 154-159.<br />
4- Khan, A. S., Maupin, G. O., Rollin, P. E., Noor, A. M., Shurie, H. H., Shalabi, A. G., et al. An Autbreak of<br />
Crimean-Congo hemorrhagic fever in the United Arab Emirates, 1994–1995. Am J Trop Med Hyg 1997;<br />
57. 519–25.<br />
5- Burt, F. J., Leman, P. A., Abbott. J. C. and Swaneooel. R. (1994) :Serodiagnosis of Crimean-Congo<br />
haemorrhagic fever. Epidemiology and Infection, 113, 551-562.<br />
6- Gozalan, A., Akin, L., Rolain, J. M, Tapar, F. S., Oncul, O., Yoshikura, H, et al. Epidemiological<br />
Evaluation of a Possible Outbreak in and Near by Tokat Province. Mikrobiyol. Bul. 2004; 38. 33–44.<br />
7- Bakir, M., Ugurlu, M., Dokuzoguz, B., Bodur, H., Tasyaran, M. A. Turkish CCHF Study Group. Crimean–<br />
Congo Haemorrhagic Fever Outbreak in Middle Anatolia; A Multicenter Study of Clinical Features and Outcome<br />
Measures. J. Med Microbiol. 2005; 54. 385–9.<br />
8- Bishop, D. H. Biology and molecular biology of Bunyaviruses, In: Eliot R.M. (ed.) The Bunyaviridae,<br />
Plenum Pres, New York, 19-61, (1996).<br />
9- Burney, M. I., Ghafoor, A., Saleen, M., Webb, P. A., Casals, J. Nosocomial outbreak of viral hemorrhagic<br />
fever caused by Crimean hemorrhagic fever-Congo virus in Pakistan, Am J. Trop. Med. Hyg., 29, 941-947,<br />
10- Burt, F. J., Leman, P. A., Smith, J. F, Swanepoel, R. The use of a reverse transcription-polimeraz chain<br />
reaction fort he detection of viral nucleic acid in the diagnosis of Crimean-Congo hemorrhagic fever, J. Vir.<br />
Methods, 70, 129-137, (1998).<br />
11- Butenko, A. M., Chumakov, M. P., Bashkirtsev, V. N., Zavodova, T. I., Tkachenko, E. A., Rubin, S. G.,<br />
Stolbov, D. N. Isolation and investigation of Astrakhan strain (“Drozdov”) of Crimean hemorrhagic fever virus<br />
and data on serodiagnosis of this infection, Mater. Nauchn. Sess. Inst. Polio Virus Entsefalitov (Moskow), 3, 88-<br />
90, (1968).<br />
12- Casals, J., Henderson, B. F., Hoogstraal, H., Johnson, K. M., Shelokov, A. A review of Soviet viral<br />
hemorrhagic fevers, J. Infect. Dis., 122, 437–453, (1969).<br />
13- Chinikar, S., Persson, S. M., Johansson, M., Linda, B., Goya, M., Houshmand, B., Mirazimi, A., Plyusnin,<br />
A., Lundkvist, A., Nilsson, M. Genetic Analysis of Crimean- Congo Hemorrhagic Fever virus in Iran, J. Med.<br />
Virol. 73, 404–411, (2004).<br />
14- Chumakov, M. P. A new virus disease - Crimean hemorrhagic fever, Nov. Med, 4, 9-11, (1947).<br />
15- Elliott, R. M. Molecular biology of the Bunyaviridae, . J. Gen. Virol., 71, 501–522, (1992).<br />
16- Zgurskaya, G. N., Chumakov, M. P. Titration of antibodies to Crimean hemorrhagic fever virus in a drop<br />
from infected tissue culture suspension by the indirect immunofluorescence method, Vopr. Virusol., 22, 606–608,<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Doç. Dr. Aykut ÖZDARENDELİ<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Ünal KILINÇ (EVKAE)<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar : Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi<br />
12
T.C.<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI :Kuzeydoğu Anadoludaki Sığır Atıklarında İnfeksiyöz<br />
Bovine Rhinotracheitis (IBR) ve Bovine Viral Diarrhae (BVD) Etkenlerinin<br />
Araştırılması.<br />
(The investigation of IBR and BVD diseases viral agents in Northeastern Anatolia from<br />
Bovine Fetal Abortions)<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Ömer Faruk KÜÇÜKKALEM<br />
Kurumu : Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı: X<br />
Araştırma Programı : X X<br />
5. PROJE SÜRESİ : 12 ay (1 yıl)<br />
5.1. Başlama Tarihi : 01.01.2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : 31.12.2009<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu araştırmada Kuzeydoğu Anadolu Bölgesindeki illerden Enstitü Müdürlüğüne<br />
getirilen sığır atıklarında IBR ve BVD’nin oranının ortaya konulması planlanmıştır. Bu amaçla<br />
Enstitü Müdürlüğüne getirilen sığır atıklarından alınan doku örneklerinden Polimeraz Zincir<br />
Reaksiyonu (PCR) ile IBR ve BVD viruslarının genom varlığı, tip ve alt tip veya biyotip<br />
düzeyinde ortaya konulacaktır. Ayrıca, aynı atıklardan alınan dalak, akciğer, karaciğer,<br />
böbrek ve barsaklardan alınan örnekler ise histopatolojik olarak etiyolojik uyumluluğu<br />
yönünden değerlendirilecektir.<br />
Çalışma sonucunda Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’ne getirilen<br />
sığır atıklarında IBR ve BVD’nin oranı ve etiyolojik yorumu ortaya konacaktır.<br />
SUMMARY: In this project, it is aimed to detect the prevalance of the BVD and IBR<br />
infections in aborted fetal calves, which sent from the North-East Anatolian Region. For this<br />
purpose, sample tissues coming from the region to İnstitute will be taken from aborted fetal<br />
calves, in order to examing the presence of genomes of BVD and IBR, which gives the result<br />
13
of the types, biotypes and subtypes results of the agents. At the same time, the spleen, lung,<br />
liver, kidney, intestine samples will be examined by histopathologically too,<br />
At the end of the study, the prevalance of IBR and BVD in aborted fetal calf samples<br />
that came to Erzurum Veterinary Control and Research Institute will be determined according<br />
to this study’s results.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER:<br />
Atık, Sığır, IBR, BVD, PCR<br />
(Abortion, Cattle, IBR, BVD, PCR)<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1. Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Sığırların önemli bir patojeni olan Bovine Herpesvirus-1 (BHV-1) başta üst solunum<br />
yolu (IBR) ile genital kanal enfeksiyonu (IPV,IBP) olmak üzere yerleştiği dokuya göre<br />
değişen farklı klinik tablolara sebep olurlar. Bu virus süt veriminde azalma, abortlar, yemden<br />
yararlanma gücünün azalması ve ölümler nedeniyle önemli ekonomik kayıplara yol<br />
açabilmektedir (4). BHV-1 Herpesviridae ailesi içerisinde yer alan Alphaherpesvirinae alt<br />
ailesinden çift iplikli linear formda bir DNA virusudur. BHV-1 genellikle doğal ve suni<br />
tohumlama yolu ile bulaştırılmakta, gebe <strong>hayvan</strong>larda abort, infertilite, endometrit ve<br />
embriyonik absorbsiyon gibi pek çok üremeyle ilgili probleme sebebiyet vermektedir (17).<br />
Diğer herpesviruslarda olduğu gibi BHV-1 de primer enfeksiyonun ardından<br />
organizmadan tamamen elimine edilememekte, viral genom, bölgesel ganglion hücrelerinde<br />
latent durumda kalabilmektedir. Çeşitli stres faktörlerinin etkisi (gebelik, hastalık, transport<br />
vb.) ve kortikosteroidlerin uygulanması sırasında latent virus reaktive olarak, replikasyonun<br />
gerçekleşeceği mukozal yüzeylere ulaşmakta ve buradan saçılmaya devam etmektedir (1).<br />
BHV-1’in viral zarı üzerinde bulunan glikoproteinler patogenezis ve immunitede<br />
önemli rol oynarlar. BHV-1.1, BHV-1.2a, BHV-1.2b ve BHV-1.3 olmak üzere 4 alt tipi tesbit<br />
edilmiştir. Nörotropik alt tip olan BHV-1.3 sonradan BHV-5 olarak isimlendirilmiştir. BHV-<br />
1.1 alt tiplerinin de BHV-1.2 alt tiplerine göre daha virulent olduğu ortaya konulmuştur(19).<br />
Bovine Viral Diarrhoae Virus (BVDV), Flaviviridae ailesinin pestivirus genusu içinde<br />
yer alan zarlı, tek iplikçikli linear yapıda bir RNA virusudur. Sığırlarda özellikle aborttan<br />
kongenital bozukluklara kadar değişebilen üreme problemleri oluşturmaktadır. Bu virusun<br />
Tip-1 BVD ve Tip-2 BVD olmak üzere iki biyotipinin var olduğu her iki biyotip kendi içinde<br />
stopatik ve nonstopatik olmak üzere iki biyotipe ayrıldığı ortaya konulmuştur(3). Tip-2 BVD<br />
ve nonstopatik suşun plasentayı geçerek fötal enfeksiyona sebebiyet verdiği ve ağır klinik<br />
semptomlu mukozal hastalığa sebep olduğu, Stopatik biyotipin ise mucosal hastalık ve sadece<br />
persiste enfeksiyonla sonuçlanan fötal enfeksiyona neden olduğu belirtilmiştir (5, 20).<br />
Atıklara neden olan etkenler içerisinde IBR ve BVD virus etkenlerinin önemli bir yer<br />
oluşturduğu yapılan çalışmalardan anlaşılmaktadır (3).<br />
Kuzeydoğu Anadolu Bölgesinde, <strong>hayvan</strong>cılığın önemli bir yeri olduğu ve<br />
ekonomisinin de büyük oranda <strong>hayvan</strong>cılığa dayandığı bilinmektedir. Sığırlarda atıklarla sıkça<br />
karşılaşılmakta ve bazen atıklara sebep olan etkenler ortaya konulamamaktadır. Mevcut<br />
bilgilere göre sığır abortları bölgemizde önemli bir sorun olarak devam etmekte. Bu sorunun<br />
etiyolojisinin aydınlatılmasına ve viral abortlarla ilgili çalışmalara katkı sağlamak amacıyla<br />
böyle bir çalışma planlanmıştır.<br />
Çalışmada önemli ekonomik kayıplara neden olan ve nedeni belirlenemeyen sığır<br />
atıkları içerisinde IBR ve BVD etkenlerinin oranlarının ortaya konulması hedeflenmiştir.<br />
14
8.2. Literatür Özeti:<br />
Ak ve ark. (2) “Trakya bölgesinde sığırlarda BVDV infeksiyonlarının prevalansı ve<br />
persiste infekte <strong>hayvan</strong>ların saptanması” konulu çalışmalarında 260 lökosit örneği, fötal dana<br />
böbrek hücre kültüründe 2 kör pasajdan sonra BVDV antijenleri yönünden indirekt<br />
immunoperoksidaz testi ile incelenmiş, 35 sığırda (%13.46) BVDV antijeni yönünden pozitif<br />
bulmuşlardır.<br />
Can Şahna ve Bilge Dağalp (7) “BHV-1 ile doğal enfekte sığırlardan doğan<br />
buzağılarda maternal antikor düzeyi” adlı çalışmalarında BHV-1 ile doğal enfekte olan<br />
sığırların kolostrumunda kan örneklerine oranla yaklaşık 3 kat fazla antikor bulunduğu ve<br />
kolostrum alımına bağlı olarak yeni doğan buzağıların postnatal yaşamın ilk gününden itibaren<br />
erişkin sığırlara benzer düzeyde pasif bağışıklığa sahip olabildiklerini belirlemişlerdir.<br />
Çabalar ve Can-Şahna (8). “Doğu ve Güneydoğu Anadolu Bölgesinde Süt Sığırlarında<br />
Parainflüenza Virus -3, Bovine Herpes Virus-1 ve Respiratory Sinstial Virus<br />
Enfeksiyonlarının Sero-epidemiyolojisi” konulu çalışmalarında 471 kan serumu bu üç hastalık<br />
yönünden serum nötralizasyon testi ile incelenmiş 17 işletmenin 15’i (% 88.2) PIV-3’e karşı,<br />
16’sında (%94.1) BHV-1’e karşı ve 15’inde (%88.2) BRSV’ye karşı seropozitif bulunmuştur.<br />
Smith ve Ark.(16) “Atık fötal örneklerde BHV-1’in immonoperoxidaz taraması”<br />
konulu çalışmalarında 87 abort yapmış fötusa ait karaciğer ve dalak dokularını incelemişler 16<br />
vakadan 15’i pozitif sonuç vermiştir.<br />
Gür ve Akça (9) “BVD seropozitif mandalarda IBR/IPV ve sığır vebasının sero<br />
epidemiyolojisi” konulu çalışmalarında 452 manda kan örnekleri mikro nötralizasyon testi ile<br />
incelenmiş BVD için 1/5 ile 1/640 arasında değişen titrelerde 257 numunede (% 56.8), BHV-1<br />
için ise 1/1 ile 1/32 arasında değişen titrelerde 198 numunede (% 43.8) spesifik antikor varlığı<br />
ortaya konulmuştur.<br />
Okur Gümüşova ve Ark (11). “Bovine Viral Respiratory Dısease’in seroprevalansı”<br />
konulu çalışmalarında sığırlarda solunum sistemi hastalıklarına sebep olan BHV-1, BVDV,<br />
PIV-3, BAdV-1, BAdV-3 Virusları konvensiyonal metodlarla ( Serum nötralizasyon testi)<br />
çalışmışlar bu 5 virusa karşı sırası ile % 61.17, % 53.19, % 88.82, % 72.34, % 81.38 oranında<br />
antikor varlığı tespit etmişlerdir.<br />
Rodger ve Ark.(14) “Gebelik boyunca BHV-1’in deneysel yolla plasentaya ve fötusa<br />
infeksiyonundan sonra antijen varlığı ve mikroskobik lezyonları” konulu çalışmalarında<br />
virusun patogenesisinin abort olgularında plasenta ve beyni de içeren pek çok organda bulunan<br />
damar endotel hücrelerini kapsadığı, şüpheli vakalarda histopatolojik incelemenin de virus<br />
infeksiyonunun teşhisini doğrulamada etkin bir yöntem olduğunu ortaya koymuşlardır.<br />
Tan ve Ark.(16) “Aydın ili ve çevresindeki sığırcılık işletmelerinde BVDV<br />
enfeksiyonunun serolojik olarak araştırılması” konulu çalışmalarında Neutralization<br />
Peroxidase Linked Antibady (NPLA) testi sonucunda işletmelerin tamamına enfeksiyonun<br />
girdiği, işletmeler bazında %44 ile %100 lük arasında seropozitiflik saptandığı, toplanan kan<br />
örneklerinde antijen ELISA kiti kullanılarak yapılan çalışmalarda ise % 4.9 oranında<br />
pozitiflik saptandığı ve bunların da persiste enfekte olduğu değerlendirilmiştir.<br />
Yıldırım ve Ark.(17) “Kuzeydoğu Anadolu Bölgesindeki Sığırlarda Mavi Dil, IBR, PI-<br />
3, EBL ve BVD Enfeksiyonlarının Seroprevalansı” konulu çalışmalarında bölgeden toplanan<br />
kan örneklerinde Serum Neutralizasyon Testi sonucunda IBR % 59.48 ve BVD % 81.62<br />
oranında seropozitiflik saptamışlardır.<br />
Bu çalışmada PCR’ın seçilmesinin sebebi PCR’ın kısa sürede sonuç veren, duyarlılığı<br />
yüksek bir metot olmasıdır. Örneğin, Mars ve Van Manen (10) “Hollanda’da BVDV kontrolü<br />
maksadı ile kullanılan diagnostik yöntemler konulu çalışmalarında RT-PCR ve antijen ELISA<br />
15
kullanmışlar ve bunların duyarlıklarını tartışmışlar ve antijen ELISA ile teşhis edilemeyen<br />
suşların teşhisinde PCR’ın önemli rol oynadığını ortaya koymuşlardır.<br />
Rocha ve Ark.(13) “BHV-1 virusunun doğal enfekte sığır fötusunda PCR yöntemi ile<br />
taraması” konulu çalışmalarında PCR yönteminin virus izolasyon testine göre daha hızlı ve<br />
kolay uygulanabilir olduğunu saptamışlardır. Yine aynı çalışmada yapılan histopatolojik<br />
incelemelerde fötüsların kalplerinde solgunluk, şiddetli bilateral hemorajiler, subpleural<br />
peteşiyal hemorajiler, deri altında peritoneal alanlarda ve pleural kavitede ödem, mikroskobik<br />
incelemede ise multifokal pulmoner hemoraji, şiddetli renal interstisiyel hemoraji (daha çok<br />
kapsul altında) ve intrahepatik kolestazis tespit etmişlerdir.<br />
8.3.Materyal ve Metot:<br />
Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’ne bağlı Kuzeydoğu Anadolu<br />
Bölgesindeki illerden Enstitü Müdürlüğüne getirilen sığır atıkları bu projede çalışma<br />
materyalini oluşturacaktır.<br />
Metot olarak genel prosedürlere uygun olarak otopsileri yapılan buzağılardan alınan iç<br />
organlardan hazırlanan homojenize inokulumlardan; önce genel primerler kullanılarak PCR<br />
ile IBR ve BVD viruslarının genomlarının varlığı ortaya konacaktır. Daha sonraki aşamada,<br />
gerek IBR gerekse BVD viruslarının tipleri veya biyotiplerinin tespiti için, pozitif çıkan<br />
örneklerden ikinci tiplere özgü bir PCR kurulacaktır. Ayrıca, genel primerlerle pozitif olduğu<br />
tespit edilen ve – 80 0 C’de saklanan doku örneklerinden virus izolasyonu amaçlı olarak hücre<br />
kültürlerine ekimler yapılacaktır. IBR için CPE pozitif, BVD için hem CPE görülen ve hem de<br />
CPE görülmeyen hücre üst sıvılarından PCR ile etkenlerin varlığı ortaya konacaktır. Aynı<br />
hücrelerden immunoperoksidaz metodu ile de etkenler antijenik olarak belirlenecektir. Bu<br />
çalışmalar sonunda, etkenler izole ve identifiye edilerek, daha sonraki çalışmalarda<br />
kullanılmak üzere azot tankında saklanacaktır.<br />
Çalışmada, virolojik tanıya ilave olarak, atık materyallerinden %10’luk formol<br />
içerisine alınan dalak, akciğer, karaciğer, böbrek ve barsak örnekleri de histopatolojik olarak<br />
incelenecektir.<br />
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Çalışma sonucunda öncelikle, Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’ne<br />
bağlı Kuzeydoğu Anadolu Bölgesindeki illerden Enstitü Müdürlüğüne getirilen sığır<br />
atıklarında IBR ve BVD etkenlerinin prevalansı belirlenecektir. Böylelikle, bölgemizde<br />
atıkların etiyolojisine yönelik önemli veri elde edilecektir. Bu veriler ışığında, atık semptomu<br />
ile seyreden hastalıklarla mücadelede koruma ve kontrol çalışmaları daha bilinçli olarak<br />
yapılabilecek. Ayrıca, bu proje ile, çalışılan her iki virus için tip düzeyinde tespite imkan<br />
tanıyacak PCR metodunun laboratuarımıza yerleştirilmesi daha sonraki vakaların erken<br />
tanısında elimizi güçlendirecektir.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Ömer Faruk KÜÇÜKKALEM Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viral Teşhis Laboratuarı<br />
9.2.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim İbrahim SÖZDUTMAZ Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viral Teşhis Laboratuarı<br />
9.3.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Doç.Dr. Yavuz Selim SAĞLAM Atatürk<br />
Üniversitesi Veriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi<br />
16
9.4.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı :Veteriner Hekim Yıldıray KALKAN Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Patoloji Laboratuarı<br />
9.5.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Ahmet TEMUR Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Patoloji Laboratuarı<br />
9.6.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Serap KILIÇ ALTUN Erzurum Veteriner Kontrol ve<br />
Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Bakteriyoloji Laboratuarı<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1.Birimde Mevcut Donanım: Enstitümüz Viroloji ve Patoloji laboratuarında çalışmanın<br />
yapılabilmesi için gerekli donanım sağlanmıştır.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım: -<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri: Şu anda<br />
yürütülmekte olan bir proje mevcut değil.<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE :<br />
1. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- Üretime yönelik mal ve malzeme alımları<br />
03.2-Tüketime yönelik mal ve malzeme, alımları 17.300<br />
03.3- Yolluklar 500<br />
03.4- Görev giderleri<br />
03.5- Hizmet alımları<br />
03.6- Temsil ve tanıtma giderleri<br />
03.7- Menkulmal, gayri maddi hak alım, bakım ve onarım<br />
giderleri<br />
03.8- Gayrimenkul mal bakım ve onarım giderleri 300<br />
03.9-Tedavi ve cenaze giderleri<br />
TOPLAM 18.100<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-Mamul mal alımları 2.500<br />
06.2-Menkul sermaye üretim giderleri<br />
06.3-Gayrimaddi hak alımları<br />
06.4-Gayrimenkul alımları ve kamulaştırılması<br />
06.5-Gayrimenkul sermaye üretim giderleri<br />
06.6- Menkul malların büyük onarım giderleri 3.900<br />
06.7- Gayrimenkul büyük onarım giderleri<br />
06.8- Stok alımları (savunma dışında)<br />
06.9-Diğer sermaye giderler<br />
TOPLAM 6.400<br />
17
II. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI : YTL<br />
03.2.1.01 Kırtasiye Alımları : 1.000<br />
03.2.2.02 Temizlik Malzemesi Alımları : 300<br />
03.2.6.01 Laboratuvar Malzemesi ile Kimyevi ve Temrinlik Malzeme Alımları : 15.000<br />
03.2.6.02 Tıbbi Malzeme ve İlaç Alımları : 1.000<br />
03.3.1.01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları : 500<br />
03.8.1.01 Büro Bakım ve Onarımı Giderleri : 300<br />
06.1.3.03 Tıbbi Gereçler Alımları : 500<br />
06.1.3.04 Laboratuar Gereçleri Alımları : 2.000<br />
06.6.4.01 Yakacak alımları : 2.000<br />
06.6.4.02 Akaryakıt ve yağ alımları : 500<br />
06.6.4.03 Elektrik alımları : 1.000<br />
06.6.5.01 Posta ve Telgraf Giderleri : 200<br />
06.6.5.02 Telefon Abonelik ve Kullanım Ücretleri : 200<br />
TOPLAM 24.500<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ :<br />
DÖNEMLER YAPILACAK ÇALIŞMALAR<br />
01.01.2009-30.05.2009 (5 ay) Veri toplama, kimyasal ve sarf malzemenin hazırlanması<br />
01.06.2009-30.08.2009 (3 ay) Materyalin işlenmesi, değerlendirilmesi<br />
01.09.2009-31.12.2009 (4 ay) Projenin yazılması<br />
13.LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1.Ackermann M., Wyler R. (1984): The DNA of an IPV strain of Bovine Herpesvirus-1 in<br />
sacral ganglia durinf latency after intravaginal infection. Vet Microbiol., 9:53-63<br />
2-Ak S.,Fırat İ, Bozkurt H.H., Gülyaz V., Ak K.( 2002):T he Prevalence of Bovine Viral<br />
Diarrhoea Virus (BVDV) Infections in Cattle and Existence of Persistently Infected Cattle in<br />
the Trakya Region. Turk J Vet Anim Sci.26 .245-248<br />
3-Baker J.C.( 1990): Clinical aspects of bovine virus diarrhoea virus infection. Rev. Sci.<br />
Tech. off. Int. Epi. 9, 25-41.<br />
4-Baker J.A., McEntee K., Gillespie J.M. (1960): Effects of infectious bovine<br />
rhinotracheitis /infectious pustular vulvovaginitis virus on newborn calves. Cornell Vet.,<br />
50:156-170<br />
5-Brownlie J.( 1990): The pathogenesis of bovine virus diarrhoea virus infections. Rev. Sci.<br />
Tech. off. Int. Epi. 9, 43-59.<br />
6-Bulut H., Bolat Y., Özdarendeli A, Doymaz M.Z, Gürhan S.İ. (1998): Infectious Bovine<br />
Rhinotracheitis (IBR) Virus Antijenlerinin Lokalizasyonunun Immunoperoksidaz Boyama ile<br />
Gösterimi. Tr. J. of Veterinary and Animal Sicences 22. 267-271<br />
7-Can Şahna K., Bilge Dağalp S. (2002): BHV-1 ile Doğal Enfekte Sığırlardan Doğan<br />
Buzağılarda Maternal Antikor Düzeyi. Veteriner Hekimleri Mikrobiyoloji Dergisi Elektronik<br />
Versiyonu.Cilt 02 Sayı 2 Sayfa 6-12 (orijinal dergide sayfa7-12)<br />
8-Çabalar M.,<br />
Can Şahna C.( 2000): Doğu ve Güneydoğu Anadolu Bölgesinde Süt<br />
Sığırlarında Parainfluenza Virus-3, Bovine Herpes Virus-1 ve Respiratory Syncytial Virus<br />
Enfeksiyonlarının Seroepidemiyolojisi. Y.Y.Ü. Vet. Fak. Derg., 11 ( 2 ): 101-105<br />
9-Gür S., Akça Y.( 2008 ):BVD seropozitif mandalarda IBR/IPV ve sığır vebasının<br />
seroepidemiyolojisi. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 55, 45-50,<br />
18
10-Mars M.H., Van Manen C. (2005) : Diagnostic assays applied in BVDV control in The<br />
Netherlands. Preventive Veterinary Medicine 72 (2005) 43–48<br />
11-Okur Gümüşova Sç, Yazıcı Z., Albayrak H., And Cakıroğlu D. (2007): Seroprevalence<br />
Of Bovıne Vıral Respıratory Dıseases. Acta Veterinaria (Beograd), Vol. 57, No. 1, 11-16.<br />
12-Parsonson I.M., Snowdon W.A. (1975): The effect of natural and artificial breeding using<br />
bulls infected With or semen contaminated with IBR virus. Australian Veterinary Journal 51.<br />
365-369.<br />
13-Rocha M.A., Barbosa E.F., Guedes R.M.C., Lage A.P., Leite R.C., Gouveia<br />
A.M.G.(1998): Detection of BHV-1 in a Naturally Infected Bovine Fetus by a Nested PCR<br />
Assay.Veterinary Research Communications. 23. 133-141.<br />
14-Rodger S. M., Murray J., Underwood C., Buxton D. (2007): Microscopical Lesions and<br />
Antigen Distribution in Bovine Fetal Tissues and Placentae Following Experimental Infection<br />
with Bovine Herpesvirus-1 during Pregnancy. J. Comp. Path.,Vol.137, 94-101<br />
15-Smith K.C.(1997): Herpesvirus Abortion in Domestic Animals.The Veterinary Journal.<br />
153, 253-268<br />
16-Smith G.H., Collins K.J., Carman J. (1989): Use of İmmunoperoxidase test for dhe<br />
detection of bovine herpesvirus-1 in aborted fetal tissue.Vet.Diagn. İnvest 1: 39-44<br />
17-Tan M.T., M.Karaoğlu T., Erol N., Yıldırım Y. (2006): Serological and Virological<br />
Investigations of Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) Infection in Dairy Cattle Herds in<br />
Aydın Province.Turk. J. Vet. Anim. Sci.30 299-304.<br />
18-Yıldırım Y., Burgu İ. ( 2005): Kuzeydoğu Anadolu bölgesindeki sığırlarda mavidil (BT),<br />
IBR, PI-3, EBL ve BVD enfeksiyonlarının seroprevalansı. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52,<br />
113-117.<br />
19-http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00056.htm(Erişim tarihi: 16.01.2008)<br />
Infectious bovine rhinotracheitis/Infectious pustular vulvovaginitis<br />
20-http://edis.ifas.ufl.edu/VM023 (Erişim tarihi: 16.01.2008) Richey E. J. (2004) Veterinary<br />
Medicine-Physiological Science Department, Florida Cooperative Extension Service, Institute<br />
of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. Original publication date December<br />
10, 2004.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı-Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Ömer Faruk KÜÇÜKKALEM<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Ufuk DİNLER<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar : TAGEM<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi<br />
19
T.C.<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı :<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1.PROJE ADI : Erzurum yöresinde farklı <strong>hayvan</strong> türlerinde Campylobacter jejuni<br />
ve Campylobacter coli’nin izolasyonu, antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesi, izole<br />
edilen suşların PCR ile moleküler analizi.<br />
(The isolatıon and determination of antibiotic resistance in Campylobacter jejuni and<br />
Campylobacter coli in various animal sources in Erzurum and molecular analysis of isolated<br />
strains by PCR.)<br />
2.YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
3.PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Serap KILIÇ ALTUN<br />
Kurumu : Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı : X<br />
Araştırma Programı : X X<br />
5. PROJE SÜRESİ : 15 Ay<br />
5.1.Başlama Tarihi : 01.10.2008<br />
5.2.Bitiş Tarihi : 01.01.2010<br />
6.PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu araştırma, Erzurum yöresinde çeşitli kaynaklardan Campylobacter jejuni ve<br />
Campylobacter coli’nin izolasyonu, identifikasyonu, identifiye edilen suşların antibiyotik<br />
dirençlilikleri ve genetik olarak tiplendirilmesi amacıyla yapıldı. Çalışma kapsamında 100<br />
adet tavuk eti (1), 100 adet sığır safra kesesi, 100 adet koyun safra kesesi olmak üzere toplam<br />
600 adet numune incelenecek. Örnekler uygun besi yerlerine ekilecek. İzole edilen suşlar<br />
“Bakteri ve Maya Tanımlama Cihazı’’ ile antibiyotik dirençlilikleri tespit edilecek. İzole<br />
edilen suşların identifikasyonu amacıyla PCR kullanılacaktır.<br />
Bunun yanında elde edilen veriler değerlendirilerek, insan ve <strong>hayvan</strong> <strong>sağlığı</strong>nı<br />
yakından etkileyen bu iki termofilik Campylobacter türünün tespiti, identifikasyonu ve<br />
antibiyotik duyarlılığının belirlenmesi amaçlanmıştır.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER:<br />
Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, antibiyotik dirençlilik, PCR<br />
(Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, antibiotic resistance, PCR)<br />
20
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
İnsan ve <strong>hayvan</strong> <strong>sağlığı</strong>nı yakından etkileyen zoonoz hastalık etkeni olan termofilik<br />
Campylobacter türlerinin tespiti, identifikasyonu ve antibiyotik dirençliliğinin belirlenmesi<br />
amaçlanmıştır.<br />
Çeşitli <strong>hayvan</strong> türlerinden izole edilen Campylobacter coli ve Campylobacter jejuni’<br />
nin moleküler identifikasyonu ve antibiyotik dirençliliği saptanarak hem insan ve hem de<br />
<strong>hayvan</strong> <strong>sağlığı</strong> açısından rolü tespit edilmeye çalışılacak.<br />
8.2 Literatür Özeti:<br />
Ertaş ve Ark. (1) “Tavuk orijinli Campylobacter coli ve Campylobacter jejuni’nin PCR<br />
ile identifikasyonu” başlıklı araştırmasında, 150 adet kanatlı barsak ve karaciğer<br />
numunesinden PCR ile toplam 25 (%16.6) Campylobacter coli ve 32 (%21.3) Campylobacter<br />
jejuni identifiye etmişlerdir.<br />
Niwa ve Ark.(3) “Campylobacter jejuni ve Campylobacter coli’nin PCR ile<br />
identifikasyonu ve erythromycin dirençliliği” konulu <strong>araştırmaları</strong>nda, bu antibiyotiğe<br />
dirençliliklerini araştırmışlardır.<br />
Ertaş ve Ark. (4) “Koyun safra kesesi örneklerinden Campylobacter jejuni ve<br />
Campylobacte coli izolasyonu ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile identifikasyonu” başlıklı<br />
<strong>araştırmaları</strong>nda %34 C.jejuni, %32 C. coli izole ve identifiye etmişlerdir.<br />
Rönner ve Ark. (5) “İsviçrede insan ve tavuklardan Campylobacter jejuni ve<br />
Campylobacter coli’nin antibiyotik dirençliliği ve genotiplendirerek spesifik identifikasyonu”<br />
başlıklı çalışmalarında insan ve evcil <strong>hayvan</strong> suşlarının %7’sini ve tavuk suşlarının %2’sini<br />
kinolon gurubu antibiyotiklere dirençli bulmuşlardır.<br />
Shin ve Lee.(6)’nın yapmış oldukları araştırmada çeşitli antibiyotiklere karşı<br />
Campylobacter coli’nin gösterdiği dirençler belirlenmiştir.<br />
Moore ve Ark. (7)nın çalışmasında Campylobacter jejuni ve Campylobacter coli’nin<br />
florokinolonlar ve macrolid grubu antibiyotiklere dirençliliklerini araştırmışlardır.<br />
Öngen ve Ark. (8) rutin dışkı kültürlerinde üretilen Campylobacter türleri ve<br />
antibiyotik duyarlılıklarını değerlendirmişler ve makrolidler ilk tercih edilen antibiyotikler<br />
olmakla birlikte kinolonlardaki yüksek direnç, tercih sebebi olabileceğini düşünmüşlerdir.<br />
8.3.Materyal ve Metot:<br />
Çalışma kapsamında 150 adet sahipli veya sahipsiz köpekten alınacak rektal swap (5),<br />
150 adet değişik satış noktalarından alınan soğuk zincire uygun tüketime sunulmuş ambalajlı<br />
tavuk eti (1), 150 adet mezbahanede kesimi yapılan <strong>hayvan</strong>lardan alınan sığır safra kesesi ve<br />
150 adet koyun safra kesesi olmak üzere toplam 600 adet numune, çalışma materyalini<br />
oluşturacaktır.<br />
Metot olarak, usulüne uygun olarak alınan numuneler OIE’de belirtildiği şekilde soğuk<br />
zincire uyularak laboratuara getirilecektir (9).<br />
Numunelerden; ön zenginleştirme Preston Campylobacter Selektif Broth’a ekimi<br />
yapılarak 42 0 C’de 48 saat inkube edildikten sonra Campylobacter Selektif Agara ekimler<br />
yapılacak. Petriler C02’li gaz kiti ile sağlanan mikroaerofilik ortamda 42 0 C’de 48 saat inkube<br />
edilecek.<br />
Pozitif Campylobacter suşların antibiyogram duyarlılıkları “VITEK-II Compaq” ile 13<br />
farklı antibiyotik ile bakılacak.<br />
21
Etkenlerin PCR ile identifikasyonunda her iki türe ait ceuE genine spesifik dört farklı<br />
primer kullanılacaktır.<br />
8.4 Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Erzurum yöresinde çeşitli kaynaklardan Campylobacter jejuni ve Campylobacter<br />
coli’nin izolasyonu, identifikasyonu yapılacak. İdentifiye edilen suşların antibiyotik<br />
dirençlilikleri belirlenerek uygun antibiyotik seçimi sağlanmış olunacaktır.<br />
Yine bu çalışmada Bakteri ve Maya Tanımlama Cihazı ( VITEK-II COMPAQ ) ve<br />
PCR cihazı ile Erzurum yöresindeki Campylobacter alt türleri tanımlanarak yöredeki C.coli<br />
ve C.jejuni enfeksiyonlarının varlığı hakkında fikir verecektir.<br />
Bunun yanında elde edilen veriler değerlendirilerek insan ve <strong>hayvan</strong> <strong>sağlığı</strong>nı yakından<br />
etkileyen bu iki termofilik Campylobacter türünün tespiti, identifikasyonu ve antibiyotik<br />
duyarlılığının belirlenmesi neticesinde bu türler ile daha etkin mücadele yapılması<br />
sağlanacaktır.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Serap KILIÇ ALTUN Erzurum Veteriner<br />
Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Bakteriyoloji laboratuarı<br />
9.2.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Uzman Veteriner Hekim Şenay SEYİTOĞLU<br />
Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Bakteriyoloji laboratuarı<br />
9.3.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Atatürk Üniversitesi Yrd.Doç.Dr.Ekrem KİREÇCİ<br />
Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi<br />
9.4.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim İbrahim SÖZDUTMAZ Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viroloji laboratuarı<br />
9.5.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Ömer Faruk KÜÇÜKKALEM<br />
Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viroloji laboratuarı<br />
9.6.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner hekim Yıldıray KALKAN Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Patoloji Laboratuarı<br />
9.7. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı :Veteriner Hekim Bünyamin İREHAN Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Bakteriyoloji laboratuarı<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Enstitümüz bakteriyoloji laboratuarında çalışmanın<br />
yapılabilmesi için gerekli donanım sağlanmıştır.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım : -<br />
10.3.Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri : Şu anda<br />
yürütülmekte olan bir proje mevcut değildir.<br />
22
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE:<br />
1. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- Üretime yönelik mal ve malzeme alımları<br />
03.2- Tüketime yönelik mal ve malzeme,<br />
alımları<br />
23.300<br />
03.3- Yolluklar 500<br />
03.4- Görev giderleri<br />
03.5- Hizmet alımları<br />
03.6- Temsil ve tanıtma giderleri<br />
03.7- Menkulmal, gayri maddi hak alım, bakım<br />
ve onarım giderleri<br />
03.8- Gayrimenkul mal bakım ve onarım<br />
300<br />
giderleri<br />
03.9-Tedavi ve cenaze giderleri<br />
TOPLAM 24.100<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-Mamul mal alımları 2.500<br />
06.2-Menkul sermaye üretim giderleri<br />
06.3-Gayrimaddi hak alımları<br />
06.4-Gayrimenkul alımları ve kamulaştırılması<br />
06.5-Gayrimenkul sermaye üretim giderleri<br />
06.6- Menkul malların büyük onarım giderleri 3.000<br />
06.7- Gayrimenkul büyük onarım giderleri<br />
06.8- Stok alımları (savunma dışında)<br />
06.9-Diğer sermaye giderler<br />
TOPLAM 5.500<br />
II. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI YTL<br />
03.2.1.01 Kırtasiye Alımları : 500<br />
03.2.2.02 Temizlik Malzemesi Alımları : 300<br />
03.2.6.01 Laboratuvar Malzemesi ile Kimyevi ve Temrinlik Malzeme Alımları : 22.000<br />
03.2.6.02 Tıbbi Malzeme ve İlaç Alımları : 500<br />
03.3.1.01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları : 500<br />
03.8.1.01 Büro Bakım ve Onarımı Giderleri : 300<br />
06.1.3.03 Tıbbi Gereçler Alımları : 500<br />
06.1.3.04 Laboratuar Gereçleri Alımları : 2.000<br />
06.6.4.01 Yakacak alımları : 1.000<br />
06.6.4.02 Akaryakıt ve yağ alımları : 500<br />
06.6.4.03 Elektrik alımları : 1.000<br />
06.6.5.01 Posta ve Telgraf Giderleri : 200<br />
06.6.5.02 Telefon Abonelik ve Kullanım Ücretleri : 300<br />
TOPLAM 29.600<br />
23
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
DÖNEMLER YAPILACAK ÇALIŞMALAR<br />
01.10.2008-31.12.2008 (3 ay) Numunelerin toplanması<br />
01.01.2009-31.08.2009 (8 ay)<br />
Teşhis kit ve kimyasal<br />
numunelerin işlenmesi<br />
alımlarının sağlanması,<br />
01.09.209-31.12.2009 (4 ay) Projenin yazılması<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1- Erbaş H.B., Çetinkaya B., Muz A., Öngör H.(2002) : Tavuk orijinli Campylobacter coli<br />
ve Campylobacter jejuni’nin Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile İdentifikasyonu. Türk<br />
J.Vet.. Anim. Sci. 26.1447-1452<br />
2-Aydın F., Gümüşsoy S.K., İça T., Sümerkan B., Eşel D., Akan M., Özdemir A. (2007):<br />
The Prevalence of Campylobacter jejuni in kayseri, Turkey, and Molecular Analysis of<br />
İsolated Strains by PCR-RFLP. Türk J.Vet.. Anim. Sci. 31(1):13-19<br />
3-Niwa H., Chuma T., Okamoto K., Itoh K. (2001): Rapid detection of mutations associated<br />
with resistance to erythromycin in Campylobacter jejuni/coli by PCR line probe assay<br />
.International Journal of Antimicrobial Agents 18.359-364.<br />
4- Ertaş H.B., Özbey G., Kılıç A., Muz A.(2003): Isolation of Campylobacter jejuni and<br />
Campylobacter coli from the Gall Bladder Samples of Sheep and Identification by Polimerase<br />
Chain Reaction .Journal of Veteriner Medicine Series B 50 (6), 294-297<br />
5-Rönner Anna-Clara., Olsson Engvall E., Andersson L., Kaijser B.(2004): Species<br />
identification by genotyping and determination of antibiotic resistance in Campylobacter<br />
jejuni and Campylobacter coli from humans and chickens in Sweden.International Journal of<br />
Food Microbiology 96.173-179<br />
6-Shin E., Lee Y.(2007): Antimicrobial resistance of 114 porcine isolates of Campylobacter<br />
coli. International Journal of Food Microbiology 118.223-227<br />
7-Moore J.E., Barton M.D., Blair I.S., Corcoran D., Dooley J.S.G., Fanning S., Kempf I.,<br />
Lastovica A.J., Lowery C.J., Matsuda M., McDowell D.A., McMahon A., Millar B.C.,<br />
Rao R.J., Rooney P.J., Seal B.S., Snelling W.J., Tolba O.(2006): The Epidemiology of<br />
Antibiotic Eesistance in Campylobacter.Microbes and İnfections 8.1955-1966<br />
8-Öngen B., Nazik H., Kaya I.(2007): Rutin dışkı kültürlerinde üretilen Campylobacter<br />
türleri ve antibiyotik duyarlılıkları: 5 yıllık sonuçların değerlendirilmesi.ANKEM Derg (37-<br />
41)<br />
9-Manuel of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals 5th edition 2004<br />
chapter 2.8.10<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı-Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Serap KILIÇ ALTUN<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Ufuk DİNLER<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar : TAGEM<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi<br />
24
T.C.<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1.PROJE ADI: Kuzey Doğu Anadolu Bölgesindeki sığırlarda Neospora caninum ve<br />
Toxoplasma gondii ‘nin varlığının ve yaygınlığının serolojik olarak araştırılması.<br />
2.YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
3.PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Zekai BASTEM<br />
Kurumu : Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4.Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı : X<br />
Araştırma Programı : X X<br />
5.PROJE SÜRESİ : 1 yıl (12 ay)<br />
5.1.Başlama Tarihi : 01.06.2008<br />
5.2.Bitiş Tarihi : 01.06.2009<br />
6.PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu araştırmada Kuzey Doğu Anadolu bölgesinde çeşitli illerde’ ki sığırlarda paraziter<br />
abortlara neden olabilen Neospora caninum ve Toxoplasma gondii yaygınlığının belirlenmesi<br />
planlanmıştır.<br />
Bu amaçla bölgedeki sığırlardan kan örnekleri toplanarak, bu kanlara ait serumlarda<br />
ELİSA yöntemi ile N. caninum ve T. gondii antikorları tespit edilip, bu etkenlerin bölgedeki<br />
yaygınlığı ortaya konulacaktır.<br />
Elde edilen veriler değerlendirilerek, bölgede belirlenecek olan enfeksiyonun<br />
durumuna göre gerekli olan eğitim ve korumaya yönelik uygulamalar ele alınacaktır.<br />
7.ANAHTAR KELİMELER: Kuzey Doğu Anadolu Bölgesi, N. caninum, Sığır, T. gondii<br />
8.PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1.Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Amacı: Bölgedeki sığırlarda Neospora caninum ve Toxoplasma gondii‘nin varlığı ve<br />
yaygınlığının ortaya konulması amaçlanmıştır.<br />
Gerekçesi: Kuzey Doğu Anadolu Bölgesinde büyükbaş <strong>hayvan</strong>cılığının önemli bir yeri<br />
bulunmaktadır. Gerek bölge gerekse ülke <strong>hayvan</strong>cılığını olumsuz etkileyen faktörler içerisinde<br />
25
abortlar önemli bir yer tutmaktadır. Hayvancılık üzerinde özellikle abortlarda oldukça etkili<br />
olabilen Neospora caninum ve Toxoplasma gondii‘nin varlığı ve yaygınlığı üzerine bölgedeki<br />
birçok ilde yeterli çalışma yapılmamıştır.<br />
8.2.Literatür Özeti:<br />
Dubey ve ark., (9,10) N. caninum ve T. gondii’nin intraselüler protozoon olduğunu,<br />
morfolojik ve biyolojik özellikleriyle birbirleriyle benzerlik gösterdiklerini, her iki parazittin<br />
de sığır, at, koyun, keçi gibi <strong>hayvan</strong>larda neonatal ölüm ve abortlara sebebiyet verdiğini<br />
belirtmektedirler.<br />
Hobson ve ark., (12) ve Romero ve ark., (17) her iki parazitin sığırlarda yaptığı<br />
abortların yanında, et ve süt verimini düşürdüğü ve bu nedenle önemli miktarda ekonomik<br />
kayba neden olduğunu, Akça ve ark.,(1) ve Bartels ve ark.,(6) sığırlarda N. caninum<br />
enfeksiyonunun vertikal (transplasental) ve horizontal (sığırdan sığıra, köpekten sığıra) olarak<br />
bulaşabileceğini belirtmekle birlikte enfeksiyonun yayılmasında enfekte çoban köpekleri ve<br />
persiste sığırlar önemli rol oynadığını bildirmektedirler.<br />
Türkiye’de sığırlarında N. caninum’un yaygınlığı % 2-32,72 arasında (1,7) olup, Kuzey<br />
Doğu Anadolu Bölgesinde sığırlara yönelik yapılan tek çalışma mevcut olup Akça ve ark.<br />
(1,2), Kars’ ta %2 olarak bildirilmiştir.<br />
Türkiye’ de sığırlarda T. gondii’nin yaygınlığı; %27,61-70,49 arasında (3, 4, 5, 8, 11,<br />
13, 14, 15, 16, 18) olup, bölgede konuyla ilgili çalışmaya rastlanmamıştır.<br />
Aktaş ve ark.(3) Ocak 2003 – Haziran 2004 tarihlerinde Elazığ, Malatya, Muş ve<br />
Bingöl illerinde sığırlarda Neospora caninum’un araştırılması amacıyla yaptıkları çalışmada<br />
değişik yaş ve ırkta toplam 513 sığır ile atık yaptığı belirlenen 32 inekten kan örnekleri<br />
alınmış ve serumları çıkarılmış. Bu serumlarda enzim-linked immunosorbent assay (ELİSA)<br />
testi ile N. caninum’a karşı şekillenen antikorlar araştırılmıştır. ELİSA testi ile N. caninum<br />
antikorları yönünden muayene edilen 513 sığırın 36 (% 7,01)’sı seropozitif bulunmuştur.<br />
Seropozitiflik oranının Elazığ’da %15, Malatya’da % 4, Muş’ta % 4,86 ve Bingöl’de % 4,69<br />
olduğu belirlenmiştir. Atık yapan ineklerdeki seropozitiflik oranı ise %3,12 olarak<br />
belirlenmişlerdir.<br />
İça ve ark. (13) Kayseri yöresinde sığırlarda Neospora caninum'un seroprevalansını<br />
belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada , 186 sığırdan kan örnekleri toplanmış ve bu<br />
örneklerden serum elde edilmiştir. Serum örnekleri ticari kompetatif ELISA (c-ELISA) kiti ile<br />
N.caninum'a karşı gelişen antikorlar yönünden analiz edilmiştir. ELISA test sonuçlarına göre<br />
Kayseri yöresinde N.caninum'un seroprevalansı % 7 olarak bulunmuştur. Abort yapan 9<br />
inekten 3'ü (%33,3) seropozitif bulunmuştur.<br />
Nalbantoğlu ve ark. (16) yaptıkları çalışmada Kuzey Kıbrıs Türk Cumhuriyeti'nin<br />
farklı bölgelerinden değişik yaş gruplarından 98 sığıra ait serumları Sabin Feldman Dye testi<br />
ve İndirekt Floresan Antikor testi ile Toxoplasma gondii antikorları yönünden muayene<br />
etmişler ve ,yaptıkları muayenede 98 serumdan SF testinde 34 (% 34,69)'., IFA testinde 30 (%<br />
30,61)’u seropozitif bulmuşlardır.<br />
8.3. MATERYAL VE METOT:<br />
Çalışmada Kuzey Doğu Anadolu Bölgesindeki sığırlardan toplanacak kan örnekleri<br />
materyali oluşturacaktır.<br />
Bu amaçla bölgeyi temsil edecek tarzda sığırlardan kan örnekleri toplanarak soğuk<br />
zincirde laboratuara getirilerek burada kan serumları usulüne uygun olarak çıkarılacaktır. Kan<br />
serumları ELİSA yöntemiyle N. caninum ve T.gondii antikorları yönünden araştırılacaktır.<br />
26
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Bölgede sığırlarda N. caninum ve T.gondii’nin yaygınlığına dair fazla çalışma<br />
yapılmamış olması nedeniyle öncelikle bölgede bu etkenlerin yaygınlığı belirlenmiş olacak,<br />
bunun yanında daha önce bölgede yapılan çalışmalarda atıklara neden olan bakteriyel ve viral<br />
etkenler arasında belirlenen sonuçlarda bu parazitlerin yeri belirlenecektir.<br />
Bölgede yaşayan insanların çoğunluğu <strong>hayvan</strong>cılıkla geçimini sağlamakta, bunun<br />
yanında bölgede yetiştiriciliği yapılan <strong>hayvan</strong> grupları arasında sığırcılığın başta gelmesi<br />
nedeniyle bu <strong>hayvan</strong>larda meydana gelen abortların bölge insanını dolayısıyla ülke<br />
ekonomisini olumsuz yönden önemli derecede etkilemektedir.<br />
Çalışma sonucunda abort nedeni olan N. caninum ve T. gondii nin yaygınlığı<br />
belirlenecek olup, hem literatüre katkıda bulunulmuş olunacak hem de bu etkenlere karşı<br />
bölgede tedavi ve korumaya yönelik önlemler belirlenecektir. Sonuç olarak hem bölge hem de<br />
ülke ekonomisine olumlu anlamda katkıda bulunulmuş olacaktır.<br />
9.ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Zekai BASTEM Erzurum Veteriner Kontrol<br />
ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü<br />
9.2.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı :Veteriner Hekim Dr.Hazma AVCIOĞLU Atatürk<br />
Üniversitesi Veteriner Fakültesi Öğretim Üyesi<br />
9.3.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Yrd.Doç.Dr. İbrahim BALKAYA Atatürk<br />
Üniversitesi Veteriner Fakültesi Öğretim Üyesi<br />
9.4.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Yıldıray KALKAN Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Patoloji Laboratuarı<br />
9.5.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Ömer Faruk KÜÇÜKKALEM<br />
Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viroloji laboratuarı<br />
9.6.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı :Veteriner hekim İbrahim SÖZDUTMAZ Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viroloji Laboratuarı<br />
9.7. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Biyolog Suha Kürşat ÖNALAN Erzurum Veteriner<br />
Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Gıda Laboratuarı<br />
9.8. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı :Veteriner Hekim Serap KILIÇ ALTUN Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Bakteriyoloji laboratuarı<br />
10.ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1.Birimde Mevcut Donanım: Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
parazitoloji laboratuarında altyapı yeterlidir.<br />
10.2.Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım:<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri:Şu anda Pendik Veteriner<br />
Kontrol ve Araştırma Enstitüsü liderliğindeki ülkesel Babesiosis projesi yürütülmektedir.<br />
27
11.TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- Üretime yönelik mal ve malzeme alımları<br />
03.2-Tüketime yönelik mal ve malzeme, alımları 12.300<br />
03.3- Yolluklar 500<br />
03.4- Görev giderleri<br />
03.5- Hizmet alımları<br />
03.6- Temsil ve tanıtma giderleri<br />
03.7- Menkulmal, gayrimaddi hak alım, bakım ve<br />
onarım giderleri<br />
03.8- Gayrimenkul mal bakım ve onarım giderleri 300<br />
03.9-Tedavi ve cenaze giderleri<br />
TOPLAM 13.100<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ<br />
1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-Mamul mal alımları 2.500<br />
06.2-Menkul sermaye üretim giderleri<br />
06.3-Gayrimaddi hak alımları<br />
06.4-Gayrimenkul alımları ve kamulaştırılması<br />
06.5-Gayrimenkul sermaye üretim giderleri<br />
06.6- Menkul malların büyük onarım giderleri 1.900<br />
06.7- Gayrimenkul büyük onarım giderleri<br />
06.8- Stok alımları (savunma dışında)<br />
06.9-Diğer sermaye giderler<br />
TOPLAM 4.400<br />
II. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI : YTL<br />
03.2.1.01 Kırtasiye Alımları : 1.000<br />
03.2.2.02 Temizlik Malzemesi Alımları : 300<br />
03.2.6.01 Laboratuvar Malzemesi ile Kimyevi ve Temrinlik Malzeme Alımları : 10.000<br />
03.2.6.02 Tıbbi Malzeme ve İlaç Alımları : 1.000<br />
03.3.1.01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları : 500<br />
03.8.1.01 Büro Bakım ve Onarımı Giderleri : 300<br />
06.1.3.03 Tıbbi Gereçler Alımları : 500<br />
06.1.3.04 Laboratuar Gereçleri Alımları : 2.000<br />
06.6.4.01 Yakacak alımları : 0<br />
06.6.4.02 Akaryakıt ve yağ alımları : 500<br />
06.6.4.03 Elektrik alımları : 1.000<br />
06.6.5.01 Posta ve Telgraf Giderleri : 200<br />
06.6.5.02 Telefon Abonelik ve Kullanım Ücretleri : 200<br />
TOPLAM : 17.500<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
DÖNEMLER YAPILACAK ÇALIŞMALAR<br />
01.06.2008-31.11.2008 (6 Ay) Veri toplama, kimyasal ve sarf malzemelerin hazırlanması<br />
01.12.2008-31.02.2008 (3 Ay) Materyalin işlenmesi, değerlendirilmesi<br />
01.03.2009-31.05.2009 (3 Ay) Projenin yazılması<br />
28
13.LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1-Akça A., Gökçe H, (2003): Kars yöresi yerli ve kültür ırkı ithal sığırlarında Neospora caninum'un<br />
seroprevalansı. XII. Ulusal Parazitoloji Kongresi, Konya.<br />
2-Akca, A., Gokce, H.I., Guy, C.S., McGarry, J.W., Williams, D.J. (2005): Prevalence of<br />
antibodies to Neospora caninum in local andimported cattle breeds in the Kars province of Turkey.<br />
Res.Vet. Sci. 78, 123–126.<br />
3-Aktaş M., Babür C., Karaer Z., Dumanlı N. (2000): Elazığ yöresinde sığırlarda Sabin-Feldman<br />
(SF) testi ile anti-Toxoplasma gondii antikorlarının belirlenmesi. Türk J Vet Anim Sci; 24: 535-538.<br />
4-Aslan G, Babür C. (2002):Şanlıurfa'da koyun ve sığırlar ile mezbaha çalışanlarında Toxoplasma<br />
gondii seroprevalansı.Türk Mikrobiyol Cem Derg; 32(1-2): 102-105.<br />
5-Aslantaş Ö., Babür C, (2000): Kars Yöresinde sığır ve koyunlarda Bruselloz ve Toksoplazmoz<br />
üzerine seroepidemiyolojik araştırmalar.Etlik Vet Mikrob.Derg; 11(1-2):47-55.<br />
6-Bartels, C.J., Van Maanen, C., Van der Meulen, A.M., Dijkstra, T., Wouda, W. (2005):<br />
Evaluation of three enzyme-linked immunosorbentassays for detection of antibodies to Neospora<br />
caninum inbulk milk. Vet. Parasitol. 131, 235–246.<br />
7-Bıyıkoğlu G., Aksoy E., Bozkır M., Küçükayan U., Ertürk A. (2003): İç Anadolu Bölgesi<br />
sığırlarında Neospora caninum’un varlığının araştırılması. 13. Ulusal Parazitoloji Kongresi. Eylül, 8-<br />
12, Konya- Türkiye.<br />
8-Çiçek H., Babür C, (2002): Afyon yöresinde sığırlarda Toxoplasma gondii’ nin Sabin Feldman (SF)<br />
Dye testi ile seroprevalansı. Etlik Vet Mikrob Derg; 13(2): 1-3.<br />
9- Dubey J.P., Lindsay D.S. (1996): A review of Neospora caninum andneosporosis. Vet Parasitol;67:<br />
l-<br />
10- Dubey J.P., Carpenter J.L., Speer C.A., Topper M.J, Uggla A. (1988): Newly recognized fatal<br />
protozoan disease of dogs. J Am VetMed Assoc;192:1269-1285.<br />
11-Eren H., Babür C., Erdal N., Sert H. (1997): Ankara ve Aydın yöresi sığırlarında Sabin -Feldman<br />
testi ile Toxoplasma gondii’nin prevalansı. Türk Hij Den Biyol Derg; 54 (1-2): 31-34.<br />
12-Hobson, J.C., Duffield, T.F., Kelton, D., Lissemore, K., Hietala, S.K.,Leslie, K.E., McEwen,<br />
B., Cramer, G., Peregrine, A.S. (2002): Neospora caninum serostatus and milk production of<br />
Holsteincattle. J. Am. Vet. Med. Assoc. 221, 1160–1164.<br />
13-İnci A., Aydın N., Babür C., Çam Y., Akdoğan C., Kuzan Ş. (1999): Kayseri yöresinde sığır ve<br />
koyunlarda Toksoplazmozis ve Brusellozis üzerine seroepidemiyolojik araştırmalar. Pendik Vet<br />
Mikrobiyol Derg; 30 (1): 41 - 46.<br />
14-Karatepe B., Babür C., Karatepe M. (2001): Amasya yöresi sığırlarında Toxoplasma gondii’nin<br />
seroprevelansı. Etlik Vet Mikrob Derg; 12 (1-2): 8-11.<br />
15-Karatepe B., Babür C., Karatepe M., Çakmak A., Nalbantoğlu S. (2003): Niğde yöresinde<br />
sığırlarda Toxoplasma gondii’ nin seroprevalansı. Etlik Vet Mikrob Derg; 14(1-2): 18-<br />
16-Nalbantoğlu S., Vatansever Z., Deniz A., Babür C., Çakmak A., Karaer Z., Korudağ E.<br />
(2002): Kuzey Kıbrıs Türk Cumhuriyeti'nde Sabin-Feldman (SF) ve indirekt floresan antikor (İFA)<br />
testleri ile sığırlarda Toxoplasma gondii’ nin seroprevalansı. Türk J Vet Anim Sci; 26: 825-828.<br />
17-Romero, J.J., Breda, S.V., Vargas, B., Dolz, G., Frankena, K. (2005): Effect of neosporosis on<br />
productive and reproductive performance of dairy cattle in Costa Rica. Theriogenology.<br />
18-Yıldız K., Babür C., Kılıç S., Aydenizöz M., Dalkılıç İ. (2000): Kırıkkale Mezbahası'nda kesilen<br />
koyun ve sığırlar ile mezbaha çalışanlarında anti-Toxoplasma gondii antikorlarının araştırılması. T<br />
Parazitol Derg; 24(2): 180-185.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı-Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Zekai BASTEM<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Ufuk DİNLER<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar : TAGEM<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi<br />
29
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI: Adana bölgesinde görülen neonatal buzağı enfeksiyonlarının morbidite<br />
ve mortaliteleri ile bunları etkileyen risk faktörlerinin belirlenmesi<br />
“Determination of morbidity and mortality of the neonatal calf infections and risk factors in<br />
vicinity of Adana.”<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Adana Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Veteriner Hekim Cemal KURT<br />
Kurumu :Adana Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı: ______________________<br />
Araştırma Programı : _______________________<br />
5. PROJE SÜRESİ : 24 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : 01,01,2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : 31,12,2011<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
ÖZET<br />
Planan bu Proje, ocak 2009-aralık 2011 tarihleri arasında Adana bölgesinde bulunan<br />
<strong>hayvan</strong>cılık işletmelerinden tesadüfi olarak seçilen 5 odak ve 20 işletmede doğan buzağılarda<br />
görülen neonatal enfeksiyonları kapsayacaktır. Çalışma esnasında her işletmede ayrı ayrı anket<br />
uygulanarak ve rutin ziyaretler yapılarak çiftliklerin sevk ve idaresi, sütçü sığırların sağlık<br />
problemleri ve neonatal buzağıların morbidite ve mortalite oranları ile bunları etkileyen risk<br />
faktörleri belirlenecektir.<br />
Hasta ve sağlıklı buzağılardan alınan dışkı, kan ve nasal svaplar bakteriyel, viral,<br />
paraziter hastalık etkenleri yönünden ölen buzağılar ise otopsileri yapılarak patolojik<br />
muayeneleri yapılacaktır.<br />
Abstract: This project will include the neonatal calf infections that will be born in randomly<br />
selected 10 focus and 50 farms of animal breeding farms in vicinity of Adana between January<br />
2009 - December 2011. During the research, surveys will be applied, farms will be visited and<br />
the management and sending of the farms, the health problems of dairy cattle, the morbidity<br />
and mortality rate of the neonatal calfs and risk factors will be determined. For this purpose,<br />
30
feces, blood and nasal swaps will be obtained from healthy calf; necrosy and pathologic<br />
examination will be done in the mortal cases due to diseases will be caused by bacteria,<br />
viruses and parasites.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER:<br />
Neonatal buzağı, risk faktörleri, morbidite, mortalite<br />
Neonatal calf, risk factors, morbidity, morality<br />
8.PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Tarım ve <strong>hayvan</strong>cılık sektörü, Ülkemizin ekonomisinde her zaman önemli bir yere<br />
sahip olmuştur. Sanayileşmeye paralel olarak gelişmiş ülkelerde tarım ve <strong>hayvan</strong>cılık büyük<br />
işletmeler halinde yapılmakta ve nüfusun küçük bir kısmı bu sektörde istihdam edilmektedir.<br />
Ancak gelişmekte olan ülkelerde ve ülkemizde bu sektör halen en önemli iş kolu olma<br />
özelliğini korumakta ve nufusun önemli bir kısmına küçük aile işletmelerinde iş imkanı<br />
sunmaktadır. Küçük aile işletmeleri şeklinde yapılan yetiştiricilik daha yönetsel ve sağlık<br />
sorunlarını da beraberinde getirmektedir. Adana bölgesinde <strong>hayvan</strong>cılık sektörünün en önemli<br />
kolu sığır yetiştiriciliğidir. Hayvancılık ve <strong>hayvan</strong>sal ürünlerin üretimi ve pazarlaması yöre<br />
halkı için önemli bir ekonomik girdi oluşturmaktadır. Bu nedenle yetiştirme ve üretim<br />
sırasında meydana gelen kayıpların önlenmesi yöre halkının ekonomik kazancın daha da<br />
arttırılmasına, hem üreticinin refahı hem de ülke ekonomisine büyük katkı sağlayacaktır.<br />
Yöre <strong>hayvan</strong>cılığının önemli sorunlarının başında, enfeksiyöz ve non-enfeksiyöz<br />
hastalıklar ve çiftlik sevk ve idare 'management' (bakım, besleme, yetiştiricilik) hatalarından<br />
kaynaklanan kayıplar gelmektedir. Buna rağmen bugüne kadar Adana yöresinde neonatal<br />
buzağı kayıplarına sebep olan sorunları kapsayan herhangi bir çalışma gerçekleştirilmemiştir.<br />
Bu projede ilk defa yöredeki çiftliklerin demografisi, verim özellikleri, sevk ve idare<br />
yöntemleri (bakım,besleme, yetiştiricilik) belirlenerek yörede yaygın olan neonatal buzağı<br />
hastalıklarının, etiolojileri ile kimi risk faktörleri de belirlenmeye çalışılacaktır.<br />
Bu proje çerçevesinde elde edilen veriler, hem sahadaki veteriner hekimlik hizmeti<br />
veren kişi veya kuruluşların hem de üreticinin kendisinin koruma ve kontrol stratejilerini<br />
saptamasına yardımcı olacaktır.<br />
8.2 Literatür Özeti:<br />
İnsan nüfusunun artışına ve özellikle de ikinci dünya savaşından sonra sanayileşmeye<br />
paralel olarak gıda ihtiyacının artması <strong>hayvan</strong> yetiştiriciliğinin daha intensif olarak<br />
yapılmasına, dolayısıyla da çiftlik sevk ve idaresinin (management) daha komplike hale<br />
gelmesine yol açmıştır. Bu durum ise üreticilerin, zamanında ve yerinde uygun karar<br />
alabilmeleri için çiftlik ve çiftçilikle ilgili daha detaylı verilere ihtiyaç duymasına neden<br />
olmuştur (Halpin, 1975).<br />
Çiftlik sevk ve idaresi 'management' <strong>hayvan</strong> hastalıklarının epidemiyolojilerinin<br />
değerlendirilmesinde ve çiftlik verimliliğinin belirlenmesinde çok ciddi önem arz etmektedir<br />
(Halpin, 1975; Thrusfield, 1996; Simianer ve ark., 1991). Hayvancılık işletmelerindeki en<br />
önemli ekonomik kayıpların, hastalıklardan ve çiftlik sevk ve idaresindeki eksikliklerden<br />
kaynaklandığı bilinmektedir (Simianer ve ark., 1991; Smith, 1998; Alejandrino ve ark., 1999;<br />
Broom ve Corke, 2002). Nitekim saha çalışmaları çiftlik sevk ve idaresi ile enfeksiyöz<br />
(paratuberculosis, tuberculosis, brucellosis) veya non-enfeksiyöz (topallık, ketozis) hastalıklar<br />
arasında ilişki olduğunu göstermektedir (Griffin ve ark., 1993; Çetinkaya ve ark., 1997; Price,<br />
31
1997; Omar ve ark., 2000). Dolayısıyla çiftlik sevk ve idaresi (management) ile ilgili bilgilerin<br />
yanısıra ortaya çıkan hastalıkların da belirlenmesi gerekmektedir.<br />
Hastalık kayıtları, çok önemli bilgilerin toplanmasını sağlayarak çiftçilerin ve veteriner<br />
hekimlerin koruyucu önlemleri alması aşamasında önceliklerin belirlenmesinde yardımcı olur<br />
ve böylece hastalıklardan kaynaklanan ekonomik kayıpların da önlenmesi mümkün olur<br />
(Thrusfield, 1996). Çiftlik verimliliğini etkileyen diğer bir önemli hususta sürüdeki<br />
ayıklamadır (Esslemont ve Kossaibati, 1997; Stevenson ve Lean, 1998, Rajala-Schultz ve<br />
Gröhn, 1999). Ayıklama, zorunlu olarak yani <strong>hayvan</strong>ın sürüden ayıklanmasından başka<br />
seçenek bulunmadığında (enfeksiyöz hastalıklar, infertilite) veya isteğe bağlı olarak (düşük süt<br />
verimi, yaşlılık) gerçekleşir (Stevenson ve gençleşmesini ve dolayısıyla işletmenin kazancının<br />
artmasını sağlarken, zorunlu ayıklama ise ekonomik kayba yol açar (Esslemont ve Kossaibati,<br />
1997; Stevenson ve Lean, 1998, Gröhn ve ark., 1998; Rajala-Schultz ve Gröhn, 1999).<br />
Yapılan araştırmalar dünyanın farklı bölgelerinde enfeksiyöz ve non enefeksiyöz<br />
hastalıklar, verim düşüklüğü ve yaşılık gibi sebeplerden sığırların yaklaşık % 20-35'i<br />
ayıklandığını göstermektedir. (Esslemont ve Kossaibati, 1997; Stevenson ve Lean, 1998,<br />
Gröhn ve ark., 1998; Rajala-Schultz ve Gröhn, 1999, Dutil ve ark., 1999).<br />
Çiftlik verimliliğini etkileyen bir diğer önemli faktör ise düzenli ve sağlıklı buzağı<br />
alınamamasıdır. Neonatal dönem, doğumu takip eden O ile 28. günler arasını kapsayan<br />
(Mickelson ve Evermann, 1994) ve buzağı yetiştiriciliğinin en kritik dönemidir. Bu dönem<br />
özellikle buzağı yaşamının ilk 15 günü hastalıkların en yaygın olduğu ve ölüm oranlarının en<br />
yüksek olduğu dönemdir (Wells ve ark. 1996). Neonatal buzağı hastalıkları ve ölümleri, sığır<br />
yetiştiriciliği yapılan tüm işletmelerde önemli sağlık problemlerinden birisi olup ciddi<br />
ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Ekonomik kayıp başlıca buzağının kaybı, ölümle<br />
birlikte genetik materyalin kaybı, tedavi masrafları, iyileşmeye rağmen yaşamın ileriki<br />
dönemlerinde performans geriliğinden kaynaklanmaktadır (Arda, 1988; Toombs, 1994; Wells<br />
ve ark., 1996; Eskiizmirliler ve ark., 2001). Buzağılarda neonatal dönem hastalıkları,<br />
enfeksiyöz (bakteriyel, viral, paraziter ve mikotik) ve nonenfeksiyöz (vitamin, mineral madde,<br />
iz element yetersizlikleri, konjenital anomaliler vs) olarak sınıflandırmak mümkündür.<br />
Buzağı morbidite ve mortaliteleri ile ilgili olarak dünyanın çeşitli ülkelerinde, farklı<br />
yaş gruplarını kapsayan epidemiolojik çalışmalar yapılmıştır (Andrews ve ark. 1984, Blowey<br />
1993, Sivula ve ark 1996, Collery ve ark. 1996, Dutil ve ark. 1999, Gitau ve ark. 1999, French<br />
ve ark. 2001, Svensson ve ark. 2003). Buzağılarda görülen hastalıkların morbidite oranları %<br />
20 - % 52.9 arasında değişmektedir (Wells ve ark. 1996, Sivula ve ark. 1996, Gitau ve ark.<br />
1999, Dutil ve ark. 1999, Svensson ve ark. 2003). Wells ve ark. 'nın (1996) 0-8 haftalık<br />
buzağıları kapsayan morbidite çalışmasında, ishal % 24.6, halsizlik % 10, solunum sistemi<br />
problemleri % 8.4, dehidrasyon % 4.1, eklem problemleri ve topallık olaylarının % 1,1<br />
oranında bildirmişlerdir. Sivula ve ark. (1996) ise inceledikleri 0-16 haftalık buzağılarda %<br />
17.9 oranında enteritis ve % 9.4 oranında ise pnömoni olgularına rastlamışlardır. Virtala ve<br />
ark. (1996) 0-3 aylık buzağılarda yaptıkları çalışmada ishal, göbek enfeksiyonu, hemia<br />
umblicalis, trikofitozisin morbiditelerini sırasıyla % 28.8, % 14.2, % 15.1 ve % 3.9 olarak<br />
bulmuşlardır. Svensson ve ark. (2003) yine 0-90 günlük buzağıları kapsayan çalışmalarında<br />
ishal, solunum sistemi problemleri, sindirim sistemi problemleri (enfeksiyöz olmayan),<br />
anomali, actinomycosis, travma ve yetersizlik hastalıklarını sırasıyla % 10.3, % 7.2, % 1, %<br />
1.1, % 0.5, % 0.6 ve % 0.2 oranında bulmuşlardır.<br />
Gelişmiş ülkelerde buzağı mortaliteleri % 2 - % 12 arasında bulunmuştur (Blowey<br />
1993; Sivula ve ark., 1996; Wells ve ark., 1996; Danovan ve ark., 1998; Dutil ve ark., 1999).<br />
Nitekim Dutil ve ark. (1999) tarafından gerçekleştirilen anket ve saha çalışmasında perinatal<br />
32
ölüm oranı % 4.9 - % 5.2, Wells ve ark.'nın (1996) yaptığı saha çalışmasında ise 0-8 haftalık<br />
buzağılarda ölüm oranı % 6.3 olarak bulunmuştur. Benzer bir çalışmada Sivula ve ark. (1996)<br />
0-16 haftalık buzağılarda mortalite oranını % 1 1.8 ve yine Donovan ve ark. (1998) 0-6 aylık<br />
buzağılarda mortalite oranını % 11.7 olarak bulmuşlardır. Ancak gelişmekte olan ülkelerde<br />
mortalite oranlarının daha yüksek olduğu (yaklaşık % 35) bildirilmiştir (French ve ark., 2001).<br />
Bakteriyel enfeksiyonların % 10.1 ve protozon enfeksiyonlarının % 1.7 oranında buzağı<br />
ölümlerine sebep olduğunu tespit etmişlerdir. Sivula ve ark. (1996) enteritisli buzağıların %<br />
43.8’inin ve pnömonili buzağıların ise % 29’sinin öldüğünü bildirmişlerdir. Dutil ve ark.<br />
(1999) ise ishalden % 29 ve pnömonilerden % 18 oranında ölümlerin gerçekleştiğini tespit<br />
etmişlerdir. Donovan ve ark (1998) tarafından 0-6 aylık buzağılarda yapılan çalışmada ise<br />
diyare, pnömoni, septisemi, ve diğer sebeplerden kaynaklanan ölüm oranları sırası ile, % 10,<br />
% 55.4, % 21.9 ve % 11.8 olarak saptanmıştır.<br />
Buzağı morbidite ve mortalite etiyolojilerinin belirlendiği çalışmalar da yapılmıştır.<br />
Sivula ve ark. (1996) enteritis ve pnömoni olgularında Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV),<br />
Infectious Bovine Rhinotracheitis (lBR), Parainfluenza-3 (PI-3), Pasteurella hemolytica, P.<br />
multicida, Haemophilus somnus, Rotavirus ve E. Coli’nin etken olduğunu belirlemişlerdir.<br />
Yine Collery ve ark (1996) ölü buzağılardan Brucella abortus, Pasteurella hemolytica,<br />
Salmonella dublin ve Leptospira hardjo bakterilerini izole etmişledir. Blowey (1993),<br />
Respiratory Syncytial Virus (RSV), PI-3, BVDV, IBR, Pasteurella, Haemophilus,<br />
Myeoplasma mikroorganizmalarının belli başlı buzağı pnömonilerinin sebebi olduğunu<br />
bildirmiştir. Blowey (1993) rotavirus, coronavirus, Cryptosporidium, E. eoli (verotoksijenik<br />
veya enterotoksijenik) ve Salmoneıla mikroorgnizmalarının sırasıyla % 42, % 14, % 23, % 13<br />
ve % 12 oranında buzağı ishallerine sebep olduğunu bildirmiştir. Rotavirus ve coronavirus<br />
yaygınlığı sırasıyla % 16 - % 80 ve % II - % 81 arasında olduğu belirlenmiştir (Reynolds ve<br />
ark., 1986; de Verdier ve Svensson, 1998, Bendali ve ark., 1999). Neonatal ishalli buzağılarda<br />
yapılan bir çalışmada ise Cryptosporidium spp., rotavirus, E. coli, coronavirus ve Salmoneıla<br />
spp. sırasıyla % 52.3, % 42.7, % 11.9, % 7.3 ve % 0.9 oranında belirlenmiştir. Buzağı<br />
ishallerinde genelde ilk aydan itibaren Eimeria spp. % 21.9 ila % 89.8 oranları arasında<br />
belirlenmiştir (Ernst ve ark., 1984; Oda ve Nishida, 1990). Buzağı ishallerinde Clostridium<br />
perfringens tip A, B, C, D ve bunların eneterotoksinlerinin rolü olduğunu belirlenmiştir<br />
(Radostits ve ark., 1994; Fleming, 1994, Manteca ve ark., 2001). Neonatal dönemde görülen<br />
hastalıklar ve ölümlerle ilgili yapılan çeşitli derlemelerde hastalık ve ölüme yol açan<br />
mikroroganizmalar olarak en çok; IBR, rotavirus, caronavirus, astrovirus, BVDV, parvovirus,<br />
adenovirus, E. eoli, Salmonella, Clostridium perfiringes, Campylobacter spp., Eimeria spp. ve<br />
Cryptosprodium spp. bildirilmektedir (Diker ve İstanbulluoğlu, 1983; Burgu ve Öztürk, 1986;<br />
Sezen, 1986; Aytuğ, 1986; Blowey, 1993; Wikse ve ark., 1994).<br />
Türkiye'de ishalli buzağılarda yapılan çalışmalarda ise rotavirus infeksiyonlarının<br />
prevelansı % 0-53 arasında (Burgu ve ark., 1995; Emre ve Fidancı, 1998; Alkan, 1998;<br />
Çabalar ve ark., 1998; Çabalar ve ark., 2001) ve coronavirus enfeksiyonlarının prevelansı ise<br />
% 13- i 8 arasında bulunmuştur (Alkan, 1998; Eskiizmirliler ve ark., 2001). İshalli buzağılarda<br />
yapılan çalışmalarda Eimeria spp. oranları % 59-% 90.8 arasında (Dumanlı ve ark., 1993),<br />
Cryptosporidium spp. % 7.2-% 63.3 oranları arasında belirlenmiştir (Özer ve ark., 1990; ırmak<br />
ve Şahal, 1993; Emre ve ark., 1998). E. coli ise bir çok çalışmada ishalin etkeni olarak<br />
belirlenmiştir. (Erganiş ve ark., 1989; Emre ve Fidancı, i 998; Çabalar ve ark., 2001).<br />
Buzağı hastalıkları ve ölümlerinin ciddi ekonomik kayıplara yol açtığı bilinmektedir.<br />
Blowey (1993) ekonomik kaybın, % 5 oranında buzağı mortalitesi görülen İngiltere' de yıllık<br />
20 milyon sterline ulaştığını, Toombs ve ark. (1994) ise bu kaybın Amerika Birleşik<br />
33
Devletlerinde 976 milyon ABD Dolarına tekabül ettiğini bildirmişlerdir. Buna ilave olarak bir<br />
çok araştırıcı perinatal dönemde görülen hastalıkların gelişme geriliğine neden olduğunu,<br />
bunun da ergin yaştaki verim ve performans geriliğine neden olduğunu belirtmişlerdir.<br />
(Toombs ve ark., 1994; Sivula ve ark., 1996; Virtala ve ark. 1999). Ayrıca tedavi masrafları da<br />
hesaba katılırsa kaybın daha yüksek olacağı düşünülebilir. Bölgemiz için buzağı hastalık ve<br />
ölümlerinden kaynaklanan ekonomik kayıpların hesaplandığı her hangi bir çalışma mevcut<br />
değildir.<br />
Bu çalışmada amaç, Adana bölgesinde sığır yetiştiriciliği yapılan işletmelerde<br />
neonatal dönemde buzağıların karşılaştığı hastalıkların morbidite, mortalite oranları,<br />
etyolojileri ve bazı risk faktörlerini belirlemektir.<br />
8.3. Materyal ve Metot:<br />
Hayvan Materyali :<br />
Enstitümüz sorumluluk bölgesinde bulunan 5 farklı odakta sığırcılık yapan 20 adet<br />
işletme ve bu işletmelerde 2 yıl içerisinde doğan buzağılar çalışmanın materyalini<br />
oluşturacaktır. Çalışma çiftlikleri, Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı Adana İl Müdürlüğü'nden<br />
temin edilen adreslerden tesadüfi olarak seçilecektir. Çalışmanın başında çiftlikler ziyaret<br />
edilerek çiftlik sahipleriyle birebir görüşülerek çalışmanın amacı ve içerdiği prosedürler<br />
hakkında bilgi verilip anketler düzenlenecektir. Çiftlik ziyaretleri materyal toplama<br />
aşamasında neonatal buzağı takibini gerçekleştirmek üzere haftalık olarak yapılacaktır.<br />
Hayvan ve çiftliklerle ilgili bilgilerin toplanması<br />
Çalışmanın başında çiftçilerle yüz yüze görüşme usulü ile çiftlikteki <strong>hayvan</strong>lar ve<br />
çiftlik sevk ve idaresi hakkında aşağıda belirtilen konularla ilgili bilgi alınacaktır.<br />
1) Hayvanlarla ilgili bilgiler: Hayvanların türü, ırkı, sayısı, beslenme amacı, verim özellikleri<br />
ve değerleri, yaşa göre <strong>hayvan</strong>ların gruplandırılması, sürüye dışarıdan yeni katılan <strong>hayvan</strong><br />
sayısı ve tarihi, son yıllarda <strong>hayvan</strong>ların geçirdiği hastalıklar ve tedaviler, parazit mücadelesi<br />
ve aşılamalar.<br />
2) Hayvanların barınması: Ahır sayısı, ahır türü, büyüklüğü, kullanılan yataklık türü,<br />
temizleme sıklığı, dezenfeksiyon sıklığı, havalandırma imkanları ve ahırda barındırılan diğer<br />
<strong>hayvan</strong>lar.<br />
3) Hayvanların beslenmesi: Yedirilen yemin tipi, yemlerin temin edildiği kaynaklar, yemlerin<br />
depolanma şartları ve içme suyu kaynakları<br />
4) Buzağılama ile ilgili bilgiler: Doğumun gerçekleştiği yer, varsa buzağılama bölmesinde<br />
annenin doğumdan önce kalış süresi, buzağılama ayı, doğumun şekli (güç, kolay, sezeryan<br />
vs.), buzağılama bölmesinde kullanılan yataklık türü ve buranın temizliği, bölmede buzağı ile<br />
annenin doğumdan sonra kalış süresi ve her doğumdan önce bölmenin dezenfeksiyonu,<br />
buzağının göbek kordonunun bakımı, doğumla buzağının ilk kolostrumu aldığı ana kadar<br />
geçen süre, kolostrumun veriliş şekli (kendisinin emmesi, biberon vs) ve pasif bağışıklık<br />
sağlayan serumların uygulanması .<br />
5) Buzağı ile ilgili bilgiler: Doğum sonrası buzağının anne ile beraber kaldığı süre, buzağının<br />
barındırıldığı barınak farklıysa, tipi, çiftlik veya ahırda lokalizasyonu, kullanılan altlık tipi,<br />
temizleme sıklığı, kaba ve konsantre yeme geçiş tarihleri (eğer kaba yeme başlanmışsa), içme<br />
su kaynakları ve çiftçinin tespit ettiği sağlık problemleri ve uygulanan tedaviler.<br />
34
Örnek toplama<br />
Belirlenen çiftliklere haftalık ziyaretler yapılıp, işletmelerde doğan neonatal<br />
buzağıların muayeneleri yapılarak ishalli buzağılardan dışkı ve kan örnekleri, solunum<br />
sistemi problemli hastalardan ise kan örnekleri ve nazal svaplar alınacaktır. Kontrol<br />
amacıyla hasta buzağıyla aynı yaş grubundaki bir sağlıklı buzağıdan da söz konusu marazi<br />
maddeler alınacaktır.<br />
Bakteriyolojik-Serolojik Muayene<br />
Buzağılardan alınan marazi maddelerden uygun vasatlara ekimler yapılarak,<br />
Pasteurella, Mycoplasma, Haemophilus E coli, Salmoneıla, Yersinia, Campylobacter ve<br />
Clostridium perfiringes yönünden incelenecektir. Bu amaçla spesifik selektif<br />
zenginleştirme buyyonları ile selektif agarlar kullanılacaktır (Quinn ve ark., 1994; Arda ve<br />
ark., 1999).Alınan dışkı örneklerinde Coronavirus 'ün varlığı ticari ELISA kiti (BIO-X<br />
Coronavirus ELISA kit, Bio-X Diagnostics, Belçika) ile Rotaviruslar ise yine ticari latex<br />
agglutinasyon testi (Virotect-Rota, Omega Diagnostics, DK) ile belirlenecektir.<br />
Neonatal buzağılarda IBR (BIO-X lnfectious Bovine Rhinotracheitis ELlSA kit,<br />
BioX Diagnostics, Belçika), BVDV (BIO-X Bovine Viral Diarrhoea Virus ELlSA kit, Bio-<br />
X Diagnostics, Belçika), BRSV (BIO-X Bovine Respiratory Syncytial Virus ELlSA kit,<br />
Bio-X Diagnostics, Belçika), ve PB (BIO-X Parainfluenza-3 virus ELlSA kit, Bio-X<br />
Diagnostics, Belçika) antikorlarının varlığı ticari ELlSA kitleri kullanılarak tespit<br />
edilecektir.<br />
Parazitolojik Muayene<br />
Hasta ve kontrol <strong>hayvan</strong>lardan alınan dışkı örnekleri, Cryptosporidium, Eimeria ve<br />
gastrointestinal helmintler yönünden parazitoloji laboratuvarına getirilerek aşağıda<br />
belirtilen yöntemler kullanılarak incelenecektir.<br />
Eimeria spp.: Dışkı flotasyon teniği ile Eimeria türleri yönünden incelendikten sonra<br />
pozitif olan örnekler Modifiye Mc Master metodu ile incelenerek gramdaki oocyst sayıları<br />
(OPG) belirlenecektir.<br />
Crvptosporidium spp.: Dışkı örneklerinde Cryptosporidium spp. aramak için Modifiye<br />
Acid Fast tekniği kullanılacaktır.<br />
Gastrointestinal Parazitler: Helmint, özellikle askarit, yumurtaları flotasyon yöntemi<br />
kullanılarak belirlenecektir.<br />
Histopatolojik Muayene<br />
Ölen buzağıların sistemik otopsileri yapılarak alınan doku örnekleri rutin doku<br />
işleme prosedürlerinden geçirildikten sonra parafin blokları hazırlanacak. Hazırlanan<br />
bloklardan alınan kesitler hematoksilen eozin boyaması ile bayanarak ışık mikroskobik<br />
incelemeleri yapılacaktır. Gerekli görülen kesitlere de özel boyama teknikleri<br />
uygulanacaktır.<br />
İstatistik Değerlendirmeler<br />
Anket sonuçları, hastaların muayene ve laboratuvar analizleri sonucu elde edilen<br />
bilgiler istatistik analizleri yapılmak amacıyla Microsoft Access <strong>program</strong>ı kullanılarak<br />
oluşturulan veri bankasına yüklenecek. Oranların karşılaştırılmasında Yates düzeltilmiş ki<br />
kare testi, grup büyüklüğü, yaş sınıflandırılması ile hastalıklar arasındaki ilişki için khi<br />
kare testi, ortalamaların karşılaştırılmasında ise Kruskall- Wallis testi kullanılacaktır.<br />
Çiftlik özellikleri ve verim parametrelerinin belirlenmesi amacıyla basit frekans<br />
Dağılım hesaplamaları kullanılacaktır. (Dean ve ark., 1994).<br />
Neonatal buzağı hastalıklarının morbidite, mortalite, vaka ölüm oranı ve nispi ölüm<br />
oranları da aşağıda belirtilen formüller yardımıyla hesaplanacaktır. (Erganiş, 1993;<br />
Kirkwood, 1998; Dutil ve ark., 1999, French ve ark., 2001).<br />
Buzağılama Oranı =Doğan toplam buzağı sayısı/Toplam inek sayısı X 100<br />
Çiftlik prevelansı =Hastalıklı çiftlik sayısı/Toplam çiftlik sayısı X100<br />
35
Morbidite oranı =Hasta neonatal buzağı sayısı/Toplam neonatal buzağı sayısı X100<br />
Mortalite oranı =Ölen neonatal buzağı sayısı/Toplam neonatal buzağı sayısı X l00<br />
Vaka ölüm oranı =Ölen neonatal buzağı sayısı/Toplam hasta neonatal buzağı sayısı X100<br />
Nispi ölüm oranı =Spesifik bir hastalıktan ölen neonatal buzağı sayısı/Toplam ölen<br />
neonatal buzağı sayısı X100<br />
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
1. Adana bölgesinde ilk defa sığır yetiştiriciliği yapılan işletmelerde neonatal dönemde<br />
buzağıların karşılaştığı hastalıkların morbidite, mortalite oranları ile etiyolojileri ve risk<br />
faktörleri belirlenecektir.<br />
2. Bu proje çerçevesinde elde edilen veriler, hem sahadaki veteriner hekimlik hizmeti<br />
veren kişi veya kuruluşların hem de yetiştiricilerin koruma ve kontrol stratejilerini<br />
saptamasına yardımcı olacaktır.<br />
3. Bu proje Enstitümüzde yürütülmekte olan “Atık Sığır Fetuslarında Brucella, Leptospira,<br />
Listeria, Campylobacter ve Klamidia Etkenlerinin Immunohistokimyasal, Mikrobiyolojik<br />
ve Moleküler Yöntemlerle İncelenmesi” isimli projenin sonuçları ile birlikte<br />
değerlendirildiğinde bölgemizde önemli bir sorun olan buzağı kayıpları konusunda önemli<br />
bir bilgi birikimi sağlayacaktır.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı: Veteriner Hekim Cemal KURT<br />
9.2. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Mehmet TUZCU (Patoloji Lab. Şefi)<br />
9.3. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Veteriner Hekim Nevin TURUT (Bakt.LabŞefi)<br />
9.4. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Veteriner Hekim Mehmet MİRİOĞLU (Seroloji<br />
Laboratuvarı Şefi)<br />
9.5. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Atila YOLDAŞ (Moloküler Biy. Lab. Şefi)<br />
9.6. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Veteriner Hekim Nevin TUZCU (Çukurova<br />
Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Doktora Öğrencisi)<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Olan Donanım<br />
Patoloji Laboratuarı:<br />
Mikrotom, Hızlı Dondurma Ünitesi, Otomatik Doku Takip Cihazı, Doku Gömme Cihazı, Etüv<br />
Steril Kabin, Binoküler Araştırma Mikroskobu, Buzdolabı, Rutin Patolojik Muayeneler için gerekli<br />
kimyasallar<br />
PCR laboratuarı:<br />
Light Cycler 2.0 (Roche), MagNA Pure LC (Roche), MagNA Lyser (Roche), Steril Kabin (Nüve)<br />
Labratuvar Kullanımına Uygun Derin Dondurucu (Sanyo), Rutin Mikrobiyolojik Muayeneler için<br />
gerekli kimyasal ve besiyerleri<br />
Teşhis laboratuarı:<br />
Vitek Bakteri İzalasyon Cihazı (Biomerieux), Minilyser ELİSA (TECAN) ,Microbiological<br />
Incubators (Heraeus), Mini API (Biomerieux)<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım :<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri<br />
Atık Sığır Fetuslarında Brucella, Leptospira, Listeria, Campylobacter ve Klamidia<br />
Etkenlerinin Immunohistokimyasal, Mikrobiyolojik ve Moleküler Yöntemlerle<br />
İncelenmesi. Proje Lideri: Dr. Mehmet TUZCU<br />
36
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
100.000 30.000<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
03.3- YOLUKLAR<br />
03.4- GÖREV GİDERLERİ<br />
03.5- HİZMET ALIMLARI<br />
03.6- TEMSİL VE TANITMA GİDERLERİ<br />
03.7- MENKULMAL, GAYRİMADDİ HAK ALIM,<br />
BAKIM VE ONARIM GİDERLERİ<br />
03.8- GAYRİMENKUL MAL BAKIM VE ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
03.9- TEDAVİ VE CENAZE GİDERLERİ<br />
10.000 5.000<br />
TOPLAM 110.000 35.000<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM GİDERLERİ<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA)<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER<br />
TOPLAM<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
Başlıca Aşamalar Ayrıntılı Bilgi Zamanlama<br />
Çiftlik Ziyaretleri, Materyal toplanması ve<br />
1. Aşama işlenmesi, sarf ve demirbaş malzemenin temini, 1-12 aylar<br />
literatür araştırması<br />
2. Aşama<br />
Çiftlik Ziyaretleri, Materyal toplanması, toplanan<br />
13-24 aylar<br />
materyallerin incelenmesi, literatür araştırması<br />
3. Aşama<br />
Laboratuvar muayenelerinin tamamlanması ve<br />
25-32 aylar<br />
bulguların değerlendirilmesi<br />
4. Aşama Proje kesin raporunun yazımı 33-36 aylar<br />
37
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
ALEJANDRINO, A.L., Asaad, C.O., Malbayabas, 8., De vera, A.C., Herrera, M.S., Deocaris,<br />
C.C., Ignacio, L.M., Palo, L.P., Constraints on dairy cattle productivity at the smallholder level in<br />
the Philippines, Preventive Veterinary Medicine, 38, 167-178, (1999).<br />
ALKAN, F., Buzağı ishallerinde rotavirus ve coronavirusların rolü, Ankara Üniversitesi Veteriner<br />
Fakültesi Dergisi, 45,29-37, (1998).<br />
ANDREWS, A.H. and Read, D.J. Disease levels in calves up to fıve weeks old kept under<br />
commercial conditions and different management systems, British Cattle Veterinary Association<br />
Proceedings for 1983-1984, (1984), Pp: 99-108.<br />
ARDA, M. Neonatal buzağılarda ishaller ve neonatal bağışıklık, Etlik Veteriner Mikrobiyoloji<br />
Dergisi, 6 (2), 143-169, (1988). .<br />
ARDA, M., Aydın, N., Ilgaz, A., Minbay, A., Kahraman, M., İzgür, M., Leloğlu, N., Akay, Ö.,<br />
Diker, K.S., Özel Mikrobiyoloji, 5. baskı, Medisan, Ankara (1999).<br />
AYTUG, C.N., Buzağılarda neonatal dönemde rastlanan paraziter hastalıkların tedavisi ve<br />
profilaksisi, Neonatal Buzağı Kayıpları Sempozyumu, S.Ü. Veteriner Fakültesi, Konya,(1986) 75<br />
BENDALI F., Bichet, H., Schelcher, F., Sanaa, M., Pattem of diarrhoea in newbom beef calves<br />
in south-west France, Veterinary Research Corninication, 30(1), 61-74, (1999).<br />
BLOWEY, R.W., A Veterinary Book for Dairy Farmers. 2nd ed. Farming Press Ltd. Great Britain,<br />
(1993), Pp: 15-77.<br />
BROOM, D.M., Corke, M.J., Effeets of disease on farın animal welfare, Acta Veterinaria Brno,<br />
71,133-136, (2002).<br />
BURGU, İ., Akça, Y., Alkan, F., Özkul, A., Karaoğlu, T., Yeni doğan ishalli buzağılarda<br />
rotavirusların elektron mikroskopi (EM), enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) ve<br />
polyaerylamide geleleetrophoresis (P AGE) teknikleri ile çabuk teşhisi ve antijenik<br />
karakterizasyonu, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 42, 491-498, (1995).<br />
BURGU, İ., Öztürk, F., Neonatal dönemdeki buzağıların viral hastalıkları, Neonatal Buzağı<br />
Kayıpları Sempozyumu, S.Ü. Veteriner Fakültesi, Konya, (1986) sf: 50-59.<br />
COLLERY, P., Bradley, J., Fagan, J., Jones, P., Redehan, E., Weavers, E., Causes of perinatal<br />
ealfmortality in the Republie ofIreland, Jrish VeterinaryJournal,. 49,491-496, (1996).<br />
ÇABALAR, M., Boynukara, B., Gülhan, T., Ekin, I.H., Prevalence of Rotavirus, Escherichia<br />
coli K99 and 0157:H7 in healthy dairy cattle herds in Van, Turkey, Turkish Journal of<br />
VeterinaryandAnimal Science, 25, 191-196, (2001).<br />
ÇABALAR, M., V oyvoda, H., Sekin, S., İshalli buzağılarda rotavirusların latex aglutination (LA)<br />
ve polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) teknikleri ile tanısı, III. Ulusal Veteriner<br />
Mikrobiyoloji Kongresi, , Bursa, (1998)<br />
ÇETİNKAYA, B., Erdogan, H.M., Morgan K.L., Relationships between the prevalence of<br />
Johne's disease and farın management factors in dairy cattle in the U.K, Preventive Veterinary<br />
Medicine, 32, 253-266, (1997).<br />
DEAN AG, Dean JA, Coulombier D, Brendel KA, Smith DC, Burton AH, Dicker RC,<br />
Sullivan KM, Fagan RF, Amer TG: Epi-Info, Version 6: A word processing, database, and<br />
statistics <strong>program</strong> for epidemiology on microcomputers. Center for Disease Control and<br />
Prevention, Atlanta, Georgia, U.S.A., (1994).<br />
DİKER, K.S., İstanbulluoğlu, E., Sağlıklı ve sürgünlü <strong>hayvan</strong>lardan C. fetus subsup. jejuni<br />
izolasyonu üzerine çalışmalar, Ankara Üniversİtesi Veteriner Fakültesi, Dergisi, 30(1),28-<br />
34,(1983).<br />
DONOV AN, G.A., Dohoo, LR., Montgomery, D.M., Bennett, F.L., Associations between<br />
passive immunity and morbidity and mortality in dairy heifers in Florida, USA, Preventive<br />
Veterinary Medicine, 34, 31-46, (1998).<br />
DUMANLI, N, Güler, S., Erdoğmuş, Z., Köroğlu, E., Yılmaz, H., Küçükerden, N., Elazığ<br />
yöresinde sığırlarda bulunan coccidia etkenleir ve bunların yayılışı, Doğa Türk Veteriner ve<br />
Hayvancılık Dergisi, 17,223-227, (1993).<br />
DUTIL, L., Fecteau, G., Bouchard, E., Dutremblay, D., Pare, J., A questionnaire on the health,<br />
management, and performence of cow-calf herds in Quebec, Canadian Veterinary Journal, 40, 649-<br />
656, (1999).<br />
38
EMRE, Z., Fidancı, H., Prevalence of mix infections of Cryptosporidium spp., Escherichia coli<br />
K99 and Rotavirus in the faeces of diarrhoeic and healthy cattle in Ankara, Turkeyand in vitro<br />
resistance of Escherichia coli K99 to antimicrobial agents, Turkish Journal of Veterinary and<br />
.1nimal Science, 22, 175-178, (1998).<br />
EMRE, Z., Alabay, M., Fidancı, H., Düzgün, A., Çerçi, H., Prevalence of Cryptosporidium spp.<br />
infection and its relation to other enteric pathogens (Escherichia coli K 99 and rotavirus) in cattle in<br />
Ankara, Turkey, Turkish Journal of Veterinary and Animal Science, 22, 453-458,(1998).<br />
ERGANİŞ, O., Veteriner Epidemiyoloji, Mimoza Yayınları, Konya, (1993). sf: 23-37.<br />
ERGANİŞ, O., Ateş, M., Çorlu, M., Kaya, O., Konya bölgesindeki ishalli buzağılardan izole<br />
edilen E. coli'lerin biyokimyasal, hemaglütinasyon, mannoz rezistan hemaglütinasyon ve<br />
enteropatojenik özellikleri üzerinde araştırmalar, Doğa Türk Veteriner ve Hayvancılık Dergisi,<br />
13(2), 108-122, (1989).<br />
ERNST, J., Ciordia, H., Stuedemann, J., Coccidia in cows and calves on pasture in north<br />
Georgia (U.S.A.), Veterinary Parasitology, 15,213-221, (1985).<br />
ESKİİZMİRLİLER, S.N., Öncel, T., Beyazıt, A., Mısırlıoğlu, Ö.Z., Türkiye'nin değişik<br />
illerindeki ishalli buzağılarda rotavirus, coronavirus ve cryptosporidiosisin yayılışı, Veteriner<br />
Hekimleri Mikrobiyoloji Dergisi, 1(2),35-42, (2001).<br />
ESSLEMONT, R.J., Kossaibati, M.A., Culling in 50 dairy herds in England, Veterinary Record,<br />
140,36-39, (1997).<br />
FLEMING, S., Enterotoxemia in neonatal calves, The Veterinary Clinics of North AmericaFood<br />
Animal Practice, 10 (1),509-514, (1994).<br />
FRENCH, N.P., Tyrer, 1., Hırst, W.M., S:nallholder dairy farming in the Chikwaka communal<br />
land, Zimbabwe:birth, death and demographic trend. Preventive Veterinary Medicine, 48(2),101-<br />
112, (2001).<br />
GRIFFIN, 1.M., Hahesy, T., Lynch, K., Salman, M.D., McCarthy 1., Hurley, T., The<br />
association of cattle husbandry practices, environmental factors and farmer characteristics with the<br />
occurrence of chronic bovine tuberculosis in dairy herds in the Republic of Ireland, Preventive<br />
Veterinary Medicine, 17, 145-160, (1993).<br />
GROHN, Y.T., Eicker, S.W., Ducrocq, V., Herl, I.A., Effect of disease s on the cuIling of<br />
Holstein dairy cows in New York State. Journal of Dairy Science, 81,966-978, (1998).<br />
HALPIN, B., Patterns of Animal Disease 1 st ed. ,Bailliere Tindall, London,U.K., (1975). Pp: 130-<br />
IRMAK, K., Şahal, M.: Buzağılarda deneysel cryptosporidiosis'de klinik bulgular ve sağaltım,<br />
Turkish Jornal of Veterinary and Animal Sciences, 17: 81-88, (1993).<br />
MANTECA, C., Daube, G., Pirson, V., Limbourg, B., Kaeckenbeeck, A., Mainil, l.G.,<br />
Bacterial intestinal flora associated with enterotoxaemia in Belgian Blue calves, Veterinary<br />
Microbiology, 81(1),21-32 (2001).<br />
MICKELSEN, W.D., Evermann, l.F., In utero infection responsible for abortion, stillbirth, and<br />
birth ofweak calves in beef cows, The Veterinary Clinics ofNorth America- Food Animal Practice,<br />
10 (1), 1-14, (1994).<br />
ODA, K., Nishida, Y., Prevelance and distribution of bovine coccidia in Japan, Japanese Journal<br />
of Veterinary Science, 52(1), 71-77, (1990).<br />
OMAR, M.K., Skjerve, E., Woldehiwet, Z. Holstad, G., Risk factors for Bruceıla spp. in dairy<br />
cattle fanns in Asmara, State of Eritrea, Preventive Veterinary Medicine, 46,257-265, (2000).<br />
ÖZER, E., Erdoğmuş, S.Z., Köroğlu, E., Elazığ yöresinde buzağı ve kuzularda bulunan<br />
Cryptosporidium'un yayılışı üzerinde araştınnalar, Turkish Journal of Veterinary and Animal<br />
Sciences, 14,439-445, (199Cf).<br />
PRICE, J.E., Genetİcs of health and fertmty İn daİry cattle, (PhD Thesis), University of<br />
Edinburgh, UK, (1997.).<br />
RADOSTITS, O.M., Blood, D.C., Gay, C.C., Veterinary Medicine. 8th ed. Bailliare Tindall,<br />
London. U.K., (1994). Pp: 242-314,684-687, 884-908, 965-973,1016-1094.<br />
RAJALA-SCHUL TZ, PJ., Gröhn, YT., Disease occurrence and risk factor analysis in Finnish<br />
Ayrshire cows, Acta Veterİnarİa Scandİnavİa, 39, 1-13, (1998).<br />
RAJALA-SCHUL TZ, P.J. Gröhn, Y.T., Culling of dairy cows. Part i. Effect of diseases on<br />
culling in Finnİsh Ayrshire cows, Preventİve Veterİnary Medicine, 41, 195-208 (1999).<br />
39
REYNOLDS, DJ., Morgan, J.H., Chanter, N., Jones, P.W., Bridger, J.e., Debney, T.G.,<br />
Bunch, K.J., Microbiology of calf diarrhoea in southem Britain, Veterİnary Record, 119(2),<br />
34-39, (1986).<br />
SEZEN, İ.Y Buzağılarda Bakteriyel Enfeksiyonlar, Neonatal Buzağı Kayıpları Sempozyumu, S.Ü.<br />
Veteriner Fakültesi, Konya, (1986) sf: 69-75.<br />
SIMIANER, H., Solbu, H., Schacffer, L.R., Estimated genetic correlation between disease and<br />
yield traits in dairy cattle, Journalaf Dairy Science, 74,4358-4365, (1991).<br />
SIVULA, N.l., Ames, T.R., Marsh, W.E., Werdin, R.E., Descriptive epidemiology of morbidity<br />
and mortality in minnesota dairy heifer calves, Preventive Veterinary Medicine, 27,155-171,<br />
(1996).<br />
SMITH, R.A., Impact of disease on feedlot performance: A review, Journalaf Animal Science, 76,<br />
272-274, (1998).<br />
STEVENSON, M.A., Disease incidence in dairy herds in the southem highlands district of New<br />
South Wales, Australia, Preventive Veterinary Medicine, 43, I-ll, (2000).<br />
SVENSSON, C., Lundborg, K., Emanuelson, U., Olsson S.O., Morbidity in Swedish dairy<br />
calves from birth to 90 days of age and individual calf-Ievel risk factors for infectious diseases,<br />
Preventive Veterinary Medicine, 58, 179-197, (2003).<br />
THOMPSON, K.F., Hart, N.D., Animal Production in eastem Turkey, Proceeding of New<br />
Zealand Society of Animal Production, 54, 189-191, (1994).<br />
THRUSFIELD, M., Veterinary Epidemiology. 2nd ed. Blackwell Science, London, UK., (1996).<br />
Pp: 17-18, 28-36, 39-43, 72-80, 178-198, 312-32 ı.<br />
TOOMBS, R.E., Wikse, S.E., and Kasari, TR., The ıncidence, causes, and financialımpact of<br />
perinatal mortality in North Aamerican beef herds, The Veterinary Clinics of North America<br />
FoodAnimal Practice, 10 (1),137-147, (1994).<br />
WELLS, S.J., Garber, L.P., Hill, G.W., Health status ofpreweaned dairy heifers in the United<br />
States, Preventive Veterinary Medicine, 29, 185-199, (1996).<br />
WIKSE, S.E., Kinsel, M.L., Field, R.W., and Holland, P.S., Investigating perinatal calf mortality<br />
in beef herds, The Veterinary Clinics of North America- Food Animal Practice, LO (1),147-167,<br />
(1994).<br />
VIRTALA, A., Mechor, G.D., Grohn, Y.T, Erb, H.N., Morbidity from nonrespiratory diseases<br />
and mortality in dairy heifers during the first three months of life, Journal of American Veterinary<br />
Medical Association. 12,2043-2046, (1996a).<br />
VIRTALA, A., Mechor, G.D., Grühn, Y.T, Erb, H.N., Dubovi, E.l., Epidemiologic and<br />
patlıologic clıaracteristics of respiratory tract disease in dairy heifers during the first three months<br />
of life, Journal of American Veterinary Medical Association. 12,2035-2042, (1996b).<br />
VIRTALA, A., Grohn, Y.T., Mechor, G.D., The effect ofmatemally derived immunoglobulin G<br />
on the risk of respiratory disease in heifers during the first 3 months of life, Journal of Preventive<br />
Veterinary Medicine, 39,25-37, (1999).<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Cemal KURT<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Mehmet MİRİOĞLU<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar :<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar :<br />
40
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : A-01 Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : A-01.P-01 Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1.PROJE AD: Çukurova yöresinde sığırlarda görülen granülomatöz pneumonilerin<br />
etiyolojisinin histopatolojik ve moloküler yöntemlerle belirlenmesi.<br />
“The Determination of the etiology of granulomatous pnömonia in cattles in vicinity of<br />
Çukurova, with histopathologic and molecular methods.”<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ :<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı :Dr. Mehmet Tuzcu<br />
Kurumu :Adana Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı: ______________________<br />
Araştırma Programı : _______________________<br />
5. PROJE SÜRESİ : 24 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : 01,01,2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : 31,12,2010<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
ÖZET<br />
Bu projede , sığırlarda görülen granülomatöz pnömoniler (GP) ile son zamanlarda<br />
artış eğilimine giren tüberkülozun (Tb), sığırlardaki görülme oranı ve patolojik özellikleri<br />
ortaya konularak, söz konusu pnnömonileri oluşturan etkenlerinin Real Time PCR ile<br />
Teşhisinin yapılabilirliği araştırılacaktır. Bu çalışmada Adana bölgesinde faaliyet<br />
gösteren mezbahalar haftada bir kez kesim saatinden önce ziyaret edilerek kesim için<br />
getirilen sığırlar klinik olarak muayene edilecektir. Mazbaha ziyaretleri 5000 baş sığır<br />
muayene edilene kadar sürdürülecektir. Kesilen sığırların ante mortem muayenelerini<br />
takiben kesim sonrası akciğerlerin ve ilgili lenf düğümlerinin makroskobik muayeneleri<br />
yapılacaktır. Muayene sırasında Granülamatöz lezyonlu akciğerlerlerden ve lenf<br />
düğümlerinden alınan doku örnekleri laboratuvara getirilerek histopatolojik,<br />
mikrobiyolojik ve Real Time PCR ile incelenmesi yapılacaktır.<br />
ABSTRACT<br />
In this project, the availability of the application of real time PCR for the<br />
determination of etiologic factors of the granulomatous pneumonia and tuberculosis, which<br />
had an increasing incidence recently, will be investigated with the pathologic features and<br />
41
prevalance in cattles. During the investigation, the slaughterhouses in Adana will be visited<br />
before cutting and the cattles will be examined clinically per week. These visits will be<br />
applied till 5000 cattles will be examined. After the ante mortem examination the lungs<br />
and lymph nodes will be examined macroscopically in post mortem clinical examination.<br />
From the granulomatous lesions histologic samples will be obtained and microbiologic and<br />
real time PCR research will be applied.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER:<br />
Granülamatöz pnömoni, Tüberkülozis, Patoloji, Real Time PCR<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Bu proje ile Adana bölgesinde kesilen sığırlarda görülen granülomatöz pnömonilerin<br />
oranları belirlenerek, günümüzde yaygın olarak kullanılmaya başlayan PCR tekniği ile<br />
etiyolojileri belirlenmeye çalışılacaktır. Son yıllarda bir çok hastalığın teşhisinde çeşitli<br />
araştırmacılar tarafından kullanılan ve yüksek düzeyde duyarlı ve spesifik olduğu saptanan<br />
PCR tekniği ile (Glenn on ve ark, 1997, Bascunana ve Belak, 1996, Wards ve ark, 1995)<br />
öncelikle sığır tüberkülozu etkenleri ve diğer mikotik pnömoni etkenlerinin hızlı ve kesin<br />
olarak belirlenmesi amaçlanmaktadır.<br />
Sığır tüberküloz etkeninin insan tüberkülozuna da sebeb olması, bu hastalığın insan<br />
topluluklarında eradikasyonu için öncelikle sığır tüberkülozunun kontrol ve eradike<br />
edilmesini gerekli kılmaktadır. Dünyada eradikasyon amacıyla yapılan tüm uygulamaların<br />
temeli bu hastalığı taşıyan <strong>hayvan</strong>ların belirlenmesi ve itlaf edilmesidir.Tüberkülozun<br />
teşhisinde genelde konvensiyonel teknikler kullanılmaktadır. Bunlar bakteriyolojik olarak<br />
etkenin enfekte materyalden izole edilmesi, deri duyarlılık testi serolojik testler ve ölü<br />
<strong>hayvan</strong>lardan alınan dokuların histopatolojik muayenesidir.<br />
Etken izolasyonu en etkili ve kesin yöntemdir. Ancak izolasyonun çoğu zaman aylarca<br />
sürmesi, izolasyon için selektif besi yerlerine ihtiyaç duyulması ve etkenin yüksek<br />
patojeniteye sahip olması birer dezavantajdır. Daha güvenli olan serolojik testlerin<br />
(Aglutinasyon testleri, komplement fikzasyon, indirekt-hemaglutinasyon, presipitasyon,<br />
ELISA) diğer mikobakteri türleriyle çapraz reaksiyon vermesi nedeniyle güvenilir<br />
olmadığı belirtilmektedir. (Auer, 1987; Rothel ve ark, 1992) Hanna ve ark, 1992).<br />
Bahsedilen testlerin bir diğer dezavantajı da çok düşük seviyedeki serum antikorlarını<br />
tespit edememeleridir (Tizard, 1982).<br />
Tüberküloz teşhisinde kullanılan bir diğer yöntem PPD deri testidir. Tüberküloz<br />
etkeni izole edilmesine rağmen PPD negatif ve patolojik bulguların rastlanmadığı durumlar<br />
da rapor edilmiştir (Pritchard 1988, Beytut 2001)<br />
8.2 Literatür Özeti:<br />
Granülomatöz pnömoniler (GP), akciğerde genellikle lokal veya bazen yaygın<br />
yerleşimli, değişik büyüklükte granülomlara neden olan kronik pnömonilerdir. Bunlar<br />
arasında en önemlisi şüphesiz tüberküloza (Tb) ilgili olanlarıdır. Bunu aktinobasilloz ile<br />
mantarlara bağlı diğer pnömomikozlar takip eder (Jones ve Hunt, 1983; Urman, 1983;<br />
Alibaşoğlu ve Yeşildere, 1988). Varlığı M.Ö. 5000 yıllarına kadar dayanan, yıllar boyu<br />
insanlığın korkulu rüyalarından biri olarak mevcudiyetini sürdüren ve son yıllarda ise<br />
yeniden yaygınlaşma eğiliminde olan tüberküloz (Thoen, 1988; Diker, 1989b; Köküöz,<br />
1996), sığırlarda genellikle aerojen olarak bulaşır (Francis, 1972; Pritchard, 1988). Primer<br />
lezyon en çok akciğerlerde, özellikle de dorso-kaudal bölgelerinde, tek veya multiple<br />
odaklar şeklinde görülür ve daima bölge lenf düğümlerini de etkiler. Enfeksiyon, bronkopnömonide<br />
olduğu gibi bronşioler-alveoler bölgelerden başlar ve lobüler yerleşimli,<br />
yonca yaprağı görünümünde, multiple odaklar şekillenir (Dungworth, 1985). Tüberküloz<br />
lezyonları bazen de birbirleriyle birleşerek geniş kazeifikasyon nekroz alanları oluştururlar<br />
42
(Urman, 1983; Alibaşoğlu ve Yeşildere, 1988).<br />
Granülomatöz tipte pnömoni tüberkülozdan başka aktinobasilloziste de görülür.<br />
Mikotik enfeksiyonlarda granülomatöz pnömonilere sebep olurlar. Granülomatöz mantar<br />
enfeksiyonları arasında aspergilloz, blastomikoz, kriptokokkoz ve koksidioidomikoz<br />
sayılabilir. (Jones ve Hunt, 1983).<br />
Aktinobasillozisle Aerojen enfeksiyonlarda, akciğerde kraniyal loblarda büyümenin<br />
yanısıra yumruk büyüklüğüne varan ve küçük apselerle bezenmiş yumuşak bölgeler<br />
görülür. Bunların çevresinde fibröz kapsül bulunur. Hematojen enfeksiyonda ise, multiple<br />
miliyer (domuz) veya ceviz büyüklüğünde düğümler meydana gelir. Mikroskobik olarak,<br />
ortada ışınsal yapıda etkenlerin çevresinde nötrofil lökositler, epiteloid hücreler, dev<br />
hücreleri ve lenfositlerden oluşan hücre infiltrasyonları ile bunların çevresinde fibröz<br />
kapsül görülür (Jones ve Hunt, 1983; Urman, 1983; Alibaşoğlu ve Yeşildere, 1988).<br />
Mikotik pnömoniler mantarların sebep olduğu pnömoniler olup, hematojen ve<br />
solunum yoluyla bulaşırlar. Mikotik pnömoniler ya fırsatçı (fakültatif patojen) mantar<br />
enfeksiyonları, ya da sistemik enfeksiyonlar (obligat patojen mantarlar) sırasında meydana<br />
gelirler (Jones ve Hunt, 1983; Urman, 1983; Alibaşoğlu ve Yeşildere, 1988).<br />
Mantar enfeksiyonları özellikle immunsupresyon ve uzun süreli antibiyotik<br />
tedavisinden sonra görülür. Akciğer aspergillozunda miliyerden ceviz büyüklüğüne varan<br />
ve büyük olanları belirgin bir fibröz kapsülle çevrili granulomlara rastlanır.<br />
Blastomyces dermatitidis'in oluşturduğu granülomatöz pnömonide Makroskobik<br />
olarak akciğere serpilmiş halde çok sayıda ve değişen büyüklükte nodüller görülür. Bu<br />
nodüller, genellikle sert kıvamlı granulomlar halindeyken, bazen ortalarında irinleşmeye de<br />
(piyogranulom) rastlanır. Akciğerdeki bu granulomlara ilaveten genellikle bölgesel lenf<br />
düğümlerinde de granulomlara veya kazeifiye odaklara rastlanır. Bu durum, tüberkülozun<br />
primer kompleksine benzer. Mikroskobik olarak makrofaj, epiteloid histiyositler, dev<br />
hücreleri ve az sayıda nötrofil lökositler ile bağ dokudan oluşan gdanulomlar görülür.<br />
Etken, PAS ve methenamine-silver boyama yöntemleriyle ortaya konabilir (Jones ve Hunt,<br />
1983; Urman, 1983; Alibaşoğlu ve Yeşildere, 1988., Diker, F. (1989a) ).<br />
Cryptococcus neoformans, pnömonisinde Makroskobik olarak akciğerlerde çok<br />
sayıda, küçük, beyaz renkli ve jelatinöz görünümde granulomlar vardır. Bu jelatinöz<br />
görünümün sebebi, etkenin kapsülündeki mukustur. Mikroskobik olarak çoğunun<br />
sitoplazması vakuollü makrofajlar ile lenfosit ve plazma hücrelerinin yanısıra bol miktarda<br />
etkenlere rastlanır. Bazı olgularda epiteloid histiyositler ve dev hücreleri de bulunabilir.<br />
Hematoksilen-eozin boyamada etken, boyayı almadığı için bu lezyonların ilk bakışta sabun<br />
köpüğü gibi bir görünümü vardır. Etkenin kapsülü, PAS, mucicarmine ve Alcian blue ile<br />
iyi boyanır(Jones ve Hunt, 1983; Urman, 1983; Alibaşoğlu ve Yeşildere, 1988).<br />
Coccidioides immitis’in oluşturduğu granülomatöz pnömoniye akciğer ve bölgesel<br />
lenf düğümlerinde rastlanır. Makroskobik olarak akciğerde gri-beyaz renkli, iyi sınırlı<br />
granulomlar vardır. Bunların ortasında kazeifikasyon ve bazen irinli erimelere rastlanır.<br />
Mikroskobik olarak bu granulomlar, epiteloid histiyositler, dev hücreleri, lenfositler ve<br />
nötrofil lökositlerden oluşmuştur. Bu bölgelerde etkenin endosporları (2-5 mikron) veya<br />
sporangium’larına (10-70 mikron) rastlanır (Jones ve Hunt, 1983; Urman, 1983;<br />
Alibaşoğlu ve Yeşildere, 1988).<br />
Granülomatöz pneumoniye sebep olan etkenlerin ve özellikle de Tüberküloz etkeninin<br />
kısa ve direk teşhisi bir takım zorlukları içermektedir.<br />
Dünyanın çeşitli yerlerinde tüberküloz eradikasyon kampanyalarında intradermal<br />
tüberkülin testlerinden faydalanılmıştır. Fakat testin spesifıtesi yüksek bulunurken<br />
(%98,8), sensivıtitesi düşük (%65,6) çıkmıştır. Ayrıca atipik mykobakteriler kros<br />
reaksiyonlara da neden olabilir. Deri testlerinin bir diğer dezavantajı da 72 saat lik bir süre<br />
sonunda okunabilmesidir ( Liebana 1995 ). Hastalığın mikrobiyolojik teşhisi de kültürlerle<br />
43
yapılabilmektedir. Fakat M. bovis'in mikrobiyolojik teşhisi 2-3 ay alabilen oldukça yavaş<br />
bir prosedürdür. ilave olarak isolatın biyokimyasal identifikasyonu için 2-3 hafta<br />
gereklidir. Ayrıca bilinmelidirki kültürlerin sensitivitesi % 100 değildir. Hatalı negatif<br />
kültür sonuçları meydana gelebilir (Liebana 1995).<br />
Behren ve arkadaşlarının (1996) bildirdiğine göre M. bovis'in hücre yüzeyinde bir seri<br />
önemli zar lipoproteinleri bulunmaktadır. Bu değişken yüzey proteinleri film inhibisyon ve<br />
immunofloresan antikor testleri gibi bazı klasik laboratuvar yöntemlerinin duyarlılıklarının<br />
azaltabilir. Daha gelişmiş yöntemlerden olan ELlSA rutin diyagnostik çalşmalarda önemli<br />
bir rolü olmasına rağmen spesifitesi büyük ölçüde kullanılan monoklonal antikora bağlıdır.<br />
Çeşitli evcil <strong>hayvan</strong>larda ( Perumaalla V.S. 1996, Herrera ve ark. 1996, Aranaz ve ark.<br />
1996) yapılan bazı çalışmalarda M. bovis'in belirlenmesi amacıyla PCR tekniğinden<br />
faydalanılmıştır. Türe özel PCR yönteminin uygulanması tüberkülozun teşhisinde klasik<br />
yöntemlerde karşılaşan problemlerin aşılmasında önemli bir alternatif olarak<br />
görülmektedir. (Jones ve Hunt, 1983; Urman, 1983; Alibaşoğlu ve Yeşildere, 1988).<br />
8.4. Materyal ve Metot:<br />
Çalışma materyalini Adana da bulunan 2 adet özel Mezbahada kesilen değişik yaş ve<br />
ırklardan oluşan 5000 baş sığırın akciğerleri ile mediastinal ve bronşial lenf düğümlerinin<br />
muayenesinde bulunacak granülomatöz lezyonlu dokular oluşturacaktır. Şubat 2009-Mart<br />
2010 tarihleri arasında her ayın belirli günlerinde periyodik olarak mezbahaya gidilmek<br />
suretiyle kesim için getirilen sığırların antemortem muayeneleri yapılacak kesimden önce<br />
yapılan muayenede şüpheli bulunan <strong>hayvan</strong>ların yaşı, cinsiyeti, ırkı, ve geldiği odak tespit<br />
edilerek kaydedilecektir. Eğer <strong>hayvan</strong> sahipleri kesim esnasında mevcutsa çiftliği ve<br />
<strong>hayvan</strong>la ile ilgili bazı bilgiler (<strong>hayvan</strong> sayısı, ırkı, besleme amacı, geçirdiği gebelik sayısı,<br />
solunum sistemi hastalığı geçirip geçirmediği, bakım ve barındırma vs) de anket yoluyla<br />
elde edilecektir. Kesilen sığırların akciğerleri makroskobik olarak muayene edilerek,<br />
belirlenen granülomatöz lezyonlar önceden hazırlanan akciğer şemaları üzerinde<br />
işaretlenecek ve mikrobiyolojik muayeneler için steril kaplara, PCR ve histopatolojik<br />
muayeneler için % 10'luk tamponlu formaline lezyonlu bölgelerden doku parçaları alınarak<br />
tespit edilecektir. Tespit edilen doku parçaları histopatolojik muayeneler için Luna, 1968<br />
göre işlenerek 5-6 mikron kalınlığında kesitler alınacaktır. Alınan tüm kesitler<br />
Hematoksilen ve Eozin, Ziehl-Neelsen (ZN), Periodic Acid Schiff (PAS), Brown ve Brenn<br />
ile Gridley boyama metotlarıyla boyanarak ışık mikroskobunda incelenecektir. PCR için<br />
alınan doku örneklerinden histopatolojik sonuçlara göre nükleik asit amplifikasyon<br />
temeline dayanan ticari moleküler sistemlerden ROCHE firması (TIB Molbiol)<br />
tarafından üretilen Myocobacterium ssp. kiti ile mycobacteriumlar, aynı firma tarafından<br />
üretilen ZR Fungal Bacterial DNA kiti ve Panfungal Kit kullanılarak Roche marka light<br />
cycler 2.0 cihazı ile etkenlere ait nükleik asitler ortaya konulacaktır.<br />
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
1. Adana bölgesinde ilk defa patolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak sığırlarda<br />
granülomatöz pnömoni etkenlerinin teşhisi yapılacak ve teklif edilen projenin yürütüleceği<br />
laboratuvarlara adı geçen teşhis teknikleri yerleştirilecektir. Bu proje ile özellikle<br />
tüberkülozun teşhisinde önemli bir bilgi birikimi sağlayacaktır.<br />
2. Adana bölgesinde ilk defa patolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak sığırlarda<br />
granülomatöz pnömoni etkenlerinin neden olduğu patolojik değişiklikler saptanarak ortaya<br />
konulacaktır.<br />
3. Adana bölgesinde ilk defa patolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak sığırlarda<br />
granülomatöz pnömonilerin görülme sıklıgı ile bakım besleme şartları arasındaki ilişki<br />
ortaya konulacaktır.<br />
44
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı: Dr.Mehmet TUZCU (Patoloji Laboratuvarı Şefi)<br />
9.2. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Atila YOLDAŞ (Moloküler Biyoloji<br />
Laboratuvarı Şefi)<br />
9.3. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Veteriner Hekim Cemal KURT<br />
9.4. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Veteriner Hekim Nevin TUZCU (Çukurova<br />
Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Doktora Öğrencisi)<br />
9.5. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Veteriner Hekim Nevin TURUT (Bakteriyoloji<br />
Laboratuvarı Şefi)<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Olan Donanım<br />
Patoloji Laboratuarı:<br />
Mikrotom, Hızlı Dondurma Ünitesi, Otomatik Doku Takip Cihazı, Doku Gömme Cihazı, Etüv,<br />
Steril Kabin, Binoküler Araştırma Mikroskobu, Buzdolabı, Rutin Patolojik Muayeneler için gerekli<br />
kimyasallar<br />
PCR laboratuarı:<br />
Light Cycler 2.0 (Roche), MagNA Pure LC (Roche), MagNA Lyser (Roche), Steril Kabin (Nüve),<br />
Labratuvar Kullanımına Uygun Derin Dondurucu (Sanyo), Rutin Mikrobiyolojik Muayeneler için<br />
gerekli kimyasal ve besiyerleri<br />
Teşhis laboratuarı:<br />
Vitek Bakteri İzalasyon Cihazı (Biomerieux), Minilyser ELİSA (TECAN) ,Microbiological<br />
Incubators (Heraeus), Mini API (Biomerieux)<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım :<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri<br />
Atık Sığır Fetuslarında Brucella, Leptospira, Listeria, Campylobacter ve Klamidia<br />
Etkenlerinin Immunohistokimyasal, Mikrobiyolojik ve Moleküler Yöntemlerle<br />
İncelenmesi. Proje Lideri: Dr. Mehmet TUZCU<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
Talep edilen bütçe; analitik bütçe olarak YTL cinsinden hazırlanır. Eğer proje süresi bir<br />
yıldan fazla ise yıllık maliyetleri ayrı ayrı hesaplanır. Araştırma ekipmanı araştırma sarf<br />
malzemeleri vb. (ulaşım, literatür ve yayın masrafları vb.) bütçeye dahil edilir. Bütçe hazırlıkları<br />
yapılırken , www.bumko.gov.tr. internet adresinden faydalanılır.<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
50.000 30.000<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
03.3- YOLUKLAR<br />
03.4- GÖREV GİDERLERİ<br />
03.5- HİZMET ALIMLARI<br />
03.6- TEMSİL VE TANITMA GİDERLERİ<br />
03.7- MENKULMAL, GAYRİMADDİ HAK ALIM,<br />
BAKIM VE ONARIM GİDERLERİ<br />
03.8- GAYRİMENKUL MAL BAKIM VE ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
03.9- TEDAVİ VE CENAZE GİDERLERİ<br />
10.000 5.000<br />
TOPLAM 60.000 35.000<br />
45
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM GİDERLERİ<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA)<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER<br />
TOPLAM<br />
II. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
Başlıca Aşamalar Ayrıntılı Bilgi Zamanlama<br />
1. Aşama<br />
Materyal toplanması, sarf ve demirbaş malzemenin<br />
1-12 aylar<br />
temini, literatür araştırması<br />
Materyal toplanması, ilk 12 ay toplanan materyalin<br />
2. Aşama Patolojik ve PCR incelemelerinin yapılması,<br />
literatür araştırması<br />
13-18 aylar<br />
3. Aşama Patolojik ve PCR bulgulann degerlendirilmesi 19-21 aylar<br />
4. Aşama Proje kesin raporunun yazımı 21-24 aylar<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
Alibaşoğlu, M. ve Yeşildere, T. (1988). Veteriner Sistemik Patoloji. Cilt i, 207-262,<br />
Kardeşler Basımevi, istanbul<br />
Aranaz, A, Liebana, E., Pickering, X. Novoa, C., Mateos, A, Dominguez, L. (1996)<br />
Use of Polymeraze Chain Reaction in the diagnosis of tuberculosis in ca ts and dogs.<br />
Veterinary Record, 138, 276-280<br />
Auer, L. A (1987) Assessment of an enzyme-linked immunosorbent assay for the<br />
detection of cattle infected with Mycobacterium bovis. Australian Veterinary Journal. 64,<br />
172-176<br />
Bascunana, C. R, Belak, K. (1996) Detection and identification of mycobacteria in<br />
formalinfixed, paraffin-embedded tissues by nested PCR and restriction enzyme analysis.<br />
J. Clin. Microbiol, 34, 2351-2355<br />
Behrens, A, Poumarat, F., Le Grand, D., Heller, M. and Rosengarten, R (1996)<br />
Microbiology 142, 2463<br />
Beytut E(2001): Kars ili ve yöresinde sığırlarda tüberküloz insidensi ve lezyonların<br />
lokalizasyonu üzerine patolojik incelemeler. Kafkas Üniversitesi Vet. Fak. Derg. 7(1):15-<br />
Controversy. J. Comp. Path. 99, 357-399<br />
Diker, F. (1989a). Bursa yöresinde çeşitli ırk sığırlarda görülen tüberküloz lezyonlarının<br />
organlara dağılışı ve histolojik yapıları. Pendik Hayv. Hast. Merk. Araşt. Enst. Derg., XX<br />
46
(2),78-94.<br />
Diker, F. (1989b). Tüberkülozun dünü ve bugünü. Vet.Hek.Dern.Derg., 59 (3-4), 32-36.<br />
Dungworth, D.L. (1985). The Respiratory System. In "Pathology of Domestic Animals"<br />
Ed by K.V.F. Jubb, P.C. Kennedyand N. Palmer, Vol. 2, 3rd ed, 413-556, Academic Press,<br />
London.<br />
Francis, J. (1972). Route of infection in tuberculosis. Aust.Vet.J., 48, 578.<br />
Glennon, M., Jager, B., Dowdalı, D., Maher, M., Dawson, M., Quigley, F., Costello, E,<br />
Smith, T. (1997) PCR-based fingerprinting of Mycobacterium bovis isolates. Vet<br />
Microbiol, 1997, 54, 235-245<br />
Hanna, J. ve ark (1992) Vet. Microbiol. 31, 243 PerumaallaV.S. et aL. (1996): Molecular<br />
Epidemiology of M. bovis in Texas and Mexico. Journal of Clinical Microbiology, 34,<br />
2066-2071.<br />
Köküöz, Ayşe N. (1996). 1995 Dünya Sağlık Raporu'ndan. TÜBiTAK Bilim ve Teknik<br />
Derg., 29, 36-37.<br />
Liebana E, Aranaz, A, Mateos, AVilafranca, M.Gomez,E et al (1995) Simple and<br />
Rapid Detrection of M. tuberculosis Complex Organism in Bovine Tissue Samples by PCR<br />
Journal of Clinical Microbiology, Jan, 33-36:<br />
Luna, L.G. (1968). Manuel of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institue<br />
of Pathology. 3rd ed, Mc Graw-Hill Bo ok Company, New York.<br />
Pritchard, D. G. (1988) A Century of Bovine Tuberculosis 1888-1988: Conquest and<br />
Pritchard, D.G. (1988). A century of bovine tuberculosis 1888-1988: Conquest and<br />
controversy. J.Comp.Path., 99,357-399.<br />
Rothel, J. S., Jones, S. L., Corner, L. A, Cox, J. C., and Wood, P. R (1992) The gamma<br />
interferon assay7 for diagnosis of bovine tuberculosis in cattle: conditions affecting the<br />
production of gamma-interferon in whole blood culture. Australian Veterinary Journal. 69,<br />
1-4<br />
Runnels, RA, Monlux, W.S. and Monlux, A.W. (1960). Principles of Veterinary<br />
Pathology. pp.391-441, The lowa State University Press, Ames, lowa, USA.<br />
Thoen, C.O. (1988). Tuberculosis. JAVMA, 193 (9), 1045-1048.<br />
Tizard, i. (1982) Serologic assays. JA VMA. 181, 1162-1165 Wards, B. J., Collins, D. M.,<br />
de Lisle, G. W. (1995) Detection of Mycobacterium bovis in tissues by polymerase chain<br />
reaction. Vet Microbiol, 43, 1995.<br />
Urman, H.K. (1983). Evcil Hayvanların Özel Patolojik Anatomisi. Cilt i, A.Ü. Vet. Fak.<br />
Yay. Basımevi, Ankara.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Dr. Mehmet TUZCU<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Mehmet MİRİOĞLU<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar :<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar :<br />
47
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI: Marmara bölgesindeki koyunlarda pestivirusprevalansının<br />
saptanması.<br />
The detection of pestivirus prevalance in sheep in Marmara region.<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ :Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Dr. Nesrin TURAN<br />
Kurumu : Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
(Projeye en uygun düşen Araştırma Fırsat Alanını, Araştırma Programını ve Önceliklerini yazınız)<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı: Küçükbaş <strong>hayvan</strong>cılık<br />
Araştırma Programı : Koyun yetiştiriciliği<br />
5. PROJE SÜRESİ : 12 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : 01.06.2008<br />
5.2. Bitiş Tarihi : 01.06.2009<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Pestivirüs enfeksiyonları gebe koyunlarda yavru atma, yeni doğan kuzularda<br />
kongenital olarak merkezi sinir sistemi bozuklukları, dikleşmiş tüyler, normalin altında<br />
doğum ağırlığı ve kafatasında değişikliklerle karakterinize bir hastalıktır. Marmara<br />
bölgesinde persiste enfeksiyona neden olan pestivirusunun prevalansının saptanması<br />
amacıyla Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsüne bağlı illerdeki koyunlarda<br />
kan numuneleri alınacak, kanlardan lökösit ve kan serumları ayrılarak numunelerden önce<br />
BVDV antijen detection ve antikor detection ELISA ile pestivirüs ve bu virusa karşı<br />
oluşmuş antikor varlığı varlığı araştırılacak, aynı zamanda lökosit örneklerinden kuzu<br />
böbrek hücre kültürlerine ekimler yapılacaktır. Kan serumlarında pestivirusa karşı<br />
oluşmuş antikor varlığına SNT ile bakılacaktır. CPE pozitif virus üremesi görülen hücre<br />
kültürlerinde pestivirusunun varlığının saptanması amacıyla ELISA ve virus nötralizasyon<br />
testi yapılacaktır. CPE negatif hücre kültürleri 3 kör pasajdan sonra İmmun peroksidaz<br />
testi uygulanarak Non-sitopatik pestivirusu varlığı araştırılacaktır.<br />
7.ANAHTAR KELİMELER:<br />
Pestivirus, kan serumu, lökosit, izolasyon,koyun,ELISA,Immunperoksidaz<br />
48
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi: Koyun yetiştiriciliğinde pestiviruslar yeni doğan<br />
kuzularda kongenital olarak merkezi sinir sistemi bozuklukları, dikleşmiş tüyler, normalin<br />
altında doğum ağırlığı ve kafatası iskeletinde değişikliklerle karakterize hastalık<br />
oluştururlar. Hastalığın yayılmasında en önemli faktör klinik tablo oluşturmayan sürekli<br />
enfekte <strong>hayvan</strong>lardır. Bunlar sekret ve eksretleri ile virusu uzun süre saçarlar. Virusu çeşitli<br />
yollarla alan duyarlı gebe koyunlar enfekte olurlar. Bu enfeksiyon daha sonra yavruya<br />
kongenital yolla bulaşarak yavruda fötopati oluşmasının yanı sıra, abort ve enfekte kuzu<br />
doğumlarıda meydana gelir. Bu durum yıllarca sürer ve enfekte erkek kuzularda infertilite<br />
oluşur. Aynı zamanda bu koçlar sperma vasıtasıyla enfeksiyonu yayarlar. Bu proje ile<br />
Enstitümüze bağlı illerde yetiştirilen koyunlarda persiste enfeksiyonlara neden olan<br />
pestivirus enfeksiyonunun yaygınlığının belirlenmesi ve elde edilecek sonuçlara göre bu<br />
enfeksiyona karşı gerekli tedbirlerin uygunlanması amaçlanmıştır.<br />
8.2.Literatür Özeti:<br />
Pestivirus enfeksiyonları yeni doğan kuzularda,kongenital olarak merkezi sinir<br />
sistemi bozuklukları, dikleşmiş tüyler, normalin altında doğum ağırlığı ve kafatasında<br />
değişikliklerle karakterinize bir hastalıktır. (19).<br />
Border Disease ilk defa İngiltere ve Galler arasında sınır bölgesinde bildirildikten<br />
sonra,Scotland,YeniZelanda,İrlanda,Avusturalya,Amerika,İsviçre,Yunanistan,Hollanda,Ka<br />
nada,Norveç,Almanya,Suriye,Fransa ve Türkiye’de de bildirilmiştir.(19).<br />
Border disease virusu Flaviviridae familyasının pestiviruslar alt grubunda yer<br />
almaktadır. Pozitif tek iplikçikli RNA içeren virus, zarlı ve helikal simetrik yapıdadır.(19)<br />
Koyunlardan izole edilen Border Disease virusu ile sığırlardan izole edilen BVD virusu<br />
çok yakın akrabadırlar. Bu iki virus Avrupa Domuz Vebası virusu ile daha az derecede<br />
akrabalık gösterirler. Bu üç virusun olduğu grup virolojide pestiviruslar olarak<br />
isimlendirilmişlerdir. Deneysel olarak sığırları Border Disease virusu ile, koyunlarıda BVD<br />
virusları ile enfekte etmek mümkündür. Her iki deneysel çalışmada fötal enfeksiyonlar<br />
meydana gelir. Domuzlarda bu iki virusla enfekte edilebilir ancak genellikle hastalık<br />
meydana gelmemektedir. (9).<br />
Monoklonal ve poliklonal antiserum kullanılarak yapılan çalışma ile 110 dan fazla<br />
izolatın serolojik karşılaştırılmasında pestiviruslardan biri koyunlarda,diğeri sığırlarda<br />
olmak üzere predominant iki antijenik grubun varlığı gösterilmiştir.(20). Sitopatojen (cp)<br />
suşların varlığı bildirilmesine rağmen, genel olarak border disease virusunun tüm saha<br />
izolatları hücre kültürlerinde sitopatojenik etki yapmayan biyotipidir. Sitopatojenik<br />
olmayan (ncp) biyotipleri,persiste ve kongenital enfeksiyon durumunda; sitopatojenik<br />
izolatlar ise mukozal belirtiler gösteren ve ölmek üzere olan koyunlardan izole<br />
edilmiştir.(6).,(10).,(14).<br />
Virus, primer veya fötal dana ve kuzu böbrek ile testis hücre kültürlerinde CPE<br />
yaparak ve yapmadan üreyebilir.<br />
Hastalığın yayılmasında en önemli faktör, klinik tablo oluşmayan sürekli enfekte<br />
<strong>hayvan</strong>lardır. Bunlar sekret ve eksretleri ile virusu uzun süre saçarlar.Virusu çeşitli<br />
yollardan alan duyarlı gebe koyunlar enfekte olurlar. Bu enfeksiyon daha sonra yavruya<br />
kongenital yolla bulaşarak yavruda fötopati oluşmasının yanı sıra, abort ve enfekte kuzu<br />
doğumları da meydana gelir. Bu durum yıllarca sürer ve enfekte erkek kuzularda infertilite<br />
oluşur. Aynı zamanda bu koçlar sperma vasıtasıyla enfeksiyonu yayarlar.(19).<br />
Genel olarak bulaşma direkt ve indirekt yollarla olmaktadır.Virus gözyaşı, burun<br />
akıntısı, gaita,idrar, uterus akıntısı,amniyotik sıvı,plasenta ve sperma ile saçılmaktadır.<br />
İndirekt bulaşmada,ahır materyali, enfekte yem ve sular yer almaktadır.Sığır ve keçiler<br />
49
doğal enfeksiyon kaynağı olarak rol oynarlar.Virus, vahşi ruminantlar arasında değişik<br />
geyik türlerinden de izole edilmiştir.Diğer etkili enfeksiyon kaynağı ise,pestiviruslarla<br />
kontamine modifiye canlı aşılardır.Bütün modifiye canlı aşılar koyun,sığır veya domuz<br />
hücre kültürlerinde ve bu türlerden elde edilen serum (pestiviruslarla kontamine olma riski<br />
taşıyan)eklenmiş vasatlarda üretilir.Bu nedenle pestivirus yönünden negatif serum ve hücre<br />
kullanımı enfeksiyonun kontrol altına alınmasında önemlidir.Yapılan çalışmalarda,kan<br />
emen kenelerin mekanik olarak virusu bulaştırdığı bildirilmiştir.(19).<br />
Border disease ile enfekte yetişkin koyunlarda,enfeksiyondan birkaç gün sonra hafif<br />
bir ateş ve orta şiddette bir leukopeni görülür.Gebe koyunlarda ise enfeksiyon fötusa<br />
geçerek ya abort oluşturur yada çeşitli malformasyonlu doğumlar meydana gelir.Abort<br />
olayları genellikle gebeliğin 90. gününde oluşur. Fötus kahverengi mumifiye ve şişmiş<br />
durumdadır.Hastalıklı ve canlı olan kuzular ise,genellikle biraz erken ve normalden daha<br />
düşük doğum ağırlığına sahip olarak doğarlar.Bu kuzular ayakta duramazlar ve titreme<br />
gösterirler.Deride ise ,kılsız bölgeler veya dikleşmiş köpek kılı manzaralı alanlar<br />
görülür.Deride özellikle ense ve boyun bölgesinde kahverengi siyah pigmentasyonlar<br />
dikkati çeker.Bu tür kuzuların alın kemiklerinde çıkıntılar ve arka ayaklarda kısalık<br />
görülebilir.Ayrıca mandibula kısalığına da sıkça rastlanır.En önemli belirtiler<br />
abort,kısırlık,zayıf kuzu doğumu ve anormal pigmentasyonla birlikte yapağı<br />
değişiklikleridir(köpek kılı benzeri görünüm). Enfekte olmuş kuzulara bu belirtiden dolayı<br />
hairy shaker veya fuzzy lambs gibi isimler verilmiştir.<br />
Genellikle kuzulardaki klinik tablo teşhise yardımcı olur.Tipik hairy shaker klinik<br />
belirtisi olan kuzu doğumu teşhisi doğrular. Şüpheli sürüdeki tüm <strong>hayvan</strong>lardan persiste<br />
enfeksiyonları belirlemek için kan örnekleri alınmalıdır.Antikor negatif, virus pozitifler<br />
persiste enfeksiyonların tespitini kolaylaştırır.Virus izolasyonu kuzu böbrek ve kas hücre<br />
kültürlerinde gerçekleştirilir.Nonsitopatojen virusların tespiti için de,İmmunofloresan ve<br />
İmmunperoksidaz testleri laboratuarlarda rutin olarak kullanılmaktadır.Spesifik<br />
antikorların belirlenmesinde de en çok kullanılan serolojik testler ELISA ve serum<br />
nötralizasyon teknikleridir.Son yıllarda persiste enfeksiyonların tespitinde lökositlerden<br />
virus izolasyonu çok zaman aldığı için monoklonal antikorlar<br />
kullanılarak;ELISA,immunfloresan boyama(Flow cytometry metodu) ve DNA dot-blot<br />
hibridizasyon gibi yeni biyoteknolojik teşhis metotları denenmektedir.<br />
İthal <strong>hayvan</strong>ların Border Disease yönünden negatif olup olmadığı kontrol<br />
edilmelidir. Enfekte sürülerde bireysel olarak seronegatif <strong>hayvan</strong>lar ,virus<br />
taşıyabileceğinden bu sürüler kabul edilmemelidir. Hastalığın endemik olduğu ülkelerden<br />
alımlarda dikkatli olunmalıdır. Sporadik vakalarda enfeksiyonun yayılmasını önlemenin en<br />
emin yolu, <strong>hayvan</strong>ları keserek elden çıkartmaktır .Endemik vakalarda enfeksiyon<br />
yayılmaya başlamışsa, persiste enfekte <strong>hayvan</strong>ların tespiti ve bunların eliminasyonu<br />
önemlidir. Çiftleşmeden en az iki ay önce bütün <strong>hayvan</strong>lar serolojik olarak kontrol<br />
edilmelidir. Çünkü alınan ilk kan örneğinde virus pozitif, antikor negatif olduğu<br />
durumlarda 1-2 ay sonra tekrar alınan kan örneği ile, bunun bir akut enfeksiyon mu yoksa<br />
persiste bir enfeksiyon mu olduğunun ayırt edilmesi gerekir. İkinci alınan kan örneğinde<br />
yine virus pozitif, antikor negatif çıkarsa, bunun persiste bir enfeksiyon olduğuna karar<br />
verilir. Enfeksiyon akut ise virus negatif, antikor pozitif çıkar. Border disease hastalığının<br />
kontrolünde, damızlık sürüdeki dişilerin çiftleşmeden birkaç ay önce aşılanması önemlidir.<br />
BD e karşı hazırlanmış özel bir aşı yoktur. Dünyada BVDV aşısı kullanılmaktadır. Hangi<br />
suşların enfeksiyonu oluşturduğu bilinmeden aşılama yapmak pratik değildir.<br />
Pescador ve ark. (25 ), inkoordinasyon ve tremörler ile karakterize sinirsel<br />
semptomlar gösteren 2 aylık kuzuların otopsilerinde cerebellumun önemli derecede<br />
küçüldüğünü, lateral ventriküllerde bilateral dilatasyon olduğunu ifade etmişlerdir.<br />
50
Mikroskopik olarak cerebellar kortekste selüler dizorganizasyon, cerebellumda granular<br />
tabakada hücre yoğunluğunda azalma ile moleküler tabakadaki hücrelerde büyük<br />
sitoplazmik vakuollerin varlığını tanımlamışlardır. BVDV Mab kullanılarak beyinde gri<br />
maddeki nöronlarda, mezenterik lenf nodülllerindeki makrofajlarda pozitif boyanmalar<br />
olduğunu ifade etmişlerdir.<br />
Burgu ve ark (5), Ankara bölgesindeki farklı mezbahanelerden toplanan 100 gebe<br />
koyuna ait kan serumlarında pestivirus varlığını %41,3 seropozitiflik saptadıklarını, 65<br />
fötus örneğinin tamamının seronegetif olduğunu, 108 fötüsa ait 584 farklı organ ve kan<br />
örneklerinden birinde noncytopatic pestivirus tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Burgu ve<br />
ark. (8 ) ları yaptıkları diğer bir araştırmada 174 adeti gebeliğin 2-3. aylarında ve doğum<br />
yaptıkları gün, 487 adeti yalnızca doğum yaptıkları gün olmak üzere toplam 661 koyundan<br />
ve 29 koçtan kan örnekleri alındığını, 109 adeti ikiz olan 770 kuzudan prekolostral kan<br />
örneği sağlandığını, kan örneklerinin pestivirus antijeni yönünden kontrolü sonucunda<br />
koyunlarda persiste pestivirus enfeksiyonu saptanamadığını , buna karşın koyunların kan<br />
serumlarında 1. dönem için %25 ve 2. dönem için %21.5 oranında seropozitiflik<br />
saptandığını, prekolostal kan örneklerinde antikor tespitine dayanılarak yapılan testlerde<br />
127 kuzunun pestivirus yönünden seropozitif olduğu ve bu sonuçlar ışığında kuzuların<br />
gebeliğin 2-3. aylarında immunsistem geliştikten sonra enfekte olduklarını gösterdiği<br />
kanatine vardıklarını bildirmişlerdir.<br />
Lamontagne ve Roy (24), Koyun ve keçilerde BVD-MD’nin seroprevalansının<br />
saptanmasında şetçikleri her bir sürüden %10 oranında kan serumu örneklerinin BVD-MD<br />
yönünden serum nötralizasyon testi ile incelediklerini ve koyunlarda %10.9 ve keçilerde<br />
%16 oranında pozitiflik saptadıklarını bildirmişlerdir.<br />
Emmanuel ve ark.(14) sağlıklı koyunlardan alınan 158 kan serumunun 4 ‘ünde<br />
(%2,5) virus nötralizasyon ile BVDV antikorları tespit etmişlerdir.<br />
Elazhary ve ark.(13) Kanada’da klinik olarak normal 1,075 koyun ve keçiden<br />
topladıkları kan örneklerinde BVDV virusuna karşı antikor varlığını % 22.2 olarak<br />
saptadıklarını bildirmişlerdir.<br />
Hyera ve ark.(21) Güney Tanzanya’da yaptıkları çalışmada koyunlarda BVD<br />
virusunun seropozitifliğinin saptanması amacıyla serolojik taramaları için 471 adet koyun<br />
kan toplandığını ve elde edilen kan serumlarında BVD virusuna karşı antikor varlığını<br />
serum nötralizasyon testi ile %32.1 olarak saptandığını,pozitiflik oranlarının yaşlı<br />
<strong>hayvan</strong>larda (3 yaş üzeri) genç <strong>hayvan</strong>lardan (1 yaş ve altı) daha yüksek olduğunu<br />
bildirmişlerdir.<br />
Adair ve Ark. (1) Kuzey İrlanda’da yaptıkları çalışmada 113 çiftlikten 400 adet<br />
koyun kan serumunun toplandığı, kan serumlarının % 53’ünün Immunofluorescent staining<br />
ile pozitif bulunduğunu bildirmişlerdir.<br />
Depner ve ark. (12) Namibia’da 618 koyun kan serumundan %14 ‘ünde BVD<br />
virusuna karşı nötralizan antikorları saptadıklarını bildirmişlerdir.<br />
Loken ve ark. (26), Norveçte 3712 koyun kan serumunda BVD virusuna karşı<br />
nötrlizan antikorları % 4.5 olarak serum nötralizasyon testi ile saptamışlardır.<br />
Goyal ve ark.(18) Amerika Birleşik Devletleri Minnesoto’da üniversiteye ait 377<br />
adet koyun sürüsünde 1 koyunda virus nötralizasyon testi ile Bovine viral diarrhea’ye karşı<br />
antikor titre saptadıklarını bildirmişlerdir.<br />
8.3.MATERYAL VE METOT:<br />
MATERYAL VE METOT:<br />
Materyal: Hücre Kültürü: Araştırmada Virus izolasyonu, İmmun peroksidaz, virus, virus<br />
nötralizasyon testleri için immun peroksidaz testi sonucunda pestivirus yönünden negatif<br />
olduğu tespit edilmiş Fötal Dana Böbrek (FDB) ve MDBK hücre kültürleri kullanılacaktır.<br />
51
Standart Pestivirus suşları: Pozitif kontrol olarak BVDV referenz suşu olan CPE<br />
(+)NADL, sitopatojen olmayan CPE (-) BVD Virusu suşu (0712/Hannover suşu)<br />
kullanılacaktır<br />
IPEX-BVD Immunoperoxidase staining kit : Hücre kültürlerinde Non-cytopathic<br />
pestivirusu saptamak amacıyla kullanılacaktır.<br />
BVDV antijen detection ELISA kiti : Lökosit örneklerinde ve hücre kültüründe izole<br />
edilen pestivirus suşlarının saptanması amacıyla kullanılacaktır.<br />
BVDV antikor detection ELISA kiti : Kan serumlarında pestivirusa karşı oluşan antikor<br />
varlığının saptanması amacıyla kullanılacaktır.<br />
BVDV hiperimmun serumu : ticari olarak temin edilecektir.<br />
Lökosit örnekleri : koyunlardan EDTA lı tüplere alınan kanlardan elde edilecektir.<br />
Kan serumları : Koyunlardan kanlar alınacak ve kan serumları ayrılarak 220µm lik<br />
memran filtrelerden süzülerek 56 o C de inaktif edilerek pestivirus’lara karşı antikor<br />
varlığının belirlenmesi amacıyla ELISA ve serum nötralizasyon testinde kullanılacaktır.<br />
Virus İzolasyon Materyalleri: Virus izolasyonu amacıyla koyunlardan EDTA lı tüplere<br />
alınan kanlardan elde edilecek Lökosit örnekleri kullanılacaktır.<br />
METOT:<br />
Kan serumlarında Pestivirus antikor varlığının saptanması :<br />
ELISA testi ile Pestivirusa karşı antikor varlığının saptanması : Bu amaçla ticari<br />
ELISA kitleri kullanılacak ve üretici firmanın direktifleri doğrultusunda test yapılacaktır.<br />
Serum nötralizasyon testi ile Pestivirusa karşı antikor varlığının saptanması<br />
Kan serumlarında pestivirusa karşı antikor varlığının saptanması amacıyla 96 gözlü<br />
pleytlerde serumların 2 katlı dilüsyonları yapılacak ve her dilüsyona 100 DKID50/50 ml<br />
CPE(+) BVD virusundan eklenerek 37oC de 1 saat süreyle inkubasyona bırakılacaktır.Süre<br />
sonunda Her göze 100’er µl MDBK hücre süspansiyonundan eklenerek 37 o C de CO2 li<br />
etüvde inkubasyona bırakılacaktır. 10 gün süreyle her gün hücrelerin CPE oluşumları<br />
yönünden kontrolleri yapılacaktır. (3)<br />
Pestivirusların kanda saptanması :<br />
Lökosit örneklerinin hazırlanması :<br />
MDBK hücre kültürü hazırlanması : Azot tankında muhafaza edilen MDBK hücre<br />
kültürü 37 o C’ lik benmaride hızlı bir şekilde çözdürülür. Mililitre’de 300.000 hücre<br />
olacak şekilde 37 o C ısıdaki % 10 FCS içeren GMEM vasatı ile sulandırılarak 25cm 2 lik<br />
flasklara 7.5 ml konarak 37 o C de ve %5 CO2‘li ortamda monolayer hücre kültürü oluşması<br />
için inkubasyona bırakılır.Flasklar her gün hücrelerin üremeleri yönünden kontrolleri<br />
yapılır(5,7 ).<br />
Kuzu Böbrek Hücre Kültürünün Hazırlanması ( Literatür 2, 18 )<br />
1- Kuzu böbrek hücre kültürü 4 aylığı geçmemiş tercihen 2 aylık kuzulardan steril olarak<br />
alınan taze böbreklerden hazırlanır.<br />
2- Kesimden hemen sonra alınarak PBS içerisinde laboratuara getirilen böbreklerin<br />
öncelikle üzerindeki yağları temizlenir ve kapsülaları çıkarılır.<br />
3- Paslanmaz steril çelik kaplarda böbreklerin korteks kısmı medullaya dokunulmadan<br />
steril bir makas ve pens yardımı ile çok küçük parçalar halinde kesilir.<br />
4- Uç kez TD veya PBS ile yıkanır.<br />
5- Yıkanmış doku parçaları steril bir kaşık yardımı ile içerisinde canı veya teflon kaplı<br />
manyetik çubuk bulunan erlanmayerlere aktarılır.<br />
52
6- Doku parçaları ağırlıklarının 7-8 katı miktarında %0,25 tripsin solüsyonu ilave edilerek<br />
oda derecesinde 30 dakika veya tercihen 37•C de 15 dakika bir manyetik döndürücü<br />
üzerinde ön tripsinizasyona bırakılır.<br />
7- Ön tripsinizasyondan sonra tripsin atılır ve tekrar yeni %O,25 lik tripsin konarak<br />
1.tripsinizasyona başlanır.<br />
8- Daha sonraki tripsinizasyonlar 15-20 dakika sürer ve her etabın sonunda hücre<br />
süspansiyonları steril tülbentten süzülmek suretiyle alınarak bir şişede toplanır ve şişeye<br />
eşit miktarda % 10 dana serumlu GMEM besiyeri konur.<br />
9- Tripsinizasyona yeterince hücre süspansiyonu elde edilinceye veya sadece bağ doku<br />
kalıncaya kadar devam edilir(max.8 defa).<br />
10-Tripsinizasyonlar sırasında toplanan hücreler +2 0 C/+8 0 C da tutulurlar.<br />
11-Toplanan hücre süspansiyonu steril çift katlı tülbentlerden santrifüj şişelerine süzülür.<br />
12-1000 devirde 10 dakika santrifüj edilir.<br />
13-Santrifüj sonrası üstteki sıvı dökülür,dipte kalan hücreler %10 dana serumlu GMEM<br />
besiyerinde %0,5 oranında veya yoğun hücre süspansiyonu %0,1 trypanblue ile<br />
boyandıktan sonra haemacytometer ile hücre sayımı yapılarak her ml.de 300-500.000<br />
hücre bulunacak şekilde sulandırılır.<br />
14-Sulandırılan hücre süspansiyonu 1.000 ml,lik yassı doku kültür şişelerine 100<br />
ml.miktarında taksím edilerek etüve(37 0 C) konur.<br />
Doku kültür mikroskobunda her gün üreme durumu kontrol edilir. 3-4 gün sonra<br />
şişelerdeki besiyeri %10 dana serumlu GMEM besiyeri ile değiştirilir.Şişelerdeki üreme<br />
yüzeyi tamamen kapladıktan sonra bu hücreler sekonder hücre kültürü yapılarak<br />
kullanılırlar.Bu aşamada hücreler yassı doku kültür şişelerinden 1,5 litre kapasiteli döner<br />
kültür şişelerine geçirilerek döner sistem cihazında inkubasyona bırakılırlar.<br />
Hücrelerin Dondurularak Saklanması<br />
Hücre kültürlerinin uzun süreli ve özelliklerini değiştirmeksizin saklanabilmeleri<br />
için,hücrelerin dondurularak saklanması yoluna gidilir.Bu amaçla sırasıyla;<br />
1-Monoleyer hücreler 3 kez PBS ile yıkanır.<br />
2-Tripsinize edilir.<br />
3-800-1000 devirde 10 dakika santrifüj edilir.<br />
4-% 10 DMSO ve % 90 dana serum ilave edilir.<br />
5-Karışımdan ml’de 10 3 - 10 4 hücre olacak şekilde hücre dilüsyonu yapılarak her cryo tüpe<br />
0,5 ml.konarak içinde trypanblue bulunan suya atılır. Böylelikle kapaklarda sızma<br />
olup olmadığı anlaşılır.<br />
6-2-4 saat süreyle +2 0 C/+8 0 C da,2-4 saat -20 0 C da,1 gece -70 0 C da bırakıldıktan sonra –<br />
196 0 C derece sıvı azot tankına yerleştirilir.<br />
Hücrelerin çözdürülmesi amacıyla sırasıyla;<br />
1-Hazırlanacak kültür için gerekli besiyeri miktarının 1 misli fazla hacımda besiyeri<br />
hazırlanır ve 37 0 C da tutulur.<br />
2-Bu besi yerinin yarısı, kültür şişesine konur.<br />
3-Sıvı azottan çıkartılan cryo tüp içindeki hücreler 37 0 C daki su banyosunda<br />
süratle çözdürülerek tamamı kültür şişesindeki besiyerine katılır.<br />
4-Hücreler monolayer oluşturduktan sonra .besiyeri boşaltılarak yerine kalan besiyeri<br />
konur ve tekrar inkubasyona bırakılır.<br />
53
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) : Bu amaçla ticari ELISA test kiti (Bio-<br />
X BVD Elisa antigen detection Kit ve Bio-X BVD Elisa antikor detection Kit )<br />
kullanılacaktır. Kan örneklerin elde edilecek lökosit numuneleri ve kan serumları antikor<br />
ve virus varlığının saptanması amacıyla üretici firma tarafından belirlenen uygulama<br />
yönergesi doğrultusunda işlenecek ve 450nm filtre absorbansları okunmak suretiyle<br />
sonuçlar değerlendirilecektir. (2).<br />
Hücre kültüründe virus izolasyonu : Lökosit örneklerinden 25 cm 2 lik flasklarda<br />
üretilen kuzu böbrek hücre kültürlerine ekimleri yapılacaktır. Bu amaçla, %90 monolayer<br />
olarak üreyen kuzu böbrek hücre kültürlerinin vasatları dökülür, 3 kez 100IU/ml penicilin,<br />
100mg/ml streptomicin ve 10 µl/ml partricine içeren GMEM vasatı ile 3 kez hücre<br />
yüzeyleri yıkanır ve kuzu böbrek hücre kültürü kaplı 25 cm 2 lik flasklara her numuneden<br />
2 flask olacak şekilde 0.5 ml ayrı ayrı hücre kültürlerine ekimleri yapılarak örnekler 1 saat<br />
boyunca 37 o C de %5 CO2‘li etüvde inkubasyona bırakılacaktır. İnkubasyon periyodu<br />
sonunda flasklardaki hücrelerin yüzeyleri 3 kez GMEM vasatı ile yıkanıp ve her flaska %2<br />
FCS içeren 7.5 ml GMEM vasatı konarak 37 o C de %5 CO2 li etüvde inkubasyona<br />
bırakılır. Ayrıca pozitif kontrol olarak 2 şer flaska ( kuzu böbrek) CPE (+) ve CPE (–)<br />
BVD virusu ekimleri yapılırken 2 adet hücre (kuzu böbrek) kültür ekim yapılmaksızın<br />
hücre kontrol olarak bırakılır. Hücre kültürleri 10 gün süreyle her gün CPE oluşumları<br />
yönünden kontrolleri yapılacaktır. (6,7,15).<br />
Virus titrasyon testi: Hücre kültürlerinde CPE oluşturarak üreyen virusun pestivirus<br />
yönünden VN testi ile identifikasyonu amacıyla titresi saptanır. Bu amaçla 24 gözlü<br />
pleytlerde monolayer MDBK hücre kültürü hazırlanır. Kuyuculardaki hücrelerin yüzeyi<br />
100 IU/ml penicillin, 100μg/ml streptomicin ve partricin içeren GMEM vasatı ile 3 kez<br />
yıkanır. İzole edilen virusun log.10 cinsinden 10 katlı dilüsyonları yapılır. Her dilüsyondan<br />
4 kuyucuğa 200’er μl konur ve 1 saat boyunca 37 o C de %5 CO2 li etüvde inkubasyona<br />
bırakılır. İnkubasyon periyodu sonunda hücre yüzeyleri 3 kez GMEM ile temizlenir ve her<br />
kuyucuğu 1’er ml %2 fötal Calf serumlu GMEM vasatı eklenerek 37 o C de inkubasyona<br />
bırakılır. 10 gün süreyle her gün hücrelerin CPE oluşumları yönünden kontrolleri<br />
yapılacaktır. Sonuçlar Sperman-Kaerber metoduna göre değerlendirilecektir.(3)<br />
Virus nötralizasyon testi : İzole edilen CPE (+) virusun identifikasyonu amacıyla 24<br />
gözlü pleytlerde monolayer MDBK hücre kültürü hazırlanır. Kuyuculardaki hücrelerin<br />
yüzeyi 100 IU/ml penicillin, 100μg/ml streptomicin ve 10 μl/ml partricine içeren GMEM<br />
vasatı ile 3 kez yıkanır. İzole edilen ve titreleri saptanan virus 100 DKID50 /0.1ml değerleri<br />
saptanan ve 200 µl virus içeriği ile 200 ml BVD virusuna karşı hazırlanmış<br />
hiperimmunserumu karıştırılır ve 37 o C de 1 saat süreyle inkubasyona bırakılır. İnkubasyon<br />
periyodu sonunda karışımdan 24 gözlü kuyucuklarda hazırlanan ve hücre yüzeyleri 3 kez<br />
GMEM ile temizlenen hücre kültürlerine ekimleri yapılır. 37 o C’de 1 saatlik periyot<br />
sonunda hücre yüzeyleri tekrar GMEM vasatı ile yıkanarak her kuyucuğu 1’er ml %2 fötal<br />
Calf serumlu GMEM vasatı eklenir ve 37 o C de inkubasyona bırakılır. Kontrol olarak her<br />
izolat süspansiyonundan saf virus ekimleri yapılır. 10 gün süreyle her gün hücrelerin CPE<br />
oluşumları yönünden kontrolleri yapılır.(3)<br />
İzole edilen virusların ELISA testi ile identifikasyonu : Bu amaçla ticari ELISA test<br />
kiti (Bio-X BVD Elisa antigen detection Kit) kullanılacaktır. Hücre kültüründe CPE<br />
meydana getiren virusların pestivirus yönünden identifikasyonu amacıyla her virus içeriği<br />
üretici firma tarafından belirlenen uygulama yönergesi doğrultusunda işlenir ve 450nm<br />
filtre absorbansları okunmak suretiyle sonuçlar değerlendirilecektir.<br />
54
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Marmara Bölgesinde koyun yetiştiriciliğinde yavru atmalara sebep olan<br />
pestivirusların varlığı ve prevalansı üzerinde daha önceden ayrıntılı bir çalışma<br />
yapılmamıştır. Bu çalışma ile pestivirusların koyunlarda prevalans oranı belirlenerek bu<br />
hastalık ile mücadelede koruyucu tedbirlerin alınmasında fikir verecektir.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı :Dr. Nesrin TURAN<br />
9.2.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı :Züleyha PESTİL APUHAN, Veli GÜLYAZ,<br />
Selma ÖZDEMİR, Selma İYİSAN, Ahmet SAİT<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Enstitümüzde Araştırma Geliştirme olup yeterli donanım<br />
ve ekipman vardır.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım :<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri:<br />
11.TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
15.000<br />
03.3- YOLLUKLAR 1.000<br />
03.4- GÖREV GİDERLERİ 3.000<br />
03.9- TEDAVİ VE CENAZE GİDERLERİ<br />
TOPLAM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM GİDERLERİ<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA)<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER<br />
TOPLAM 19.000<br />
55
II. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
İlk 6 ay İkinci 6 ay<br />
Numunelerin toplanması x<br />
Örneklerinin işlenmesi x<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1.Adair B.M., McFerran J.B., McKillop E.R.,McCullough S.J. (1984). Survey for antibodies t<br />
respiratory viruses in two groups of sheep in Northern Ireland. Vet. Rec. 115, 403-406.<br />
2.Ak S.,Fırat İ.,Bozkurt H.H.,Gülyaz V.,Ak K.(2002) The Prevalence of Bovine Viral Diarrhoea<br />
Virus (BVDV) Infections in Cattle and Existence of Persistently Infected Cattle in the Trakya<br />
Region.Turk J Vet. Anim.Sci. 26 (2002) 245-248<br />
3.Alkan F.(1989 )Arthrogryposis ve Hydranencephaly’li Buzağı doğumlarında Bovine Viral<br />
Diarrhea Mucosal Disease (BVD-MD)’in İnsidensi üzerinde araştırmalar.Ank Üniv Sağlık<br />
Bilimleri Enst. Doktora Tezi<br />
4.Alkan F.,Yeşilbağ K.,Burgu İ.,(2001).Persiste enfekte sığırlarda BVDV ‘nin organ dağılımı.<br />
Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg. 48,111-115<br />
5.Brownlie J.,Hooper L.B.,Thompson I.,Collins ME.,(1998). Maternal recognition of foetal<br />
infection with bovine virus diarrhoea virus (BVDV)-the bovine pestivirus.Clin. Diagn. Virol.,10 (2-<br />
3) 141-150<br />
6.Burgu İ. (2003). Gebe Koyunlar ve Fötuslarında Pestivirus Enfeksiyonu.A.Ü.Bilimsel Araştırma<br />
Projeleri Kesin Raporu.<br />
7. Burgu İ. Ve Özkul A.(1993).Detections by cultural isolation of bovine virus diarrhea(BVD)<br />
virus following field infections in cattle and their fetuses. DTW/Deutsche<br />
Tıeraerztliche Wochenschrift 100,361-363<br />
8.Burgu İ.,Alkan F.,Yeşilbağ K.,(1999). Türkiye’de Sığırlarda Persiste BVD Virus<br />
Enfeksiyonu.Ankara Üniv. Vet Fak Derg. 46,169-177<br />
9.Burgu İ.,Akça Y.,Alkan F.,Özkul A.,Karaoğlu T.,Dağalp Bilge S.,Oğuzoğlu Ç.,Yeşilbağ<br />
K.(2001) Koyunlarda Doğum Öncesi ve Sonrası Dönemlerde Bovine Viral Diarrhea (BVD) Virus<br />
Enfeksiyonunun Serolojik,Virolojik ve Patogenez Yönünden Araştırılması.Turk J.Vet.Anim.Sci. 25<br />
(2001) 551-557<br />
10.Carlsson U. (1991). Border disease in sheep caused by transmission of virus from cattle<br />
persistently infected with bovine virus diarrhoea virus.Vet. Rec. 128, 145-147<br />
11.Dekker A,Wensvoort G.,Terpsta C.(1995) Six antigenic groups within the genus pestivirus as<br />
identified by cross-neutralisation assay.''.Vet. Microbiol. 47,317-329,<br />
12.Depner K., Hübschle O.J.B. and Liess B. (1991). Prevalance of ruminant pestivirus infections<br />
in Namibia. Onderstepoort J.Vet.Res. 58,107-109.<br />
13.Elazhary M.A.S.Y. ,Silim A. And Dea S. (1984) Prevalance of antibodies to bovine<br />
respiratory syncytial virus, bovine viral diarrhea virus, bovine herpesvirus-1 and bovine<br />
parainfluenza-3 virus in sheep and goats in guebec. Am. J. Vet. Res. Vol<br />
14.Emmanuel E. Brako,Fulton R. W., Nicholsan S.S and Amborski G. F. (1984) .Prevalance of<br />
bovine herpesvirus-1, bovine viral diarrhea, parainfluenza-3, goat respiratory syncytial, bovine<br />
leukemia and bluetongue viral antibodies in sheep.Am. J. Vet. Res. Vol.45 ,No:4;813-816<br />
15. Entrican G.,Dand A.&Nettleton P.F. (1994) A double monoclonal-antibody ELISA for<br />
detecting pestivirus antigen in the blood of viraemic cattle and sheep.Vet. Microbiol. 43, 65-74,<br />
16.Fenton A.,Sinclair J.A,Entrican G.,Herring J.A.,Nettleton PF. (1991).A monoclonal<br />
antibody capture ELISA to detect antibody to border disease virus in sheep sera.Vet. Microbiol.,<br />
Cilt: 28, No: ?, Sf: 327-333<br />
17.Gard G.P.,Acland H.M.,Plant J.W.(1976) A mucosal disease virus as a cause of<br />
abortion,hairy birth coat and unthriftiness in sheep.2.Obse Aust Vet. J. 52 (2) 64-68<br />
18.Goyal M.,Khan M.A., McPerson W.,Robinson R.A. and Boylon W.J. (1988). Am.J. Vet.<br />
Res.,(49) (4). 464-467.<br />
56
19.Howard C.J.,Brownlie J.,Clarke M.C.(1987) Compararison by the neutralization assay of<br />
pairs of non-cytopathogenic and cytopathogenic strains of bovine virus iarrhoea virus isolated from<br />
cases of mucosal disease.Vet Microbiol.,13:361-369<br />
20.Hussin AA.,Woldehiwet Z. (1994). Lymphocyte responses to viral antigens and<br />
phytohaemagglutinin in persistently viraemic sheep and lambs experimentally infected with Border<br />
disease virus.Vet. Mic.39 (1-2) 89-95<br />
21.Hyera , J.M.K.,Liess, B. And Frey H.R. (1991). Bovine Viral Diarrhoea Virus Infection in<br />
cattle,sheep and goats in northern Tanzania. Trop. Anim. Hlth prod. 23, 83-94.<br />
22.İssi M.,Gülaçtı İ.,Kızıl Ö.,Karapınar T.,Bulut H.,Gül Y.(2006) Kliniğimizde gözlemlenen<br />
Reverse Transkriptaz-Polimeraz Zincir Reaksiyonu(RT-PCR) ile Doğrulanan Mukoza Hastalığı<br />
Olguları.F.Ü.Sağlık Bil.Dergisi 20 (3) 253-258<br />
23.Karaoğlu M.T.,(1996) Sahadan izole edilen Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) suşlarının<br />
immunplak test yardımıyla biyotip karakterlerinin Sitopatejen-CP ve Stp.olmayan –NCP)<br />
saptanması. Ank Üniv Sğlık Bilimleri Enst. Doktora tezi<br />
24.Lamontagne. L and Roy R. (1984) Presence of Antibodies to Bovine Viral Diarrhea-Mucosal<br />
Disease Virus (Border Disease) in sheep and Goat Flocks in guebec. Can. J. Comp. Med.; 48 : 225-<br />
25.Levings R.L.,Wessman S.J.(1991)Bovine viral diarrhea virus contamination of nutrient<br />
serum,cell cultures an viral vaccines.Developments in biological standardization<br />
75 171-181<br />
26.Loken T., Krogsrud J. And Larsen L. (1991). Pestivirus Infections in Norway.Serological<br />
investigations in cattle,sheep and pigs.Acta Vet. Scand. 32,27-34.<br />
27.Manual of Diagnostic Tests and vaccınes for terrestrial animals.(2004) Border<br />
Disease.Chapter 2.10.5.<br />
28.NBA Cattle Health Committee Reports.(2002).Bovine viral diarrhoea and mucosal disease<br />
29.Nettleton P.F.,Gilrary J.A.,Russo P.,Dlissi E(1998).Border disease of sheep and goats.<br />
Vet Res. 29 (3-4) 327-340<br />
30.Osburn B.I.,Castrucci G.(1991).Diaplacental infections with ruminant pestiviruses.Arch Virol.<br />
3,71-78<br />
31.Özkul A.,(1992 )Gebe İneklerde ve Fötuslarında Bovine Virus Diarrhea-Mucosal<br />
Disease(BVD-MD) Ank Üniv.Doktora Tezi<br />
32.Patel J.R.,Didlick S.,Quinton J.(2005) Variation in immunogenicity of ruminant pestivirus as<br />
determined by the neutralisation assay.American Journal of Veterinary Research.169 (3) 468-475<br />
33.Pescador C.A.,Corbellini L.G.,Driemeier D.,Gonçalves R.K.,Cruz E.F. (2004) .Neurological<br />
disorder associated with pestivirus infection in sheep in Rio Grande do Sul,Brazil 34 (3) 935-938<br />
34.Plant J.W.,Acland H.M.,Gard G.P.(1976) A mucosal disease virus as a cause of abortion<br />
hairy birth coat and unthriftiness in sheep.1.Infic 52 (2) 57-63<br />
35.Plant J.W.,Acland H.M.,Gard G.P.,Walker K.H. (1983).Clinical variations of border disease<br />
in sheep according to the source of the inocolum.Vet Rec.,113 (3) 58-60<br />
36.Plant J.W.,Walker K.H.,Acland H.M.,Gard G.P.,(1983) Pathology in the ovine foetus<br />
caused by an ovine pestivirus.Aust Vet J.,60(5) 137-140<br />
37.Potts BJ.,Sawyer M.,Shekarchi IC.,Wismer T.,Huddleston D. (1989). Peroxidase-labeled<br />
primary antibody method for detection of pestivirus contamination in cell cultures.Journal of<br />
Virological Methods.26 (1) 119-124<br />
38.Pratelli A.,Martella V.,Cirone F.,Buonavoglia D.,Elia g.,Tempesta M., Buonavoglia C.<br />
(2001) Genomic characterization of pestivirus isolated from lambsand kids in Southern Italy.<br />
Journal of Virological Methods. 94 (1-2) 81-85<br />
39.Ronan G. O’Neill,Michael o’Connor and Patric J. O’Reilly (2004) A survey of antibodies to<br />
pestivirus in sheep in the Republic of Ireland.Irish Veterinary Journal .57 (9) 525-530<br />
40.Sawyer MM. (1992) Border disease of seep:the disease in the newborn,adolescent and adult.<br />
Comp Immunol Microbiol Infect Dis., 15 (3) 171-177<br />
41. Sawyer MM.Schore C.E,Osburn B.I.(1991). Border disease of sheep-aspect for diagnostic<br />
and epidemiologic consideration.Arch Virol Suppl. 3,97-100<br />
42.Snowdon W.A.,Parsonson I.M.,Broun M.L., (1975).The reactions of pregnant ewes to<br />
inoculation with mucosal disease virus of bovine origin.J Comp Pathol. 85 (2) 241-251<br />
57
43.Thabti F.,Fronzaroli L.,Dlissi E.,Guibert JM.,Hammami S.,Pepin M.,Russo P.<br />
(2002).Experimental model of Border Disease virus infection in lambs;comparative pathogenicity<br />
of pestiviruses isolated in France and Tunisia. Vet.Res.33 (1) 35-39<br />
44.Thabti F.,Letellier C.,Hammami S.,Pepin M.,Ribiere M.,Mesplede A.,Kerkhofs P.,Russo<br />
P.(2005) Detection of novel border disease virus subgrup in Tunisian sheep.Arch. Virology 150 (2)<br />
215-229<br />
45.Thur B.,Hilbe M.,Strasser M.,Ehrensperger F.(1997). Immunohistochemical diagnosis of<br />
pestivirus infection associated with bovine and ovine abortion and perinatal death.Am. J. Vet. Res.<br />
58 (12) 1371-<br />
46.Loken T. (2000). Recent advances in goat diseases.Publiser.:International Veterinary Inform.<br />
Service<br />
47.Vantsis J.T.,Borlow R.M.,Fraser J.,Rennie J.C.,Mould D.L. (1976) Experiments in Border<br />
disease.VIII.Propagation and properties of a cytopathic virus. J. Comp Pathol.,86 (1) 111-120<br />
48.Weiss M.,Hertig C.,Strasser M.,Vogt H-R.,Peterhans E. (1994) Bovine virus<br />
diarrhoa/mucosal disease Schweiz Arch T.erheilkd. 136 (5) 173-175<br />
49.Wensvoort G.,Terpsta C., De Kluvyer E.P. (1989).Characterisation of porcine and some<br />
ruminant pestiviruses by cross-neutralisation..Veterinary Microbiol. Cilt: 20, No: ?, Sf: 291-306,<br />
50.Xue W. Minocha H.C.(1996) Identification of bovine viral diarrhea virus receptor<br />
in different cell types.Veterinary Microbiology 49 (1-2) 67-69<br />
51.Yeşilbağ K.,Özkul A.,Burgu İ., (2001) Farklı laboratuarlarda aynı adla kullanılan BVDV<br />
suşları arasında antijenik farklılıklar.A.Ü. Vet.Fak. Derg. 48,7-11<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Nesrin TURAN<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Dr.Muhammed AKSIN<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar :<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar :<br />
58
T.C.<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı :<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1.PROJE ADI : Kuzey Doğu Anadolu Bölgesinde Ortaya Çıkan Koyun ve Keçi<br />
Çiçeği olgularının Virolojik ve Epizootiololojik Yönden İncelenmesi<br />
“Virological and epizootiological investigations of sheep and poxvirus disease in Norht-<br />
East Anatolian Region”<br />
2.YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Erzurum Veteriner Kontrol Ve Araştırma Enstitüsü<br />
3.PROJE LİDERİ :<br />
Adı Soyadı : İbrahim SÖZDUTMAZ<br />
Kurumu : Erzurum Veteriner Kontrol Ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü<br />
4.Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Araştırma Fırsat Alanı: Küçükbaş Hayvancılık<br />
Araştırma Programı : Küçükbaş Hayvan Hastalıkları<br />
5.PROJE SÜRESİ : 12 Ay<br />
5.1.Başlama Tarihi : 01/01/2009<br />
5.2.Bitiş Tarihi : 31/12/2009<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI :<br />
Koyun ve keçi çiçeği virüsleri (SPV ve GPV) koyun ve keçilerde benzer<br />
hastalıklara sebep olmaktadır. Bu hastalıklar özellikle genç <strong>hayvan</strong>larda ölümlerin en genel<br />
sebeplerindendir. Koyun-keçi çiçeği hastalıkları gelişmiş ülkelerde eradike edilmiş<br />
olmasına rağmen az gelişmiş ülkelerde halen önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır.<br />
Ayrıca, bu hastalıklar Uluslararası Salgın Hastalıklar Ofisi (Office International des<br />
Epizooties; OIE)’nin bildirimi zorunlu hastalıkları listesinde A grubu hastalık olarak yer<br />
almaktadır. Avrupa Birliği (AB) bu hastalıkları egzotik hastalık olarak kabul etmesine<br />
rağmen, ülkemizde bu hastalıklar bölgesel tarzda endemik olarak seyretmektedir. Ayrıca,<br />
ülkemizdeki olgular, AB ülkelerinde görülen salgınlar AB ülkelerinde görülen salgınların<br />
sebebi olarak değerlendirilmektedir. Bu projede, Bu projede 2008-2009 yıllarında<br />
Kuzeydoğu Anadolu Bölgesinde ortaya çıkan SPV ve GPV’lerin moleküler<br />
epidemiyolojisi ve diğer ülke izolatlarıyla filogenetik ilişkisinin araştırılması<br />
amaçlanmıştır. Bu amaçla, 2008-2009 yılları arasında, Enstitümüzün görev alanına giren 9<br />
ilden (Erzurum, Erzincan, Gümüşhane, Bayburt, Ağrı, Iğdır, Kars, Ardahan ve Artvin)<br />
ortaya çıkan koyun-keçi çiçeği hastalıklarından şüpheli olarak gelen numuneler analiz<br />
edilecektir. Projenin ilk aşamasında, bu örneklerden virus DNA’ları elde edilecek ve<br />
genom üzerinde bulunan oldukça değişken gen bölgesi Polimeraz Zincir Tepkimesi<br />
(PCR) ile çoğaltılacak ve klonlanacaktır. Daha sonraki aşamada klonlanan bu bölgenin<br />
dizilimi sekanslanacaktır. Elde edilen sekanslar ile SPV ve GPV’lerin genbankasında<br />
59
mevcut olan sekanslar kıyaslanacaktır. Bu projenin gerçekleşmesi durumunda,<br />
bölgemizdeki SPV-GPV’lerin moleküler epidemisinin aydınlatılmasına yönelik veriler<br />
elde edilecek ve Türkiye izolatları ile diğer ülke virus izolatları arasındaki filogenik ilişki<br />
hakkında bilgiler edinilecektir.<br />
Sheeppox virus (SPV) and goatpox virus (GPV) cause similar diseases (SP and GP)<br />
in sheep and goats. The diseases are of the common causes of high mortality in young<br />
animals. The diseases have now been eradicated in developed countries, but remain as the<br />
cause of major losses in some developing countries. In addition, the diseases in the of the<br />
Office International des Epizooties (OIE), SP and GP are accepted as exotic diseases and<br />
absent in EU countries, with the exception of sporadic cases. In Turkey, SP and GP are<br />
endemic and cause important economical losses. It is believed that the cases occurred in<br />
EU countries originated from Asian countries such as Turkey. In this project, it is aimed to<br />
detect the molecular epidemiology of the diseases in North-East Anatolian Region and<br />
phylogenetic correlation between Turkey and other contry sheep-goat poxvirus isolates.<br />
The isolats will be obtained from 9 provinces (Erzurum, Erzincan, Gümüşhane, Bayburt,<br />
Ağrı, Iğdır, Kars, Ardahan ve Artvin) which they are included in Erzurum Veterinary<br />
Control and research Institute work region during the time period in 2008-2009 years will<br />
be analyzed. Partial sequences of hyper variable of SPV-GPV genome will be amplified by<br />
polymerase chain reaction (PCR). Then, the PCR amplification produces will be<br />
sequenced. According to the results of sequences and the present reports obtained from<br />
Genebank, phylogenetic analysis will be carried out. This project will provide data about<br />
the molecular epidemiology of the viruses in North-east Anatolian region and Turkey and<br />
phylogenetic correlation between Turkey and other country sheep-goatpox virus isolates.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER :<br />
(Capripoxvirus, Koyun çiçek virusu, Keçi çiçek virusu, filogenetik analiz)<br />
(Capripoxvirus, sheeppox virus, goatpox virus, phylogenetic analysis )<br />
8.PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1.Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi :<br />
Koyun-keçi çiçek hastalıklarının etkenleri Poxviridae ailesinin Chordopoxvirinae<br />
alt ailesinde bulunan capripoxvirus cinsinde yer alan sheeppox virus (SP) ve goatpox (GP)<br />
virüslerdir. Uluslararası Salgın Hastalıkları Dairesi (OIE) bu hastakları, önemli ekonomik<br />
kayıplara sebep olması nedediyle, en tehlikeli hastalıkların bulunduğu A listesi içerisinde<br />
<strong>değerlendirme</strong>ktedir (1).<br />
Hastalıktan her yaştaki koyun ve keçiler etkilenebilir fakat genç <strong>hayvan</strong>larda daha<br />
şiddetli seyretmektedir. Duyarlı bir koyun sürüsünde <strong>hayvan</strong>ların en az %75’ini<br />
etkilemekte ve mortalite oranı genç <strong>hayvan</strong>larda % 100’e kadar çıkabilmektedir. (1, 2).<br />
Bu hastalıklar gelişmiş ülkelerde tam olarak eradike edilmiş olmasına rağmen,<br />
Güney Asya, Orta Asya, Ortadoğu, Hindistan yarımadası, Orta ve Kuzey Afrika’da ve<br />
ülkemizde endemik olarak ve seyretmektedir. Avrupa ülkeleri, özellikle Yunanistan ve<br />
Romanya olmak üzere, çok az sayıda ülkede sporadik vakalar olarak bildirilmektedir (1,<br />
2). Avrupadaki bu olguların sebebi olarak ise başta Türkiye’deki epidemiler olmak üzere,<br />
Asya ülkelerinde görülen epidemiler sorumlu tutulmaktadır (3, 4).<br />
Ülkemizde koyun-keçi çiçeği hastalığı endemik olarak seyretmektedir ve bu<br />
hastalık bildirimi zorunlu bir hastalıktır (5). Hayvan Sağlığı ve Zabıta Kanununa göre;<br />
çiçek hastalığına yakalanmış <strong>hayvan</strong>lar tazminatsız olarak öldürülür ve imha edilir.<br />
Hastalıktan ve bulaşmadan şüpheli <strong>hayvan</strong>lar masrafları sahibine ait olmak üzere altmış<br />
gün karantinaya alınır. Karantina sonunda hastalık tespit edilen <strong>hayvan</strong>lar da öldürülür ve<br />
imha edilir. Hastalıksız <strong>hayvan</strong>lar masrafları sahibine ait olmak üzere kestirilir, etleri<br />
serbest bırakılır (6).<br />
60
Capripoxvirus genusu içinde yer alan virüsler genel olarak konakcı spesifiktirler.<br />
Koyun çiçeği, keçi çiçeği ve kabarcıklı deri hastalığı etkenleri sırasıyla koyun, keçi ve<br />
sığırlarda hastalığa sebep olmaktadır (7). Bununla birlikte koyun ve keçi çiçeği<br />
virüslerinde doğal olarak ve deneysel çalışmalar sonucunda çapraz enfeksiyonların ortaya<br />
çıktığı ortaya konulmuştur (8). Koyun ve keçi çiçeği hastalıklarındaki klinik<br />
belirtilerindeki benzerlik ve her iki hastalık etkeninin mevcut serolojik yöntemlerle<br />
ayrımının mümkün olmaması, koyun ve keçi çiçeği virüslerinin aynı etken tarafından<br />
şekillendirilen bir hastalık kompleksinin birer üyesi olduklarının düşünülmesinin en önemli<br />
sebebidir. Bu nedenle, daha önceki yıllarda SPV ve GPV’nin aynı virüsün keçi ve koyunda<br />
izole edilen farklı izolatları veya suşları olduğu kanısı hakimdi. Ancak, günümüzde,<br />
özellikle moleküler biyoloji tekniklerinin kullanımıyla birlikte elde edilen bulgular<br />
ışığında, bu iki virüs Capripoxvirus genusunda yer alan iki farklı tür olarak<br />
sınıflandırılmaktadır (7,9). İlk yapılan çalışmalarda koyun ve keçi çiçeği etkenlerinin<br />
arasında genotipik anlamda %96-97 oranında benzerliğin var olduğu ortaya konulmuştur<br />
(8). Ancak daha sonraları yapılan çalışmalarda genomun terminal bölgelerinde görülen<br />
farklılıklar dikkate alınarak, GPV ve SPV arasında ayrım yapılabileceği düşünülmüştür. Bu<br />
amaçla gerçekleştirilen ilk çalışmalarda hücre kültürlerinde fazla miktarda ve saf olarak<br />
üretilen virüslerde elde edilen viral genomik DNA’nın restriksiyon enzimlerle kesildikten<br />
sonra kesim motiflerinin kıyaslanması gerçekleştirilmiştir (10-13). Ancak, viral genomun<br />
oldukça fazla sayıda nükleotit çifti (yaklaşık 150 kilobaz çifti) uzunlukta oluşması, tüm<br />
genoma ait DNA motiflerinin yorumlanmasının zor ve tartışmalı olmasını beraberinde<br />
getirmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bu amaçla viral genom üzerinde seçilmiş bir<br />
bölgenin PCR çoğaltılması ve restriksiyon enzimlerle kesilmesi ya da doğrudan multipleks<br />
PCR ile ayrıma gidilmesine yönelik metotlar bildirilmektedir (8). Mevcut bilinenlere<br />
rağmen, bu virüslerin koyun ve keçilerdeki konakçı spesifikliğiyle ilgili tartışmalar devam<br />
etmektedir. Ülkemizde bu hastalıklar hastalığın görüldüğü konağa göre<br />
isimlendirilmektedir ve bu virüslerin ayrımına yönelik bir çalışmaya rastlanmamıştır.<br />
Poxviridae ailesinde tüm alt ailelerde bulunan virüslerin genom kısımlarının<br />
merkezi kısmını oluşturan yaklaşık 120.000 nükleotitlik kısmı aile içerisinde oldukça<br />
korunmuş bölgeler olup, bu bölgeler yüksek oranda bir birine benzer (14). Özellikle, alt<br />
ailelerdeki bu bölgelerin benzerliği % 100’e yakındır. Bu nedenle, bu projede SPV-GPV<br />
genomlarının oldukça değişken bölgeleri olan viral terminal bölgelerin<br />
kimliklendirilmesine yönelik bir çalışma hedeflenmiştir. Bu amaçla, genbankasına daha<br />
önceden sunulmuş olan SPV-GPV genomlarının 5’ ve 3’ uçlarında bulunan ve yapısal<br />
proteinleri kodlayan yaklaşık 1000 nükleotitlik iki farklı oldukça değişken bölge<br />
tarafımızdan belirlenecektir.<br />
Virüsler arasında genomik düzeyde filogenetik ilişkinin ilişkinin ortaya konması,<br />
ortaya çıkan epideminin kaynağını belirlemek bakımından oldukça önemlidir. Virüs<br />
kaynağı, daha önceki bir epidemiden çevrede canlı kalan veya bazı viral hastalıklarda<br />
persistent ya da kronik enfekte <strong>hayvan</strong>dan menşey alabileceği gibi başka bir ülkeden<br />
kaynaklanan ve daha önce o ülkede görülen virüsün suşundan farklı bir suş da olabilir.<br />
Özellikle çiçek virüslerde enfeksiyon kaynağını belirlemek o enfeksiyona karşı savaşım<br />
stratejilerinin şekillenmesinde önem arz etmektedir (14, 15).<br />
Önerilen bu proje ile, Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma enstitüsü<br />
Müdürlüğü’nün görev alanına giren 9 ilde ortaya çıkacak koyun ve keçi çiçeği<br />
hastalıklarından izole edilecek koyun-keçi çiçeği virüslerinin moleküler<br />
epidemiyolojisinin araştırılması ile elde edilen bulguların Türkiye’de ve diğer ülkelerde<br />
daha önce elde edilen virus izolatları ile filogenetik ilişkisinin irdelenmesi amaçlanmıştır.<br />
61
8.2.Literatür Özeti :<br />
Koyun-keçi çiçek hastalıklarının etkenleri Poxviridae ailesinin Chordopoxvirinae<br />
alt ailesinde bulunan capripoxvirus cinsinde yer alan sheeppox virus (SP) ve goatpox (GP)<br />
virüslerdir. Uluslararası Salgın Hastalıkları Dairesi (OIE) bu hastakları, önemli ekonomik<br />
kayıplara sebep olması nedediyle, en tehlikeli hastalıkların bulunduğu A listesi içerisinde<br />
<strong>değerlendirme</strong>ktedir (1).<br />
Hastalıktan her yaştaki koyun ve keçiler etkilenebilir fakat genç <strong>hayvan</strong>larda daha<br />
şiddetli seyretmektedir. Duyarlı bir koyun sürüsünde <strong>hayvan</strong>ların en az %75’ini<br />
etkilemekte ve mortalite oranı genç <strong>hayvan</strong>larda % 100’e kadar çıkabilmektedir. (1, 2).<br />
Bu hastalıklar gelişmiş ülkelerde tam olarak eradike edilmiş olmasına rağmen,<br />
Güney Asya, Orta Asya, Ortadoğu, Hindistan yarımadası, Orta ve Kuzey Afrika’da ve<br />
ülkemizde endemik olarak ve seyretmektedir. Avrupa ülkeleri, özellikle Yunanistan ve<br />
Romanya olmak üzere, çok az sayıda ülkede sporadik vakalar olarak bildirilmektedir (1,2).<br />
Avrupadaki bu olguların sebebi olarak ise başta Türkiye’deki epidemiler olmak üzre, Asya<br />
ülkelerinde görülen epidemiler sorumlu tutulmaktadır (3,4).<br />
Ülkemizde koyun-keçi çiçeği hastalığı endemik olarak seyretmektedir ve bu<br />
hastalık bildirimi zorunlu bir hastalıktır (5). Hayvan Sağlığı ve Zabıta Kanununa göre;<br />
çiçek hastalığına yakalanmış <strong>hayvan</strong>lar tazminatsız olarak öldürülür ve imha edilir.<br />
Hastalıktan ve bulaşmadan şüpheli <strong>hayvan</strong>lar masrafları sahibine ait olmak üzere altmış<br />
gün karantinaya alınır. Karantina sonunda hastalık tespit edilen <strong>hayvan</strong>lar da öldürülür ve<br />
imha edilir. Hastalıksız <strong>hayvan</strong>lar masrafları sahibine ait olmak üzere kestirilir, etleri<br />
serbest bırakılır (6).<br />
Capripoxvirus genusu içinde yer alan virüsler genel olarak konakcı spesifiktirler.<br />
Koyun çiçeği, keçi çiçeği ve kabarcıklı deri hastalığı etkenleri sırasıyla koyun, keçi ve<br />
sığırlarda hastalığa sebep olmaktadır (7). Bununla birlikte koyun ve keçi çiçeği<br />
virüslerinde doğal olarak ve deneysel çalışmalar sonucunda çapraz enfeksiyonların ortaya<br />
çıktığı ortaya konulmuştur (8). Koyun ve keçi çiçeği hastalıklarındaki klinik<br />
belirtilerindeki benzerlik ve her iki hastalık etkeninin mevcut serolojik yöntemlerle<br />
ayrımının mümkün olmaması, koyun ve keçi çiçeği virüslerinin aynı etken tarafından<br />
şekillendirilen bir hastalık kompleksinin birer üyesi olduklarının düşünülmesinin en önemli<br />
sebebidir. Bu nedenle, daha önceki yıllarda SPV ve GPV’nin aynı virüsün keçi ve koyunda<br />
izole edilen farklı izolatları veya suşları olduğu kanısı hakimdi. Ancak, günümüzde,<br />
özellikle moleküler biyoloji tekniklerinin kullanımıyla birlikte elde edilen bulgular<br />
ışığında, bu iki virüs Capripoxvirus genusunda yer alan iki farklı tür olarak<br />
sınıflandırılmaktadır (7, 9). İlk yapılan çalışmalarda koyun ve keçi çiçeği etkenlerinin<br />
arasında genotipik anlamda %96-97 oranında benzerliğin var olduğu ortaya konulmuştur<br />
(8). Ancak daha sonraları yapılan çalışmalarda genomun terminal bölgelerinde görülen<br />
farklılıklar dikkate alınarak, GPV ve SPV arasında ayrım yapıla bileceği düşünülmüştür.<br />
Bu amaçla gerçekleştirilen ilk çalışmalarda hücre kültürlerinde fazla miktarda ve saf olarak<br />
üretilen virüslerde elde edilen viral genomik DNA’nın restriksiyon enzimlerle kesildikten<br />
sonra kesim motiflerinin kıyaslanması gerçekleştirilmiştir (10-13). Ancak, viral genomun<br />
oldukça fazla sayıda nükleotit çifti (yaklaşık 150 kilobaz çifti) uzunlukta oluşması, tüm<br />
genoma ait DNA motiflerinin yorumlanmasının zor ve tartışmalı olmasını beraberinde<br />
getirmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bu amaçla viral genom üzerinde seçilmiş bir<br />
bölgenin PCR çoğaltılması ve restriksiyon enzimlerle kesilmesi ya da doğrudan multipleks<br />
PCR ile ayrıma gidilmesine yönelik metotlar bildirilmektedir (8). Mevcut bilinenlere<br />
rağmen, bu virüslerin koyun ve keçilerdeki konakçı spesifikliğiyle ilgili tartışmalar devam<br />
etmektedir. Ülkemizde bu hastalıklar hastalığın görüldüğü konağa göre<br />
isimlendirilmektedir ve bu virüsülerin ayrımına yönelik bir çalışmaya rastlanmamıştır.<br />
62
Poxviridae ailesinde tüm alt ailelerde bulunan virüslerin genom kısımlarının<br />
merkezi kısmını oluşturan yaklaşık 120.000 nükleotitlik kısmı aile içerisinde oldukça<br />
korunmuş bölgeler olup, bu bölgeler yüksek oranda bir birine benzer (14). Özellikle, alt<br />
ailelerdeki bu bölgelerin benzerliği % 100’e yakındır. Bu nedenle, bu projede SPV-GPV<br />
genomlarının oldukça değişken bölgeleri olan viral terminal bölgelerin<br />
kimliklendirilmesine yönelik bir çalışma hedeflenmiştir. Bu amaçla, genbankasına daha<br />
önceden sunulmuş olan SPV-GPV genomlarının 5’ ve 3’ uçlarında bulunan ve yapısal<br />
proteinleri kodlayan yaklaşık 1000 nükleotitlik iki farklı oldukça değişken bölge<br />
tarafımızdan belirlenecektir.<br />
Virüsler arasında genomik düzeyde filogenetik ilişkinin ilişkinin ortaya konması,<br />
ortaya çıkan epideminin kaynağını belirlemek bakımından oldukça önemlidir. Virüs<br />
kaynağı, daha önceki bir epidemiden çevrede canlı kalan veya bazı viral hastalıklarda<br />
persistent ya da kronik enfekte <strong>hayvan</strong>dan menşey alabileceği gibi başka bir ülkeden<br />
kaynaklanan ve daha önce o ülkede görülen virüsün suşusundan farklı bir suş da olabilir.<br />
Özellikle çiçek virüslerde enfeksiyon kaynağını belirlemek o enfeksiyona karşı savaşım<br />
stratejilerinin şekillenmesinde önem arz etmektedir (14, 15).<br />
8.3.MATERYAL VE METOT :<br />
Örnekler: Bu çalışmadaki örnekleri 2008-2009 yıllarında Erzurum Veteriner<br />
Kontrol ve Araştırma enstitüsü Müdürlüğünün görev alanına giren 9 ilde ortaya çıkacak<br />
koyun ve keçi çiçeği hastalıklarından toplanmış klinik örnekler kullanılacaktır. Bu amaçla<br />
çiçek şüpheli hastalardan EDTA’lı ve EDTA sız tüplere kan, vezikül içerikleri ile ölen<br />
<strong>hayvan</strong>lara ait akciğer dokuları alınarak vasat ortamına alınacaktır. Kan örneklerinin<br />
serumları çıkartılacak, serum örnekleriyle birlikte tüm örnekler deneylerde kullanılıncaya<br />
kadar -80ºC derin dondurucuda saklanacaktır. Ayrıca daha önceki yılarda bu bölgede<br />
çıkmış epidemilerden elde edilmiş parafinlenmiş dokularda izole edilecek DNA örnekleri<br />
ile Pendik Araştırma Enstitüsü tarafından ülkemizin çeşitli bölgelerinde izole edilen<br />
viruslara ait DNA’lar da çalışmanın virolojik kısmında değerlendirilecektir.<br />
Yeni epidemilerde örneklerin toplandığı çiftliklerde <strong>hayvan</strong>ların yaşı, cinsiyetleri,<br />
aşılanma durumları, aşının ne zaman yapıldığı ve hangi aşıların kullanıldığı , bu sürüye<br />
yakın zaman içerisinde yeni bir <strong>hayvan</strong> katılıp katılmadığı, veya bu sürünün yakın<br />
zamanda başka bir sürüyle temasının olup olmadığı hakkında bilgi alınacaktır ve ayrıca<br />
<strong>hayvan</strong>lardaki genel bulgular kaydedilecektir.<br />
DNA ekstraksiyonu<br />
Kan ve vezikül örnekleri ile kontrol örneklerinden (pozitif kontroller olarak; koyunkeçi<br />
çiçeği aşı suşu, daha önceki epizootilerden izole edilen ve Pendik Araştırma<br />
Enstitüsünden temin edilen koyun-keçi çiçeği virusları, negatif kontroller olarak; distile su,<br />
non-enfekte ve aşılanmamış <strong>hayvan</strong>larda elde edilen kan örnekleri) DNA ektraksiyonu<br />
klasik fenol-klorform ekstraksiyon metoduna göre gerçekleştirilecektir. Elde edilen DNA<br />
peletleri 50 µl distile su içinde çözdürülüp, kullanılıncaya kadar -20 0 C’de saklanacaktır.<br />
PCR<br />
Bu çalışmada, öncelikle, izolatlarda viral genomun varlığının doğrulanması için<br />
tüm Capripoxvirusların korunmuş bölgeleri olan merkezi genom bölgelerinden seçilen<br />
primerler kullanılarak kısa nükleotit uzunluğuna sahip amplikonlar çoğaltılacaktır. Bu<br />
bölgeye ait primerler yayımlanmış bir makaleden seçilecektir (4). Filogenetik kıyaslanma<br />
için ise, Capripoxvirus’larda oldukça değişken olan genomun terminal bölgelerinde<br />
yaklaşık 1000 nükleotitlik iki farklı bölgenin çoğaltılması sağlanacaktır. Bu amaç için<br />
primerler, gen bankasında Capripoxvirus’lara ait olan sunulmuş dizilimler kullanılarak<br />
BLAST <strong>program</strong>ı ile tarafımızdan oluşturulacaktır. Çoğaltılacak tüm PCR ürünlerinin 10<br />
63
µl’si % 2’lik agaroz jelde yürütülecek ve UV ışığı altında etidium bromide boyamayla<br />
görüntülenecektir. Ağırlık markerleri ile kıyaslanarak, beklenilen büyüklükte<br />
amplifikasyon ürünü elde edilen örnekler kaydedilecektir.<br />
Klonlama: Filogenik analiz için PCR’da çoğaltılan amplikon bölgeleri pGEM-T<br />
kolay vektör (Promega) kullanılarak klonlanacaktır. Elde edilen klonlardan ekstrakte<br />
edilen rekombinant plazmitlerde insört genin varlığı eleketroforez deneyi ve PCR taraması<br />
ile ortaya konacaktır. Rekombinant DNA’ların purifikasyonları, purifikasyon kiti<br />
kullanılarak jelde gerçekleştirilecektir.<br />
Sekanslama: Jelde purifiye edilen rekombinant ürünler, ABI 310 DNA Genetic<br />
Analysis System kullanılmak suretiyle sekanslanacaktır.<br />
Öncelikle, saha izolatlarına ait elde edilen sekanslar Türkiye izolatlarına ait olarak<br />
BLAST <strong>program</strong>ı ile Genbank’a sunulacaktır. Daha sonra, saha izolatlarına ait sekanslar<br />
ile Genbankasında mevcut olan çoğaltımış bölgeye ait sekanslarının kıyaslanması online<br />
olarak mevcut BLAST <strong>program</strong>ı kullanılarak gerçekleştirilecektir. Multiple seguens<br />
eşleştirmesi parametreleri kullanılarak ClustalX ile yapılacaktır. Filogenetik analiz ise<br />
MEGA versiyon 2.1 kullanılarak gerçekleştirilecek ve filogenetik ağaç oluşturulacaktır.<br />
8.4.Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı :<br />
1- Ülkemiz, coğrafi konumu nedeniyle, koyun-keçi çiçeği hastalığının yaygın<br />
olarak görüldüğü Asya ülkeleri ile hastalığın az sayıda salgınlara sebep olduğu Avrupa<br />
ülkeleri arasında bir köprü görevi görebildiği ve bu nedenle ülkemizdeki vakaların OIE<br />
tarafından dikkatle takip edildiği bilinen bir gerçektir. Şu an Avrupa Ülkelerinde<br />
(Yunanistan ve Romanya) bu hastalıkla bildirilmekte, bu olgularda da ülkemizdeki<br />
salgınlar sorumlu tutulmaktadır (3,4). Bu çalışma ile ülkemizde daha önceden bildirilmiş<br />
koyun ve keçi çiçeğine ait izolatlar ile bölgemizde koyun ve keçi çiçeği hastalığı<br />
olgularından elde edilecek etkenler hakkında filogenetik yapı ortaya konulacaktır.<br />
2- Ülkemizde koyun ve keçi yetiştiriciliğinin bir arada yapılabilmekte veya aynı<br />
köyde yetiştirilen bu <strong>hayvan</strong>lar aynı merayı paylaşabilmektedirler. Ayrıca, ülkemizde<br />
genel olarak koyun sürüsüne sahip olan pek çok yetiştirici, keçilerin liderlik özelliğini<br />
dikkate alarak sürülerinde az sayıda olsa da keçi bulundurmaktadır. Ancak, ülkemizde<br />
çıkan çiçek olguları görüldüğü <strong>hayvan</strong>ın türüne göre koyun veya keçi çiçeği olarak<br />
isimlendirilmektedir. Bu nedenle ülkemizde elde edilecek virüslerin moleküler yöntemlerle<br />
SPV-GPV yönünden isimlendirilmesi bu virüslerın epizootiyolojilerinin daha iyi<br />
anlaşılması noktasına mevcut literatür bilgilerine önemli katkı sağlayacaktır.<br />
3- Çiçek hastalığı virüsleri, özellikle hem zarflı hem de zarfsız formları enfektif<br />
olması sebebiyle, çevreye en dayanıklı virüslerdir. Bu nedenle, bir önceki yıldaki<br />
epidemiye sebep olan virüsler ahır veya mera ortamında canlı olarak kalabilmekte ve yeni<br />
bir dönemdeki epidemilerin sebebi de olabilmektedir. Elde edilecek sekansların<br />
değerlendirilmesi ile birlikte yıllık olarak epidemilere sebep olan virüslerin ilişkisi ortaya<br />
konabilecek ve epidemilerin yeni bir kontaminasyondan mı yoksa çevrede canlı kalabilen<br />
virüslerden mi kaynaklandığı hakkında bilgi sağlanacaktır. Bu ise savaşımda aşılamaya<br />
ilave stratejilerin belirlenmesinde bizlere bilgiler sunacak ve bu savaşım stratejilerinin<br />
öneminin bilimsel verilerle ortaya konmasına katkı sağlayacaktır.<br />
9.ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ :<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Veteriner Hekim İbrahim SÖZDUTMAZ Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viral Teşhis Laboratuarı<br />
9.2.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Doç. Dr. Hakan BULUT Fırat<br />
Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı<br />
9.3.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Ömer Faruk KÜÇÜKKALEM<br />
Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viroloji Laboratuarı<br />
64
9.4.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Dr.Veli GÜLYAZ Pendik<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viroloji Laboratuarı<br />
10.ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ :<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Bu araştırma Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü’nde yürütülecektir. Enstitümüzün ilgili bölümlerinde projenin yürütülebilmesi<br />
için deneyimli ve yeterli sayıda personel mevcut olup, fiziki alt yapı bakımından da<br />
eksiklik bulunmamaktadır. Viral Teşhis Laboratuvarında Hücre Kültüründe etken<br />
izolasyon ve idenfikasyonu, Elisa ile etken identifikasyonuna yönelik altyapı mevcut olup<br />
birimde çalışan personel bu konuda yeterli deneyime sahiptir. Bu bölümde Class II<br />
Biyogüvenlik kabini (Metisafe), Karbondioksitli İnkubatör (Nuaire), Soğutmalı Santrifüj<br />
(Nüve), -20 ve -80ºC derin dondurucular, Moleküler Teşhis Ünitesinde Bir adet PCR<br />
Thermal Cycler (Thermo Hybaid Px2) Real-Time PCR Cihazı (Roche Light Cycler 2.0,<br />
Nükleik Asit Ekstraksiyon Robotu (Roche Magna Pure LC), Jel Elektroforez sistemi<br />
(CLP), Jel Görüntüleme Ve Dökümantasyon Sistemi (Spectronics Corp. Geneline),<br />
Soğutmalı Santrifüj (Heraus), Vortex, PCR Kabin (Esco)<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım : ABI 310 DNA Genetic Analysis<br />
System<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri: -<br />
11.TALEP EDİLEN BÜTÇE :<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- Üretime yönelik mal ve malzeme alımları<br />
03.2-Tüketime yönelik mal ve malzeme,<br />
alımları<br />
33.500<br />
03.3- Yolluklar 1.000<br />
03.4- Görev giderleri<br />
03.5- Hizmet alımları<br />
03.6- Temsil ve tanıtma giderleri<br />
03.7- Menkulmal, gayrimaddi hak alım, bakım<br />
ve onarım giderleri<br />
03.8- Gayrimenkul mal bakım ve onarım gid. 500<br />
03.9-Tedavi ve cenaze giderleri<br />
TOPLAM 35.000<br />
65
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-Mamul mal alımları 2.500<br />
06.2-Menkul sermaye üretim giderleri<br />
06.3-Gayrimaddi hak alımları<br />
06.4-Gayrimenkul alımları ve kamulaştırılması<br />
06.5-Gayrimenkul sermaye üretim giderleri<br />
06.6- Menkul malların büyük onarım giderleri 4.000<br />
06.7- Gayrimenkul büyük onarım giderleri<br />
06.8- Stok alımları (savunma dışında)<br />
06.9-Diğer sermaye giderler<br />
TOPLAM 6.500<br />
II. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI YTL<br />
03.2.1.01 Kırtasiye Alımları : 1.000<br />
03.2.2.02 Temizlik Malzemesi Alımları : 500<br />
03.2.6.01 Laboratuvar Malzemesi ile Kimyevi ve Temizlik Malzeme Alımları : 30.000<br />
03.2.6.02 Tıbbi Malzeme ve İlaç Alımları : 2.000<br />
03.3.1.01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları : 1.000<br />
03.8.1.01 Büro Bakım ve Onarımı Giderleri : 500<br />
06.1.3.03 Tıbbi Gereçler Alımları : 500<br />
06.1.3.04 Laboratuar Gereçleri Alımları : 2.000<br />
06.6.4.01 Yakacak alımları : 2.000<br />
06.6.4.02 Akaryakıt ve yağ alımları : 500<br />
06.6.4.03 Elektrik alımları : 1.000<br />
06.6.5.01 Posta ve Telgraf Giderleri : 250<br />
06.6.5.02 Telefon Abonelik ve Kullanım Ücretleri : 250<br />
TOPLAM : 41.500<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
YAPILACAK<br />
İŞ<br />
Malzeme<br />
temini<br />
Materyal<br />
Toplanması<br />
PCR aşaması<br />
Klonlama ve<br />
sekanslama<br />
Sonuçların<br />
değerlendiril<br />
mesi<br />
Yazım<br />
aşaması<br />
2008 2009<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24<br />
66
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1-World Organisation for Animal Health, In OIE Classification of Diseases,<br />
Annual Animal Health Information, Handistatus II, Last uptade Jan. 2007.<br />
2-Carn VM. Control of capripoxvirus infections. Vaccine, 1993;11:1275-1279.<br />
3-Markoulatos P., Mangana-Vougiouka O., Koptopoulos G., Nomikou K.,<br />
Papadopoulos O. Detection of sheep poxvirus in skin biopsy samples by a multiplex<br />
polymerase chain reaction. J Virol Methods., 2000;84:161-177.<br />
4-Mangana-Vougiouka, O., Markoulatos, P., Koptopoulos, G., Nomikou, K.,<br />
Bakandritsos, N. and Papadopoulos, O., 1999. Sheep poxvirus identification by PCR in cell<br />
cultures. J Virol Methods.,1999; 77: 75-79.<br />
5-Oguzoglu ,T.C., Alkan, F., Ozkul, A., Vural, S.A., Gungor, A.B. and Burgu, I.,<br />
2006. A sheeppox virus outbreak in central Turkey in 2003: Isolation and identification of<br />
capripoxvirus ovis. Vet Res Com., 2003; 30: 965-971.<br />
6- http://www.kkgm.gov.tr/Mevzuat<br />
7-Bhanuprakash V, Indrani BK, Hosamani M, Singh RK. The current status of<br />
sheep pox disease. Comp Immunol Microbiol Infect Dis., 2006;29:27-60.<br />
8-Hosamani M, Mondal B, Tembhurne PA, Bandyopadhyay SK, Singh RK, Rasool<br />
TJ. Differentiation of sheep pox and goat poxviruses by sequence analysis and PCR-RFLP<br />
of P32 gene. Virus Genes, 2004;29:73-80.<br />
9-Rao TV, Bandyopadhyay SK. A comprehensive review of goat pox and sheep<br />
pox and their diagnosis. Anim Health Res Rev., 2000;1:127-136.<br />
10-Gershon, P.D. and Black, D.N., 1989. A capripoxvirus pseudogene whose only<br />
intact homologs are in other poxvirus genomes. Virology, 1989; 172:350-354.<br />
11-Gershon PD, Ansell DM, Black DN. A comparison of the genome organization<br />
of capripoxvirus with that of the orthopoxviruses. J Virol., 1989;63:4703-4708.<br />
12-Gershon PD, Black DN. A comparison of the genomes of capripoxvirus isolates<br />
of sheep, goats, and cattle. Virology, 1988;164:341-349.<br />
13-Bhat PP. A comparison of genomes of sheep pox virus isolates. Indian J Exp<br />
Biol., 1989; 27: 714-717.<br />
14-Tulman ER, Afonso CL, Lu Z, Zsak L, Sur JH, Sandybaev NT, Kerembekova<br />
UZ, Zaitsev VL, Kutish GF, Rock DL. The genomes of sheeppox and goatpox viruses. J<br />
Virol., 2002;76:6054-6061.<br />
15-Sonntag KC, Darai G. Evolution of viral DNA-dependent RNA polymerases.<br />
Virus Genes, 1995;11:271-284.<br />
14. TEKLİF ONAYI :<br />
Adı-Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : İbrahim SÖZDUTMAZ<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Ufuk DİNLER<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar : TAGEM<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi,<br />
Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
67
T.C.<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı :<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1.PROJE ADI : Erzurum yöresinde koyunlarda Clostridium perfringens<br />
toksinlerinin ELISA ve Lateks Aglutinasyon Test yöntemleri ile araştırılması.<br />
(Determination of Clostridium perfringens toxin types with ELISA and Latex<br />
Agglutination Test in sheep in Erzurum.)<br />
2.YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
3.PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Şenay SEYİTOĞLU<br />
Kurumu : Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı : X<br />
Araştırma Programı : X X<br />
5. PROJE SÜRESİ : 16 Ay<br />
5.1.Başlama Tarihi : 01.09.2008<br />
5.2.Bitiş Tarihi : 01.01.2010<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu araştırma ile Erzurum yöresinde aniden ölen ve enterotoksemi şüphesi bulunan<br />
koyunlarda bu hastalığa neden olan Cl. perfringens tiplerinin ve bu bakterinin üretmiş<br />
olduğu toksinlerinin belirlenmesi amaçlandı. Bu çalışmada Enstitü Müdürlüğüne getirilen<br />
Erzurum yöresinde enterotoksemi şüphesi ile ölen çeşitli ırk ve yaştaki koyunlar ile<br />
mezbahanede kesilen 50 adet sağlıklı koyun kullanılacaktır. Bu amaçla her bir koyunun<br />
ince barsak içeriği toplanacak ve bu içeriklerde ELISA ve Latex Aglutinasyon Test ile Cl.<br />
perfringens alt tipleri tarafından üretilen alfa, beta ve epsilon toksinlerinin varlığı<br />
araştırılacaktır.<br />
Bunun yanında elde edilen veriler değerlendirilerek Erzurum yöresinde Cl.<br />
perfringens alt tipleri belirlenerek uygun aşının ve düzenli periyotlarda uygulanması yarar<br />
sağlayacaktır.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER: Koyun, Cl. perfringens, Enterotoksemi, ELISA, LAT<br />
(Sheep Cl. perfringens, Enterotoxaemia, ELISA, LAT )<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar enterotoksemiden kaynaklanan ekonomik<br />
kayıpların ne denli büyük olduğu konusunda fikir verecektir. Yörede koyun türlerinin<br />
<strong>sağlığı</strong> ve verimini yakından etkileyen Cl. perfringens tiplerinin hangi toksinlerinin var<br />
olduğu belirlenecektir.<br />
68
Bunun yanında elde edilen veriler değerlendirilerek Erzurum yöresinde Cl.<br />
perfringens alt tipleri belirlenerek uygun aşıların uygulanmasına yarar sağlayacaktır.<br />
Bu araştırma sonucunda elde edilen veriler değerlendirilerek yetiştirici bilincinin<br />
geliştirilmesi neticesinde <strong>hayvan</strong>cılık ekonomisine de katkı sağlanmış olunacaktır.<br />
8.2 Literatür Özeti:<br />
Gökce ve Ark.(1) “Kars ilinde enterotoksemi şüphesi ile ölen koyunlarda Cl.<br />
perfringens’in toksinlerinin belirlenmesi.” konulu çalışmalarında 260 barsak içeriğinden<br />
ELISA yöntemi ile 220’sinde ( % 84.61) LAT ile ise 152’sinde (%58.46) Cl. perfringens<br />
toksinlerine rastlamışlardır. Cl. perfringens tip A, B, C ve D ELISA ile %47.27, % 9.09,<br />
% 4.54 ve %39.07 sırasıyla bulunmuştur. LAT testi ile de % 51.97, %9.86, % 4.60 ve %<br />
33.55 sırasıyla identifiye etmişlerdir. Her iki testte de en yüksek pozitiflik Cl. perfringens<br />
tip A ve Cl. perfringens tip D bulmuşlardır.<br />
Fernandez-Miyakawa ve Ark.(2) “Cl. perfringens tip B izolatlarının Epsilon ve<br />
Beta toksinlerinin prognozdaki önemi” konulu çalışmalarında Cl. perfringens’in dört<br />
öldürücü toksininin varlığını ve bunların CPA, CPB, ETX ve IOT-toxin olduğunu, fakat<br />
virülensin daha kompleks olduğunu, çünkü bakterinin 15 farklı toksin ürettiğini ve<br />
toksinlerin farklı yöntemlerle izolasyon çalışmalarını yapmışlardır.<br />
Martin ve Naylor (3). “Cl. perfringens epsilon toksininin LAT ile taranması”<br />
konulu çalışmalarında LAT’ın ELISA’dan daha kolay daha hassas ve daha spesifik Cl.<br />
perfringens epsilon toksini belirlediğini saptamışlardır.<br />
Naylor ve Ark.(4) “Cl. perfringens Beta Toksini’nin ELISA ile taranması” konulu<br />
çalışmalarında Cl. perfringens tip B, C, D’nin oluşturduğu enterotoksemi vakalarında<br />
ELISA yöntemi ile Beta ve Epsilon toksinlerinin varlığını ortaya koymuşlardır.<br />
Özcan ve Gürçay 5) “Elazığ ve çevresinde 1994-1998 yılları arasında küçük<br />
ruminantlarda enterotoksemi insidensi” konulu çalışmalarında alınan 132 barsak<br />
örneğinden 51’inde toksin nötralizasyon testi ile pozitiflik, 81’inde negatiflik bulmuşlardır.<br />
Augutynowicz ve Ark.(6) “Cl. perfringens toksinlerinin duplex PCR yöntemi ile<br />
taranması” konulu çalışmalarında 64 izolattan duplex PCR yöntemi ile 24 adetinin<br />
enterotoksijenik olduğu, diğerlerinin zayıf toksin ürettiklerini, zayıf toksin üretimininde<br />
yanlış negatif sonuç verebileceğine kanaat getirmişlerdir.<br />
Manteca ve Ark.(7) “Cl. perfringens Beta-2 toksininin sığır enterotoksemilerindeki<br />
rolü” başlıklı çalışmalarında beta-2 gen probları, hibridizasyon testi, bakteriyel izolasyon,<br />
ELISA testi gibi yöntemlerle Cl. perfringens beta-2 toksininin clostridial hücre değişimleri<br />
ile ve makroskobik lezyonlar ile varlığını ortaya koymuşlardır.<br />
8.3.Materyal ve Metot:<br />
Enstitüye enterotoksemi şüphesi ile getirilen koyun barsak içerikleri ile<br />
mezbahaneden alınacak sağlıklı koyunun kesim sonrası alınacak barsak içerikleri bu<br />
çalışmada materyali oluşturacaktır. Barsak içerikleri 24 saatten önce 4-6 0 C ‘de muhafaza<br />
edilerek çalışılacaktır.<br />
Örnekler 1/5 oranında endotoxin test edilmiş distile su ile dilue edildikten sonra<br />
2000 devirde 20 dakika 4 0 C’de santrifüj edilerek 0.45µm membran filtreden geçirilerek -<br />
70 0 C’de saklanacaktır. Cl. perfringens toksinleri indirekt ELISA yöntemi ile ticari test<br />
prosedürüne uyularak araştırılacaktır. Lateks Aglutinasyon Test ile test prosedürüne<br />
uyularak (1) alınan bu numuneler çalışılacaktır..<br />
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Bu araştırma ile enterotoksemi hastalığının teşhisinde, deney <strong>hayvan</strong>larında fare<br />
toksisite testlerine alternatif olarak invitro testlerin kullanılabilirliğini ve teşhis<br />
çalışmalarında ELISA ve LAT’ın kullanılabilirliğini araştırmak ve toksinlerin kısa sürede<br />
izolasyonunu saptamak amaçlanmıştır. Bunun yanında yöredeki enterotoksemi şüpheli<br />
69
vakaların pozitifliğini belirlemek ve daha kısa sürede sonuç vererek hastalığın<br />
yayılmasının önüne geçmek amaçlanmıştır.<br />
Bunun yanında elde edilen veriler değerlendirilerek <strong>hayvan</strong> <strong>sağlığı</strong>nı yakından<br />
etkileyen Cl. perfringens’in bölgedeki tiplerinin tayini ve toksinlerin izolasyonu ile uygun<br />
olan tip spesifik aşılama yapılarak <strong>hayvan</strong>cılık ekonomisine katkıda bulunulacaktır.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Uzman Veteriner Hekim Şenay SEYİTOĞLU Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Bakteriyoloji laboratuarı<br />
9.2.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Serap KILIÇ ALTUN Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Bakteriyoloji laboratuarı<br />
9.3.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı Yrd.Doç.Dr.Ekrem KİREÇCİ Atatürk Üniversitesi<br />
Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi<br />
9.4.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim İbrahim SÖZDUTMAZ<br />
Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viroloji laboratuarı<br />
9.5.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Ömer Faruk KÜÇÜKKALEM<br />
Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Viroloji laboratuarı<br />
9.6.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner hekim Yıldıray KALKAN Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Patoloji Laboratuarı<br />
9.7. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Bünyamin İREHAN Erzurum<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Bakteriyoloji laboratuarı<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ :<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Enstitümüz Bakteriyoloji laboratuarında çalışmanın<br />
yapılabilmesi için gerekli donanım sağlanmıştır.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım : -<br />
10.3.Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri : Şu anda<br />
yürütülmekte olan bir proje mevcut değildir.<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- Üretime yönelik mal ve malzeme alımları<br />
03.2-Tüketime yönelik mal ve malzeme, alım. 15.300<br />
03.3- Yolluklar 500<br />
03.4- Görev giderleri<br />
03.5- Hizmet alımları<br />
03.6- Temsil ve tanıtma giderleri<br />
03.7- Menkulmal, gayrimaddi hak alım, bakım<br />
ve onarım giderleri<br />
03.8- Gayrimenkul mal bakım ve onarım gider 300<br />
03.9-Tedavi ve cenaze giderleri<br />
TOPLAM 16.100<br />
70
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-Mamul mal alımları 2.500<br />
06.2-Menkul sermaye üretim giderleri<br />
06.3-Gayrimaddi hak alımları<br />
06.4-Gayrimenkul alımları ve kamulaştırılması<br />
06.5-Gayrimenkul sermaye üretim giderleri<br />
06.6- Menkul malların büyük onarım giderleri 3.000<br />
06.7- Gayrimenkul büyük onarım giderleri<br />
06.8- Stok alımları (savunma dışında)<br />
06.9-Diğer sermaye giderler<br />
TOPLAM 5.500<br />
II. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI : YTL<br />
03.2.1.01 Kırtasiye Alımları : 500<br />
03.2.2.02 Temizlik Malzemesi Alımları : 300<br />
03.2.6.01 Laboratuvar Malzemesi ile Kimyevi ve Temrinlik Malzeme Alımları : 14.000<br />
03.2.6.02 Tıbbi Malzeme ve İlaç Alımları : 500<br />
03.3.1.01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları : 500<br />
03.8.1.01 Büro Bakım ve Onarımı Giderleri : 300<br />
06.1.3.03 Tıbbi Gereçler Alımları : 500<br />
06.1.3.04 Laboratuar Gereçleri Alımları : 2.000<br />
06.6.4.01 Yakacak alımları : 1.000<br />
06.6.4.02 Akaryakıt ve yağ alımları : 500<br />
06.6.4.03 Elektrik alımları : 1.000<br />
06.6.5.01 Posta ve Telgraf Giderleri : 200<br />
06.6.5.02 Telefon Abonelik ve Kullanım Ücretleri : 300<br />
TOPLAM : 21.600<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
DÖNEMLER YAPILACAK ÇALIŞMALAR<br />
01.09.2008-31.12.2008 (4 ay) Numunelerin toplanması<br />
01.01.2009-30.09.2009 (9 ay)<br />
Teşhis kit ve kimyasal<br />
numunelerin işlen.<br />
alımlarının sağlanması,<br />
01.10.2009-31.12.2009 (3 ay) Projenin yazılması<br />
71
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1-Gökçe H.İ., Genç O., Süzmen M., Gökçe G.(2007): Determination of Clostridium<br />
perfringens Toxin Types in sheep with Suspected Enterotoxemia in Kars Province, Turkey.<br />
Türk J.Vet. Anim.Sci.31 (5): 355-360<br />
2-Fernandez-Miyakawa E. M., Fisher J.D., Poon R., Sayeed S., Adams V., Rood J.I.,<br />
Mc Clane B.A., Uzal F.A.(2007): Both Epsilon-Toxin and Beta-Toxin are İmportant for<br />
the Lethal Properties of Clostridium perfringens Type B Isolates in the Mouse Intravenous<br />
Injection Model<br />
3-Martin P.K, Naylor R.D (1994): A Latex Aglutination Test for The Qualitative<br />
Detection of Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Res Vet Sci. Mar ;56 (2):259-61<br />
8191019 [Cited:<br />
4-Martin P.K., Naylor R.D., Sharpe R.T.(1997): Detection of Clostridium perfringens<br />
alpha toxin by enzyme-linked immunosorbent assay. 63(1):101-2.<br />
5- Özcan Ö., Gürçay M.(2000): Elazığ ve Çevresinde 1994-1998 Yılları Arasında Küçük<br />
Ruminantlarda enterotoksemi Insidensi. Türk J.Vet. Anim.Sci. 24.283-286<br />
6- Augutynowicz E., Gzyl A., Slusarczyk J.(2002): Detection of enterotoxigenic<br />
Clostridium perfringens with a dublex PCR. J. Med. Microbiol-Vol 51, 169-172<br />
7-Manteca C., Daube G., Jauniaux T., Linden A., Pirson V., Detilleux J., Ginter A.,<br />
Coppe P., Kaeckenbeeck A., Mainil J.G.(2002): A Role for the Clostridium perfringens<br />
Beta_2 Toksin in Bovine Enterotoxemia? Veterinary Microbiology 86,191-202<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı-Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Şenay SEYİTOĞLU<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Ufuk DİNLER<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar : TAGEM<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi<br />
72
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma öncelik Puanı :<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI ( Türkçe/İngilizce):<br />
Küçük Ruminant Vebası Virusu ile Doğal Olarak Enfekte Koyunlarda<br />
Apoptozisin İmmunohistokimyasal Yöntemlerle İncelenmesi.<br />
“Examination of Apoptosis by Immunohistochemical Techniques in Naturally Infected<br />
Sheep with PPR Virus”<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Samsun Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Ömer Can GÜRCAN<br />
Kurumu : Samsun Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4 . Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Araştırma Fırsat Alanı: Küçükbaş<br />
Hayvancılık<br />
Araştırma Programı : A – 08. P - 02.<br />
5. PROJE SÜRESİ : 24 (yirmi dört) Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : 01.01.2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : 01.01.2011<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Küçük ruminant vebası hastalığı ( Peste des Petits Ruminants, PPR ) evcil ve vahşi<br />
küçük ruminantların oldukça bulaşıcı ve enfeksiyöz viral bir hastalığıdır. Ülkemizde 1999<br />
yılı eylül ayında görüldüğü bildirilen PPR enfeksiyonu bu tarihten sonra yayılarak özellikle<br />
ülkemiz koyunculuğunda önemli kayıplara neden olmuştur. Bu tarihten öncede<br />
görüldüğüne dair bazı raporlar bildirilmiştir. Alçığır ve ark. tarafından, 1996 yılında<br />
kuzularda patomorfolojik ve immunohistolojik olarak hastalığın tespit edildiği<br />
bildirilmiştir.<br />
Çalışmada PPR enfeksiyonundan ölen 20 adet koyun kullanılacaktır. Koyunlara<br />
sistemik nekropsi yapılacak alınacak doku örnekleri %10’luk tamponlu formaldehit<br />
solusyonunda tespit edildikten sonra alkol ve ksilol serilerinden geçirilecek ve parafinde<br />
bloklanacaktır. Dokularda antijen ve apoptozisde etkili olduğu bilinen caspase-3, caspase-<br />
8, caspase-9 avidin biotin peroksidaz tekniği ile apoptotik hücreler ise TUNEL metodu ile<br />
ortaya konacaktır. Boyanan kesitler ışık mikroskobunda incelenecek ve görüntü analiz<br />
<strong>program</strong>ı ile değerlendirilecektir.<br />
X<br />
X<br />
73
Planlanan araştırma ile PPR Virusu ile doğal olarak enfekte koyunlarda hastalığın<br />
patolojik lezyonlarının ortaya konması, viral antijenin vücuttaki dağılımının tespiti ve<br />
apoptotik mekanizmaların incelenmesi amaçlanmıştır.<br />
PPR yurdumuzda bölgesel salgınlar halinde görülmekte ve ülke <strong>hayvan</strong>cılığına<br />
önemli zararlar vermektedir. Viral enfeksiyonların patogenezinin incelenmesi aşı ve tedavi<br />
çalışmalarına veri teşkil etmektedir. Planlanan çalışmada incelenecek olan apoptotik<br />
mekanizmalar bu enfeksiyon için daha önce incelenmemiştir. Elde edilecek veriler literatür<br />
bilgideki açığı dolduracaktır.<br />
Summary: PPR ( Peste des Petits Ruminants) is highly contagious and infectious disease<br />
of the domestic and wild ruminants. In Turkey, diseases first reported in 1999 and disease<br />
was lead to economical loses, especially sheep breeding by spreading all around the<br />
country. In this study 20 sheep which are died because of PPR will be used. Sheep will be<br />
systemically necropsied and samples of tissues will be fixed 10% naturally buffered<br />
formaldehitde, dehydrated with ethyl alchool and embedded in paraffin wax. PPR antigen<br />
and caspase-3, caspase-8, caspase-9 will be determined by avidine-biotine peroksidase<br />
technique; apoptotic cells will be demonstrated by TUNEL method. Staining sections will<br />
be investigated with light microscope and evaluated by image analysis software. The aim<br />
of the planning study was to determine the pathological findings of the disease and to<br />
investigated antigen distribution of the body and mechanisms of the apoptotic processes.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER:<br />
Küçük ruminant vebası hastalığı ( Peste des Petits Ruminants, PPR ), İmmunohistokimya,<br />
Apoptozis, TUNEL metodu.<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Küçük ruminant vebası hastalığı ( Peste des Petits Ruminants, PPR ) evcil ve vahşi<br />
küçük ruminantların oldukça bulaşıcı ve enfeksiyöz viral bir hastalığıdır. Ülkemizde resmi<br />
olarak 1999 yılı eylül ayında görüldüğü bildirilen PPR enfeksiyonu bu tarihten sonra<br />
yayılarak özellikle ülkemiz koyunculuğunda önemli kayıplara neden olmuştur.<br />
Planlanan araştırma ile Küçük Ruminant Vebası Virusu ile doğal olarak enfekte<br />
koyunlarda hastalığın patolojik lezyonlarının ortaya konması, viral antijenin vücuttaki<br />
dağılımının tespiti ve apoptotik mekanizmaların incelenmesi amaçlanmıştır.<br />
8.2 Literatür Özeti:<br />
PPR hastalığı öncelikle evcil küçük ruminantların şiddetli seyreden ve hızlı bulaşan<br />
bir hastalığıdır. Hastalık ani durgunluk, ateş, burun ve gözde akıntı, ağızda yaralar,<br />
düzensiz solunum ve öksürük, kötü kokulu ishal ve ölümle karakterizedir ( FAO, 1999).<br />
PPR’ın etkeni olan Peste des Petits Ruminants Virus (PPRV) Paramyxoviridae<br />
familyasının, Paramyxovirinae alt familyasının, morbillivirus grubu içinde yer almaktadır.<br />
Etkenin, sığırların ve mandaların Sığır Vebası Virusu, insanların Kızamık Virusu, Köpek<br />
ve bazı yabani karnivorların Distemper Virusu ve su memelilerinin morbillivirusları ile<br />
yakın ilişkisi vardır ( FAO, 1999, Pastoret,2006 ).<br />
Hastalık klinik olarak koyun ve keçilerde görülür (Bundza ve ark,1988, FAO, 1999,<br />
USAHA, 2006, Yazıcıoğlu,2006). Hastalığın <strong>hayvan</strong>at bahçesindeki ceylan, koyun ve dağ<br />
keçisi gibi yabani küçük ruminantlarda da görüldüğü bildirilmiştir. Hastalık sığır, manda,<br />
deve ve domuzlarda görülür fakat çok hafif geçirilir (Bundza ve ark,1988, CFSPH,2006,<br />
FAO, 1999, OIE,2004).<br />
PPR hastalığı Atlantik Okyanusu ve Kızıl Deniz arasında uzanan bölgedeki birçok<br />
Afrika ülkesinde tespit edilmiştir (FAO, 1999). Son yıllarda hastalık Yakın Doğu ve Arap<br />
74
Yarımadasında, İran, Irak, İsrail, Ürdün, Kuveyt, Lübnan, Umman, Suudi Arabistan,<br />
Birleşik Arap Emirlikleri, Yemen, Suriye ve Türkiye’de görülmüştür. Günümüzde<br />
Hindistan, Nepal, Bengaldeş, Pakistan ve Afganistan’da yaygın salgınlar bilinmektedir<br />
(Gül ve ark,2006, Özkul ve ark,2002, Toplu,2004, USAHA, 2006, Yazıcıoğlu,2006).<br />
Ülkemizde PPR enfeksiyonu resmi olarak 1999 yılı eylül ayında bildirilmesine<br />
rağmen bu tarihten öncede görüldüğüne dair bazı raporlar bildirilmiştir (Özkul ve<br />
ark,2002). Alçığır ve ark. tarafından, 1996 yılında kuzularda patomorfolojik ve<br />
immunohistolojik olarak hastalığın tespit edildiği bildirilmiştir.<br />
PPRV diğer morbilliviruslar gibi lenfotropik ve epiteliotropik karakterdedir. Bu<br />
nedenle lenfoid ve epitel dokudan zengin organ sistemlerinde şiddetli lezyonlar meydana<br />
gelir (Abraham,2005). Virus solunum sistemi yolu ile vücuda girdikten sonra faringeal ve<br />
mandibular lenf düğümlerine ve tonsillere yerleşerek primer replikasyonu gerçekleştirir.<br />
Enfeksiyondan 2-3 gün sonra ve klinik belirtiler ortaya çıkmadan 1-2 gün önce viremi<br />
meydana gelir. Virus dalak, kemik iliği, gastrointestinal kanal ve solunum sistemi<br />
mukozalarına yerleşerek tekrar replike olur ve bunu takiben klinik bulgular açığa çıkar<br />
(Abraham,2005, Bundza ve ark,1988, Milli ve Hazıroğlu,1997). Enfeksiyondan 4-10 gün<br />
sonra, özellikle hastalığın akut fazı sırasında oluşan lökopeni, lenfopeni ve spesifik ve<br />
nonspesifik antijenlere karşı erken antikor cevabındaki azalma ile belirgin<br />
immunosupresyon şekillenir (Rajak ve ark,2005).<br />
Hücresel reseptörler bir virusun konakçı seçimi ve doku tropizmini belirleyen<br />
önemli kriterlerden biridir. PPRV için incelenen kaynaklarda özel bir hücresel reseptör<br />
bildirilmemiştir. İnsan Signaling Lymphocyte Activation Molecule (SLAM, CD150 olarak<br />
ta bilinir) lenfosit ve dendritik hücrelerce eksprese edilen bir membran glukoproteinidir ve<br />
MV için hücresel reseptördür. (Abraham,2005).<br />
Birincil hücresel reseptör olarak SLAM’ı kullanan morbilliviruslar çok düşük etki<br />
ile SLAM negatif hücreleri de enfekte edebilirler (Tatsuo ve Yanagi,2002).<br />
Hücrelerin kendilerini kontrollü bir şekilde öldürdükleri aktif bir intrasellüler ölüm<br />
<strong>program</strong>ı olan apoptozis <strong>program</strong>lı hücre ölümü olarakta adlandırılır. Apoptozis morfolojik<br />
olarak çekirdekte parçalama ve apoptotik cisimcikler oluşumuna neden olan hücresel<br />
bozukluklarla karakterizedir. Biyokimyasal olarakta oligonükleozomlarda kromozomal<br />
DNA kırılmaları ile kendini belli eder. Son zamanlarda kızamık (Measles), Influenza, Felin<br />
panleukopeni, Bovine virus diarrhoea, Infeksiyöz bursal hastalık, Afrika domuz vebası ve<br />
Human immunodeficiency virus tip 1 viruslarının apoptozisi başlattığı gösterilmiştir.<br />
Measles virus, Canin distemper virus, Rinderpest virus ve deniz memelileri viruslarının da<br />
dahil olduğu Paramyxoviridae familyasının Morbillivirus cinsi içinde yer alan PPR<br />
virusunun lenfoid hücre fonksiyonlarında yol açtığı değişikliklerin direkt olarak<br />
apoptozisin uyarılması ile ilişkili olduğu düşünülmektedir (Mondal ve ark,2001).<br />
Mondal ve ark. (2001) keçi lenfoid hücrelerinde in vitro PPR enfeksiyonunun<br />
apoptozise neden olup olmadığı üzerine yaptıkları çalışmada, keçilerin periferal<br />
kanlarındaki mononuklear hücrelerin (PBMC) in vitro olarak PPRV ile enfekte<br />
edildiğinde, çekirdekte yoğunlaşma ve fragmantasyon, DNA fragmantasyonu, plazma<br />
membranında kabarıklıklar ve apoptotik indekste artış gibi apoptozisin uyarıldığını<br />
destekleyen oluşumları tespit etmişlerdir. PPRV’nun PBMC’lerde apoptozisi uyarma<br />
yeteneği immun sistemi etkilediğinden önemlidir (Mondal ve ark,2001).<br />
Doğal enfeksiyonlarda virus bulaştıktan yaklaşık 2–6 gün sonra klinik belirtiler<br />
ortaya çıkar (OIE,2007, Yazıcıoğlu,2006). Aniden ortaya çıkan, en az 40–41°C rektal ateş<br />
görülür. Hasta <strong>hayvan</strong>larda belirgin durgunluk ve uyuşukluk vardır. Özellikle kısa tüylü<br />
ırklarda kıllar dikleşmiş ve kabarık görünür. Bu safhadan hemen sonra gözler, burun ve<br />
ağızdan berrak sulu bir akıntı başlar, akıntı sonradan sekonder bakteriyel enfeksiyon<br />
sonucu koyu ve sarı bir renk alır ( FAO, 1999).<br />
75
Ateş ortaya çıktıktan 1-2 gün sonra ağız ve gözdeki müköz membranlarda<br />
kızarıklık meydana gelir. Sonra epitelyum nekrozu sonucu diş etleri, damak, dudaklar,<br />
yanağın iç tarafında ve dilin üst yüzeyinde toplu iğne başı büyüklüğünde grimsi alanlar<br />
oluşur. Dudaklar şişkin, üzerinde çatlaklar bulunur ve kabukla kaplanmıştır Hastalık<br />
ilerledikçe karakteristik olarak ağızdan kötü kokulu eksudat gelir. Hastalar ağrı nedeniyle<br />
ağızlarını açmak istemezler ( FAO, 1999).<br />
Ateşin ortaya çıkmasından 2-3 gün sonra ishal meydana gelir. Hastalığın<br />
başlangıcında veya hafif vakalarda ishal belirgin olmayabilir. Başlangıçta yumuşak olan<br />
dışkı, daha sonra sulu ve kötü kokulu bir hal alır ( FAO, 1999).<br />
Hasta <strong>hayvan</strong>lar hızlı nefes alır, güç ve gürültülü solunum görülür. Sonuçta, bazı<br />
hastalarda dehidratasyon görülür, gözler içeri çöker ve klinik belirtilerin ortaya<br />
çıkmasından 7-10 gün sonra ölüm şekillenir. Diğer <strong>hayvan</strong>lar uzun bir nekahat<br />
döneminden sonra iyileşirler ( FAO, 1999).<br />
Hastalığın genellikle keçilerde veya genç <strong>hayvan</strong>larda görülen perakut formunda<br />
inkübasyon süresi 2 güne kadar düşer. Hastalık ani yüksek ateş, durgunluk, iştahsızlık ve<br />
solunum güçlüğü ile başlar. Bazı olaylarda müköz membranlarda konjesyon ve hemorajiler<br />
görülür ve kısa sürede ölümle sonuçlanır. Morbidite % 100 iken mortalite % 90<br />
civarındadır (Tatar,2007).<br />
PPR hastalığının subklinik formlarının yerli ırkların doğal direnci nedeniyle bazı<br />
bölgelerde yaygın olarak görüldüğü, böyle olaylarda hastalığın değişken semptomlarla 10-<br />
15 gün süreyle devam ettiği ve son dönemlerinde (geç aşamada) kontagiyöz karakterde,<br />
ektimadakine benzer papül veya püstüller görülebileceği vurgulanmıştır (Gül ve ark,2006).<br />
Dudakların dışında, mermenin etrafındaki deri üzerinde küçük nodüler lezyonların<br />
oluşumu hastalığın son safhasında görülen yaygın bir özelliktir ( FAO, 1999).<br />
PPR enfeksiyonunda sürüdeki <strong>hayvan</strong>ların % 100’ü etkilenebilir ve % 20-90’ı<br />
ölebilir. Hastalığı önceden atlatmış <strong>hayvan</strong>ların bulunduğu endemik bölgelerde bu oranlar<br />
genellikle düşüktür. Endemik bölgelerde hasta ve ölenlerin çoğu 4 ayın üzerinde ve 18–24<br />
aya kadar olan <strong>hayvan</strong>lardır. Gebe <strong>hayvan</strong>larda abort görülebilir ( FAO, 1999).<br />
PPR hastalığının patolojisinde başlıca ağız ve gastrointestinal kanalda yangısal ve<br />
nekrotik lezyonlar görülür (USAHA,2006). Ayrıca interstisyel pnömoni ve bakteriyel<br />
bronkopnömoni veya fibrinoid pnömoni ile seyreden akciğer lezyonları da dikkati çeker<br />
(Toplu,2004).<br />
Hasta <strong>hayvan</strong>ların karkasları aşırı zayıflamıştır, arka kısımları ve bacakları<br />
yumuşak sulu dışkı ile kirlenmiştir ve gözleri içine çökmüştür. Gözler ve burunda kurumuş<br />
akıntı bulunur Ağızda, alt dudağın iç kısmında ve diş etleri, dudakların birleşim yerlerine<br />
yakın yanak mukozasında ve dilin üst kısmında lezyonlara yol açan eroziv stomatitis<br />
şekillenir. ( FAO, 1999).<br />
Akciğerlerde pnömoni şekillenmişse özellikle anterior ve kardiak loblarda<br />
dokunulunca sert kıvamda koyu kırmızı veya mor renkte alanlar, konsolidasyon ve<br />
atelektazi görülür (Abraham,2005, Milli ve Hazıroğlu,1997).<br />
Dalak hafifçe büyümüş ve konjesyone olabilir. Mediastinal ve mezenterial lenf<br />
düğümleri yumuşak ve şişkindir. Abomazumda konjesyon ve hemorajiler görülür ( FAO,<br />
1999).<br />
İnce bağırsak mukozasında konjesyon ve hemorajiler gelişir. Lezyonlar özellikle<br />
doudenumun başlangıç kısmında ve ileumdadır (Milli ve Hazıroğlu,1997).<br />
Payer plaklarında ülserasyonla sonuçlanan şiddetli nekroz meydana gelir<br />
(USAHA,2006). Kalın bağırsaklar genellikle daha şiddetli etkilenir ve iliosekal valvul<br />
çevresinde, sekokolik bağlantı yerinde ve rektumda konjesyon görülür. Kolonun posterior<br />
kısmında ve rektumda zebra çizgisi olarak tanımlanan çizgi şeklinde konjesyonlar<br />
şekillenir (Abraham,2005).<br />
76
PPR virusu sindirim ve solunum kanalında eozinofilik intrastoplazmik ve<br />
intranüklear inklüzyon cisimciklerinin varlığı ile birlikte epitelde nekroza neden olur.<br />
Epitelde ve lenf yumrularında multinuklear sinsityal dev hücreleri gözlenir<br />
(Abraham,2005).<br />
Ağız mukozası, akciğerler ve bağırsaklar başlıca karakteristik lezyonların<br />
görüldüğü yerlerdir. Dil, ağız boşluğu, dudak ve yumuşak damaktaki mukozal lezyonlar,<br />
nekroz alanları, ve epitel hücrelerinde hidropik dejenerasyon ve epitel tabakasında erozyon<br />
ve ülserasyonla birlikte nötrofil lökosit infiltrasyonundan ibarettir. Şiddetli hidropik<br />
dejenerasyonun görüldüğü alanlardaki epitel hücrelerinde amorf, eozinofilik,<br />
intrastoplazmik inklüzyon cisimcikleri bulunur. İlave olarak dil ve ağız mukozasında<br />
intrastoplazmik inklüzyon cisimcikleri içeren dev hücreleri görülür. Submukozada ödem<br />
ve çoğunlukla lenfosit ve makrofajlardan oluşan mononuklear hücre infiltrasyonları<br />
görülür (Toplu,2004).<br />
İnce bağırsakların kript epitelyumu nekroza uğrar ve kriptlerde sinsityal hücreler<br />
şekillenir ve bu kısımlarda villuslar atrofiktir. Submukozada diffuz ödem ve hafif hücre<br />
infiltrasyonu vardır (Milli ve Hazıroğlu,1997). Payer plaklarında, lenfoid foliküllerde<br />
lenfolizis ve karyoreksis ile karakterize parsiyal ya da tamamen yıkımlanma görülür<br />
(Toplu,2004).<br />
Karaciğerde multifokal koagulatif nekroz alanları ve hepatositlerde vakuolasyon<br />
gözlenir (Toplu,2004).<br />
Dalak, tonsiller ve lenf yumrularında virusun yol açtığı lenfosit nekrozuna bağlı<br />
olarak çekirdekte piknoz ve karyoreksis görülür (Abraham,2005). Dalakta beyaz pulpada,<br />
parafolliküler alanlardaki lenfositlerde belirgin azalma ile birlikte retiküloendotelyal hücre<br />
hiperplazisi şekillenir. Sinüzoidler genişlemiş ve makrofaj, plazma hücreleri ve az<br />
miktarda nötrofillerle doludur. Tonsillerdeki lezyonlar dalaktaki lezyonlara benzer, ancak<br />
ilave olarak hemorajiler görülebilir (Toplu,2004).<br />
Akciğerlerde, bronşitis, nekrotik bronşiolitis, diffuz proliferatif interstisyel pnömoni<br />
ve alveolar sinsityal hücre formasyonları görülür. Bronş ve bronşiol epitellerinde, tip II<br />
pnömositlerde ve sinsityal hücrelerde sitoplazmik ve nüklear eozinofilik inklüzyonlar<br />
bulunur (Milli ve Hazıroğlu,1997).<br />
Benzer belirtilerle seyreden diğer akut hastalıklardan ve sığır vebası hastalığından<br />
PPR’ın ayırt edilebilmesi gerektiğinden bazı laboratuar testlerinin yapılması gereklidir (<br />
FAO, 1999).<br />
Kumar ve ark. (2004) keçilerde deneysel PPR enfeksiyonunun<br />
immunohistokimyasal teşhisi üzerine yaptıkları çalışmada spesifik IHC reaksiyonunun<br />
hücre ve dokularda açıktan koyu kahverengine değişen renklerde granüler alanlarla<br />
karakterize olduğunu bildirmişlerdir (Kumar ve ark,2004).<br />
Gastrointestinal kanalda; ağız boşluğunda, yanak mukozasında dejenere epitel<br />
hücrelerinde ve nekroze epitel hücre odaklarında ve döküntülerinde immun boyanma<br />
gözlemişlerdir. Yağ bezlerinde de viral antijen tespit etmişlerdir. İnce ve kalın<br />
bağırsakların kript ve villus epitelinde lumene bakan yüzeylerinde sitoplazmik viral protein<br />
birikimini gösteren pozitif immun boyanma tespit etmişlerdir. Epitel hücrelerinin<br />
çekirdeklerinde viral proteine daha az rastlamışlardır. Hücre membranına doğru<br />
sitoplazmik viral boyanmanın daha yoğun olduğu görmüşlerdir. Bağırsak epitel<br />
hücrelerinde her zaman kaba granüler boyanma alanları bulunduğunu bildirmişlerdir. Payer<br />
plaklarında boşalmış foliküllerdeki nekrotik hücrelerde ve retikuloendotelyal hücrelerde<br />
pozitif immun reaksiyon belirlemişlerdir (Kumar ve ark,2004)<br />
Lenfoid organlarda; Mezenterial lenf yumrularında geriye kalan lenfoid folikül<br />
hücrelerinde ve komşu bölgelerdeki lenfositlerde viral-spesifik antijen varlığını tespit<br />
77
etmişlerdir. Kortikal bölgedeki boşalmış lenfoid foliküllerde retiküler hücrelerde pozitif<br />
boyanma gözlemişlerdir (Kumar ve ark,2004).<br />
Akciğerde; Bronşial ve bronşioler epitel sitoplazmalarında viral antijen varlığını<br />
tespit etmişlerdir. Bronşiollerdeki yangısal hücrelerin şiddetli boya aldığı görülmüştür.<br />
Dökülen bronşial ve bronşioler epitel hücrelerinde, pnömositlerde, makrofajlarda ve<br />
lümende bulunan diğer lökositlerde antijen varlığını göstermişlerdir. Vakaların çoğunda<br />
sinsityal hücrelerin sitoplazmalarının iyi boya aldığı ve seyrek olarak ta nukleuslarının<br />
boyandığını bildirmişlerdir (Kumar ve ark,2004).<br />
8.3. MATERYAL VE METOT:<br />
Çalışmada PPR’dan ölen 20 adet koyun kullanılacaktır. Sistemik nekropsi ile<br />
koyunlardan alınan karaciğer, böbrek, dalak, beyin, akciğer, lenf yumrusu, bağırsak, ağız<br />
mukozası, dil, tonsil, kalp örnekleri %10’luk tamponlu formalin solusyonunda 24 saat<br />
tespit edildikten sonra alkol ve ksilol serilerinden geçirilecek ve parafinde bloklanacaktır.<br />
Mikrotom ile 5 mikron kalınlığında APES kaplı lamlara alınan kesitler, rutin histopatolojik<br />
<strong>değerlendirme</strong>ler için hematoksilen-eozin ile boyanacaktır.<br />
İmmunohistokimyasal boyamalar streptavidin-peroksidaz immunohistokimya<br />
tekniğine uygun olarak takip edilecektir. Deparafinize kesitler testin her aşaması sonrası 2<br />
kez, 10 dakika tris-buffer (pH 7.4) ile yıkanacaktır. Kesitler öncelikle formaldehitin<br />
dokudaki antijenik yapıyı maskeleyici etkisini gidermek için sitrat tamponlu antijen<br />
retrieval solüsyonunda 20 dakika kaynatılacaktır. Yıkama işleminden sonra, metanolde<br />
hazırlanmış %3’lük H2O2 ile 5 dakika inkübe edilerek, dokudaki endojen peroksidaz<br />
aktivitesi giderilecektir. Spesifik olmayan antijenik bağlanmaları engellemek için %5’lik<br />
normal keçi serumunda tutulacaktır. Kesitler daha sonra anti-ppr, anti-Caspase 3, anti-<br />
Caspase 8 ve anti-Caspase 9 antikorlar ile +4°C’de bir gece inkübe edilecektir. Daha sonra<br />
sırasıyla biotinle işaretli sekonder antiserum ve streptavidin peroksidase enzimi ile 10’ar<br />
dakika oda ısısında bekletilecektir. Son olarak kesitler 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC)<br />
veya diaminobenzidin (DAB) ile mikroskop altında kontrollü olarak 15 dakika süreyle<br />
tutulduktan sonra, Gill’s hematoxylin ile karşıt boyamaları yapılarak, su bazlı immun<br />
yapıştırıcı ile kapatılacaktır.<br />
Dokulardaki apoptozu belirlemek üzere TUNEL (terminal deoxynucleotidyl<br />
transferase mediated dUTP nick end labelling) metodu kullanılacaktır. Kesitler in situ<br />
apoptozis kiti kullanılarak boyanacaktır. Deparafinize ve rehidre edilecek olan doku<br />
kesitleri, 20 dakika cytonin ile muamele edilecek ve deiyonize su ile 2 kez 2’şer dakika<br />
yıkanacaktır. Kesitler endojen peroksidaz aktivitesinin giderilmesi için %3’lük H2O2 ile 5<br />
dakika inkübe edilecek ve 1 dakika PBS ile yıkandıktan sonra TdT işaretleme<br />
tamponunuda 5 dakika tutulacaktır. Kesitler işaretleme reaksiyonu karışımında 37 °C’ de 1<br />
saat inkubasyonu takiben, işaretleme reaksiyonu durdurmak için TdT durdurma<br />
tamponunda 5 dakika tutulacaktır. Sonra PBS de iki kere çalkalanacaktır. Kesitler anti-<br />
BrdU antikoru ile 37°C de 1 saat inkübe edilip, PBS’le üç kez yıkandıktan sonra<br />
streptavidin-HRP solüsyonu ile 10 dakika inkübe edilecektir. PBS’le üç kez yıkandıktan<br />
sonra AEC kromojen olarak kullanılacak ve Gill’s hematoxylin ile karşıt boyama<br />
yapılacaktır.<br />
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
PPR yurdumuzda bölgesel salgınlar halinde görülmekte ve ülke <strong>hayvan</strong>cılığına<br />
önemli zararlar vermektedir. Viral enfeksiyonların patogenezinin incelenmesi aşı ve tedavi<br />
çalışmalarına veri teşkil etmektedir. Planlanan çalışmada incelenecek olan apoptotik<br />
mekanizmalar bu enfeksiyon için daha önce incelenmemiştir. Elde edilecek veriler literatür<br />
bilgideki açığı dolduracaktır.<br />
78
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Ömer Can GÜRCAN<br />
Konuyla İlgili Araştırma Deneyimi: Var<br />
9.2. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Doç Dr. Tolga GÜVENÇ<br />
Konuyla İlgili Araştırma Deneyimi: Var<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım (Projeyle İlgili Donanım):<br />
Buzdolabı (1 adet), Mikrotom (1 adet), Doku yüzdürme cihazı, Parafin dispenser,<br />
Otomatik doku takip seti, mikroskop (1 Adet), Normal etüv (1Adet).<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım :<br />
Samsun Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Veteriner Fakültesi Patoloji Ana Bilim Dalı<br />
Araştırma mikroskobu, Dijital görüntü analiz <strong>program</strong>ı.<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri:<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIMI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM GİDERLERİ<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME ALIMLARI<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME ALIMLARI<br />
1.Yıl 2.Yıl<br />
03.2.1 Kırtasiye ve Büro Malzemesi Alımları<br />
250<br />
500<br />
03.2.3.02 Akaryakıt ve Yağ Alımları<br />
03.2.6.01 Laboratuar Malzemesi ile Kimyevi ve Temrinlik Malzeme Alımları<br />
03.3- YOLUKLAR<br />
2.000<br />
12.000<br />
2.000<br />
12.000<br />
03.3.1.01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları<br />
03.4- GÖREV GİDERLERİ<br />
03.5- HİZMET ALIMLARI<br />
03.6- TEMSİL VE TANITMA GİDERLERİ<br />
03.7- MENKULMAL, GAYRİMADDİ HAK ALIM, BAKIM VE ONARIM<br />
500<br />
500<br />
GİDER<br />
03.7.3.03 Taşıt Bakım ve Onarım Giderleri<br />
03.8- GAYRİMENKUL MAL BAKIM VE ONARIM GİDERLERİ<br />
03.9- TEDAVİ VE CENAZE GİDERLERİ<br />
250<br />
250<br />
TOPLAM 15.000 15.250<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI<br />
06.1.2.04 Laboratuar Cihazı Alımları<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM GİDERLERİ<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE KAMULAŞTIRILMASI<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM GİDERLERİ<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM GİDERLERİ<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM GİDERLERİ<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA)<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER<br />
TOPLAM<br />
GENEL TOPLAM : 30.250<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIMI<br />
1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
79
II. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI: Yukarıdaki tablo içerisinde belirtilmiştir.<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ: Örneklerin hangi dönemlerde toplanacağı ve ona göre analizlerin<br />
yapılacağı dönemler<br />
I. Dönem<br />
(0-6 Ay)<br />
II. Dönem<br />
(6-12 Ay)<br />
III. Dönem<br />
(12-18 Ay)<br />
IV. Dönem<br />
(18-24 Ay)<br />
Malzemenin Temini +<br />
Örneklerin Toplanması + + +<br />
Dokuların İşlenmesi ve Histopatolojik<br />
+ + + +<br />
Değerlendirme<br />
İmmunohistokimyasal Olarak Antijen Belirlenmesi + + +<br />
Apoptozisin Belirlenmesi-TUNEL Metodu + + +<br />
Kaspaz 3, 8 ve 9’un İncelenmesi + + +<br />
Sonuçların Değerlendirilip Kesin Rapor Yazılması +<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1. ABRAHAM, G., (2005). Epidemiology of Peste des Petits Ruminants Virus in<br />
Ethiopia and Molecular Studies on Virulence, (Phd Thesis), Le Titre de Docteur de<br />
L’Institut National Polytechnique de Toulouse.<br />
2. ALCIGIR, G., VURAL, S.A., TOPLU, N. (1996). Turkiye'de kuzularda peste des<br />
petits ruminants virus enfeksiyonunun patomorfolojik ve immunhistolojik ilk tanimi.<br />
Ankara UNiv. Vet. Fak. Derg., 43 (2) : 181-189<br />
3. BUNDZA, A., AFSHAR, A., DUKES, T. W., MYERS, D. J., DULAC, G. C.,<br />
BECKER, S. A.W., (1988). Experimental Peste des Petits Ruminants ( Goat Plague ) in<br />
Goats and Sheep, Can. J. Vet. Res.52: 46-52<br />
4. CFSPH., Peste des Petıts Rumınants.Erişim :<br />
http://www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/Paste_des_Petits_Ruminants.pdf, Erişim<br />
tarihi : 28.11.2006<br />
5. ELIGULASHVILI, R., PERLI, S., STRAM, Y., FRIEDGUT, O., SHEICHAT, N.,<br />
SAMINA, I., TRAININ, Z., (1999). Immunohistochemical Detection of Peste des Petits<br />
Ruminants Viral Antigen i,n Formalin-fixed, Paraffin-embedded issues From Cases of<br />
Naturally Occuring İnfection. J. Vet. Diagn. Invest. 11:286-288<br />
6. FAO., (1999). Recognizing Peste des Petits Ruminants. a field manual. Erişim:<br />
http://www.org/DOCREP/003/X1703E/X1703E00.htm, Erişim Tarihi : 28.11.2006<br />
7. GÜL. Y., KIZIL. Ö., İSSİ. M., (2006). Bir Kuzuda Saptanan Subklinik Küçük<br />
Ruminant Vebası (Peste des Petits Ruminants, PPR) Olgusu. F.Ü Sağ.Bil.Der. 20(3): 245-<br />
247<br />
8. KUMAR,P., TRIPATH, B. N., SHARMA, A. K., KUMAR, R., SREENIVASA, B. P.,<br />
SINGH, R. P., DHAR, P., (2004). Pathological and Immunohistochemical Study of<br />
Experimental Peste des Petits Ruminants Virus Infection in Goats. J. Vet. Med. B 51: 153-<br />
159<br />
9. MİLLİ, Ü.H., HAZIROĞLU,R., (1997). Veteriner Patoloji.Cilt: I Tamer Matbaası,<br />
Ankara. S.: 7- 9<br />
10. MONDAL, B., SREENIVASA, B. P., DHAR,P., SINGH, R. P.,<br />
BANDYOPADHYAY, S. K., (2001). Apoptosis İnduced by Peste des Petits Ruminants<br />
Virus in Goat Peripheral Blood Mononuclear Cells. Virus Res. 73: 113 - 119<br />
80
11. OIE., (2004). Peste des petits ruminants. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for<br />
Terrestrial Animals. Part 2, Section 2.1., Chapter 2.1.5.<br />
12. OIE., Peste des Petıts Rumınants, Erişim:<br />
http://www.oie.int/eng/maladies/fiches/a_a050.htm, Erişim Tarihi: 12.01.2007<br />
13. ÖZKUL, A., AKÇA, Y., ALKAN, F., BARRETT, T., KARAOĞLU, T., DAĞALP, S.<br />
B., ANDERSON, J., YEŞİLBAĞ, K., ÇOKÇALIŞKAN, C., GENCAY, A., BURGU, İ.,<br />
(2002). Prevalance, Distribution and Host Range of Petse des petits ruminants virus,<br />
Turkey. Emerg. Infect Dis. 8 (7) : 708-712.<br />
14. PASTORET, P.P., Rinderpest: a General Intraduction. Erişim:<br />
http://books.elsevier.com/uk/bookscat/samples/9780120883851/9780120883851.<br />
pdf?mscssid= F6Q15VJ5ALUJ8HJRS3B2E45WNPG17ULC Erişim Tarihi: 29.11.2006<br />
15. RAJAK, K.K., SREENIVASA, B. P., HOSAMANI, M., SINGH, R. P., SINGH, S. K.,<br />
SINGH, R. K., BANDYOPADHYAY, S. K., (2005). Experimental Studies on<br />
Immunosuppressive Effects of Peste des Petits Ruminants (PPR) Virus in Goats. Comp.<br />
İmmun. Microbol. Infect. Dis. Jul; 28(4): 287-296<br />
16. SALIKI,J.T., BROWN, C. C., HOUSE, J. A., DUBOUI, E. J., (1994). Differential<br />
Immunohistochemical Staining of Peste des Petits Ruminants and Rinderpest Antigens in<br />
Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissues Using Monoclonal and Polyclonal Antibodies.<br />
J. Vet. Diagn. Invest. 6: 96-98<br />
17. TATAR, N., Koyun Keçi Vebası. Erişim :<br />
http://erzurum.vet.gov.tr/ihbari_mec_hs_copy(8).htm, Erişim Tarihi: 24.01.2007<br />
18. TATSUO, H., YANAGİ. Y., (2002). The Morbillivirus Rceptor SLAM (CD150) Mic.<br />
Immunol. 46(3), 135-142<br />
19. TOPLU, N., (2004). Characteristic and Non-characteristic Pathological Findings in<br />
peste des Petits Ruminants (PPR) of sheep in the Ege District of Turkey. J. Comp. Path.<br />
131: 135-141.<br />
20. USAHA., Peste des Petıts Rumınants. Foreign Animal Diseases "The Gray Book".<br />
Erişim: http://www.vet.uga.edu/vpp/gray_book02/fad/pdp.php, Erişim Tarihi: 28.11.2006<br />
21. YAZICIOĞLU,Ö., Koyun Keçi Vebası, Bornova Kontrol ve Araştırma Enstitüsü.<br />
Erişim: http://www.bornova.vet.gov.tr/kkvebasi.htm, Erişim tarihi: 28.11.2006<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Ömer Can GÜRCAN<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : İsmail AYDIN<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar :<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : Samsun Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Veteriner<br />
Fakültesi<br />
81
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : A-08 Araştırma Öncelik Puanı: O<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası:<br />
1. PROJE ADI : Merinos ve Ile de France x Akkaraman ( G2 melezi) koyunlarında<br />
laktasyonun değişik dönemlerinde yapağı, serum ve süt iz element düzeylerinin<br />
karşılaştırılması<br />
“Comparative investigation of wool, milk and serum trace element levels in different<br />
period of lactation in Merinos and Ile de France x Akkaraman (G2 hybrid) sheep”<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ :<br />
Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı :Vet. Hek. G. Işıl BEKTAŞ<br />
Kurumu : Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4 . Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı: Küçükbaş Hayvancılık O<br />
Araştırma Programı : Hayvan Besleme O<br />
5. PROJE SÜRESİ : 24 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : Nisan 2008<br />
5.2. Bitiş Tarihi : Nisan 2010<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu araştırmada Merinos ve Ile de France x Akkaraman (G2 melezi) koyunlarının,<br />
laktasyonun başlangıç, orta ve son dönemlerine ( Merinos için 15, 45 ve 75 günlerde,<br />
Akkaraman melezi için 15, 75 ve 150 günlerde) ait serum, yapağı ve süt örneklerinde iz<br />
element düzeylerinin ( Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Se) tespit edilmesi , iki ırka ait değerlerin<br />
karşılaştırmalı olarak incelenmesi ve iz element yetersizlik hastalıkları ile<br />
karıştırılabilecek fizyolojik durumların incelenen lakatasyon sürecinde var olup<br />
olmadığının saptanması amaçlanmıştır.<br />
The aim of this study is to search wool, milk and serum trace element ( Fe, Cu,<br />
Zn, Mn, Co, Se) levels in the firs, middle and last period of lactation (for Merinos 15 th ,<br />
45 th ve 75 th days, for Akkaraman hybrid 15 th , 75 th ve 150 th days) to compare the levels<br />
and to find out if there is any differences between metabolic diseasses and diseasses<br />
depending on lack of trace elements in Merinos and Ile de France x Akkaraman (G2<br />
hybrid) sheep.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER: İz element, koyun, laktasyon dönemi, serum, süt, yapağı,<br />
Trace element, sheep, lactation period, serum, milk, wool<br />
82
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Türkiye’de yetiştirilen Merinos ve Ile de France x Akkaraman (G2 melezi)<br />
koyun ırklarının karşılaştırmalı olarak laktasyonun çeşitli dönemlerinde serum, yapağı ve<br />
sütlerindeki iz element düzeylerinin belirlenmesi ve değerlerin konu ile ilgili literatür<br />
bilgiler ışığında <strong>hayvan</strong> <strong>sağlığı</strong> ve hastalıkları yönünden incelenmesi. Bu şekilde,<br />
koyunlarda zaman zaman gözlenen yapağı dökümü gibi klinik yetersizlik belirtilerinin<br />
gerçek iz element yetersizliklerinden ayırt edilmesinde yararlanılması sağlanmış olacaktır.<br />
Ayrıca, laktasyon süresince <strong>hayvan</strong>lardaki iz element durumu da incelenmiş olacaktır.<br />
Çünkü iz elementlerin yetersizliği veya fazlalığı <strong>hayvan</strong>ların büyüme ve beslenmesini hızlı<br />
bir şekilde yavaşlatır ve verim düşüklüğüne neden olur. İz elementlerin noksanlığı veya<br />
fazlılığının tanısı klinik belirtilerin yanında patolojik ve biyokimyasal incelemelerle<br />
desteklenmelidir, bu maksatla <strong>hayvan</strong> doku ve sıvı örneklerinden yararlanılabilir. Ayrıca<br />
yapağının da örnek alımı ve muhafazasının kolay olması nedeniyle bazı iz elementler için<br />
vücut dokusu ve sıvısına tercih edileceği bildirilmiştir.<br />
Bu araştırmada Merinos ve Ile de France x Akkaraman (G2 melezi) koyunlarının,<br />
laktasyonun çeşitli dönemlerine ait serum, yapağı ve süt örneklerinde iz element<br />
düzeylerinin (Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Se) tespit edilmesi , iki ırka ait değerlerin karşılaştırmalı<br />
olarak incelenmesi ve iz element yetersizlik hastalıkları ile karıştırılabilecek fizyolojik<br />
durumların var olup olmadığının saptanması amaçlanmıştır.<br />
Yaptığımız taramalarda; aynı bakım-besleme koşulları altında yetişen ve laktasyon<br />
döneminde olan koyun ırklarında süt, serum ve yapağı iz element düzeylerinin ve<br />
metabolik durumunun karşılaştırmalı olarak incelenmesiyle ilgili bu kapsamda bir literatür<br />
bilgisine rastlanmamıştır. Bu ilişki hem ırklar arasındaki hem de organik materyallerde<br />
(serum, süt, yapağı) laktasyonun çeşitli dönemlerindeki iz element düzeyleri arasındaki<br />
farkı ortaya koyması ve iz element yetersizlik hastalıkları ile karıştırılabilecek fizyolojik<br />
olayları ayırt etme açısından önem taşımaktadır.<br />
8.2 Literatür Özeti:<br />
İnsan ve <strong>hayvan</strong> organizmasında varlığı tespit edilebilen çok sayıda kimyasal<br />
elementten yaklaşık 26 kadarının hayat için önemli olduğu kabul edilmektedir. Bunlardan<br />
dördü (C, H, O ve N) temel element, bir kısmı (Ca, P, Na, K, Cl, Mg ve S) makroelement,<br />
bir kısmı da (Fe, I, Cu, Mn, Zn, Co, Mo, Se ve F) mikroelement yada iz element olarak<br />
bilinir ve <strong>hayvan</strong> beslenmesinde son derece önemlidir (Karagül ve ark, 2000). Çoğu<br />
<strong>hayvan</strong> türlerinin, sağlıklı yaşam ve maksimum verim için daha önce en az 7 makro ve 17<br />
mikro olmak üzere 24 minerale ihtiyaçlarının olduğu bildirilmekteydi (Mc Dowell L.R,<br />
1992). Günümüzde ise bu minerallerin sayısı 50’ye yaklaşmaktadır (Ergün A., 2001).<br />
Organizmanın fonksiyonlarını yerine getirebilmesi ve bunu sağlıklı bir şekilde<br />
sürdürebilmesi için protein, yağ, karbonhidrat, aminoasit ve mineral maddeleri gibi temel<br />
besin ve yapı maddeleri ile beraber vitamin ve iz elementlerin de düzenli ve dengeli bir<br />
şekilde alması gereklidir. (Mc Dowell, 1992)<br />
Vücuda giren iz elementler kan proteinlerine bağlanarak vücuda dağılırlar (Değer, 2000).<br />
İz elementler birçok enzim ve hormonun fizyolojik etkisi için gereklidir, organ ve<br />
dokuların yapısına girer, besinlerle birlikte dışarıdan alınmak zorundadır (Mc Dowell,<br />
1992).<br />
İz elementlerin yetersizliği veya fazlalığı <strong>hayvan</strong>ların büyüme ve beslenmesini hızlı bir<br />
şekilde yavaşlatır ve verim düşüklüğüne neden olur (Hartmans, 1970)<br />
Bu araştırmada laktasyonun değişik zamanlarında (laktasyon başı, ortası ve sonu) yapağı,<br />
serum ve sütte bulunan iz element düzeylerinin laktasyon dönemlerdeki miktarlarını ve iki<br />
farklı ırk arasındaki düzeylerin karşılaştırılması ve bu şekilde de iz element düzeylerinin<br />
83
koyunlarda vücut sıvıları ve dokularına dağılımlarında fizyolojik veya patolojik bir durum<br />
olup olmadığı hususunun ırk boyutunda saptanması düşünülmektedir.<br />
Akkaraman koyunlarında mevsimsel olarak yapağı dökümü olaylarına rastlandığı<br />
ve mineral dengesizliği şüphesine karşılık olayın tamamen fizyolojik olduğu yönünde<br />
çalışmalar mevcuttur (Altıntaş ve ark, 1991a, 1991b).<br />
8.3. MATERYAL VE METOT:<br />
MATERYAL:<br />
Ankara Polatlı ilçesine bağlı TİGEM tarım işletmesinde birbirine yakın yaşlarda, aynı<br />
bakım-beslenme ve hijyenik şartlarda bulunan Merinos ve Akkaraman x Ile de France<br />
koyun ırklarından, her ırktan 30'ar adet olmak üzere, 60 adet serum, yapağı ve süt örnekleri<br />
usulüne uygun şekilde alınacaktır. Bu işlem yapağı için bir kez, süt ve serum için laktasyon<br />
süresince toplam üç kez (Merinos için 15., 45. ve 75. günlerde, Akkaraman melezi için 15.,<br />
75. ve 150. günlerde) tekrarlanacaktır. Hayvanlara verilen yem ve su örnekleri de bir kez<br />
aynı parametreler açısından analiz edilecektir.<br />
Grup oluşturmada; <strong>hayvan</strong>ların kaçıncı doğumlarının olduğu (ilk, ikinci, üçüncü) ve<br />
yavru sayısı (tek, ikiz, üçüz vb) faktörleri de dikkate alınacaktır.<br />
Serum örnekleri<br />
Koyunların V. jugularisinden usulüne uygun olarak alınan kan örnekleri hemolize ve<br />
kontaminasyona fırsat vermeden 3000 rpm’de 10 dakika süre ile santrifüj edilerek serumlar<br />
çıkarılacak ve analize kadar -18 0 C dondurularak bekletilecektir.<br />
Yapağı Örnekleri<br />
Yapağı örnekleri paslanmaz çelik bir makasla <strong>hayvan</strong>ların sırt- yan bölgelerinden dipten<br />
kesilerek alınacak ve analize kadar temiz naylon poşette saklanacaktır.<br />
Süt Örnekleri<br />
Nisan- Mayıs ayında laktasyona giren koyunların sütleri 50ml'lik steril propilen kaplara<br />
alınarak analiz tarihine kadar -18 0 C dondurularak saklanacaktır.<br />
Yem ve Su Örnekleri<br />
Yem değişikliği olmadığı sürece bir kez, yem değiştirilse yeni yem usulüne uygun olarak<br />
temiz naylon poşetlere ve su örnekleri temiz propilen kaplara alınacaktır.<br />
METOT:<br />
Alınan yapağı, süt, yem örnekleri mikrodalga fırında uygun yöntemle yakılarak (AOAC,<br />
2000) Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresinde iz element (Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Se)<br />
ölçümleri yapılacaktır. Alınan serum ve su örnekleri de Atomik Absorbsiyon<br />
Spektrofotometresinde iz elementler (Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Se) yönünden analiz edilecektir.<br />
Elde edilen bireysel değerlerin ortalama değerleri hesaplanacak ve uygun istatistik<br />
yöntemlerle ırk ve laktasyon dönemi açısından karşılaştırmalı olarak incelenecektir.<br />
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Yaptığımız taramalarda aynı bakım-besleme koşulları altında yetişen ve laktasyon<br />
döneminde olan iki koyun ırkı arasındaki süt, serum ve yapağı iz element düzeylerinin ırk<br />
ve laktasyon dönemi açısından karşılaştırılarak incelenmesiyle ilgili bu kapsamda bir<br />
literatür bilgisine rastlanmamıştır. Bu ilişki hem ırklar arasındaki hem de organik<br />
materyallerde (serum, süt, yapağı) laktasyonun çeşitli dönemlerindeki iz element düzeyleri<br />
arasındaki farkı ortaya koyması ve iz element yetersizlik hastalıkları ile karıştırılabilecek<br />
fizyolojik olayları ayırt etme açısından önem taşımaktadır.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Gizem Işıl BEKTAŞ<br />
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi’nden 2005 yılında mezun oldu. Aynı<br />
fakültenin’nin Biyokimya ABD’da doktora eğitime başladı. 2006 yılından bu yana Etlik<br />
84
Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, Biyokimya Laboratuvarı’nda görev<br />
yapmaktadır.<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Hedeflenen sayıda materyal çalışmak için laboratuvarın<br />
alt yapısı yeterli.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım : -<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri:<br />
Biyokimya Laboratuvar’ı Veteriner Hekimlik sahasında klinik tanıda önemli olan iz<br />
elemetlerin incelenmesi açısından gerekli alt yapıya sahip bir laboratuardır. Laboratuvarda<br />
devam eden araştırmalar; Kırıkkale’de petrol rafineri ve silah fabrikası çevresinde<br />
yetiştirilen koyunların dokularında ve taşıdıkları helmintler ile toprak, yem ve su’da bazı<br />
ağır metallerin belirlenmesi, Türkiye’nin bazı bölgelerinden toplanan süt örneklerinde bazı<br />
ağır metal düzeylerinin tespiti.<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü İmkanları<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE<br />
MALZEME ALIMLARI<br />
10.800YTL -<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE<br />
MALZEME ALIMLARI<br />
7.200YTL 1.000YTL<br />
03.3- YOLUKLAR 1.000YTL -<br />
TOPLAM 20.000YTL<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ<br />
1.Yıl 2.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI - -<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
- -<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI - -<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
- -<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE<br />
ÜRETİM GİDERLERİ<br />
- -<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK<br />
ONARIM GİDERLERİ<br />
- -<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
- -<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA<br />
DIŞINDA)<br />
- -<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER - -<br />
TOPLAM -<br />
85
II. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI<br />
I II III IV GİDERİN EKONOMİK<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
SINIFLANDIRMASI 1.Yıl 2.Yıl<br />
03 1 9 Diğer Mal ve Malzeme Alımları:<br />
03 1 9 01 Diğer Mal ve Malzeme Alımları:<br />
Otomatik pipet, Mikrodalga için<br />
-<br />
Teflon kap ve rotoru<br />
10.800YTL<br />
03 2 1 Kırtasiye ve Büro Malzemesi<br />
Alımları:<br />
03 2 1 01 Kırtasiye Alımları 500YTL 500YTL<br />
03 2 1 05 Baskı ve Cilt Giderleri 500YTL 500YTL<br />
03 2 3 Enerji Alımları:<br />
03 2 3 02 Akaryakıt ve Yağ Alımları 4.000YTL -<br />
03 2 6 Özel Malzeme Alımları:<br />
03 2 6 01 Laboratuvar Malzemesi ile Kimyevi<br />
ve Temrinlik Malzeme Alımları 2.200YTL -<br />
03 3 1 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları:<br />
03 3 1 01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları 1.000YTL -<br />
TOPLAM 20.000YTL<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
Proje Faaliyetleri Sorumlu Gerçekleştirme Açıklama<br />
Kişi Tarihi<br />
Projede kullanılacak G.Işıl<br />
Nisan 2008<br />
malzemelerin temini<br />
Örneklerin toplanması ve<br />
laboratuara ulaştırılması<br />
BEKTAŞ<br />
G.Işıl<br />
BEKTAŞ<br />
Örneklerin İşlenmesi G.Işıl<br />
BEKTAŞ<br />
G.Işıl<br />
Örneklerin Analizi<br />
Proje sonuç raporunun<br />
hazırlanması<br />
BEKTAŞ<br />
G.Işıl<br />
BEKTAŞ<br />
Nisan 2008<br />
Ağustos 2008<br />
Eylül 2008<br />
Aralık 2008<br />
Ocak 2009<br />
Haziran 2009<br />
Temmuz 2009<br />
Nisan 2010<br />
Nisan ayında<br />
koyunlar laktasyona<br />
girecektir<br />
86
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1.HARTMANS, J. (1970): Trace element metabolosm in Animals (Mills, C.f. ED.)<br />
Livingstona, Edinburg and London. 441.<br />
2. COMBS,D.K., GOODRICH, R.D., MEİSKE,J.C. (1982): Mineral concentrations in<br />
hair as indicator of mineral satatus. A review. J.Anim. Sci. 54 (2):391-398.<br />
3.ALTINTAŞ A., UYSAL H., YILDIZ S., GONCAGÜL T. (1991): Akkaraman ve<br />
melezlerinde serum ve yapağı örneklerinde karşılaştırmalı mineral durumu<br />
4.ALTINTAŞ A., UYSAL H., YILDIZ S., GONCAGÜL T. (1991): Yapağısını döken<br />
ve dökmeyen akkaraman koyunlarda karşılaştırmalı serum ve yapağı mineral durumu.<br />
5. IŞIKYILDIZ, A., ALTINTAŞ, A. (1994): Bakarkör buzağı ve danalarda serum ve<br />
karaciğer iz element (Zn, Cu, Mn) düzeyleri.<br />
6. AOAC INTERNATİONAL Official Method of Analize, 2000<br />
7. DEĞER Y, DEDE S (2000): Koyun kanında iz element (Zn ve Cu) analizi için<br />
kulanılan bazı numune hazırlama metodlarının karşılaştırılması. Yüzüncü Yıl Üniv Sağlık<br />
Bil Derg, 6 (1-2): 5-<br />
8. ERGÜN A. (2001): Mineral elementler. In, Ergün A, Tuncer Ş (Ed): Hayvan Besleme<br />
ve Beslenme Hastalıkları. s.77-91, Medipress, Ankara.<br />
9. KARAGÜL H, ALTINTAŞ, A, FİDANCI, UR, SEL T.(2000): Klinik Biyokimya.<br />
Medisan Yayınevi.<br />
10. KARADEMİR B.,(2007): Atomik Absorbsiyon Spektrofotometrede Kan-Serumu<br />
Bakır ve Çinko Analizleri İçin Bazı Numune HazırlamaYöntemlerinin Karşılaştırılmaları.<br />
Kafkas Üniv Vet Fak Derg 13 (1): 61-66.<br />
11. KARADEMİR B.,(2007): Kış Koşulları Altındaki Akkaraman ve Tuj<br />
KoyunlarınınYaş ve Cinsiyete Göre Serum Bakır ve Çinko Düzeyleri. Kafkas Üniv Vet<br />
Fak Derg 13 (1): 55-59.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri :Vet.Hek.G. Işıl BEKTAŞ 15.01.2008<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü :Dr. Nahit YAZICIOĞLU 15.01.2008<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar :Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enst.<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : TİGEM Polatlı/ Ankara<br />
A.Ü Veteriner Fakültesi Biyokimya A.B.D<br />
87
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
ÖN PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI: Zeranolün Kastre Edilen Kıl Keçisi Oğlaklarında Bazı Besi<br />
Performansları, Reprodüktif Özellikler, Lipid Peroksidasyon ve Antioksidan<br />
Düzeylerine Etkisinin Araştırılması.<br />
“Being Research of Effect on Lipid Peroxidation and Antioxidan Levels, Reproductive<br />
Parameters, Some Feeding up Performans in The Castrated Hair Goat Kids.”<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ :<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü-ELAZIĞ<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Dr. Mehtap ÖZÇELİK<br />
Kurumu : Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
Müdürlüğü-ELAZIĞ<br />
4 . Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Araştırma Fırsat Alanı: Küçük Baş Hayvancılık<br />
Araştırma Programı : Hayvan Besleme<br />
5. PROJE SÜRESİ : 24 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : Ocak 2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : Ocak 2011<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu çalışmada, zeranol implantının kastre edilmiş ve edilmemiş kıl keçisi oğlakların<br />
kanında lipid peroksidasyon ve antioksidan düzeyleri, bazı besi performansları, reprodüktif<br />
parametrelere etkisini araştırmak amaçlanmıştır. Araştırma 4 grup üzerinde yapılacaktır.<br />
Birinci grup kastrasyon + zeranol; ikinci grup kastre edilmemiş + zeranol; üçüncü grup<br />
kastrasyon yapılanlarda kontrol; dördüncü grup ise kastre edilmemiş kontrol grubunu<br />
oluşturan <strong>hayvan</strong>larda çalışılacaktır. Uygulama 20 hafta sürecek. Uygulama sonrası kanda<br />
lipid peroksidasyon, glutatyon (GSH), glutatyon peroksidaz (GSH- Px), katalaz, E<br />
vitamini, A vitamini, β karoten; LH ve Testesteron düzeyleri ölçülecektir. Bazı besi<br />
performanslarından günlük canlı ağırlık artışı (kg), besi sonu canlı ağırlık (kg), karkas<br />
randımanı (%), göz kası alanı (cm 2 ) ölçülerek değerlendirilecektir.<br />
88
Summary: The aim of this study is effect of zeranol implant on lipid peroxidation and<br />
antioxidan levels, some feeding up performans and reproductive parameters at castrated<br />
and uncastrated Hair Goat Kids. The research will have four groups: Group 1: The<br />
castrated + Zeranol, Group 2: The Uncastrated + Zeranol, Group, 3: The castrated control,<br />
Group, 4: The Uncastrated control. The research will last for 20 weeks. At the end of the<br />
study , İt will be measured lipid peroxidation, GSH, GSH-Px, CAT, Vitamine A, Vitamine<br />
E, β carotene, LH and testesteron in blood. İt will be evaluated some of feeding up<br />
performans; daily living increased weight, last it feeding up increased weight, performans<br />
of carcass, musculus longissumus dorsi area (cm2).<br />
7. ANAHTAR KELİMELER: Zeranol, antioksidan, lipid peroksidasyon, keçi ve<br />
doğrudan verim özellikleri<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1. Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Besicilikte, semirtici amaçla yaygın olarak hormon etkisine sahip büyüme ajanları<br />
kullanılmaktadır. Amerika Birleşik Devletleri, Kanada, Yeni Zelanda ve Avustralya gibi et<br />
ihraç eden ülkelerde yaygın olarak hormon implantları kullanılmasına karşın; Avrupa<br />
Birliği ülkelerinde ve Türkiye’de <strong>hayvan</strong> yetiştiriciliğinde kullanılması yasaklanmıştır.<br />
Ancak <strong>hayvan</strong>sal ürün üretiminde anabolik ajan kullanımının yasaklanması bir çözüm gibi<br />
görünmemektedir. Bunların kullanımının önlenmesi için henüz uluslararası bir uzlaşı<br />
oluşturulamamıştır.<br />
Türkiye’de anabolizan kontrolü ithal edilen etlerde yapılırken, yurt içindeki besi<br />
çiftliklerinde tam olarak yapılmamaktadır. Ülkemizde de, et üretiminde hormonal anabolik<br />
maddelerin kullanımı belirlenmiştir. Zerenol’ün bazı erkek çiftlik <strong>hayvan</strong>larından<br />
biyokimyasal parametreler ve doğrudan verim özellikleri üzerine etkilerinin belirlenmesi<br />
amacıyla bazı araştırmalar yürütülmesine karşın, erkek keçilerde özellikle cinsel olgunluk<br />
dönemi öncesi anılan parametrelere yönelik olarak gerçekleştirilen bir araştırmaya<br />
rastlanmamıştır. Elazığ ve çevresinde yaygın olarak keçi yetiştiriciliği yapılmakta ve bu<br />
<strong>hayvan</strong>ların besi sonrası kesimi yapılarak halkın et tüketimine sunulmaktadır. Piyasaya<br />
sürülen bu etlerde hormonal anabolizanların kullanılıp kullanılmadıkları bilinmemektedir.<br />
Bu çalışmada, Zeranol implantına bağlı olarak, cinsel olgunluk dönemi öncesindeki kıl<br />
keçisi oğlaklarında endokrinolojik ve bazı antioksidan parametreler, lipid peroksidasyon ve<br />
besi performanslarındaki değişimlerine ilişkin temel parametrelerin saptanması<br />
amaçlanmıştır. Böylece, gerek kıl keçilerinde gerekse diğer çiftlik <strong>hayvan</strong>larında doğrudan<br />
verim özelliklerinin iyileştirilmesine yönelik olarak geliştirilecek <strong>program</strong>larda bu<br />
özelliklere ait parametrelerden yararlanma çalışmaları ile birlikte endokrinoloji,<br />
biyokimyasal ve besi performanslarındaki değişikliklerle ilgili uygulamaya yönelik<br />
araştırmalara da önemli derecede katkı sağlanmış olunacaktır.<br />
8.2. Literatür Özeti:<br />
Son yıllarda yapılan birçok çalışmada bazı hormonların verilmesi ile besi<br />
<strong>hayvan</strong>larında, yemden yararlanma oranında, gelişmenin hızlandırılmasında ve daha<br />
kaliteli et ve daha az yağ artışında önemli başarılar elde edilmiştir.<br />
Dağoğlu ve Aksoy; Zeranol (α-zearalanol), bir mikotoksin olan Zearalenon’dan<br />
meydana gelen, steroid olmayan östrojenik etkili bir rezorsilik asid laktonu olduğun tespit<br />
etmişlerdir. Şanlı; Kaya ve ark Zeranol, büyümeyi hızlandırmak, beslenme etkinliğini<br />
arttırmak, amacıyla yetiştiricilikte kullanılmışlardır. Zeranol kullanımı, <strong>hayvan</strong>cılıkta<br />
verim artışına paralel olarak yetiştiricilikte ürün maliyetlerinin azalmasını ve kar marjının<br />
artışını beraberinde getirmesi dolayısıyla <strong>hayvan</strong>cılık alanında geniş kullanım sahası<br />
bulmaktadır.<br />
89
Özkurt Borazan ve ark; Türk ve Liman; Saraç; Zeranol güçlü östrojenik ve anabolik<br />
etki gösterdiğini; Alaçam, hiperöstrojenizmin tüm semptomlarını kapsayan muayyen<br />
reprodüktif ve gelişimsel bozukluklar doğurabildiğini ve özellikle genç boğalarda testeron<br />
sekresyonunu değiştirdiğini saptamışlardır. Ayrıca Zeranolün testeron sekresyonunu ve<br />
testis sekresyonu üzerindeki inhibitör etkisinin bir yaşına girmeden etkili olduğunu<br />
açıklamışlardır. Daha ileriki yaşlarda uygulanan zeranolün testisler üzerine fazla etkisi<br />
olmadığı görmüşlerdir.<br />
Türk ve Liman; Kayseri’de besi sığırlarında alınan idrar ve yem örneklerinde<br />
zeranol kalıntısına rastlanmıştır. Nazlı ve ark ise İstanbul’da satışa sunulan et ve et<br />
ürünlerinde bazı zeranol kalıntılarının varlığına rastlanmışlardır.<br />
Ülkemizde, 1734 sayılı Yem Yönetmeliğine göre yemlere anabolizan ilavesi<br />
yasaklanmıştır (Yem Kanunu ve Yem Yönetmeliği, 1973). Türk Gıda Kodeksi – Gıda<br />
Değeri Olan Hayvanlara Uygulanması Yasaklanan ve Belli Şartlara Bağlanan Hormon ve<br />
Benzeri Maddeler Hakkında Teblig’e göre; stilbenler, stilben türevleri, antitiroidal etkili<br />
maddeler, anabolizan amaçla kullanıma uygun steroidler, zeranol de dahil olmak üzere<br />
rezorsilik asit laktonlar ile agonist etkili maddelerin anabolik etki amacıyla uygulanması<br />
yasaklanmıştır (Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği, 2003). Sığırların semirtilmesi gayesiyle<br />
ABD’de gelişmeyi hızlandırıcı olarak 1969’den beri kullanılmaktadır.<br />
European Commission, FAO’nun 1987 ile 1997 yılında ve Avrupa Komisyonunun<br />
1999 yılında aldığı karara göre <strong>hayvan</strong>ların yenilebilir dokularında kabul edilebilir zeranol<br />
miktarı 2 ppb, karaciğerde 10 ppb olarak; kalıntıların bu düzeye inmesi için zeranol<br />
implantasyonunu takiben kuzularda 40 gün bekleme süresine gerek olduğu belirlenmiştir.<br />
Kaya ve Pirinçci; Alaçam; büyüme ajanı uygulanan <strong>hayvan</strong>ların bekletme süresi Zeranol<br />
için 70 gün, TBA için 60-65 gün, testosteron, progesteron ve östrojen için 60 gün, insan<br />
büyüme hormonu için 7-15 gün aradan sonra kesilmeleri ile elde edilen etlerin tüketilmesi<br />
sonucu halk <strong>sağlığı</strong> bakımından hiçbir problem kalmayacağını belirtmişlerdir.<br />
Field ve ark; besicilikte oldukça yaygın olarak kullanılan zeranolün büyüme<br />
performansı ve biyokimyasal parametreler üzerine etkilerinin belirlenmesi amacıyla bazı<br />
araştırmalar yapmışlardır.<br />
8.3. Materyal ve Metot:<br />
Araştırmada, sütten kesilmiş 3- 4 aylık kullanılacak kıl keçi oğlakları<br />
kullanılacaktır. Hayvanlar yaklaşık 10 günlük adaptasyon döneminden sonra her grupta<br />
10’ar adet olmak üzere 4 grupta toplam 40 adet kullanılacaktır. Zeranol , <strong>hayvan</strong>ların<br />
kulak derisi altına yerleştirilen bir pelet (kulak implantı) ile yapılacaktır.<br />
1. Grup: Kastre edilmiş + Zeranol verilmiş <strong>hayvan</strong>lar<br />
2. Grup: Kastre edilmemiş + Zeranol verilmiş <strong>hayvan</strong>lar<br />
3. Grup: Kastre edilmiş kontrol grubu oluşturan <strong>hayvan</strong>lar<br />
4. Grup: Kastre edilmemiş kontrol grubu oluşturan <strong>hayvan</strong>lar<br />
Uygulama yaklaşık 20 hafta sürecek. 1 ve 3 grup <strong>hayvan</strong>lar kastre edilecek.<br />
Ardından Zeranol uygulanacak. Gruplardaki <strong>hayvan</strong>lardan uygulama öncesi ve uygulamayı<br />
takiben 10. , 15., 20., 30. günlerinde V. jugularisden kan örnekleri alınacaktır. Kanda lipid<br />
peroksidasyon, glutatyon (GSH), glutatyon peroksidaz (GSH- Px), katalaz, E vitamini, A<br />
vitamini, β karoten; Reprodüktif olarak, LH ile Testesteron düzeylerinde oluşacak<br />
değişiklikleri ve üreme sisteminde meydana gelebilecek değişikler belirlenecektir. Ayrıca<br />
HPLC ile oluşan zeranol kalıntısına bakılacaktır. Bazı besi performanslarından günlük<br />
canlı ağırlık artışı (kg), besi sonu canlı ağırlık (kg), karkas randımanı (%), göz kası alanı<br />
(cm 2 ) ölçülerek değerlendirilecektir.<br />
Kan örneklerinde; E vitamini Kayden ve ark. metoduna göre (Shimadzu UV-120-01<br />
Spektrophotometer Japan) spektrofotometresi ile ölçülecektir. Lipit peroksidasyonun son<br />
90
ürünü olan malondialdehid (MDA) Matkovics ve ark. tarafından modifiye edilen Placer ve<br />
ark. yöntemine göre spektrofotometre ile belirlenecektir. A vitamini ve Β-karoten düzeyleri<br />
Suzuki ve Katoh’nın tarif ettiği şekilde tespit edilecektir. LH ve Testesteron Coat- A-<br />
Count ticari kiti ile otoanalizörde ölçülecektir. GSH-Px aktivitesi düzeyi Lawrence ve ark.<br />
tarif ettiği şekilde belirlenecektir. GSH düzeyi Sedlak ve Lindsay ‘ın tarif ettiği şekilde<br />
ölçülecektir. Katalaz enzimi tayini Goth ‘un tarif ettiği şekilde yapılacaktır. Kan serumu<br />
protein konsantrasyonu Gornal ve ark. tarif ettiği şekilde biüret yöntemi ile belirlenecektir.<br />
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Araştırma sonucu elde edilen bulgular ışığı altında zeranol tarafından vücutta<br />
oluşacak oksidatif etki sonucu oluşan hasar düzeyi; büyüme performansına etkisi;<br />
reprodüktif ve gelişimsel bozukluklara etkisi hedeflenmiştir.<br />
Ayrıca ülkemiz ekonomisine önemli katkısı olan keçi besiciliğinde bazı<br />
anabolizanların yemden yararlanma oranında, gelişmenin hızlandırılmasında, daha kaliteli<br />
et ve daha az yağ artışının olup olmadığının belirlenmesi amaçlanmıştır.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Dr. Mehtap ÖZÇELİK Biyokimya Doktoralı<br />
9.2. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Yrd. Doç. Dr. Zeki ERİŞİR Zootekni Yrd. Doç.<br />
9.3. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Yrd.Doç.Dr. Atilla YILDIZ Doğum Yrd. Doç.<br />
9.4. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Fulya BENZER Biyokimya Doktoralı<br />
9.5. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Halil ŞİMŞEK Fizyoloji Doktoralı<br />
9.6. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Doç. Dr. Mine Erişir Biyokimya Doçenti<br />
9.7. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Osman GÜLER Toksikoloji-Farmakoloji<br />
9.8. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Bülent TAŞDEMİR Biyokimya Doktoralı<br />
9.9. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Yrd.Doç.Dr. S. Ebru BÜYÜKTUNCEL Kimya<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Spektrofotomere, soğutmalı santrifüj, normal<br />
santrifüj, çalkalayıcı benmari, vortex , HPLC vb.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım : F.Ü. Tıp Fak. Biyokimya Lab<br />
Otoanalizör<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri:<br />
1- Tavuklarda Ornithobacterium rhinotracheale İle Oluşturulan Deneysel Enfeksiyonlarda<br />
Kültür, PCR İle Tespiti ve Biyokimyasal Parametrelerdeki Değişikliklerin Saptanması,<br />
2- Tavuklarda Deneysel Salmonella enteritis Enfeksiyonlarda Etken Saptanması ve<br />
Antibiyotik Kullanımının Bazı Biyokimyasal Parametreler Üzerine Etkisi;<br />
3- Bal ve Polenin Kadmiyum Verilen Sıçan(Rat)’lardaki Lipit Peroksidasyonu Üzerine<br />
Antioksidan Etkileri;<br />
4- Çörek Otu Tohumunun Kurşun Verilen Sıçan(Rat)’lardaki Lipit Peroksidasyonu<br />
Üzerine Antioksidan Etkisi isimli araştırma projeleri yürütülmektedir. Ayrıca laboratuara<br />
normal olarak gelen numunelerin rutin analizleri yapılmaktadır<br />
91
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI 1000<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
17000<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI -<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
-<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
2000<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
-<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
-<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA) -<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER -<br />
TOPLAM 20 000<br />
IV. 2007 YILI YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI:<br />
06.1.3.04 Laboratuvar gereçleri alımları : 1000 YTL<br />
06.2.3.01 Gıda ürünleri, içecekler ve tütün alımları : 8000YTL<br />
06.2.6.01 Kağıt ve kağıt ürünleri alımı : 7500 YTL<br />
06.2.7.01 Kimyevi madde ile kauçuk ve plastik ürün alımları: 500 YTL<br />
06.2.9.01 Diğer alımlar :1000 YTL<br />
06.5.4.01 Yakacak alımları : 500 YTL<br />
06.5.4.02 Akaryakıt ve yağ alımları : 1000 YTL<br />
06.5.4.03 Elektrik alımları : 300 YTL<br />
06.5.5.01 Posta ve telgraf giderleri : 200 YTL<br />
06 Toplam :20000 YTL<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
Ocak 2009 -Mart 2009 Altyapı hazırlıklarının yapılması, kimyasal alımlarının<br />
başlatılması<br />
Nisan 2009- Mayıs 2009 Hayvan Alınması, Uygulamanın başlaması<br />
Mayıs 2009-Eylül 2009 Deneysel Aşama tamamlanacak<br />
Ekim 2009 Hayvanların Kesimi<br />
Ocak 2010- Ocak 2011 Analizlerin yapılması, sonuçların değerlendirilerek bitirme<br />
92
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1- Şanlı Y. Gelişmeyi hızlandırıcı maddeler. Veteriner Klinik Farmakoloji İlaçla Sağaltım<br />
İlkeleri. Medisan. Ankara 1999, ss 711-718 .<br />
2- Alaçam E. Hormonların Klinik Kullanımları. Evcil Hayvanlarda Doğum ve İnfertilite.<br />
Medisan, Ankara1997. 31-44.<br />
3- Saraç B. Dietilstilbestrol ve Zeranol Kalıntılarının Gaz Kromotografi Yöntemiyle<br />
Deneysel olarak Tavşanlar ile Mezbahalarda Kesilen Hayvanların Doku ve Organlarında<br />
Araştırılması. Doktora Tezi, İstanbul Üniv. Sağlık Bilimler Enstitüsü. İstanbul 1997.<br />
4- Türk E., Liman B. C.Kayseri’de Sığır İdrarlarında ve yemlerde Zeranol’un ELİSA ve<br />
İnce Tabaka Kromotografi ile Kantitatif Analizi. Erc. Üniv. Sağ. Bil. Derg. 13 (1) 21-<br />
25,2004.<br />
5- Gornal A. G., Bardawill C. J and David M. M. Determination of serum proteins by<br />
means of the biüret reaction. J. Biol. Chem. 1975, 177: 751.<br />
6- Goth I. A simple method for determination of serum catalase activity and revision of<br />
reference range. Clin. Chim. Acta. 1991, 196: 143–152.<br />
7- Kayden H. J., Chow C. K. and Bjarnson L. K. Spectrophotometric method for<br />
determination of tocopherol in red blood cells. J. Lip. Res. 1973, 14: 533–540.<br />
8- Lawrence R. A. and Burk R. F. Glutathione peroxidase activity in selenium-deficient<br />
rat liver. Bioch. Bioph. Res Commun. 1976, 71: 4, 952–958.<br />
9- Matkovics B., Szabo I. and Varga I. S. Determination of enzyme activities in lipid<br />
Peroxidation and Glutathione Pathways (in Hungarian). Lab. Diag. 1988, 15, 248–249.<br />
10- Dağoğlu, G., Aksoy, A.: Hayvansal üretimde zeranol. Yüzüncü Yıl Üniv. Sağlık<br />
Bilim. Derg., 1995; 1: 103-108.<br />
11- FAO/WHO : Food additivies. Thırty Second Meeting, 1987, 15-23 june Roma.<br />
12- Field AR, Snowder DG, Maiorano G, Mccormick JR, Riley LM. Growth and<br />
slaughter charateristics of ram and wether lambs ımplanted with zeranol. J Anim Sci 1993,<br />
71: 631-635.<br />
13- Kaya, S., Pirinçci, İ. ve Bilgili, A. Pharmacology with Veterinary Application (in<br />
turkish). Cilt 2, Yayın Serisi No: 28, 1997, Ankara, s 259-267.<br />
14- Nazlı B., Çolak H., Aydın A. and Hampikyan H. The presence of some anabolic<br />
residues in meat and meat products sold in İstanbul Turk J. Vet. Anim. Sci. 2005, 29 691-<br />
699.<br />
15- Ö. Borazan, G. Karagül, H. Çelik, S. Ünal, N. Pekcan, M. ve Sel, T. Determination<br />
of zeranol residues and the serum testosterone oestrogene and progesterone levels in lambs<br />
around Ankara region Ankara Üniv Vet Fak Derg, , 54, 7-10,<br />
16-Suzuki J, Katoh N. A Simple an cheap methods for measuring serum vitamin A in<br />
cattle usingy only a spectrophotometer. Jpn Vet Sci 1990; 52 (6): 1282–1284.<br />
17- Sedlak J. and Lindsay R. H. C. Estimation of total protein bound and nonprotein<br />
sulfhydryl groups in tissue with Ellmann’s reagent. Anal Biochem. 1968, 25: 192–205.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı<br />
İmza<br />
Tarih<br />
14.1.Proje Lideri : Dr. Mehtap ÖZÇELİK<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Ünal KILINÇ<br />
14.3. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : F.Ü Vet. Fak. Biyokimya A.B.D.<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : F.Ü Sivrice MYO<br />
14.5. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : İ. Ü. Ecz. Fak Analitik Kimya A.B.D.<br />
93
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI: Ege Bölgesi İllerinde Balarılarının Önemli Bakteriyel ve Paraziter<br />
Hastalıklarının Yaygınlığının Araştırılması.<br />
“The Investigation of the Prevalence of Important Bacterial and Parasitic Diseases of<br />
Honeybees in the Provinces of the Aegean Region.”<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Bornova Veteriner Kontrol ve Araşt. Enstitüsü<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Dr. Ayşen BEYAZIT<br />
Kurumu : Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Araştırma Fırsat Alanı: Kanatlı ve Küçük Evcil<br />
Hayvancılık A-13<br />
Araştırma Programı : Kanatlı ve Küçük Evcil<br />
Hayvan Hastalıkları<br />
A-13.P-01<br />
5. PROJE SÜRESİ : 24 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : 01.01.2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : 01.01.2011<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu araştırmada Ege bölgesinde; başta Muğla olmak üzere, İzmir, Denizli, Aydın,<br />
Manisa ve Kütahya illerinde yetiştirilen balarılarında; önemli bakteriyel ve paraziter<br />
hastalık etkenlerinden Amerikan yavru çürüklüğü (AYÇ) hastalığı, Avrupa yavru<br />
çürüklüğü (Av.YÇ) hastalığı, kireç hastalığı, nosemosis, varroosis ve acarosisin<br />
yaygınlığının araştırılması amaçlanmıştır.<br />
Numuneler; % 50 prevalans beklentisi ile %95 güven seviyesinde %10 doğruluk<br />
aralığında, bölgedeki tüm arıcıların oluşturduğu listeden basit rastgele örnekleme<br />
yöntemiyle seçilecek olan 384 arı işletmesinden örnekleme yapılarak alınacaktır. Araştırma<br />
materyali olarak her işletmeyi temsilen işletmedeki koloni sayısı dikkate alınarak en az 4<br />
koloniden ve her bir koloniden yeteri miktarda yavrulu petek, kabartılmış eski petek ve<br />
ortalama 300 kadar arı, alınarak laboratuvara getirilecek, gerekli ekimler ve mikroskobik<br />
muayeneler yapılarak hastalık etkenlerinin izolasyon ve identifikasyonları yapılacak, bölge<br />
arılarında bakteriyel ve paraziter önemli hastalık etkenlerinin yaygınlığı tespit edilecektir.<br />
Abstract: In this research project, investigation of the prevalence of important bacterial<br />
and parasitic diseases such as American Foulbrood Disease, European Foulbrood Disease,<br />
Chalkbrood Disease, Nosemosis, Varroaosis and Acarosis in the honey bees cultivated in<br />
94
İzmir, Denizli, Aydın, Manisa, Kütahya provinces and especially in Muğla province is<br />
aimed.<br />
The samples will be taken with simple random sampling method using the list of all<br />
beekeepers of the region, from 384 apiaries with 95 % confidence rate and 10% accuracy<br />
interval and an expectation of 50% prevalence rate. After taking the number of colonies in<br />
every apiary into consideration and sampling from at least 4 colonies and from a sufficient<br />
number of brood combs, an average number of 300 bees, and moulded old combs as<br />
research material, these will be transported to the laboratory, necessary cultivation and<br />
microscobic examination will be carried out for the isolation and identification of the<br />
disease agents, and the prevalence of important bacterial and parasitic disease agents in the<br />
bees of the region will be determined.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER: Balarısı, yavrulu petek, temel petek, Amerikan yavru<br />
çürüklüğü, Avrupa yavru çürüklüğü, kireç hastalığı, varroosis, nosemosis, acarosis.<br />
KEY WORDS: Honeybee, brood comb, foundation comb, American foulbrood,<br />
European foulbrood, chalkbrood, varroosis, nosemosis, acarosis.<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Ege bölgesi, özellikle bu bölgedeki Muğla ili Türkiye arıcılığının en büyük<br />
potansiyellerindendir. Türkiye İstatistik Kurumu’nun 2006 yılı verilerine göre Ege<br />
bölgesinde1.111.648 adet kovan mevcut olup, Muğla ilinde 2007 yılı verilerine göre kayıtlı<br />
kovan varlığı 600.000 adet civarındadır. Muğla ilindeki bu sayı ülkemiz kovan varlığının<br />
yaklaşık % 20’sini oluşturmaktadır. Bilindiği gibi geçtiğimiz yıl gerek dünyada gerekse<br />
ülkemizde önemli oranda arı kayıpları olmuştur. Bu arı kayıplarının ise nedeni kesin<br />
olarak belirlenememiştir. Yüksek orandaki arı kayıplarının ortaya çıkışında küresel ısınma<br />
ve kirlenmeye bağlı çevre koşullarındaki olumsuz değişiklikler ve teknik bilgi yetersizliği<br />
yanında arı hastalıklarının da önemli etkisinin olabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle, bu<br />
araştırma Ege bölgesinde arı kayıplarının hangi hastalıktan ne oranda olduğunu belirlemek<br />
amacıyla planlanmıştır.<br />
8.2 Literatür Özeti: Ülkemiz arıcılığa uygun iklim ve bitki örtüsüne sahip ülkelerden<br />
biridir. Türkiye’nin arı varlığı bakımından Dünyada 2. sırada yer aldığı, 2002 yılı FAO<br />
verilerine göre koloni sayısının 4 milyon 115 bin adet olduğu bildirilmektedir (3, 6).<br />
Arı hastalıklarını ergin arıların ve larvaların hastalıkları veya her ikisinin hastalığı<br />
olarak gruplandırmak mümkündür. Bu araştırmada, Ege bölgesi arılarında bu<br />
hastalıklardan önemli bakteriyel ve paraziter hastalıkların yayılışı saptanmaya<br />
çalışılacaktır. Arıların hastalıklarından başlıcaları arasında; Amerikan yavru çürüklüğü<br />
(AYÇ) hastalığı, Avrupa yavru çürüklüğü (Av.YÇ) hastalığı, kireç hastalığı, nosemosis,<br />
varroosis ve acarosis gelmektedir ( 9, 10, 12, 14, 15, 26, 28).<br />
Bakteriyel hastalıkların en önemlilerinden biri; Amerikan yavru çürüklüğü<br />
hastalığıdır. Bal arısı (Apis mellifera) ve diğer arı türlerinin larvalarında Amerikan yavru<br />
çürüklüğü hastalığı etkeni olan Paenibacillus larvae supsp. larvae’nın Gram (+), sporlu,<br />
oldukça hareketli ve hızlı çoğalma yeteneğine sahip vejetatif şekli olan basil formu olgun<br />
arı ve yavrular için tehlike oluşturmaz, ancak besinlerle beraber kovanlara bulaştırılan,<br />
çevre şartlarına, ısıya ve dezenfektanlara dirençli sporları larvalarda hastalığa neden olur<br />
(5, 9, 17, 28). Amerikan yavru çürüklüğü hastalığı Ülkemizde ihbarı mecburi bir hastalıktır<br />
(2).<br />
Bulaşma; arıcılar, temel petekler, temel petekte oğul ve kolonilerin birleştirilmesi, hastalık<br />
etkeni taşıyan ergin arılar, yağmacılık, sağlam arıların hastalıklı bölgeye girmeleri, bulaşık<br />
eski kovanların yetersiz sterilizasyon ile tekrar kullanımı, kontamine bal ve polenlerin arı<br />
95
gıdası olarak kullanımı ile olur. Ölü larvalar önce donuk beyaz, açık kahve, koyu kahve ve<br />
sonunda siyah renge dönerler. Larva çikolata rengi aldığında bir kibrit çöpü sokulup<br />
çekilirse iplik şeklinde 2.5-10 cm kadar uzayabilir (26, 28).<br />
Amerikan yavru çürüklüğü hastalığı dünyanın her yerinde yaygın olarak<br />
görülmektedir (26, 28). Ülkemizde; Kaftanoğlu ve ark. (12), 1995 yılında 47 ilde yaptıkları<br />
anketlerde AYÇ hastalığının ortalama % 24.1 oranında yayılış gösterdiğini belirtmişlerdir.<br />
Aydın ve ark. (7), yaptıkları bir çalışmada, Türkiye’nin değişik bölgelerinden toplanan 327<br />
adet balın 45’inde (%13.76) B. larvae izole ettiklerini bildirmişlerdir. Akmaz (1), Adana<br />
yöresinde, 300 adet petek numunesinin 65’inde (% 21.6) P. larvae izole etmiştir. Çakmak<br />
ve ark.(11), Güney Marmara Bölgesinde 217 arı kolonisinin hiçbirinde AYÇ etkeni tespit<br />
etmediklerini bildirmişlerdir.<br />
Sıralı ve Doğaroğlu (19), Trakya bölgesinde yaptıkları ankette arı larvalarının %<br />
14.4’ünde, Soysal ve Gürcan (23), Tekirdağ ilinde % 15’inde, Yaşar ve ark. (27),<br />
Karadeniz bölgesinde %18.33’sinde, Şahinler ve Gül (20), Hatay yöresinde % 22’sinde<br />
yavru çürüklüğü hastalığı görüldüğünü bildirmişlerdir.<br />
Önemli bir diğer bakteriyel hastalık olan Avrupa yavru çürüklüğü hastalığı, arıların<br />
larvalarının hastalığı olup, larva 4-5 günlük iken enfekte ederek ölümüne neden<br />
olmaktadır. Hastalığın asıl etkeni Melisococcus pluton olup, Paenibacillus alvei,<br />
Paenibacillus laterosporus ve Streptococcus faecalis; M. pluton ile birlikte bulunur ve<br />
sekonder etkendirler. Melisococcus pluton Gram (+), sporsuz kok olup, P. alvei Gram (+),<br />
basil ve sporlu bakterilerdendir (5, 12, 14, 17, 28). Hastalık larvanın beslenmesi sırasında<br />
işçi arılar tarafından bulaştırılır. Petek gözü kapanmadan 3 gün önce larva ölür, rengi<br />
beyazımtraktan kahverengine dönüşür. Açık gözlerdeki larvalar kıvrık halde görülür ve<br />
tracheal sistemlerinin görünür hale gelmesi bu hastalık için semptomatiktir (5, 14, 15, 17,<br />
Avrupa yavru çürüklüğü hastalığı daha çok yazın ilk dönemlerinde görülmekte<br />
olup, dünyanın birçok ülkesinde yayılış göstermektedir (9, 28). Türkiye’de yapılan<br />
çalışmalarda AvYÇ hastalığını; Şimşek ve Özcan (22), Elazığ yöresinde 110 arı<br />
işletmesinden aldıkları 250 örneğin 12’sinde klinik bulgular gözlemişler, bunların 8 (%<br />
3.2)’inde Paenibacillus alvei izole ve identifiye ettiklerini bildirmişlerdir. Çakmak ve<br />
ark.(11), Güney Marmara bölgesinde 217 arı kolonisinin % 5’inde M. pluton identifiye<br />
etmişlerdir. Soysal ve Gürcan (23), yaptıkları anket çalışmasında Tekirdağ ilinde Avrupa<br />
yavru çürüklüğü hastalığının % 9 oranında yayılış gösterdiğini bildirmişlerdir.<br />
Özakın ve ark. (16), 2003 yılında Bursa ve Yalova yöresinde yaptıkları<br />
çalışmalarında yavru çürüklüğü şüpheli 24 farklı arılıktan eski petek ve 11 marka ticari<br />
hazır petekten aldıkları numunelerde yaptıkları çalışmalarında eski peteklerin tamamında<br />
bir veya birden fazla bakteriyel ve fungal etkene rastlamışlar, ticari peteklerin 6’sında (%<br />
54.5) etken izolasyonu yapılmış, 5’inde (% 45.5) herhangi bir etken tespit etmemişler,<br />
incelenen örneklerin hiçbirinde Amerikan yavru çürüklüğü ve Avrupa yavru çürüklüğü<br />
etkenleri saptamamışlardır. Sonuçları insan ve arı <strong>sağlığı</strong> yönünden değerlendirmişlerdir.<br />
Arıların kireç hastalığı, Ascosphaera apis tarafından arı larvalarının derilerinin<br />
mantar miselyumları ile kaplanması sonucu, mumyalaşmaya ve yavru ölümlerine neden<br />
olan fungal bir hastalıktır. Kireç hastalığı ilk defa Almanya’da 1913 yılında görülmüş,<br />
sonraki yıllarda ABD, Japonya, Yugoslavya ve İran’da tespit edilmiştir. Türkiye’de<br />
Ankara’nın Kazan ilçesinde 1988 yılında mumya larvalardan Ascosphaera apis izole<br />
edilmiş, 16 ay sonra bütün coğrafi bölgelere hızla yayılmıştır. Hastalık arıcılığımızı tehdit<br />
etmekte ve ekonomik kayıplara neden olmaktadır. (9, 10, 13, 14, 26, 28).<br />
Türkiye’de balarılarında kireç hastalığını; Yaşar ve ark. (27), Karadeniz bölgesinde<br />
% 18.33, Aydın ve ark. (8) Güney Marmara bölgesinde % 11, Çakmak ve ark. (11), yine<br />
Güney Marmara bölgesinde % 26, Sıralı (18), Trakya bölgesinde % 26.4, Sıralı ve<br />
Doğaroğlu (19), Trakya bölgesinde yaptıkları ankette % 36.3, Soysal ve Gürcan (23)<br />
96
Tekirdağ ilinde % 20, Şahinler ve Gül (20) Hatay yöresinde % 0.01 oranında<br />
belirlemişlerdir.<br />
Arılarda önemli kayıplara neden olan nosemosisin etkeni, ergin arıların mide<br />
bağırsak epitel hücrelerine yerleşerek çoğalan, sindirim siteminin bozulmasına yol açan,<br />
Nosema apis adı verilen ve enfekte arıların dışkıları ile bulaşan bir protozoondur.<br />
Hastalıkta, hazımsızlık ve karında şişlik olup, dışkı koyu sarı-kahverengi ve kötü<br />
kokuludur. Etken doğada yaygın olup, bal ve petekte bir yıl kadar canlı kalır (9, 10, 26,<br />
Türkiye’de yapılan çalışmalarda bal arılarında; Sıralı ve Doğaroğlu (19), Trakya<br />
bölgesinde yaptıkları anket çalışmasında % 6.5, Soysal ve Gürcan (23), Tekirdağ ilinde %<br />
9 nosemosis görüldüğünü, Çakmak ve ark. (11), Güney Marmara bölgesinde % 24, Şimşek<br />
(21), Elazığ yöresinde % 8.77, Topçu ve Arslan (24), Kars yöresinde % 15.74 oranında<br />
Nosema apis tespit ettiklerini bildirmişler, Şahinler ve Gül (20), 2003 yılında Hatay<br />
yöresinde bulunan arıcılık işletmelerinde nosema hastalığına hiç rastlamadıklarını<br />
belirtmişlerdir.<br />
Varroosise neden olan, son yıllarda bazı araştırıcılar tarafından V. destructor olarak<br />
isimlendirilen Varroa akarı Varroa jacobsoni oudemans; bal arılarının larva, pupa ve<br />
erginleri üzerinde yaşayan, kısa zamanda çoğalan ve uzun süre dikkati çekecek bir belirti<br />
göstermeksizin arının hemolenfini emerek beslenen tehlikeli bir dış parazittir. Üzerinde<br />
bulunduğu arının ölümüne sebep olması nedeniyle dünya ve ülkemiz arıcılarını yakından<br />
ilgilendirir (9, 10, 17, 25, 26, 28). Ergin dişi Varroa, koyu kızıl kahve veya koyu<br />
kahverenginde, enlemesine oval şekilde, yaklaşık 1.2 mm uzunlukta ve 1.5 mm genişlikte bir<br />
parazittir (5, 28).<br />
Bu akar Güneydoğu Asya’dan yayılmıştır. Bulaşması ve yayılması; gezginci<br />
arıcılık, kaçan oğullar, koloni ve ana arı satışları ile hızlanmıştır. Dünyada yalnızca<br />
Avustralya kıtasında henüz bulunmadığı bildirilmektedir. Ülkemize 1976 yılında<br />
Bulgaristan’dan girdiği tahmin edilen parazit, ilk defa 1978 yılında Ege’de İzmir<br />
yakınlarındaki kolonilerde saptanmıştır. 1980 yılına kadar kaybedilen toplam koloni<br />
sayısının 600.000, ürün kaybının ise 7.000-7.500 tona ulaştığı tahmin edilmektedir.<br />
Ülkemizde bulaşık olmayan kovan kalmamıştır (9, 10, 25, 26, 28).<br />
Türkiye’de Varroa’nın balarılarındaki yayılışını; Sıralı (18), Trakya bölgesinde %<br />
64.2, Soysal ve Gürcan (23), Tekirdağ ilinde % 47, Çakmak ve ark. (11), Güney Marmara<br />
bölgesinde % 35, Aydın ve ark. (8), yine Güney Marmara bölgesinde % 58, Yaşar ve ark.<br />
(27), Karadeniz bölgesinde % 89, Şahinler ve Gül (20), Hatay yöresinde % 32 oranında<br />
bildirmişlerdir. Şimşek (21), Elazığ yöresinde; kovan dip tahtası örneklerinde % 25.61,<br />
ergin arılarda % 6.31 ve petekte % 14.38 oranında Varroa jacobsoni tespit ettiğini<br />
bildirmiştir.<br />
Acariosis; ergin arıların solunum sisteminde yerleşerek bozukluklara yol açan ve<br />
arılarda önemli kayıplara neden olan Acarapis woodi’nin sebep olduğu paraziter bir<br />
hastalıktır. Tachea akarının Avrupa ve ABD’de kovan kayıplarındaki önemli etkenlerden<br />
biri olduğu belirtilmektedir ( 26, 28).<br />
Ülkemizde; Şimşek (21) Elazığ yöresinde ve Çakmak ve ark.(11), Güney Marmara<br />
bölgesinde yaptıkları çalışmalarda arılarda tracheal akar saptamadıklarını bildirmişlerdir.<br />
Acarapis woodi’nin Ülkemizde bulunduğuna dair bir yayına rastlanmamıştır.<br />
Bu araştırma Ege bölgesi arılarının, dolayısıyla Türkiye arılarının önemli<br />
bölümünün hangi hastalıklarla bulaşık ve ne oranda bulaşık olduğu konusunda ışık<br />
tutacaktır. Yapılan literatür taramalarında Ege bölgesinde arı hastalıklarının yayılışı ile<br />
ilgili olarak bir çalışmaya rastlanmamıştır. Özellikle Muğla ilinde Türkiye arıcılığının<br />
büyük bir bölümünün yapıldığı bu bölgede; arı hastalıklarının yayılışının araştırılması,<br />
gerek bu hastalıklarla etkin bir mücadele <strong>program</strong>ı uygulanabilmesi ve gerekse<br />
eradikasyon çalışmalarının yapılabilmesi için gereklidir.<br />
97
8.3. MATERYAL VE METOT:<br />
MATERYAL: Araştırma; saha çalışması ve laboratuvar çalışması olarak iki aşamada<br />
yürütülecektir.<br />
Saha çalışmasında; Ege Bölgesi illerinin (Muğla, Denizli, İzmir, Manisa, Aydın ve<br />
Kütahya illeri) Arı Yetiştiricileri Birlikleri, Muğla Üniversitesi Arıcılık Araştırma Merkezi<br />
ve Muğla İl Müdürlüğü işbirliği ile materyal temin edilecektir. Kovanların açılarak arılar<br />
ve larvalı peteklerden numune alınabilen genellikle yavrulama dönemi olan bahar (Mart-<br />
Mayıs) aylarında, ilk numune alımlarında illere gidilerek birlikte numune alınacaktır.<br />
Çalışma yapılan dönem tamamen yavrulama dönemi olduğu için kovan kontrolleri<br />
yapılırken yavru gözlerinin üşütülmemesine özen gösterilecektir. Numuneler; % 50<br />
prevalans beklentisi ile %95 güven seviyesinde %10 doğruluk aralığında, bölgedeki tüm<br />
arıcıların oluşturduğu listeden basit rastgele örnekleme yöntemiyle seçilecek olan 384 arı<br />
işletmesinden örnekleme yapılarak alınacaktır. Basit rastgele örnekleme yöntemi ile seçilen<br />
bölgedeki işletmelerden yine basit rasgele örnekleme metodu ile seçilen en az 4 koloniden<br />
numuneler alınacaktır. Her işletmeden yavrulu petek, ergin arılar, varsa mumya larvalar ve<br />
arı işletmelerinde kullanılan geçmiş yıllara ait eski (kabartılmış) peteklerden örnekler<br />
alınacaktır. Seçilen kolonide varsa olabildiğince çok ölü larva veya rengi bozulmuş petek<br />
gözü, mümkün olduğunca az bal içeren yavrulu petekler arasından alınan bütün petek<br />
şeklindeki marazi maddeler ve eski petekler gevşekçe kağıda sarılmış olarak ve mukavva<br />
kutular içinde laboratuvara gönderilecektir. Örnekler toplanırken seçilen kolonide; kovan<br />
önünden canlı ergin ve ölü ergin arılardan en az 300 arı örneği toplanacaktır. Arı örnekleri,<br />
mumya larvalar örnekleme sırasında grublandırılarak ayrı ayrı 500-1000 ml’lik<br />
kavanozlarda laboratuvara gönderilecektir. Peteklerin içinde bulunduğu kutular, ergin arı<br />
örnekleri ve larvalar bulunan kavanozlar üzerlerine gerekli bilgiler yazılıp etiketlenerek<br />
Enstitü’ye ulaştırılacaktır.<br />
Ayrıca işletme izni olan ve temel petek üretimi yapılan işletmelerden de ilkbahar ve<br />
sonbahar döneminde birer defa temel petek numunesi alınacaktır.<br />
Örnekleme kavanozları ve petekler laboratuvara geldiğinde buzdolabına konularak,<br />
+4 ºC’de tutularak herhangi bir bozulma ya da kontaminasyon oluşması önlenecektir.<br />
Aynı arıcılık işletmesinden gelen numunelere aynı numune numarası verilerek işlem<br />
yapılacaktır.<br />
Laboratuvar çalışmasında; yavru çürüklüğü hastalıklarında ve kireç hastalığında<br />
larvalı petekler, Varroosis’de hem larvalı petekler hem de ergin bal arıları, Nosemosis’de<br />
ve acarosiste ergin bal arıları materyal olarak kullanılacaktır.<br />
METOT:<br />
l. Amerikan Yavru Çürüklüğü Hastalığının Teşhis Metodu:<br />
a. Larva ve pupadan etken teşhisinde metot (4, 5):<br />
Besi yerleri: Etken izolasyonu için Brain Heart Infusion Agar (BHIA), BHITA, Nutrient<br />
Agar (NA), Nutrient Brouth (NB), Kanlı Agar (KA) kullanılacaktır.<br />
Etken izolasyonu ve identifikasyonu: Steril tüpe steril distile sudan 9 ml konularak üzerine<br />
5-10 adet larva ve/veya pupa konulacaktır. Vorteksle süspansiyonlar hazırlanarak, tüp oda<br />
sıcaklığında 10 dakika bekledikten sonra 80°C'de, 10-15 dakika benmaride tutularak<br />
sporlanmamış Paenibacillus larvae ve kontamine bakteriler öldürülecektir. 200 µl<br />
süspansiyondan alınarak steril pamuklu swapla yukarıda belirtilen agarlara ekimleri<br />
yapılacaktır. Kanlı agarlarda hastalık etkeninin vejetatif formu ürer. Besiyerleri 36-<br />
37°C’de 7 gün inkübe edilecektir. Koyun Kanlı Agara 3 mcg / ml ilave edilmiş Nalidixic<br />
asit ve pipemidi asit Paenibacillus alvei’nin üremesini engelleyecektir. Koloniler; Gram,<br />
Giemsa, Metilen blue ve Karbon fuksin ile boyanarak bakteriyoskopik muayeneleri<br />
98
yapılacaktır. Şüpheli kolonilerin saf kültürleri yapılarak identifikasyon için katalaz ve flagella<br />
testleri yapılacaktır.<br />
b. Balmumundan etken izolasyonu metodu: Balmumu 1:2 oranında Fosfat Buffer<br />
solüsyonu ile dilüe edilecektir. Süspansiyon 2000 g devirde 15 dakika santrifüj edilecektir.<br />
Sedimentin üzerindeki sıvı dökülüp, 9 ml steril distile su eklenecektir. Süspansiyon<br />
vorteksle karıştırılarak 80°C’de 10 dakika şoklanacaktır. NA, NB, KA, BHIA, BHITA,<br />
KCA ve Nalidixic asitli KKA' a ekimleri yapılarak, 36-37°C’de 7 gün inkübe edilecektir.<br />
Koloniler Gram, Giemsa, Metilen blue ve Karbon fuksin ile boyanarak bakteriyoskopik<br />
muayeneleri, şüpheli kolonilerin saf kültürleri yapılarak identifikasyon için katalaz ve<br />
flagella testleri yapılacaktır. Ekimlerde üreme olursa katalaz testi için yatık halde dökülmüş<br />
kanlı Columbia agara ekim yapılıp 37 °C' de inkübe edilecektir. 2-3 gün içerisinde yatık kanlı<br />
Columbia agardaki üremeden nigrosin boyama yapılarak Paenibacillus larvae flagellaları<br />
aranacaktır (4, 5).<br />
Biyokimyasal Konfirmasyon Paenibacillus larvae<br />
Katalaz -<br />
Flagella (Nigrosin) +<br />
testleri uygulanacaktır. Bu testler sonucunda Paenibacillus larvae identifiye edilecektir.<br />
İlave olarak Modifiye Asılı Damla Yöntemi ile Brownian Hareketi, Nitrat<br />
Redüksiyon Testi, Holst Süt Testi ile doğrulamalar yapılacaktır.<br />
II. Avrupa Yavru Çürüklüğü Hastalığının Teşhis Metodu (5, 22):<br />
Besi yerleri: Etken izolasyonu için KKA (%5-10 defibrine koyun kanı ilaveli), BHIA<br />
kullanılacaktır.<br />
Bakteriyoskopi: Fizyolojik tuzlu suda süspansiyon haline getirilen larvalı petek<br />
parçasından hazırlanan frotiler Gram ve nigrosin boyama yöntemleri ile boyandıktan sonra<br />
mikroskopta incelenecektir.<br />
İzolasyon: Her bir örnek için, 3-5 larvayı içeren petek parçası bir tüp içinde 5 ml. steril<br />
distile su ile ezilerek süspanse edilecektir. Oda sıcaklığında 10 dakika bekletildikten sonra,<br />
80ºC’deki su banyosunda 10-15 dakika tutularak, bazıları sporlu olan hastalık etkenlerinin<br />
sporsuz hale gelmesi sağlanacaktır. Tüpler vortekste karıştırılarak elde edilen<br />
süspansiyondan BHI agar, %5-10 defibrine koyun kanlı agar ve nalidiksik asit ilaveli<br />
(3µg/ml) koyun kanlı agara ekim yapılacaktır. Daha sonra petriler 37ºC’de aerobik ve %<br />
10 CO2’li etüvde 48-72 saat inkübe edilecektir.<br />
İdentifikasyon: Etkenlerin identifikasyonu amacı ile şüpheli kolonilerden bakteriyostatik<br />
muayeneler için preparat hazırlanarak mikroskopta incelenecek ve NB’a ekim yapılarak<br />
katalaz, Voges-Proskauer, sitrat, mannitol, jelatini eritme ve nişasta hidrolizi gibi<br />
biyokimyasal testler uygulanacaktır. Ayrıca Avrupa ve Amerikan Yavru Çürüklüğü<br />
hastalıklarını birbirinden ayırmak amacıyla Holst süt testi yapılacaktır.<br />
III. Kireç Hastalığının Teşhis Metodu:<br />
Laboratuvara gönderilen numuneler Patates Dextroz Agar, Maya Extrakt Agar ya<br />
da Malt Agarla hazırlanmış besi yerlerine ekilerek 28°C’de 48 saat inkube edilecek ve<br />
mikroskopik muayene yapılacaktır (21, 28).<br />
IV. Nosemosisin Teşhis Metodu:<br />
Nosema enfeksiyonu teşhisinde, ergin arının abdominal son segmenti koparılarak<br />
yavaşça çekilecek ve ventrikulus, malpigi kanalları, ince bağırsak ve rektum dışarı<br />
çıkarılacaktır. Sağlıklı bir arıda kahverengi olan ventrikulus nosemosis’de gri-beyaz renk<br />
alır ve oldukça kırılgandır. Ancak, asıl teşhis için sporların mikroskopta görülmesi<br />
gereklidir. Bu amaçla, en az 60 adet arı muayene için alınacaktır (4, 5).<br />
Natif muayene: Arıların abdomenleri ayrılarak 2-3 ml. serum fizyolojik içerisinde<br />
ezilecek ve oluşan süspansiyondan 3 damla kadar alınarak bir lam üzerine konulacak ve<br />
99
lamel kapatılarak ışık ya da faz-kontrast mikroskopta (40X’lık objektifte) natif olarak<br />
incelenecek, 5-7 µm uzunluk ve 3-4 µm genişlikteki sporlar tespit edilecektir (4, 5).<br />
Boyanarak muayene: Giemsa boyama; serum fizyolojikte hazırlanan örnekler havada<br />
kurutulup etanolle tespit edildikten sonra Giemsa ile 45 dakika boyanıp mikroskopta<br />
incelendiğinde sporların stoplazmaları maviye boyanmış olarak görülecektir (4, 5).<br />
Safranin boyama; yine örneklerden alınan süspansiyon öze ile alınarak lam üzerine<br />
sürülecek, alevde tespit edildikten sonra üzerine 2-3 damla safranin damlatılacaktır. Alevde<br />
ısıtılıp kaynatıldıktan sonra lam soğutulup distile su ile yıkanacaktır. Üzerine 1-2 damla<br />
metilen mavisi 20 dakika boyanıp mikroskopta incelenecektir. Nosema sporları safraninle<br />
kırmızıya boyanmış olarak görülecektir (28).<br />
Nosema enfeksiyonunun derecesinin saptanması: 10 adet yaşlı işçi arının abdomeni<br />
bir havan içinde 5 ml. su ile birlikte ezilecek, elde edilen süspansiyon iki katlı gazlı bezden<br />
dereceli bir santrifüj tüpüne süzülecektir. Ayrıca 5 ml. su ile havanın içi çalkalanarak kalan<br />
partiküller de aynı şekilde ikinci bir santrifüj tüpüne süzülecektir. Tüpler 800 g’de 6 dakika<br />
santrifüj edilecek, süpernatant uzaklaştırılacak ve tüpler 10 ml. seviyesine kadar tekrar<br />
suyla doldurulacaktır. Disposable bir pipet yardımıyla çökelti birkaç kez karıştırılarak<br />
sayım yapılacak özel bir sayma lamı üzerine (hemositometre) bu homojenattan konulacak<br />
ve lamel kapatılarak mikroskopta (40X) sayım yapılacaktır. Bir mikroskop sahasında; 20<br />
spordan az enfestasyonlar hafif, 20-100 arası orta ve 100’den fazla sporla enfestasyonlar<br />
şiddetli olarak değerlendirilecektir (4).<br />
V. Varroosisin Teşhis Metodu:<br />
Petek numunesinin muayenesi: Petek numunesi beyaz bir kağıt üzerine alınacak,<br />
bistüri ile petek gözlerine enlemesine kesitler yapılarak, iğne, pens yardımıyla parazitler<br />
aranacaktır. Larvalar alınarak stereo mikroskopta incelenecektir (4, 5).<br />
Arı numunesi: Muayene için laboratuvara ağzı kapalı kaplarda gönderilen canlı<br />
(hastalıklı) arı numuneleri üzerine sprey şeklinde eter püskürtülerek veya +4°C’de<br />
bekletilerek arıların ölmesi sağlanacaktır. İçine % 70’lik etil alkol konmuş kavanoza en az<br />
100 arı alınarak konacak ve kapağı kapatılarak 30 dakika çalkalanacak ve 10-15 dakika<br />
çökmesi için bekletilecektir. Arılar ve diğer kalıntılar dibe çökerken Varroa ların yüzeyde<br />
toplanması sağlanacaktır. İşlem sonrasında bütün materyal Varroa ve arı geçişine izin<br />
vermeyecek dar gözenekli bir süzgeçten geçirilerek, üstte kalan arı ve parazitler beyaz bir<br />
kurutma kağıdı üzerine alınarak parazitler sayılarak kaydedilecektir. Daha kağıt üzerindeki<br />
arılarda özellikle kanat dipleri, abdomen segmentleri ve tüyler arasında stereo mikroskopta<br />
Varroa parazitleri aranacak, toplanan parazitler stereo mikroskopta incelenerek teşhisleri<br />
yapılacaktır. Bu parazitler toplanarak küçük kapaklı şişelere konulacak, kolonilerin kesin<br />
parazit yükü hesaplanarak kaydedilecektir (13, 21).<br />
Bulaşıklık oranı (%) = Varroa sayısı / arı sayısı X 100 formülü ile hesaplanacaktır.<br />
VI. Acariosisin Teşhis Metodu:<br />
Arılarda görülen acariosis etkeni Acarapis woodi’nin teşhisinde, şüpheli kolonideki<br />
semptom gösteren arılar arasından yaklaşık 50 adet random usulü ile örnekler seçilecektir.<br />
Canlı arılar ya etil alkol ile ya da -20ºC’de dipfrizde tutularak ölmeleri sağlanacaktır. Bu<br />
arılar insekt iğneleri ile uygun bir zemin üzerinde sabitlendikten sonra toraks bölümleri<br />
diseksiyon makas ve pensleri yardımıyla ayrılacaktır. Daha sonra bu kısım % 8’lik KOH<br />
içerisinde 37ºC’deki etüvde yaklaşık 1 gün süreyle bekletilecek, 18-20X büyütmedeki<br />
diseksiyon mikroskobunda incelenip ya da trachea’lar bir lam üzerine alınıp, üzerine su ya<br />
da gliserin damlatılarak daha büyük bir objektifle ışık mikroskobunda bu parazitler<br />
yönünden muayene edilecektir (4, 5).<br />
8.4.Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Bu araştırma sonucunda Ege Bölgesi balarılarında bakteriyel ve paraziter<br />
hastalıkların yayılışı belirlenerek, bulgular bu hastalıklarla ilgili hazırlanacak mücadele<br />
100
<strong>program</strong>larına ışık tutacaktır. Araştırma sonucundan potansiyel yararlanıcıların başında arı<br />
işletmelerinin sahipleri gelmekte olup, bölgedeki arı hastalıklarını ve yayılış oranını<br />
öğrenerek bu hastalıklarla daha etkin mücadele yoluna gidebileceklerdir. Temel petek<br />
üreten işletmelerden özellikle AYÇ hastalığı yönünden bulaşma olup olmadığı tespit<br />
edilecek, eğer varsa ilgili yönetmelik gereği sterilizasyon işlemlerinin yapılması<br />
sağlanarak, bu yolla bulaşmanın önüne geçilecektir. Arı yetiştiricilerinin talebi olduğunda<br />
onlara arı hastalıkları ve bu hastalıklarla mücadele konusunda eğitim verilebilecektir. Arı<br />
<strong>sağlığı</strong> aynı zamanda çeşitli arı ürünlerini tüketen halkın <strong>sağlığı</strong>nı da ilgilendirdiği için,<br />
özellikle bal tüketicileri potansiyel yararlanıcılar arasında yer almaktadır. Sağlıklı arı ve<br />
dolayısıyla kalıntısız bal üretimi; aynı zamanda gerek iç, gerekse dış pazarlarda satış ve<br />
ekonomiye katkı nedeniyle ülke ekonomisini de yakından ilgilendirmektedir.<br />
8.5. Önemli Araştırma Faaliyet Aşamaları<br />
İlk yıl laboratuarların hazırlığı ve Muğla İlinden ergin arı, yavrulu petek ve<br />
kabartılmış petek örneklerinin temininden sonra laboratuvar çalışmalarına başlanacak,<br />
bulgular kaydedilecektir. 2. yıl diğer illerdeki arı işletmelerinden ve temel<br />
petekişletmelerinden numuneler alınarak laboratuvara gönderilecek, laboratuvar<br />
çalışmalarından sonra tüm bulgular toplanarak çalışma sonlandırılacak ve yayın haline<br />
getirilecektir.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Dr. Ayşen BEYAZIT<br />
Konuyla İlgili Araştırma Deneyimi: 22 yıllık meslek deneyimi olup, Arı<br />
hastalıkları konusunda 1990 yılından itibaren gerek yabancı uzmanlardan, gerekse ülkedeki<br />
arı hastalıkları uzmanlarından eğitimler almış, doktora eğitiminde de kredi dersi olarak arı<br />
hastalıkları konusunda eğitim görmüştür. Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü’nde 1998 yılında Arı Hastalıkları Teşhis Laboratuvarının kurulmasında görev<br />
almış, bugüne kadar aynı laboratuvarın sorumluluğunu üstlenmiştir. Enstitüde arı<br />
hastalıklarının teşhisinin koordinasyon görevini yaparak ilgili bölüm laboratuvarları ile<br />
birlikte bu görevi yürütmektedir.<br />
9.2.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Dr. Seza ESKİİZMİRLİLER<br />
Konuyla İlgili Araştırma Deneyimi: Bakteriyoloji uzmanı ve Enstitü’nün Bakteriyoloji<br />
Bölümünün sorumlusu olup, 24 yıllık laboratuvar deneyimi vardır. Değişik <strong>hayvan</strong><br />
hastalıkları ile ilgili <strong>araştırmaları</strong> vardır. Arıların bakteriyel hastalıklarının teşhisi bu bölüm<br />
laboratuvarında yapılmaktadır.<br />
9.3.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Mehmet ÖZDEN<br />
Konuyla İlgili Araştırma Deneyimi: 8 yıllık laboratuar deneyimi vardır. 2007 yılı Ocak<br />
ayında E.Ü. Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji<br />
A.B.D.’nda doktora eğitimine başlamıştır. Twinning projesi kapsamında arı hastalıkları<br />
konusunda eğitim almıştır. 4 yıldır Bakteriyolojik Teşhis Laboratuvarında görev yapmakta<br />
ve bakteriyel arı hastalıklarının teşhisinde fiilen çalışmaktadır.<br />
9.4.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Ziya Necdet ERHAN<br />
Konuyla İlgili Araştırma Deneyimi: 1998-2004 yılları arasında Bitlis Tarım İl<br />
Müdürlüğü, Hayvan Sağlığı Şube Müdürlüğünde çalışmıştır. Bitlis ili, ülkemizde arıcılığın<br />
yoğun olarak yapıldığı illerden biridir. İlde bulunan arı kovanlarının sağlık taramaları ve<br />
kontrollerinde görev yapmıştır. Enstitünün Parazitoloji Bölümü Arı Hastalıkları Teşhis<br />
Laboratuvarında 1 yıldır görev yapmaktadır.<br />
9.5.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Veteriner Hekim Serra TUNALIGİL<br />
Konuyla İlgili Araştırma Deneyimi: 2001 yılında Ankara Üniversitesi Veteriner<br />
Fakültesinden mezun olduktan sonra Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümünde<br />
doktora <strong>program</strong>ına başladı. 2006 yılından bu yana Bornova Veteriner Kontrol ve<br />
101
Araştırma Enstitüsü Bakteriyoloji Bölümünde görev yapmaktadır. Bu bölümde arıların<br />
bakteriyel hastalıklarının teşhisi ile ilgili çalışmalar yapılmaktadır.<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım: Bu araştırma Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü’nün Parazitoloji ve Bakteriyoloji Bölümlerinde yürütülecektir. Her iki bölüm<br />
laboratuarlarında da bu araştırmayı yürütecek mevcut donanım bulunmaktadır ve yeterlidir.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım: Bu çalışmada saha çalışması da olup,<br />
arı kovanlarının açılıp materyal alımının yapılabilmesi için arıcılık alet ve malzemelerine<br />
ihtiyaç duyulmaktadır.<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri: İlgili<br />
bölümlerdeki genç Veteriner Hekimler doktora kredi eğitimlerini ve doktora tez<br />
çalışmalarını sürdürmektedirler. Ayrıca her iki bölümde de TAGEM Projeleri devam<br />
etmektedir.<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE<br />
MALZEME ALIMLARI<br />
2000<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE<br />
MALZEME ALIMLARI<br />
3000 2000<br />
03.3- YOLLUKLAR 1000<br />
03.4- GÖREV GİDERLERİ -<br />
03.5- HİZMET ALIMLARI<br />
03.6- TEMSİL VE TANITMA GİDERLERİ<br />
1000<br />
03.7- MENKULMAL, GAYRİMADDİ HAK<br />
ALIM, BAKIM VE ONARIM GİDERLERİ<br />
1000<br />
03.8- GAYRİMENKUL MAL BAKIM VE<br />
ONARIM GİDERLERİ<br />
-<br />
03.9- TEDAVİ VE CENAZE GİDERLERİ -<br />
TOPLAM 8000 2000<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI -<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
8000<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI -<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
-<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
500<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK<br />
ONARIM GİDERLERİ<br />
-<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
-<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA<br />
DIŞINDA)<br />
-<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER -<br />
TOPLAM 16 500 2 000<br />
102
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
BİRİNCİ YIL<br />
Araştırma Faaliyeti Zamanı<br />
Laboratuar Hazırlıklarının Yapılması 01.01.2009- 01.03.2009<br />
Muğla İlindeki Arı İşletmelerinden Ergin Mart 2009-Mayıs 2009<br />
Arı, Yavrulu Petek ve Kabartma Petek<br />
Örneklerinin Alınarak Enstite’ye<br />
Gönderilmesi<br />
Laboratuvar Çalışmalarının Yapılması Mart 2009-Aralık 2009<br />
İKİNCİ YIL<br />
Araştırma Faaliyeti Zamanı<br />
Laboratuar Hazırlıklarının Yapılması 01.01.2010- 01.03.2010<br />
Diğer illerdeki Arı İşletmelerinden<br />
Örneklerin alınması ve Temel Petek<br />
İşletmelerinden Numune Alınarak<br />
Enstitü’ye Gönderilmesi<br />
Mart<br />
2010-Eylül 2010<br />
Laboratuar Çalışmalarının Yapılması Mart 2010-Eylül 2010<br />
Verilerin Toplanarak Değerlendirilmesi ve<br />
Araştırmanın Sonuç Raporunun<br />
hazırlanması ve Yayın Haline Getirilmesi<br />
Eylül 2010-<br />
Aralık 2010<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1. AKMAZ, Ö. (2001). Adana yöresinde amerikan yavru çürüklüğü hastalığının yaygınlığı.<br />
Pendik Vet. Mikrobiyol. Derg. 32 (1-2): 55-60.<br />
2. ANON. (2001). Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, KKGM, Bal Arılarının Amerikan Yavru<br />
Çürüklüğü Hastalığına Karşı Korunma ve Mücadele Talimatı, Ankara.<br />
3. ANON. (2004). Dünya Hayvan Sağlığı Teşkilatı 2004 yılı teşhis kitapçığı.<br />
4. ANON. (2005) Final Report. Annex 3.5,Laboratory Method Collection. Twinning Project<br />
between Turkey and Germany. Support for the Alignment of Turkey with the EU Veterinary<br />
Acquins. Twinning No: TR02/IB/AG-01, Project No: TR 0203.05.<br />
5. ANON. (2006). OIE Manual of Standarts for Diagnostic Tests and Vaccines.<br />
6. ANON. (2006): Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü,<br />
Tarımsal Araştırma Master Planı Revizyonu. Araştırma Fırsat Alanları (AFA) Veri Değerlendirme<br />
Parorları ve Matriksler, Şubat 2006, Ankara.<br />
7. AYDIN, N., BÜLBÜL, H., YAVUZ, M.K., BIYIKOĞLU, G., YARALI., C. (1997).<br />
Tüketime sunulan ballardan ve hastalıklı kovanlardan alınan örneklerden Bacillus larvae<br />
izolasyonu ve antibiyotik duyarlılıklarının saptanması üzerinde araştırmalar. TAGEM Projesi,<br />
sonuç raporu.<br />
8. AYDIN, L., ÇAKMAK, İ., GÜLEĞEN, E, KORKUT, M. (2003). Güney Marmara Bölgesi<br />
Arı Hastalık ve Zararlıları Anket Sonuçları. Uludağ Arıcılık Dergisi, 3(1):37-40.<br />
9. BAILEY, L. (1981). Honey Bee Pathology. Academic Press, Inc. Ltd. LONDON.<br />
10. BAİLEY, L. ve BALL, B. V. (1991). Honey Bee Pathology.2nd Ed. Academic Press<br />
Limited, London, U. K., 183.<br />
11. ÇAKMAK, İ., A YDIN, L., GÜLEĞEN, A.E. (2002). Honeybee pest and disease in the<br />
Southern Marmara Region of Turkey. Sixth European Bee Conference, Cardiff, UK, 1-5 July 2002.<br />
Cab Abstracts, httb.www. cababstractsplus.org/AcNo=20053161517.<br />
12. KAFTANOĞLU, O., KUMOVA, H. ve ÖZKÖK, D. (1995). Türkiye’de balarısı<br />
hastalıklarının dağılımı, koloniler üzerindeki etkileri ve entegre kontrol yöntemlerinin<br />
uygulanması. TÜBİTAK, VHAG.<br />
103
13. KAR, S., KAYA, N., GÜVEN, E., KARAER, Z. (2006). Yeni geliştirilen tespit kabı ile ergin<br />
arılarda Varroa enfestasyonunun belirlenmesi. Uludağ Arıcılık Dergisi, 68-73.<br />
14. MORSE, R. A. and FLOTTUM, K. (1997). Honey Bee Pests, Predators and Diseases. Third<br />
Edition, Published by the A.I. Root Company, Medina, Ohio, USA.<br />
15. MORSE R. A. and NOWOGRODZKİ R. (1990). Honey Bee Pests, Predators and Diseases,<br />
2nd Ed. Cornstock Publishing Associates, London, 474.<br />
16. ÖZAKIN, C., AYDIN, L., ÇAKMAK, İ. ve GÜLEĞEN, E. (2003). Hazır ve eski peteklerin<br />
bakteriyolojik ve mikolojik yönden incelenmesi. Uludağ Arıcılık Dergisi, 27-30.<br />
17. SHİMANUKİ, H. and DAVİD, A. K. (2000). Diagnosis of Honey Bee Diseases. U. S.<br />
Deparment of Agriculture, Agriculture Handbook No. AH-690, 61 pp.<br />
18. SIRALI, R. (1993). Trakya bölgesi arıcılığı, sorunları ve çözüm yolları üzerine araştırmalar.<br />
Yüksek Lisans Tezi. Trakya Üniv.Fen Bilimleri Enstitüsü, Edirne.<br />
19. SIRALI, R. ve DOĞAROĞLU, M. (2005). Trakya bölgesi arı hastalıkları ve zararlıları<br />
üzerine anket sonuçları. Uludağ Arıcılık Dergisi, 5:71-78.<br />
19. ŞAHİNLER, N., GÜL, A. (2005). Hatay yöresinde bulunan arıcılık işletmelerinde arı<br />
hastalıklarının araştırılması. Uludağ Arıcılık Dergisi, 5: 27-31.<br />
20. ŞİMŞEK, H. (2005). Elazığ yöresi bal arılarında bazı parazit ve mantar hastalıklarının<br />
araştırılması. Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg., 52: 123-126.<br />
21. ŞİMŞEK, H., ÖZCAN, C. (2001). Elazığ Yöresinde Bulunan Arı İşletmelerinde Avrupa<br />
Yavru Çürüklüğü Hastalığının Araştırılması. Turk J Vet Anim Sci, 25: 929-932.<br />
22. SOYSAL, M.İ. ve GÜRCAN, E.K. (2005). Tekirdağ ili arı yetiştiriciliği üzerine bir<br />
araştırma. Tekirdağ Ziraat Fak. Derg., 2(2): 161-165.<br />
23. TOPÇU, B., ARSLAN, M.Ö. (2004). Kars Yöresindeki Balarılarında Nosemosisin<br />
Yaygınlığı. Uludağ Arıcılık Dergisi, 4:164-170.<br />
24. TUTKUN, E. (1991). Varroa Akarı (Varroa Jacobsoni Oudemans)’nın Biyolojisi ve<br />
Mücadelesi. Türkiye Kalkınma Vakfı, Kazan, Ankara.<br />
25. TUTKUN, E., İNCİ, A. (1992). Balarısı Zararlıları, Hastalıkları ve Tedavi Yöntemleri.<br />
Demircioğlu Matbaacılık, Ankara.<br />
26. YAŞAR, N., GÜLER, A., YEŞİLTAŞ, H.B., BULUT; G., GÖKÇE, M. (2002). Karadeniz<br />
bölgesi arıcılığının genel yapısının belirlenmesi. Mellifera, 2-3:15-24.<br />
27. ZEYBEK, H. (1991). Arı Hastalıkları ve Zararlıları. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Hayvan<br />
Hast. Araşt. Enst. Md., Etlik, Ankara.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Dr. Ayşen BEYAZIT 04.02.2008<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Necdet AKKOCA 04.02.2008<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar :-<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : Yard. Doç. Dr. Ali İhsan ÖZTÜRK<br />
Veli TÜRKMEN, Muğla Üniv. Arıcılık Araştırma Merkezi Müdürlüğü<br />
Vet. Hekim Cuma KAHRAMANOĞLU, Muğla İl Müdürlüğü<br />
Vet. Hekim Hüseyin KIŞLA, Muğla İl Müdürlüğü<br />
Ziya ŞAHİN, Muğla İli Arı Yetiştiricileri Birliği Yönetim Kurulu Başkanı<br />
Zir. Müh. Ercan ÖZKAN, İzmir İli Arı Yetiştiricileri Birliği Yönetim Kurulu Başkanı<br />
Nihat ÇOMAK, Denizli İli Arı Yetiştiricileri Birliği Yönetim Kurulu Başkanı<br />
Kadir KILIÇ Aydın İli Arı Yetiştiricileri Birliği Yönetim Kurulu Başkanı<br />
Zeynel Abidin ALINMAZ Manisa İli Arı Yetiştiricileri Birliği Yönetim Kurulu Başkanı<br />
Halit BALTA Kütahya Arı Yetiştiricileri Birliği Yönetim Kurulu Başkanı<br />
104
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma öncelik Puanı :<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI ( Türkçe/İngilizce):<br />
Orta ve Doğu Karadeniz Bölgesinde Tavukçuluk işletmelerinde ve satış noktalarında<br />
Helicobacter pylori’nin epidemiyolojisi ve kontaminasyon noktalarının konvansiyonel<br />
metodlar ve PCR ile araştırılması<br />
Investigation of contamination points and epidemiology of Helicobacter pylori in poultry<br />
farms and on the market in Middle and Eastern Blacksea Region by using microbiological<br />
conventional methods and Polymerase Chain Reaction (PCR)<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Samsun Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Yunus GÜR<br />
Kurumu : Samsun Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4 . Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Araştırma Fırsat Alanı: Kanatlı Hastalıkları<br />
Araştırma Programı :.A – 13. P - 01.<br />
5. PROJE SÜRESİ : 24 (yirmidört) Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : 01.01.2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : 01.01.2011<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Zoonoz hastalıklar insanlara oluşturdukları tehditler açısından her geçen gün önem<br />
kazanmakta olup, yapılan araştırmalara yenileri eklenmektedir.Artan nüfus ve değişen<br />
sosyo-ekonomik parametreler,zoonoz hastalıkların oluşmasında yine önemli sebeplerden<br />
birini oluşturmaktadır.<br />
Hayvan yetiştirme şartları,alternatif <strong>hayvan</strong>sal gıda üretim teknikleri ve bu üretim<br />
teknikleri sırasında insanların üretim materyalleriyle kontaminasyonda sıkı ilişkisi zoonoz<br />
hastalıkların ortaya çıkmasında ya da mevcut zoonoz etkenlerin tedaviye direnç<br />
kazanmalarında rol oynamaktadır.<br />
İlk defa histopatolojik olarak isimsiz şekilde tespit edilmesiyle mikrobiyoloji<br />
literatürüne giren bir bakteri,insanlarda bakteriyel bir inflamasyon olarak ifade edilmiştir.<br />
1989 yılında identifiye edilen, adı sonradan cins ismi değişikliğe uğratılarak günümüzdeki<br />
X<br />
X<br />
X<br />
105
haliyle literatüre girmiş olan Helicobacter pylori’nin bulaşma şekli üzerine çok sayıda<br />
çalışmalar yapılmıştır.<br />
Bu proje ile, Orta ve Doğu Karadeniz Bölgesindeki tavuk işletmelerinde ve piyasada<br />
satışa sunulmuş tavuk materyallerinden yapılacak örneklemelerle Helicobacter pylori’nin<br />
varlığı ve sağlık açısından oluşturduğu risk düzeyi belirlenecektir. Bu amaçla<br />
konvansiyonel mikrobiyolojik metotlar kullanılarak , hem izolasyon ve identifikasyonu,<br />
hem de PZR testi konfirme edilecektir. Söz konusu işletmelerde çalışan personellerde de<br />
aynı metodlarla çalışmalar yapılarak zoonoz ilişkisi tespit edilecektir.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER:<br />
Helicobacter pylori,PZR,tavuk işletmeleri<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Son yıllarda zoonoz karakterdeki hastalıklar, artan nüfusa,sosyo-ekonomik<br />
olumsuzluklara paralel olarak artış göstermektedir.Buna bağlı olarak zoonoz hastalıkların<br />
nüksü beraberinde sık ilaç kullanımına ve buna bağlı olarak da ilaçlara direnci<br />
şekillendirerek hastalıkların etkenlerinin enfekte kabiliyetlerini artırmaktadır.<br />
H.pylori enfeksiyonu gastrit, peptik ülser hastalığı ve mide kanseri ile büyük oranda<br />
ilişkisi olan ve dünya çapında insanlarda görülen en yaygın hastalıklardan biridir.H.pylori<br />
ve onun gastroduodenal hastalıklardaki rolünün keşfedilmesi, son yıllarda bakteriyoloji ve<br />
gastroenteroloji bilim dallarında yapılan önemli buluşlardan birisidir. H.pylori ‘nin neden<br />
olduğu aktif kronik gastrit dünyada en yaygın görülen bakteriyel<br />
infeksiyonlardandır.Dünya nüfusunun yarısından fazlası bu bakteri ile enfektedir. Tüm<br />
dünya nüfusunda enfeksiyon riski yaşla ve sosyoekonomik düzeyin düşüklüğü ile doğru<br />
orantılı olarak artmaktadır.Bugün,H.pylori’nin gastrit oluşumundaki nedensel<br />
rolünden,peptik ülser hastalığı ile ilişkisine ve gerek mide kanseri, gerekse MALT lenfoma<br />
gelişiminde bir ko-faktör oluşuna kadar olan patojenik önemi güvenilir bir biçimde ortaya<br />
konmuştur.<br />
Yapılan çalışmalar ile karnivor olarak kedi ve köpeklerde bu bakterinin oluşturduğu<br />
gastrit olgularına rastlanmıştır.<br />
Gelişmiş ülkelerde H.pylori seroprevalansı (% 10'dan) yeni yetişkinlerde % 70 'e,<br />
yetişkin bireylerde % 40'a, gastritlilerde % 80'e ve gastrit ve duodenal ülserlilerde % 90-<br />
100'e ulaşabilmektedir.Gelişmekte olan ülkelerde hemen hemen tüm çocuklar 10<br />
yaşlarında enfekte olmaktadırlar.<br />
Bunun yanında gıda kontaminasyonlarına bağlı oluşan zoonoz olgular büyük önem<br />
taşımaktadır.HACCP risk düzeyindeki oluşturalamamış güvenlik yetersizlikleri ve gıda<br />
üretimi sırasında oluşan kontaminasyonlar sonrasında şekillenen bulaşmalar, yeni güvenlik<br />
tedbirlerini beraberinde getirmiştir.<br />
Bu çalışma temel olarak, Helicobacter pylori’nin tavuk işletmelerinde,kesim<br />
sırasında ve kesim sonrasında kontaminasyon varlığını konvansiyonel bakteriyolojik ve<br />
PZR metodlarıyla belirleyerek ,halk <strong>sağlığı</strong> açısından oluşturduğu risk düzeyini ortaya<br />
koymayı amaçlamaktadır.<br />
106
8.2 Literatür Özeti:<br />
1893 yılında G. Bizzozero tarafından köpeklerin mide parietal hücre vakuolleri ve<br />
sitoplazmaları içerisinde, glandlarda spiral şeklinde mikroorganizmalar gösterilmiştir<br />
(1,3,4).<br />
H.pylori ile gastroduodenal patoloji arasındaki ilişki ilk defa 1979’da Robin<br />
Warren tarafından fark edilmiş, spiral bakterileri mide mukus tabakası altında saptamıştır.<br />
Mikroorganizma in vitro şartlarda ilk defa Berry Marshall tarafından 1982 yılında<br />
üretilmiştir (2). Morfolojik olarak Campylobacter’e benzediğinden Campylobacter-like<br />
bakteri adı verilmiş ise de, kimyasal ve ultrastrüktürel yapı yönünden Campylobacter<br />
grubundan tamamen farklı bulunmuştur. Bu bakteri,1984’de Marshall tarafından<br />
C.pyloridis olarak adlandırılmıştır(5). Marshall ve Warren, H.pylori enfeksiyonunun<br />
gastrik ve duodenal ülserle ilişkisi olduğunu göstermişlerdir (5,6). Bu mikroorganizma<br />
1987’de Campylobacter pylori adını almıştır(5).<br />
1989’da Goodwin ve ark. mikroorganizmayı Campylobacter cinsinden tamamen<br />
ayırmış; helikal yapısından ve sıklıkla midenin pilor bölgesinden izole edilmesinden dolayı<br />
“Helicobacter pylori “ adını vermişlerdir.<br />
H.pylori’nin rezervuarı kesinlik kazanmamıştır. Veteriner ve mezbaha işçilerinde<br />
prevalansın yüksek olması zoonotik bir rezervuar düşündürmüş, fakat delil<br />
gösterilememiştir. Evcil <strong>hayvan</strong> besleyenlerde prevalansın düşük olduğu, et yemeyenlerde<br />
de prevalans bakımından<br />
fark olmadığı görülmüştür. H.pylori dışı Helicobacter türleri bazı <strong>hayvan</strong>larda tesbit<br />
edilmiş fakat doğal <strong>hayvan</strong> rezervuarı saptanamamıştır.Ancak kedilerin doğal olarak<br />
rezervuar olabildikleri gösterilmiştir.(11) Doğal rezervuar insan gibi görünmektedir (1,16)<br />
Bulaşma yolu kesin olmayan H.pylori ‘de olası bulaşma yolları; oral-oral ve fekal–<br />
oraldir. Bulaşmanın insandan insana direkt yolla ve su kaynaklı olduğu yönündeki görüşler<br />
giderek artmaktadır (1,16,21,22).<br />
Bunun yanında büyükbaş <strong>hayvan</strong> midelerinden yapılan histopatolojik çalışmalar<br />
Helicobacter benzeri bakterilerin varlığını göstermiş,bu bakterinin zoonoz tehdit olarak<br />
düşünülmesi gerektiği bildirmiştir.(23)<br />
Fujimura S. ve ark. Japonya’da piyasadan örnekledikleri çiğ ve pastörize inek<br />
sütlerinden H.pylori varlığını PZR metodu ile analiz etmiş,çiğ sütlerde H.pylori<br />
kontaminasyonunu %72,2, pastörize sütlerde ise % 55 gibi ciddi oranlarda tespit<br />
etmiştir.(23)<br />
H.pylori’de de çevresel kontaminasyonun ilişkisi olduğu çeşitli çalışmalarla ortaya<br />
konmuştur.<br />
N. Queralt ve ark. insanlar tarafından oluşturulan çevresel fekal kirlenme ile<br />
H.pylori’nin ilişkisi araştırmış,örnekledikleri insan feçeslerinin %33’ ünde, çevresel olarak<br />
örnekledikleri kirli atık suların %66’sında,nehir sularının ise %11’inde H.pylori’nin<br />
varlığını göstermişlerdir.Aynı çalışmada kaynak sularında H.pylori kontaminasyonuna<br />
rastlanmamıştır.(22)<br />
Sosyo-ekonomik koşullarla da ilişkili olarak Peru’da yapılan bir çalışmada ev<br />
dışından sularını karşılayan kişilerde,su ihtiyaçlarını ev içinden karşılayana göre 3 kat<br />
yüksek Helicobacter enfeksiyon riski oluştuğu tespit edilmiştir.(11)<br />
H.pylori kolonizasyonu yüksek oranda yaşla ve coğrafik bölgeyle ilişkilidir.<br />
Erkekler ve kadınlarda kolonizasyon riski eşit oranlardadır.Gelişmiş ülkelerde erişkinlerin<br />
yarısı, gelişmekte olan ülkelerde ise toplumun % 80-90’ı bu bakteri ile infekte olmaktadır.<br />
Sosyo-ekonomik koşulların bozuk, aile birey sayısının fazla olduğu gelişmekte olan<br />
ülkelerde infeksiyon etkeni yaşamın ilk yıllarında alınmakta ve hayat boyu devam<br />
etmektedir. Bu ülkelerde nüfusun %80’i 20 yaşına kadar enfekte olmaktadır. Türkiye’de<br />
de durum aynıdır. Gelişmiş ülkelerde ise infeksiyon oranı 20 yaşına kadar % 10, 60 yaşın<br />
107
üzerinde % 50-60’dır.Tüm bilgiler infeksiyonun çocukluk çağında alındığını ve ileri<br />
yaşlara taşındığını göstermektedir (8, 16 ).<br />
Gıda kontaminasyonları üzerine ise Böhmler G. ve ark. taze süt ve piliç etinde<br />
H.pylori’ye rastlamamış, ancak bu gibi gıda ürünlerinin yetersiz hijyen sonrası bakteriye<br />
uygun ortam sağlayabileceği ve bu yolla enfeksiyon oluşturabileceğini belirtmişlerdir.(18)<br />
Türütoğlu H. ve ark. Burdur’da İvesi ırkı koyunlardan yaptıkları süt<br />
örneklemeleriyle yaptıkları bir çalışmada, H.pylori izole edememiş,ancak koyun sütlerinin<br />
bakteri transferinde büyük rol oynayabileceğini söylemiştir.(24)<br />
H.pylori mikroaerofiliktir (%10 CO2, %5 O2, %85 N2).Üremeleri için optimum<br />
sıcaklık 35–37°C’dir, ancak 42°C’de de gelişebilmektedirler.Yüksek nem oranının da<br />
gelişme üzerinde destekleyici bir etkisi olduğu görülmüştür (9). Kan ve serum içeren<br />
besiyerlerinde 4–7 günde 0,5-1 mm çapında düzgün kenarlı, pigmentsiz koloniler<br />
yapar.Zenginleştirilmiş brain-heart agarda 33–40°C’de ve pH: 6,6–8,4 arasında iyi ürer.<br />
Brain Heart infüzyon agar, Brucella Agar’da, Çikolata Agar,Colombia agar, Skirrow Agar<br />
gibi zenginleştirilmiş besiyerleri H.pylori ’nin üremesi için yeterlidir. Ayrıca besiyerinde<br />
% 0,2 aktif kömür bulunması üremeyi kolaylaştırır.Besiyerlerinde çeşitli antibiyotiklerin<br />
ilavesiyle seçicilik artar. Bu amaçla vankomisin (3–6 mg/ml) + amfoterisin B (2–6 mg/ml)<br />
+ trimetoprim (5-20mg/ml) + kolistin (25000U/I) + sefsulodin (5mg/ml) kombinasyonunun<br />
ilavesi önerilmektedir (8,13,14,15).<br />
Üremesinde zorluk göstermesi PZR identifikasyonunu aklımıza<br />
getirmektedir.Bugün için beşeri olgularda (tükürük,diş plağı,dışkı vb.) materyallerle<br />
kantitatif PZR identifikasyonu yapılabilmektedir.(22,23).<br />
PZR amplifikasyonunda çeşitli çalışmalarda çeşitli primerler<br />
kullanılmıştır.Bunlardan bakteri için özellikle spesifite gösteren özellik olan üreaz<br />
özelliğini kodlayan üç adet gen kullanılmıştır.Bunlar SSA(24 kDa),ureA,ureC (glmM)<br />
‘dir.İlk çalışmalarda ureA tek gen kullanıldıysa da bakterinin filogenetik çeşitliliği ve farklı<br />
gen yapıları, testlerde identifikasyonda yanlış negatif sonuçları önlemek için, son<br />
zamanlarda yapılan çalışmalarda birden fazla primer seti aynı anda kullanılmıştır.<br />
Andrey P.Lage ve ark. gastrik biyopsilerle yaptıkları PZR identifikasyonunda ureC<br />
ve cagA primerlerini tercih etmişlerdir.(16)<br />
Andrey P.Lage ve ark. aynı çalışmada ureC geni için annealingi 55 ◦ C’de 2<br />
dakikada sağlarken,cagA geni için ise annealingi 59 ◦ C’ de sağlamıştır.(16)<br />
Jang-Jih Lu ve ark.beş farklı PZR metodunu karşılaştırdığı bir çalışmada,ureC<br />
geninin spesifitesinin daha fazla olduğunu göstermiştir.(17)<br />
SI Smith ve ark. üç farklı PCR yöntemini karşılaştırmış,yöntemlerde ureA, glmM and 26kDa-SSA<br />
genlerini kullanmışlar,biyopsilerde 26 kDa-SSA genini,doğrudan çalışmalarda<br />
potansiyel bir değer taşıyabilecek gen olarak da cagA geninin kullanılmasının daha uygun<br />
olacağını tavsiye etmişlerdir.<br />
Song O. ve ark. Dental plak ve tükürüklerde yaptıkları çalışmalarda PZR ile %55-<br />
90 arasında başarı elde etmişlerdir.(20)<br />
8.3. MATERYAL VE METOT:<br />
Araştırmanın materyal kısmını Orta ve Doğu Karadeniz bölgesinde 6 ilde bulunan 40<br />
işletmeye ait 70 kümes oluşturacaktır. Çalışma materyalleri işletmelerden 2 ayda bir olmak<br />
üzere 6 defa örnekleme yapılacaktır. Materyal olarak, işletmelerden sağlanan canlı<br />
kanatlılar, kesimhaneden alınan, tavuk mide, duodenum ve bunların içerikleri, işletme giriş<br />
su örnekleri ve driplerdeki sular, kesimhane giriş ve çıkış suları, kanatlı ürünlerinin<br />
transferi için kullanılan frigorifik kamyon ve transport kasa svap örnekleri, piyasaya<br />
sunulmuş tavukların deri, karın boşluğu ve taşlıkları oluşturacaktır.İşletmelerde gerek<br />
108
kesim sırasında, gerekse farklı birimlerde çalışan personellerin tükürük örnekleri de<br />
çalışmada kullanılacaktır.<br />
İncelemeler konvansiyonel metodlar(kültür, biyokimyasal testler) ve PZR ile<br />
yapılarak karşılaştırmalı olarak değerlendirilecektir.<br />
8.3.1-Konvansiyonel teknikler ile mikroorganizmaların izolasyonu ve<br />
identifikasyonu;<br />
Tavuk mide ve duodenum epitel doku kazıntıları ve su olarak alınan örnekler<br />
H.pylori’nin izolasyonu için vankomisin (3–6 mg/ml) + amfoterisin B (2–6 mg/ml)<br />
+trimetoprim (5-20mg/ml) + kolistin (25000U/I) + sefsulodin (5mg/ml) ilaveli Skirrow<br />
Agar’a ekilerek 35-37 ◦ C’de 4-7 gün inkübasyona bırakılacaktır.İnkübasyon periyodu<br />
sonrası oluşan üremeler gram boyama tekniği ile incelenecektir.<br />
Koloni morfolojisi,biyokimyasal testler göz önüne alınarak yapılacaktır.<br />
Katalaz,oksidaz,üreaz,hippurat hidrolizi,nitrat testleri değerlendirilecektir.<br />
8.3.2-Moleküler teknikler (PZR) ile mikroorganizmaların identifikasyonu;<br />
8.3.3.1 - Bakteri türleri ve kültür şartları:<br />
PZR’nin değerlendirilmesinde, pozitif kontrol olarak H.pylori’nin standart suşu<br />
kullanılacaktır.<br />
H.pylori’nin üretilmesinde % 7 at serumlu Colombia Agar kullanılacak ve<br />
inkubasyon 37 C°’de %10 CO2 ‘li olan mikroaerofilik ortamda yapılacaktır.<br />
8.3.3.2. PZR Optimizasyonu<br />
Laboratuar şartlarında standart şus ile PZR metodu optimize edilecektir.<br />
Araştırmada laboratuvar şartlarında PZR metodu optimize edilecektir.<br />
Optimizasyon,standart suşlardan, DNA ekstraksiyonu ve amplifikasyon evreleriyle<br />
gerçekleştirilecektir.Örnekler bu optimizasyonla yapılacaktır.<br />
8.3.3.3. PZR Şartları<br />
PZR uygulamaları, DNA ekstraksiyonu, amplifikasyon ve elektroforez aşamaları ile<br />
gerçekleştirilecektir. PZR optimizasyonu ise standart suşlardan, DNA ekstraksiyonu ve<br />
amplifikasyon aşamalarında yapılan farklı uygulamalar ile gerçekleştirilecektir.<br />
DNA ekstraksiyonu ticari DNA ekstraksiyon kitlerinin kullanılmasıyla yapılacaktır.<br />
Amplifikasyon için ekstrakte edilmiş DNA, primerler, Taq polimeraz enzimi,<br />
deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP), MgCl2 ve PZR tamponunun farklı oranları ile<br />
hazırlanan karışımlar kullanılacaktır. Hazırlanan bu karışımlar, thermal cyclerda ön<br />
ısıtmayı takiben değişen sayıda siklus (denaturasyon, annealing, zincir uzaması) ile<br />
amplifiye edilecektir. Amplifikasyon işleminden sonra amplifikasyon ürünleri, agaroz jelde<br />
(%2) elektroforeze tabi tutulacak ve etidium bromidle (2μg/ml) boyanan jel oluşan bantlar<br />
yönünden UV transillüminatör ile incelenecektir.<br />
Çalışmada kullanılacak primerler;<br />
26-kDa SSA geni Primer 3, 5’-TGGCGTGTCTATTGACAGCGAGC-3’<br />
nt 474–776, 303 bp Primer 4, 5’-CCTGCTGGGCATACTTCACCAG-3’<br />
Urease A geni HPU1, 5’-GCCAATGGTAAATTAGTT-3’<br />
nt 304 – 714, 411 bp HPU2, 5’-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3’<br />
glmM geni Forward primer, 5’-AAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGGTTT-3’<br />
nt 784–1 077, 294 bp Reverse primer, 5’-AAGCTTACTTTCTAACACTAACGC-3’<br />
CagA geni Primer 1, 5’-CCATGAATTTTTGATCCGTTCGG-3’<br />
nt 394 bp Primer 2, 5’-GATAACAGGCAAGCTTTTGAGGGA-3’<br />
şeklinde olacaktır.<br />
109
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Yapılacak olan çalışma ile erişileceği düşünülen çıktılar:<br />
� Türkiye de Veteriner Hekimlik alanında kanatlı alanında H.pylori’nin araştırılması<br />
� Türkiye de H.pylori üzerine sınırlı sayıda çalışmalar yapıldığı görülmüştür.Bu çalışmada<br />
teşhis metodlarının ileri çalışmalara referans olması ve yol göstermesi açısından önem arz<br />
etmektedir.<br />
� H.pylori’nin tavuk işletmeleri üzerinden insanlara bulaşarak zoonoz bir tehlike oluşturup<br />
oluşturmadığı gösterilecek,toplumdaki yüksek enfeksiyon oranı içindeki payı ifade<br />
edilmeye çalışacaktır.<br />
� Çalışmalar ile elde edilecek veriler ile Karadeniz bölgesinin sözkonusu bakteri için risk<br />
etkeni olup olmadığı tespit edilecektir.<br />
� Bu arada çalışma ortamlarında enfeksiyonlara karşı oluşturulan hijyen güvenliği düzeyi de<br />
H.pylori açısından tavuk işletmelerinde ortaya konulacak,sözkonusu işletme ve tavuk<br />
ürünlerinin bu bakterinin insana transferinde risk oluşturup oluşturmadığı belirlenecektir.<br />
� Bu veriler beşeri olarak şekillenen H.pylori enfeksiyonlarıyla daha bilinçli ve planlı<br />
mücadele <strong>program</strong>larının geliştirilmesinde önemli bir yapı taşı olacak ve ileride yapılacak<br />
olan çalışmalara ışık tutacaktır.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Yunus GÜR<br />
Konuyla İlgili Araştırma Deneyimi: Var<br />
9.2. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Kemal Gürkan KÜTÜK<br />
Konuyla İlgili Araştırma Deneyimi: Var<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım (Projeyle İlgili Donanım):<br />
Buzdolabı (1 adet), Difiriz (1 adet), Steril Kabin (1 adet), Benmari (1 adet), İnverted<br />
mikroskop (1 Adet), Normal etüv (1Adet), Sterilizatör (1 Adet), UV box (1 Adet),<br />
Homojenizatör (1 Adet), Thermal-cycler (1 Adet), Elektroforez sistemi (1 Adet), UV<br />
Transillüminatör (1 Adet).<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım :<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri:<br />
110
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM GİDERLERİ<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME ALIMLARI<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME ALIMLARI<br />
03.2.1 Kırtasiye ve Büro Malzemesi Alımları<br />
03.2.3.02 Akaryakıt ve Yağ Alımları<br />
03.2.6.01 Laboratuar Malzemesi ile Kimyevi ve Temrinlik<br />
Malzeme Alımları<br />
03.3- YOLUKLAR<br />
03.3.1.01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları<br />
03.4- GÖREV GİDERLERİ<br />
03.5- HİZMET ALIMLARI<br />
03.6- TEMSİL VE TANITMA GİDERLERİ<br />
03.7- MENKULMAL, GAYRİMADDİ HAK ALIM, BAKIM VE<br />
ONARIM GİDER 03.7.3.03 Taşıt Bakım ve Onarım Giderleri<br />
YILLARA<br />
DAĞILIMI<br />
GÖRE<br />
1.Yıl 2.Yıl<br />
500<br />
1.000<br />
5.000<br />
1.000<br />
500<br />
500<br />
1.000<br />
5.000<br />
1.000<br />
03.8- GAYRİMENKUL MAL BAKIM VE ONARIM GİDERLERİ<br />
03.9- TEDAVİ VE CENAZE GİDERLERİ<br />
TOPLAM 8.000 8.000<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI<br />
06.1.2.04 Laboratuar Cihazı Alımları<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIMI<br />
1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM GİDERLERİ<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA)<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER<br />
1.000 1.000<br />
TOPLAM 1.000 1.000<br />
GENEL TOPLAM : 18.000<br />
500<br />
111
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1. Köksal F. H.pylori. Topçu AW, Söyletir G, Doğanay M. İnfeksiyon hastalıkları ve klinik<br />
mikrobiyoloji. Nobel Tıp Kitabevi, İstanbul.2002; 1643–1647.<br />
2. Warren JR. Unidentified curved bacilli on gasrtric epithelium in active chronic gastritis. The Lancet<br />
1983; 1273.<br />
3. Dooley CP. Background and Historical considerations of H.pylori.Gastroenterology Clinics of North<br />
Amerika 1993; 22: 1–5.<br />
4. Bingöl R. H.pylori Mikrobiyolojisi. 9.Türk Klinik ve Mikrobiyoloji Kongresi, 3–9 Kasım 1999<br />
Antalya, Kongre Kitabı. s. 51–55.<br />
5. Marshall BJ, Warren JR. Unindendified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and<br />
peptic ulseration. Lancet 1984.<br />
6. Dunn B E, Cohen H, Blaser MJ. H.pylori clinical microbiyoloji reviews 1997; 10: 720–741.<br />
7. Erdem B. Campylobacter ve Helicobacter. Ustaçelebi Ş. Temel ve Kinik Mikrobiyoloji kitabından,<br />
Güneş Kitabevi, Ankara. 1999: 536–539.<br />
8.Blaser J.Martin: H.pylori and relatid organisms. In: Mandell GL,Bennett JE, Dolin R(eds). Mandell,<br />
Douglas and Bennet’s Principles and Practice infections disease. Newyork Chrchill,Livingstone;<br />
5.baskı. 2000: 2228–2241.<br />
9.Lambert JR. The role of H.pylori in nonulcer dyspepsia.Gastroenterol Clin North Am 1993; 22(1):<br />
141–<br />
10.Kılıç SS. H.pylori: Tanı, epidemiyoloji ve korunma. 9.Türk Klinik ve Mikrobiyoloji İnfeksiyon<br />
Hastalıkları Kongresi, Antalya. Kongre kitabı 1999: 63–68.<br />
11.Klein PD, Graham DY, Gaillour A, Opekun AR, Smith EO. Water source as risk factor for<br />
Helicobacter pylori infection in Peruvian children. Gastrointestinal Physiology Working Group.Lancet<br />
1991; 337: 1503-6<br />
12.Fox JG. Non-human reservoirs of Helicobacter pylori. Aliment Pharmacol Ther 1995; 9 Suppl 2:93-<br />
13.Koneman EW, Allen SD, Janda WM at all. H.pylori. Diagnostic Microbioloji. Lippincott, New<br />
York, 5.baskı. 1997: 334–337.<br />
14. Geo. F. Brooks, Janet S. Butel, L. Nicholas Ornston. H.pylori.Medikal Microbiyology. A Lange<br />
Medikal book. p.229–230.<br />
15. Bilgehan H. Sert vücudlu sarmal hareketli, gram olumsuz bakteriler.Klinik Mikrobiyoloji kitabında.<br />
Barış yayınları, İzmir, 10.baskı. 2000:143–144.<br />
16.Diagnosis of Helicobacter pylori Infection by PCR: Comparison with Other Invasive Techniques<br />
and Detection of cagA Gene in Gastric Biopsy Specimens<br />
17.Lu JJ, Perng CL, Shyu RY, Chen CH, Lou Q, Chong SKF, Lee CH. Comparison of five PCR<br />
methods for detection of Helicobacter pylori DNA in gastric tissues. J Clin Microbiol 1999<br />
18. Böhmler, G., J. Gerwert, E. Scupin, and H.-J. Sinell. Epidemiology of H. pylori in an:Studies on<br />
survival of the agent in food. Dtsch. Tierärztl. Wschr. 103:438–443 (1996).<br />
19. Comparison of three PCR methods for detection of Helicobacter pylori DNA and detection of cagA<br />
gene in gastric biopsy specimens. World J. Gastroenterol 2004;10(13):1958-1960<br />
20. Characteristic distribution pattern of Helicobacter pylori in dental plaque and saliva detected with<br />
nested PCR. J. Med. Microbiol. -- Vol. 49 (2000), 349-353<br />
21. Mezbaha Çalışanlarında Helicobacter pylori İnsidansı ile Sığır Abomasumunda Bulunan<br />
Helicobacter pylori Benzeri Spiral Bakteriler Arasındaki İlişki Van Tıp Dergisi, Cilt:6, Sayı:3,<br />
Temmuz/1999<br />
22. Detection of Helicobacter pylori DNA in human faeces and water with different levels of faecal<br />
pollution in the north-east of Spain Journal of Applied Microbiology 2005, 98, 889–895<br />
23.Detection of Helicobacter pylori in cow’s milk Letters in Applied Microbiology 2002, 35, 504–507<br />
24.Investigation of Helicobacter pylori in Raw Sheep Milk Samples J. Vet. Med. B 49, 308–309 (2002)<br />
4. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Yunus GÜR 05.02.2008<br />
Samsun Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü :İsmail AYDIN 05.02.2008<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar :<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar :<br />
112
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı :<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1.PROJE ADI:<br />
Elazığ ve çevresindeki broiler, damızlık ve yumurtacı işletmelerde İnfeksiyöz<br />
bronşitisin patolojik, virolojik ve moleküler metotlarla araştırılması<br />
“Investigation on Infectious bronchitis in commerical broilers, breeders and laying hens in<br />
Elazig and its province by pathological, virological and molecular methods.”<br />
2.YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ: Elazığ Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü<br />
3.PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Doç. Dr. Necati Timurkaan<br />
Kurumu : Fırat Üniversitesi - Elazığ<br />
4 . Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı: Kanatlı ve Küçük Evcil Hayvancılık X X<br />
Araştırma Programı : Kanatlı X<br />
5.PROJE SÜRESİ: 24 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : Kasım 2008<br />
5.2. Bitiş Tarihi : Haziran 2010<br />
6.PROJENİN ÖZET TANITIMI :<br />
Bu çalışmada, Elazığ ve çevresindeki broiler, damızlık ve yumurtacı işletmelerde<br />
klinik olarak solunum sistemi bulguları, yumurta veriminde ve kalitesinde düşüş gösteren<br />
tavuklarda İnfeksiyöz bronşitis virusu (İBV)’ nun varlığı patolojik, virolojik ve moleküler<br />
metodlarla araştırılması amaçlanmıştır. Klinik bulgu gösteren işletmelerdeki tavuklar,<br />
kanları alındıktan sonra nekropsileri yapılacak, solunum sistemi organları ile böbrek,<br />
yumurta kanalı, dalak ve sekal tonsillerden alınan doku numuneleri histopatolojik ve<br />
immunohistokimyasal olarak değerlendirilecektir. Kan serumlarında antikor titreleri<br />
ELISA ve Hemaglutinasyon inhibisyon (HI) testleri ile belirlenecektir. Trahea, akciğer,<br />
kloakal svap, böbrek, yumurta kanalı, dalak ve sekal tonsillerden hazırlanan doku<br />
süspansiyonları embriyolu tavuk yumurtalarına (ETY) ve traheal organ kültürlerine<br />
inokule edilerek (TOK) virus izolasyonu yapılacaktır. İzolasyonu takiben Polimeraz Zincir<br />
Reaksiyonu (PZR) ile tiplendirme yapılacak, PZR sonuçları sekanslanarak teyid<br />
edilecektir.<br />
7.ANAHTAR KELİMELER: İBV, Virus izolasyonu, PZR, Histopatoloji ve<br />
İmmunohistokimya<br />
113
SUMMARY: Objective of the proposed study is to investigate the presence of Infectious<br />
bronchitis virus in commerical broilers, breeders and layer hens showing findings of<br />
respiratory disease and reduction of egg production and quality in Elazig and its province<br />
by pathological, virological and molecular methods. Receiving the serum samples from the<br />
chickens showing clinical findings, the necropsy will be performed, and respiratory system<br />
organs and kidney, oviduct, spleen and cecal tonsils will be examined by histopathological<br />
and immunohistochemical methods. Antibody titers in the serum samples will be<br />
determined by ELISA and hemaglutination inhibition tests. Virus isolation will be made<br />
from tissue suspensions of cloacal swap, trachea, lung, kidney, oviduct, spleen and cecal<br />
tonsils by inoculating into emryonated chicken eggs and tracheal organ cultures. After<br />
virus isolation, serotyps will be detected by polymerase chain reaction and results of PCR<br />
will be confirmed by sequnecing<br />
KEY WORDS: IBV, virus isolation, PCR, histopathology and immunohistochemistry<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ :<br />
8.1. Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
İnfeksiyöz bronşitis (İB) dünyada, tavukçuluk sektöründe önemli ekonomik<br />
kayıplara sebep olan viral bir hastalıktır. Virusun çok sayıda serotipinin olması ve bazı<br />
serotipler arasında çapraz korumanın olmaması ya da yetersiz oluşu nedeniyle, hastalıkla<br />
mücadelede aşılamalar yetersiz kalmaktadır. Ülkemizde İB üzerine gerek deneysel gerekse<br />
sahaya yönelik çalışmalara rastlanmış, ancak sahaya yönelik patolojik bir çalışma ile<br />
virusun serotiplendirmesine yönelik kapsamlı bir çalışmaya rastlanmamıştır. Ayrıca, Elazığ<br />
ve çevresinde İB ile ilgili yapılmış herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Planlanan bu<br />
çalışma İB infeksiyonlarının virus izolasyonu, histopatoloji ve immunohistokimyasal<br />
teşhisi ve izole edilen İBV’nin PZR ile serotiplerinin belirlenmesi hedeflenmektedir.<br />
8. 2. Literatür Özeti:<br />
Coronavirüs ailesine ait bir RNA virusu olan İnfeksiyöz Bronşitis Virusu (İBV)<br />
genellikle tavuklarda akut seyirli ve oldukça bulaşıcı bir hastalığa yol açmaktadır. Solunum<br />
sistemininin yanı sıra üro-genital sistemi de etkileyen virusun canlı ağırlık artışında azalma<br />
ile birlikte yumurta verimi ve kalitesinde önemli düşüşlere neden olduğu bildirilmektedir.<br />
İB ilk olarak 1931 yılında Amerika’da tespit edilmiş ve daha sonra bütün dünyada<br />
gözlendiği anlaşılmıştır. İB hastalığının 1956 yılına kadar Massachusettes’de izole edilen<br />
tek bir virus tarafından oluşturuluduğuna inanılmış, ancak, daha sonra değişik bölgelerde<br />
ortaya çıkan İB salgınlarında izole edilen virusun antijenik olarak bilinen Massachusettes<br />
izolatından farklı olduğu anlaşılmıştır. İBV’nin Massachusettes, Connecticut, Georgia,<br />
Delaware, Iowa 97, Iowa 609, New Hampshire, T-Strain (Australia) gibi çok sayıda<br />
serotiplerinin olduğu bildirilmektedir. İnfeksiyöz bronşitisin tanısı virus izolasyonu, PZR,<br />
immunohistokimyasal metodlarla viral antjenin belirlenmesi ve spesifik antikorlarının<br />
saptanması ile yapılmaktadır. İBV embriyolu yumurta, traheal organ kültürleri, kanatlı<br />
orjinli çeşitli hücre kültürlerinde üretilebilmektedir. Virusun hücre kültürlerine oranla<br />
organ kültürlerinde daha çabuk ve kolay ürediği ifade edilmektedir. Bu amaçla İBV’nin<br />
izolasyonu için en çok traheal organ kültürleri kullanılmaktadır.<br />
Ülkemizde İB üzerine hem sahaya yönelik hem de deneysel çalışmalar mevcuttur.<br />
Broiler, yumurta tavuğu ve damızlık işletmelerde yapılan bir çalışmada yumurta verim ve<br />
kalitesinde düşme görülen tavuklardan alınan 764 kan örneğinin 428’inde (% 56) HI testi<br />
ile İB seropozitiflik saptanmıştır. Diğer bir çalışmada solunum bulguları ile birlikte<br />
yumurta verimi ve kalitesinde düşme gözlenen broiler, yumurta tavuğu ve damızlık<br />
114
<strong>hayvan</strong>larda toplam 461 olguya ait doku örnekleri PZR ve Floresan antikor tekniği (FAT)<br />
ile incelenmiştir. PZR ile yapılan yoklamalarda broilerlerde % 16.7, broiler damızlıklarda<br />
% 22.2 ve yumurtacı sürülerde % 27.3 oranında İBV pozitiflik belirlenirken, FAT ile<br />
yapılan yoklamalarda bu oranların sırasıyla % 14.3, %16.7 ve % 18.2 olduğu saptanmış ve<br />
İB’in teşhisinde PZR’nin FAT’a göre daha üstün olduğu bildirilmiştir. Ülkemizde yapılan<br />
çalışmalarda, tavukçuluk işletmelerinde, yetiştirme yönüne göre değişmekle birlikte,<br />
İBV’nin oldukça yüksek oranlarda varlığı serolojik ve virolojik metotlarla belirlenmiş,<br />
ancak, virusun serotiplendirmesine yönelik kapsamlı çalışmalara rastlanmamıştır.<br />
Aşılamalara rağmen hastalıktan korunmada arzu edilen sonuçların alınamadığı ve bunun da<br />
bazı serotipler arasında çapraz korumanın yetersiz oluşundan kaynaklandığı ifade<br />
edilmektedir. Dolayısıyla planlanan bu çalışma, bölgemizde İBV’nin varlığının virolojik<br />
ve patolojik metotlarla araştırılmasının yanı sıra hastalığa sebep olan virusun serotiplerinin<br />
belirlenmesi hedeflenmektedir.<br />
8. 3. MATERYAL VE METOT:<br />
Bu çalışmada, broiler, damızlık ve yumurtacı işletmelerde, klinik olarak solunum<br />
sistemi bulguları ile yumurta veriminde ve kalitesinde düşüş gösteren tavuklar, kanları<br />
alındıktan sonra nekropsileri yapılacaktır. Alınan kan örneklerinden serum çıkarılacak,<br />
ELISA ve HI yöntemi ile İBV antikor titreleri belirlenecektir. Virus izolasyonu için<br />
kloakal swap, trahea, akciğer, sekal tonsil, böbrek ve yumurta kanalından uygun şekilde<br />
alınan doku örneklerinden hazırlanan homojenatlar traheal organ kültürleri ve embriyolu<br />
tavuk yumurtasına ekimleri yapılacaktır. İzolasyonu takiben HI ile virusun varlığı teyid<br />
edildikten sonra PZR ile tiplendirmeye gidilecektir. Belirlenmiş olan her serotipten bir<br />
tanesi sekanslanarak PZR sonuçları ve tiplendirme teyid edilecektir. Patolojik incelemeler<br />
için, solunum sistemi organları ile böbrekler, dalak ve yumurta kanalından alınan doku<br />
örnekleri % 10’luk nötral formalin solüsyonunda tespit edilecek ve hazırlanan parafin<br />
blokları, 5 mikrona ayarlanmış mikrotomda kesilerek Hematoxylin-Eosin (HE) ile<br />
boyanarak ışık mikroskobunda incelenecektir. Ayrıca, viral antijenin varlığını araştırmak<br />
için trahea, böbrek ve yumurta kanalından alınan kesitler ABC metodu ile<br />
immunohistokimyasal olarak boyanarak değerlendirilecektir.<br />
8.3.Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı :<br />
İB bütün dünyada tavuk yetiştiriciliğini tehdit eden ve önemli ekonomik kayıplara<br />
sebep olan bir hastalıktır. Hastalık düşük mortaliteye sahip olması nedeniyle tavukçuluk<br />
sektöründe genellikle geri planda kalmasına neden olmuştur. Bununla birlikte hastalığın<br />
morbiditesinin yüsek olması ve yol açtığı ekonomik kayıplar göz önüne alındığında,<br />
hastalığın neden olduğu bu kayıpların mortaliteden daha önemli olduğu düşünülmektedir.<br />
Hastalığa neden olduğu İBV’nun çok sayıda serotipinin olması ve bazı serotipler arasında<br />
çapraz korumanın yetersiz oluşu, hastalığa karşı aşılamalardan arzu edilen sonuçların<br />
alınamadığı bilinmektedir. Planlanan bu çalışma Elazığ ve çevresinde İB infeksiyonlarının<br />
virolojik ve patolojik metotlarla araştırılmasının yanı sıra, serotiplerinin belirlenmesi ve<br />
aşılamaların bu serotiplere göre yapılmasına yönelik veriler elde edilmesi, hastalıkla<br />
mücadelede önemli katkılar sağlayacağı düşünülmektedir.<br />
9.ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı:Doç.Dr. Necati TİMURKAAN ( Patoloji )<br />
9.2.Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı:Doç.Dr. Fethi YILMAZ (Patoloji )<br />
9.3. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Turan Turhan (Viroloji )<br />
9.4. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Fethiye Çöven (Viroloji )<br />
9.5. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Vet. Hekim Nalan DURMUŞ ( Patoloji)<br />
115
9.6. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Uz. Vet. Hekim Hüseyin Atik (Viroloji)<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Yeterli<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım : Yok<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri: Laboratuara günlük<br />
gelen numunelerin rutin muayeneleri yapılmaktadır.<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
ANALİTİK BÜTÇE TEKLİFİ<br />
I. PROJENİN TANIMI<br />
III. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ TOPLAM<br />
1-MAMUL MAL ALIMLARI<br />
2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI<br />
4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞ.<br />
5-GAYRİMENKUL SER. ÜRE. GİDERLERİ<br />
6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM<br />
GİDER.<br />
7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA)<br />
9- DİĞER SERMAYE GİDERLER<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
(YTL)<br />
Genel Dış İç<br />
Toplam Toplam Toplam<br />
06: 30 000<br />
6.2: 15 000<br />
6.5: 15 000<br />
Kasım 2008- Nisan 2009 Alt yapının hazırlanması ve sarf<br />
malzemelerinin alınması<br />
Mayıs 2009- Eylül 2009 Numunelerin toplanması<br />
Ekim 2009- Temmuz 2010 Numunelerin işlenmesi<br />
Ağustos 2010- Kasım 2010 Sonuçların değerlendirilmesi ve Proje sonuç<br />
raporunun hazırlanması<br />
116
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1. Akan, M., İzgür, M. Ve Sareyyüpoğlu, B. Tavuklarda İnfeksiyöz Bronşitisin Polimeraz<br />
Zincir Reaksiyonu ve Floresan Antikor Tekniği ile Teşhisi. Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg.,<br />
2007; 54: 47-54<br />
2. Cavanagh, D. And Naqi, S.A. Infectious Bronchitis. In: Disease of Poultry. Editor Saif,<br />
Y.M. 11th edi., Iowa State Pres, 2003.<br />
4. Çöven, F. Ege Bölgesinde Bazı Önemli Kanatlı Hastalıklarının Seroepidemiyolojik<br />
Taraması. I. Uluslararası Tavukçuluk ve Tavuk Hastalıkları Sempozyumu, Manisa, 1988;<br />
99-107.<br />
5. Ergin, A., Çöven, F., Orhan, G., Karaçalı, S., Deveci, R. İzmir ve Bursa Bölgesinde<br />
İnfeksiyöz Bronşitis Olaylarının Araştırılması ve İzolasyon Çalışmaları. Bornova Hay.<br />
Hast. Kont. Merk. Derg. 1994; 32: 29-46<br />
6. Handberg, K.J., Nielsen, O.L., Pedersen, M.W., Jorgensen, P.H. Detection and Strain<br />
Differentiation of Infectious Bronchitis Virus in Tracheal Tissues from Experimentally<br />
Infected Chickens by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. Comparison with<br />
an<br />
Immunohistochemical Technique. Avian Pathol. 1999; 28: 327-335.<br />
7. Fırat, İ. İnfeksiyöz Bronşitis Virusu (İBV)’nun Üç Değişik Patojen Suşu ile Enfekte<br />
Edilen Civcivlerdeki Nefrolojik Bulguların Histopatolojik Karşılaştırması. İ. Ü. Sağlık. Bil.<br />
Ens. Doktora Tezi, 1995.<br />
8. Kapczynski, D.R., Sellers, H.S., Rowland, G.N. and Jackwood, M.W. Detection of in<br />
ovo-inoculated infectious bronchitis virus by immunohistochemistry and in situ<br />
hybridization with a riboprobe in epithelial cells of the lung and cloacal bursa. Avian Dis.,<br />
2002;46 (3): 679-685.<br />
9. Lee,C.W., Brown, C., Hilt, D.A. and Jackwood, M.W. Nephropatogenesis of Chickens<br />
Experimentally Infected With Various Strains of Infectious Bronchitis Virus. J Vet Med<br />
Sci., 2004; 66 (7): 835-840.<br />
10. Şen, A. Yumurta Tavuğu, Damızlık ve Broyler İşletmelerinde İnfeksiyöz Bronşitisin<br />
Teşhisi ve Hastalığın Prevalansı. U. Ü. Sağlık Bil. Ens. Doktora Tezi, 1991.<br />
11. Şen, A., Çarlı, K.T., Çetin, C., Minbay, A.: Bursa Bölgesi Yumurta Tavuğu, Broyler ve<br />
Damızlık İşletmelerinde İnfeksiyöz Bronşitis Virusunun İzolasyonu ve İdentifikasyonu.<br />
Veterinarium 1998; 9: 39-45.<br />
12. Şen, A., Sönmez, G., Caner, V. ve Özyiğit, M.Ö. İnfeksiyöz Bronşitis Virusu’nun<br />
Trakeal Organ Kültürlerinde İmmunoperoksidaz Tekniği ile Saptanması. Turk J Vet Anim<br />
Sci., 2002, 26: 1381-1388.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih<br />
İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Doç.Dr. Necati Timurkaan<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Ünal KILINÇ (EVKAE)<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar : Fırat Üniversitesi - Bornova Veteriner Kontrol ve<br />
Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü<br />
117
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
ÖN PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI: Kafeik Asit Fenil Ester’in Ornithobacterium rhinotracheale ile<br />
enfekte edilen broylerlerde lipid peroksidasyon ve antioksidan enzim aktiviteleri<br />
üzerine etkisi<br />
“The effect of Caffeic Acid Phenethyl Ester on lipid peroxidation and activities of<br />
antioxidant enzyme at broiller infected with Ornithobacterium rhinotracheale.”<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ :<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü / ELAZIĞ<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Dr. Fulya BENZER<br />
Kurumu : Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü – ELAZIĞ<br />
4 . Projenin İlgili Olduğu AFA/Program<br />
Araştırma Fırsat Alanı: Kanatlı ve Küçük Evcil Hay.<br />
Araştırma Programı : Kanatlı ve Küçük Evcil<br />
Hayvan Hastalıkları<br />
5. PROJE SÜRESİ : 24 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : Ocak 2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : Ocak 2011<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu araştırma ornithobacterium rhinotracheale ile enfekte edilen tavuklarda serbest<br />
radikal hasarı, antioksidan enzim aktiviteleri ile karaciğer enzimleri üzerine kafeik asit<br />
fenil ester etkisini araştırmak amacıyla planlanmıştır. Araştırma 7 grup üzerinden<br />
yapılacaktır. 1. Grup: Kontrol, 2. Grup: Enfeksiyon, 3. Grup: Antibiyotik, 4. Grup: KAFE ,<br />
5. Grup: Enfeksiyon +Antibiyotik 6. Grup: Enfeksiyon+KAFE, 7. Grup<br />
Enfeksiyon+Antibiyotik+KAFE olacaktır. Uygulama 8 hafta sürecektir. Uygulama sonrası<br />
LPO, NO, AST, ALT, KAT, GSH-Px, GSH, SOD, PON, Vitamin A, E ve β-Karoten<br />
düzeyleri ölçülecektir.<br />
Summary: This study is planned to investigate effects of caffeic acid phenethyl ester on<br />
free radical damage, activity of antioxidant enzyme and liver enzymes in the chickens<br />
infected with ornithobacterium rhinotracheale. The study has 7 groups. 1 st .Group: Control,<br />
2nd Group: Infection, 3rd Group Anthibiotic, 4th Group: CAPE, 5th Group:<br />
118
Infection+Anthibiotic, 6th Group: Infection+CAPE, 7th Group.<br />
Infection+Anthibiotic+CAPE. Application will last 8 weeks. After application, levels of<br />
LPO, NO, AST, ALT, KAT, GSH-Px, GSH, SOD, PON, Vitamin A, E and β-caroten will<br />
be measured.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER: Kafeik asit fenil ester, Ornithobacterium rhinotracheale,<br />
Lipid Peroksidasyon, Antioksidant<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Kanatlı <strong>hayvan</strong> yetiştiriciliğinde temel amaç kar elde etmektir. İşletmelerde karın<br />
beklenilen düzeyde olabilmesi için de öncelikle infeksiyonlardan korunarak birim başına<br />
verimi artırmaktır. Solunum sistemi hastalıkları kanatlı <strong>hayvan</strong> hastalıkları arasında önemli<br />
yer tutmaktadır. Kanatlı <strong>hayvan</strong>larda solunum sisteminde görülen hastalıklar, modern<br />
işletmelerin en önemli sorunlarından birisidir. Ekonomik önemlerinden dolayı son yıllarda<br />
dünyanın her yerinde, kanatlı <strong>hayvan</strong> hastalıkları üzerindeki araştırmalar artmaktadır.<br />
Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) etkeni ilk defa 1994 yılında Vandamme ve<br />
ark. tarafından isimlendirilmiştir. ORT, gram negatif (+), mikroaerobik, pleomorfik çomak<br />
şekilli bir bakteridir. ORT, son yıllarda pek çok ülkede solunum sistemi hastalıkları ile<br />
ilgili olarak purulent pnömoni ve hava kesesi yangılarından sıklıkla izole edilmektedir.<br />
Pasteurella-benzeri olarak kabul edilen mikroorganizma hindilerde ve tavuklarda önemli<br />
solunum sistemi bozukluklarına neden olmaktadır. Etken direkt olarak bulaşmaktadır.<br />
Ancak, yumurta yolu ile bulaşıp bulaşmadığı konusu tam açıklığa kavuşturulamamıştır.<br />
Hastalığın önlenmesi için hijyenik tedbirler alınmalı ve aşı uygulanmalıdır.<br />
Propolis bal arısı tarafından bitkilerden toplanıp kovanda üretilen doğal bir üründür.<br />
Flavonoidler ile kafeik asit ve esterleri propolisde en fazla bulunan ve biyolojik olarak<br />
aktif bileşenlerdir. Eski yıllardan beri halk hekimleri tarafından çeşitli hastalıkların<br />
tedavisinde kullanılagelen propolisin antimikrobik, antiinflamatuvar, rejeneratif,<br />
antioksidan ve antineoplastik etkileri bilimsel çalışmalarla da ispatlanmıştır.<br />
Günümüzde kullanılan sentetik ilaçların yan etkilerinin ortaya çıkması ve hastalık<br />
etmenlerinin bu ilaçlara karşı direnç kazanması insanları doğal ilaç olarak bilinen ürünlerin<br />
tüketimine yönlendirmiştir. Bu çalışmada amacımız ORT enfeksiyonu üzerine kafeik asit<br />
fenil ester’in antibakteriyel ve antioksidan etkisini araştırmaktır.<br />
8.2 Literatür Özeti:<br />
ORT, tüm dünyada solunum sistemi hastalıkları ile ilgili olarak evcil ve yabani<br />
kanatlı <strong>hayvan</strong>larda yaygın olarak bulunmaktadır. ORT, başta tavuk ve hindiler olmak<br />
üzere keklik, sülün, güvercin, karga, bıldırcın, ördek, Hint sülünü, devekuşu, kaz ve beç<br />
tavuğu gibi birçok kanatlı <strong>hayvan</strong> türünde enfeksiyon oluşturabilmektedir (Back., 1997;<br />
Devrıese, 1995).<br />
ORT, genellikle 3-4 haftalık broylerlerde %2-10’luk ölüm oranı ile görülmektedir.<br />
Broyler damızlıklar ise infeksiyona en duyarlı kanatlılar olup infeksiyon daha çok 24-52.<br />
haftalarda seyretmektedir. Hindilerde daha çok 4 haftalıktan büyüklerde görülmesine<br />
rağmen 2-8 haftalıklarda da hastalık yapabilmektedir. (Roepke, DC., 1998; Van Empel,<br />
1999; Van Veen L., 2000).<br />
Propolisin kimyasal bileşimi çok kompleks bir yapıya sahiptir. Propolisin yüksek<br />
rezolüsyonlu gaz kromatografik incelemesi sonucu toplam 100’den fazla bileşen tespit<br />
edilmiştir (Bankova, 1992; Greenaway, 1987; Garcia-Viguera, 1993). Propolis insan ve<br />
veteriner tıbbındaki kullanımı açısından büyük bir potansiyele sahip doğal bir üründür.<br />
Propolisin antimikrobik etkisi bakterileri (Dobrowolski,1991; Focht, 1993), virüsleri<br />
119
(Amaros, 1992; Amaros, 1994; Amaros, 1992), mantarları (Dobrowolski, 1991), ve<br />
parazitleri (Starzyk, 1977) kapsamaktadır. Antibakteriyel etkisi özellikle gram (+) koklar<br />
ile gram (-) basiller üzerinde gözlenmiştir (Grange, 1990). Propolisin in vitro olarak<br />
besiyerinde antibiyotiklerin etkisini artırarak ve etki sürelerini uzatarak sinerjistik etki<br />
etki gösterdiği tespit edilmiş olup, böyle bir etkileşimin minimum inhibitor konsantrasyon<br />
(MİC) değerini oluşturmak için verilmesi gereken antibiyotik miktarını azalttığı<br />
belirlenmiştir. Diğer taraftan Staphylococcus aureus’un dirençli olduğu antibiyotiklerle<br />
kombine edildiğinde bu bakterilerin bu antibiyotiklere halen duyarlı olduğu da<br />
görülmüştür. Propolisin içindeki antibakteriyel etki gösteren maddelerin en önemlisi<br />
kafeik asit ve kafeatlardır. CAPE’in immunomodülatör etki göstererek gram (+)<br />
infeksiyonlara karşı proflaktik olarak etkili olduğu da bildirilmiştir. Propolisin artrit<br />
oluşturulmuş ratlarda ALT ve AST enzimlerinin seviyelerini kısmen düşürdüğü<br />
gösterilmiş olup bu etkinin mekanizması henüz tam olarak bilinmemektedir.<br />
Propolisin yeni olarak üzerinde durulan ve tartışılan özelliklerinden birisi de<br />
antioksidan etkisidir. Propolisdeki temel bileşikler olan flavonoidler ve bunlarla ilgili<br />
bileşiklerin serbest radikal temizleme etkisi en fazla olan bileşikler oldukları gösterilmiştir<br />
(Scheller, 1990). Bazı flavonoidler doymamış yağ asitlerinin peroksi radikalleriyle<br />
reaksiyona girip temizleyici görevi görerek lipid peroksidasyonunun başlangıç aşamasına<br />
etki edebilirler (Pascual, 1994; Scheller, 1990). Flavonoidlerin antioksidan etkileri peroksit<br />
iyonları, hidrojen peroksit, singlet oksijen ve lipit peroksit radikallerini ortamdan<br />
uzaklaştırabilme yeteneklerine bağlanmıştır.<br />
Antibiyotiklerin serbest radikal hasarı üzerine etkileri çeşitli çalışmalarla<br />
araştırılmış ve bu çalışmalar sonucunda antibiyotiklerin serbest radikal hasarının göstergesi<br />
olan MDA’yı artırdığı ve antioksidant sistemi ise zayıflattığı ortaya koyulmuştur (Gürbay<br />
ve ark., 2001; Parlakpınar ve ark., 2004; Pari ve Gnanasoundari., 2006; Oz ve Ilhan,<br />
2006).<br />
8.3. MATERYAL VE METOT:<br />
Araştırmada 1 günlük 100 adet broyler civciv alınarak 3 haftalık olana kadar<br />
büyütülecek, daha sonra gruplar aşağıdaki gibi ayrılacaktır. ORT suşundan B 3263/9<br />
(serotip A)’dan inokulum hazırlanacaktır. Bakteri %7 kanı içeren BHIA (Brain Heart<br />
Infusion Broth) ve MacConkey agara ekimi yapılarak % 5-10 CO2 ’li ortamda 48 saat<br />
inkube edilecektir. Bu süre sonunda üreyen bakterilerin biyokimyasal ve kültürel<br />
özellikleri kontrol edilecektir. Tavukları infekte etmek için 3,8X10 8 coloni forming ünitesi<br />
(cfu/ml) bakteriyel süspansiyon aerosol olarak verilecektir. İnokülasyondan sonra tavuklar<br />
klinik bulgular yönünden 30 gün boyunca gözlenecektir.<br />
1. Grup: Kontrol grubu olarak kullanılacaktır.<br />
2. Grup: Enfeksiyon grubu. ORT 3263 /91 suşu (serotip A) mililitre başına 3,8X10 8<br />
CFU içeren inokulum aerosol olarak verilecektir.<br />
3. Grup: Antibiyotik grubu. Enrofloksasin verilecek<br />
4. Grup: KAFE grubu.<br />
5. Grup: Enfeksiyon+KAFE grubu<br />
6. Grup: Enfeksiyon+antibiyotik grubu<br />
7. Grup: Enfeksiyon+antibiyotik+KAFE grubu<br />
Uygulama 3 hafta devam edecek ve uygulama sonrası tüm gruplardan kesilerek kan<br />
ve doku örnekleri alınacak ve alınan örneklerde; Lipit Peroksidasyon (LPO), Glutatyon<br />
(GSH), Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px), Katalaz (KAT), Paraoksanaz (PON), Nitrik Oksit<br />
(NO), Serum Alanin Amino Transferaz (ALT), Serum Aspartat Amino Transferaz (AST),<br />
E vitamini, A vitamin ve β- karoten düzeylerine bakılacaktır.<br />
120
Yapılacak Analizler<br />
• E vitamini Kayden ve ark. metoduna göre (Shimadzu UV-120-01<br />
Spektrophotometer Japan) spektrofotometresi ile ölçülecektir.<br />
• Lipit peroksidasyonun son ürünü olan malondialdehid (MDA) Matkovics ve ark.<br />
tarafından modifiye edilen Placer ve ark. yöntemine göre spektrofotometre ile<br />
belirlenecektir.<br />
• A vitamini ve Β-karoten düzeyleri Suzuki ve Katoh’nın tarif ettiği şekilde tespit<br />
edilecektir.<br />
• GSH-Px aktivitesi düzeyi Lawrence ve ark. tarif ettiği şekilde belirlenecektir.<br />
• GSH düzeyi Sedlak ve Lindsay ‘ın tarif ettiği şekilde ölçülecektir.<br />
• Katalaz enzimi tayini Aebi yöntemiyle yapılacaktır.<br />
• Doku protein konsantrasyonu Lowry yöntemi ile belirlenecektir.<br />
• Eritrosit hemoglobin tayini Drabkin yöntemine göre yapılacaktır.<br />
• NO ölçümü Griess yöntemine göre yapılacaktır.<br />
• PON 1 aktivite ölçümü Eckerson metodu kullanılacaktır..<br />
• SOD ölçümü Sun metoduna göre yapılacaktır.<br />
• Bu çalışmada istatistiksel analizler, SPSS 11,5 istatistik proğramı kullanılarak<br />
gruplar arası fark varyans analiz testine, gruplar arası farklılığın önem derecesinin<br />
tespiti Duncan testine göre yapılacaktır. Deneysel çalışmalar sonucu elde edilen<br />
veriler, ortalama ± standart sapma olarak gösterilecek ve anlamlılıklar, P
Çörek Otu Tohumunun Kurşun Verilen Sıçan (Rat)’lardaki Lipit Peroksidasyonu<br />
Üzerine Antioksidan Etkisi<br />
Bal ve Polenin Kadmiyum Verilen Sıçan (Rat)’lardaki Lipit Peroksidasyonu<br />
Üzerine Antioksidan Etkileri<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI 6.000<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM GİDERLERİ 17.000<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI -<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
-<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
2.000<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
-<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
-<br />
GİDERLERİ<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA) -<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER -<br />
TOPLAM 25.000<br />
IV. 2007 YILI YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI:<br />
06.1.3.04 Laboratuvar gereçleri alımları : 6.000 YTL<br />
06.2.3.01 Gıda ürünleri, içecekler ve tütün alımları : 7.500 YTL<br />
06.2.6.01 Kağıt ve kağıt ürünleri alımı : 500 YTL<br />
06.2.7.01 Kimyevi madde ile kauçuk ve plastik ürün alımları: 8.000 YTL<br />
06.2.9.01 Diğer alımlar : 1.000 YTL<br />
06.5.4.01 Yakacak alımları : 500 YTL<br />
06.5.4.02 Akaryakıt ve yağ alımları : 500 YTL<br />
06.5.4.03 Elektrik alımları : 500 YTL<br />
06.5.5.01 Posta ve telgraf giderleri : 500 YTL<br />
06 Toplam :25.000 YTL<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
Ocak 2009 -Nisan 2009 Altyapı hazırlıklarının yapılması<br />
Nisan 2009- Temmuz 2009 Kimyasal ve deney <strong>hayvan</strong>larının temini<br />
Temmuz 2009 -Eylül 2009 Ön çalışmanın yapılması<br />
Eylül 2009 -Aralık 2009 Mevcut araştırmanın yapılması<br />
Aralık 2009- Mart 2010 Numunelerin alınarak analizlerin yapılması<br />
Mart 2010-Ocak 2011 Sonuçların değerlendirilerek raporun hazırlanması.<br />
122
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
Kayden H. J., Chow C. K. and Bjarnson L. K. (1973). Spectrophotometric method for<br />
determination of tocopherol in red blood cells. J. Lip. Res. 14: 533–540.<br />
Lawrence R. A. and Burk R. F. (1976). Glutathione peroxidase activity in selenium-deficient rat<br />
liver. Bioch. Bioph. Res Commun. 71: 4, 952–958.<br />
Matkovics B., Szabo I. and Varga I. S. (1988). Determination of enzyme activities in lipid<br />
Peroxidation and Glutathione Pathways (in Hungarian). Lab. Diag. 15, 248–249.<br />
Placer Z. A., Cushmann L. L. and Johnson B. C. (1966). Estimation of Products of lipid<br />
peroxidation in biochhemical systems. Anal. Biochem. 16: 359–364.<br />
Sedlak J. and Lindsay R. H. C. (1968). Estimation of total protein bound and nonprotein sulfhydryl<br />
groups in tissue with Ellmann’s reagent. Anal Biochem. 25: 192–205.<br />
Suzuki J, Katoh N. A Simple an cheap methods for measuring serum vitamin A in cattle usingy<br />
only a spectrophotometer. Jpn Vet Sci 1990; 52 (6): 1282–1284.<br />
Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105: 121-126.<br />
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the<br />
folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1): 265-75.<br />
Lyall, F., Young, A., Greer, I.A. (1995). Nitric oxide concentrations are increased in the<br />
fetoplacental circulation in preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 173(3): 714-718.<br />
Tietz, N.W. (1986). Textbook of Clinical Chemistry. WB. Sounders Company Philadelphia,<br />
1532-1534.<br />
Back, A., Sprenger, S., rajashekara, G., Halvoron, D.A., Nagaraja, K.V.(1997). Antimicrobial<br />
sensitivity of Ornithobacterium rhinotracheale isolatedfrom different geographic locations. The 48 th<br />
North Central Avian Diseases Conference. Des Moines. Iowa. pp: 1- 3, October, 12-<br />
Devrıese, L.A., Hommez, J., Vandamme, P., Kestes, K., Haesebrouck. (1995). In vitro antibiotic<br />
sensitivity of Ornithobacterium rhinotracheale strains from poultry and wild birds. Vet. Rec., 137,<br />
435-<br />
Van Empel, P., Vrijenhoek, M., Goovaerts, D., Bosch, H. (1999). Immunohistochemical and<br />
Serological İnvestigation of Experimental Ornithobacterium rhinotracheale İnfection in Chickens.<br />
Avian Pathol. 28: 187- 193.<br />
Van Veen, L.V., Van Empel, P., Fabrı, T. (2000). ORT, a primary pathogen in broilers. Avian Dis.<br />
44: 896- 900.<br />
Roepke, D.C., Back, A., Shaw, P., Nagaraja, K.V., Sprenger, S.J., Halvorson, A.D. (1998).<br />
Isolation and İdentification of Ornithobacterium rhinotracheale from Commercial Turkey Flocks in<br />
the Upper Midwest. Avian Dis. 42: 219- 221.<br />
Charlton, B. R., Channıng-Santıago E. S., Bıckford, A. A., Cardona, J. C., Chın, P. R.,Cooper,<br />
G. L., Droul, R., Jeffrey, J. S., Meteyer, U. C., Shıvaprasad, H. L., Walker, L. R. (1993):<br />
Preliminary characterization of a pleomorphic gram-negative rod associated with avian<br />
respiratory disease. J. Vet. Diagn. Invest., 5:47-51.<br />
Jones, R.C. (1998): Respiratory Diseases, Fourth Asia Pacific Poultry Health Conference, 22-26<br />
November, Melbourne, Australia, 75-84.<br />
Van Empel P., Hafez H. M. (1999): Ornithobacterium rhinotracheale : a review. Avian Pathol., 28,<br />
217-<br />
Sprenger, J. S., Back, A., Shaw, P. D., Nagaraja, V. K.,Repke, D. C., Halvarson, A. D.(1998):<br />
Ornithobacterium rhinotracheale infection in turkeys:experimental reproduction of the disease.<br />
Avian Dis., 42:154-161.<br />
Vandamme, P., Segers, P., Vancanneyt, M., Hove, K. Van, Mutters, R., Hommez, J.,Dewhırst, F.,<br />
Paster, B., Kersters, K., Falsen, E., Devrıese, L. A., Bısgaard, M., Hınz, K. H.,<br />
Mannheım, W. (1994): Ornithobacterium rhinotracheale gen. nov., sp. nov., isolated from the avian<br />
respiratory tract. Int. J. Syst. Bacteriol., 44 : 24-37.<br />
Varga, J., Fodor, L., Makraı, L. (2001): Characterisation of some Ornithobacterium rhinotracheale<br />
strains and examination of their trnsmission via eggs, Acta Vet. Hung. 49(2):125-130.<br />
Pari, L., Gnanasoundari, M. (2006). Influence of naringenin on oxytetracycline mediated oxidative<br />
damage in rat liver. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 98(5): 456-61.<br />
123
Parlakpinar, H., Tasdemir, S., Polat, A., Bay-Karabulut, A., Vardi, N., Ucar, M., Acet, A. (2005).<br />
Protective role of caffeic acid phenethyl ester (cape) on gentamicin-induced acute renal toxicty in<br />
rats. Toxicology. 207(2): 169-77.<br />
Oz, E., Ilhan, M.N. (2006). Effects of melatonin in reducing the toxic effects of doxorubicin. Mol<br />
Cell Biochem. 286(1-2): 11-5.<br />
Pari, L., Gnanasoundari, M. (2006). Influence of naringenin on oxytetracycline mediated oxidative<br />
damage in rat liver. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 98(5): 456-61.<br />
Bankova V, Dyulgerov A, Popov S, Evstatieva L, Kuleva L, Pureb O, Zamjansan Z. Propolis<br />
produced in Bulgaria and Mongolia: Phenolic compounds and plant origin. Apidologie 1992; 23;<br />
79-85.<br />
Greenaway W, Scaysbrook T, Whatley FR. The analysis of bud exsudate of populus X<br />
euramericana, and propolis by gas chromatografy-mass spectrometry. Proc P Soc Lond B. 1987;<br />
232:249-72.<br />
Garcia-Viguera C, Ferreres F, Tomas-Barberan FA. Study of Canadian propolis by GC-MS and<br />
HPLC. Z Naturforsh 1993; 48: 731-35.<br />
Amaros M, sımoes CMO, Girre L, sauvager F, Cormier M. Synergistic effect of flavones and<br />
flovonols against herpes simplex virus type 1 in culture: Comparison with antiviral activity of<br />
propolis. J nat prod 1992; 55(12): 1732-40.<br />
Dobrowolski JW, Vohoraq SB, Sharma K, Shah SA, Naqvi SAH, Dandiya PC. Antibacterial,<br />
antifungal, antiameboic, antiinflamatory and antipyretic studies on propolis bee products. J<br />
Ethanopharmacol 1991; 35:77-82.<br />
Focth J, Hansen SH, Nielsen JV, Van den Berg-Segers A, Riezler R. Bactericidal effect of propolis<br />
in vitro against agents causing upper respiratory tract infections. Arzneim Forsch/Drug Res. 1993;<br />
43(2): 921-23.<br />
Amaros M, Lurton E, Boustie J, Girre L. Comparison of the anti-herpes simplex virus activities of<br />
propolis and 3-methyl-but-2-enyl caffeate. J Nat Prod. 1994. 57:644-7.<br />
Amaros M, sauvager F, Girre L, Cormier M. In vitro antiviral activity of propolis. Apidologie<br />
1992. 23: 231-40.<br />
Stazyk J, Scheller S, Szaflarski J, Moskwa M, Stojko A. Biological properties and clinical<br />
application of propolis: II: Studies on the antiprotozoan activity of ethanol excract of propolis.<br />
Arzneim Forsh/Drug res 1977; 27(1): 1198-99.<br />
Grange JM, Davey RW. Antibacterial properties of propolis (Bee Glue). J Royal Soci Med 1990;<br />
83: 159-60.<br />
Pascual C, Gonzales R, Torricella RG. Scavenging action of propolis extract against oxygen<br />
radicals. J Ethnopharmacol. 1994; 41: 9-13.<br />
Scheller S, Wilczok T, Imielski S, Krol W, Gabrys J, Shani J. Free radical scavenging by ethanol<br />
extract of propolis. Int J radiat Biol. 1990; 57(3): 461-65.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı<br />
İmza<br />
Tarih<br />
14.1.Proje Lideri :Dr. Fulya BENZER<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü :Ünal KILINÇ<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar :F.Ü Vet. Fak. Biyokimya A.B.D.<br />
14.5. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar :F.Ü Vet. Fak. Sivrice Meslek Yüksek Okulu<br />
124
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI :<br />
Pekin Ördeklerinde Yerleşim Sıklığının Büyüme Performansı, Karkas Özellikleri,<br />
Lipid Peroksidasyon ve Antioksidanlar ile Bazı Biyokimyasal Kan Parametreleri<br />
Üzerine Etkisi.<br />
The Effects on Growth, Carcass Characteristics, Lipid Peroksidation, Antioksidans and<br />
Biocemical Blood Parameters of Stocking Density in Pekin Ducks.<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ :<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü-ELAZIĞ<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Yrd. Doç. Dr. Zeki ERİŞİR<br />
Kurumu : Fırat Üniversitesi Sivrice Meslek Yüksek Okulu<br />
4 . Projenin İlgili Olduğu AFA/Program:<br />
Araştırma Fırsat Alanı : Kanatlı Hayvanlar<br />
Araştırma Programı :<br />
5. PROJE SÜRESİ : 15 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : Şubat 2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : Mayıs 2010<br />
5. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Bu çalışmada arttırılan yerleşim sıklığının pekin ördeklerinde büyüme, kesim<br />
özellikleri, karkas özellikleri, kanda bazı mineraller, lipid peroksidasyonu ve antioksidan<br />
düzeyleri üzerine etkisini araştırmak; elde edilen değerleri karşılaştırarak stresin hangi<br />
sıklık grubunda görülebileceğini belirlemek amaçlanmıştır. Araştırma 4 grup üzerinde<br />
çalışılacaktır. Her gruptan 3 tane olacak şekilde hazırlanacaktır:<br />
1. Grup: 10 adet,<br />
2. Grup: 14 adet,<br />
3. Grup: 18 adet,<br />
4. Grup: 22 adet, olacak şekilde ördek palazları kullanılacaktır.<br />
Uygulama 12 hafta sürecek. Hayvanlar her hafta tartılarak büyüme performansları<br />
tespit edilecektir. Uygulama sonrası <strong>hayvan</strong>lar kesilerek karkas randımanları (sıcak ve<br />
125
soğuk) ve karkas özelliklerinden, derili ve derisiz göğüs, but ve diğer kısımlar, karın yağı,<br />
yenebilen iç organların miktar ve oran olarak değerlendirilecektir. Kanda ise biyokimyasal<br />
olarak ürik asit, glikoz, Pi, ALP, total protein ile lipid peroksidasyon, glutatyon (GSH),<br />
glutatyon peroksidaz (GSH- Px), katalaz, E vitamini, A vitamini, β karoten; minerallerden<br />
Cu, Zn, Ca, Mn, Mg’a bakılacaktır.<br />
Summary: The aim of this study is to research effects of stocking density on some<br />
minerals and lipid peroxidation and antioxidans level in blood, carcass and slaughter<br />
characteristics, growth of Pekin ducks. The experiment will have four groups. (Each group<br />
will have 3 subgroups): Group 1: 10 number, Group 2: 14 number, Group 3: 18 number,<br />
Group 4: 22 number duck chicks. The research will last for 8 weeks. Birds will be weighed<br />
individually at the end of every weeks in order to determine live weight increases. Ducks<br />
will be slaughtered at the end of 8th weeks. Carcass percentage (hot and cold), carcass and<br />
slaughter characteristics (breast without and with skin, legs and others, abdominal fat,<br />
liver, heart) will be weighed. Some minerals (Cu, Zn, Ca, Mn, Mg) and lipid peroxidation<br />
and antioxidants (GSH, GSH-Px, CAT, Vitamin A, Vitamin E, β carotene) levels in blood<br />
will be measured.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER:<br />
Yerleşim sıklığı, büyüme, karkas özellikleri, lipid peroksidasyon, mineral madde, ördek<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1. Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Ördek yetiştiriciliği <strong>hayvan</strong>sal protein ihtiyacının karşılanması yönünde önemle<br />
üzerinde durulması gereken <strong>hayvan</strong>cılık kollarından birisidir. Bölgede pek yaygın olmayan<br />
ördek yetiştiriciliğinin tanıtılması ve yaygınlaştırılması bölge halkı için bir iş sahası<br />
olabileceği düşünülmektedir.<br />
Birçok kanatlı türünde yerleşim sıklığına yönelik çalışmalar yapılıp ve bu kanatlı<br />
türlerinde büyüme performansı, karkas özellikleri ve kan parametreleri için ideal yerleşim<br />
sıklığı tespitleri yapılmışken, yaptığımız araştırmalarda Pekin ördekleri için böyle<br />
çalışmaların yapılmadığı görülmüştür. Bu çalışmada yerleşim sıklığının, pekin<br />
ördeklerinde büyüme, karkas özelliklerini ve bazı biyokimyasal kan parametreleri üzerine<br />
etkisini araştırmak ve elde edilen değerleri karşılaştırarak stresin hangi sıklık grubunda<br />
daha fazla görülebileceğini belirlemek amaçlanmıştır.<br />
8.2. Literatür Özeti:<br />
Koçak ve Sundaram, ördekler hem ekstansif hem de entansif yetiştirmeye uygun<br />
<strong>hayvan</strong>lardır. Fransa, Çin, Amerika Birleşik Devletleri, Japonya gibi bazı ülkelerde daha<br />
çok entansif olarak yetiştirilmektedirler. Ülkemizde ise büyük ölçüde ekstansif olarak<br />
yetiştirilmektedirler.<br />
Chang- hai, Şenköylü; ördeklerin kuluçka çıkış ağırlığı ortalama 50g olup, ikinci<br />
haftanın sonunda ortalama 600 g’ın üzerinde bir ağırlığa ulaşırlar. Pekin ördekleri 7- 8<br />
haftada ergin çağ canlı ağırlıklarının % 90’ına ulaşırlar. Et tipi ördek yetiştiriciliği için<br />
pekin ördekleri önerilmektedir.<br />
Freman; kanatlı yetiştiriciliğinde, üzerinde durulan en önemli stres faktörleri<br />
iklimsel (sıcak, soğuk), çevresel (ışık, karanlık, nakil, yükseklik), besinsel (aşırı tuz, besin<br />
kıtlığı), fizyolojik (elektrik şoku, anestezi), fiziksel (hareketsizlik, kalabalık), sosyal (grup<br />
yapısındaki değişiklikler) ve psikolojik (korku, gürültü) faktörler olarak<br />
sınıflandırılmaktadır. Bu stres faktörlerinden biri de yerleşim sıklığıdır.<br />
Önderci ve arkadaşları, çevresel stresden yüksek sıcaklık özellikle bıldırcınlarda<br />
vitamin A, C miktarının artmasına, bazı antioksidanların da düşmesine neden olmuştur.<br />
126
Koçak; <strong>hayvan</strong>ların genetik kapasitelerinden tam olarak yararlanabilmek için çevre<br />
koşulları üzerinde önemle durulması gerekmektedir. Hayvanlara sağlanan bakım, besleme<br />
ve barınma önemli çevre koşullarını oluşturmaktadır. Kanatlılarda kümesin yapısı,<br />
havalandırma, aydınlatma, ısı ve nemin yanı sıra yerleşim sıklığı da önemli barınma<br />
koşullarından birisidir. Birim alana gereğinden fazla sayıda <strong>hayvan</strong> konulması, stres ve<br />
hastalık riskini artırarak büyümede gerilemeye, et kalitesinde bozulmaya neden olurken,<br />
gereğinden az <strong>hayvan</strong> konulması ise ekonomik kayıplara sebep olmaktadır.<br />
8.3. Materyal ve Metot:<br />
Araştırmanın <strong>hayvan</strong> materyalini, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi<br />
çiftliğinde bulunan kuluçkahaneden 192 tane Pekin ördeği palazı alınacak. Ankara’dan<br />
getirilen palazlar Elazığ Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsünde, 1x 2 m ebadında<br />
hazırlanmış bölmelere yerleştirilecek. Dört grup oluşturulacak. Her gruptan da üçer tane<br />
hazırlanacak:<br />
1. Grup: 10 adet;<br />
2. Grup: 14 adet;<br />
3. Grup: 18 adet,<br />
4.Grup: 22 adet hindi palazı olacak şekilde yerleştirilecek ve her yerleşim sıklığı<br />
grubundan 3 adet oluşturulacaktır. Altlık olarak hızar talaşı kullanılacaktır. Palazlara ilk iki<br />
hafta civciv büyütme yemi (% 22 ham protein, 3100 kcal/kg), daha sonraki 6 hafta<br />
boyunca büyütme-bitirme yemi (% 17 ham protein, 2950 kcal/kg) ad libitum verilecektir.<br />
Hayvanlar tartılarak kümese yerleştirilecek ve her hafta tartılarak canlı ağırlık<br />
artışları tespit edilecektir. Besi süresi sonunda her gruptan <strong>hayvan</strong>lar kesilerek karkas<br />
randımanları (sıcak ve soğuk) ve karkas özelliklerine (derili ve derisiz göğüs, but ve diğer<br />
kısımlar, karın yağı, yenebilen iç organlar- karaciğer, kalp, taşlık- miktar ve oran olarak<br />
değerlendirilecektir) ait değerler tespit edilecektir. Kanda ise bazı biyokimyasal değerlere,<br />
antioksidan ajanlara, bazı minerallere bakılacaktır.<br />
Alınan serumlarda ürik asit, glikoz, Pi, ALP, total protein ve Ca, Cu, Zn, Mn, Mg,<br />
Zn düzeyleri saptanacaktır.<br />
Kan örneklerinde; lipid peroksidasyonun son ürünü olan malondialdehid (MDA)<br />
Matkovics ve ark. tarafından modifiye edilen Placer ve ark. yöntemine göre<br />
spektrofotometre ile belirlenecektir. E vitamini Kayden ve ark. metoduna göre (Shimadzu<br />
UV-120-01 Spektrophotometer Japan) spektrofotometresi ile ölçülecektir. A vitamini ve βkaroten<br />
düzeyleri Suzuki ve Katoh’nın tarif ettiği şekilde tespit edilecektir. GSH-Px<br />
aktivitesi düzeyi Lawrence ve ark. tarif ettiği şekilde belirlenecektir. GSH düzeyi Sedlak<br />
ve Lindsay ‘ın tarif ettiği şekilde ölçülecektir. Katalaz enzimi tayini Goth ‘un tarif ettiği<br />
şekilde yapılacaktır. Kan serumu protein konsantrasyonu Gornal ve ark. tarif ettiği şekilde<br />
biüret yöntemi ile belirlenecektir.<br />
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
Bölgede tavukçuluk dışında kanatlı sektörü yok denecek kadardır. Tavukçuluğun<br />
dışındaki kanatlılar da bölgede yaygın hale gelmesi ekonomik açıdan bölgeye katkı<br />
sağlayacağı kanaatindeyiz. Pek yaygın olmayan ördek yetiştiriciliğinin tanıtılması ve<br />
yaygınlaştırılması bölge halkı için bir iş sahası olabileceği düşünülmektedir. Ördek<br />
yetiştiriciliği <strong>hayvan</strong>sal protein ihtiyacının karşılanması yönünden de üzerinde durulması<br />
gereken <strong>hayvan</strong>cılık kollarından birisidir.<br />
Yetiştiriciliğin rantabıl yapılabilmesi için ekonomik kayıplara yol açabilecek<br />
faktörlerin belirlenerek giderilmesi gerekir. Birim alana gereğinden fazla sayıda <strong>hayvan</strong><br />
konulması, stres ve hastalık riskini artışına dolayısıyla da ekonomik kayıplara yol<br />
açabilmektedir. Bu sebeple, ördek yetiştiriciliği açısından birim alana konulması gereken<br />
<strong>hayvan</strong> sayısının belirlenmesi önem arz etmektedir.<br />
127
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Yrd. Doç. Dr. Zeki ERİŞİR, Zootekni Yrd. Doç.<br />
9.2. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Mehtap ÖZÇELİK, Biyokimya Doktoralı.<br />
9.3. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Fulya BENZER, Biyokimya Doktoralı.<br />
9.4. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Halil ŞİMŞEK, Fizyoloji Doktoralı.<br />
9.5. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Osman GÜLER, Farmakoloji Doktoralı.<br />
9.6. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Doç. Dr. Mine Erişir, Biyokimya Doçenti.<br />
9.7. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Dr. Bülent Taşdemir, Biyokimya Doktoralı.<br />
9.8. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı: Uzm. Hatice İÇYEROĞLU, Parazitoloji<br />
Uzmanı.<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Spektrofotomere, Atomik Absorbsiyon, Soğutmalı<br />
santrifüj, normal santrifüj, çalkalayıcı benmari, vortex vb.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım : Yok<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri:<br />
1- Tavuklarda Ornithobacterium rhinotracheale İle Oluşturulan Deneysel Enfeksiyonlarda<br />
Kültür, PCR İle Tespiti ve Biyokimyasal Parametrelerdeki Değişikliklerin Saptanması,<br />
2- Tavuklarda Deneysel Salmonella enteritis Enfeksiyonlarda Etken Saptanması ve<br />
Antibiyotik Kullanımının Bazı Biyokimyasal Parametreler Üzerine Etkisi;<br />
3- Bal ve Polenin Kadmiyum Verilen Sıçan(Rat)’lardaki Lipit Peroksidasyonu Üzerine<br />
Antioksidan Etkileri;<br />
4- Çörek Otu Tohumunun Kurşun Verilen Sıçan(Rat)’lardaki Lipit Peroksidasyonu<br />
Üzerine Antioksidan Etkisi isimli araştırma projeleri yürütülmektedir. Ayrıca laboratuara<br />
normal olarak gelen numunelerin rutin analizleri yapılmaktadır<br />
TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI 2000<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
8500<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI -<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
-<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
1500<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
-<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
-<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA) -<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER -<br />
TOPLAM 120000<br />
128
IV. 2007 YILI YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI:<br />
06.1.3.04 Laboratuvar gereçleri alımları : 2000 YTL<br />
06.2.3.01 Gıda ürünleri, içecekler ve tütün alımları : 5000YTL<br />
06.2.6.01 Kağıt ve kağıt ürünleri alımı : 1000 YTL<br />
06.2.7.01 Kimyevi madde ile kauçuk ve plastik ürün alımları : 1000 YTL<br />
06.2.9.01 Diğer alımlar : 1500 YTL<br />
06.5.4.01 Yakacak alımları : 500 YTL<br />
06.5.4.02 Akaryakıt ve yağ alımları : 500 YTL<br />
06.5.4.03 Elektrik alımları : 400 YTL<br />
06.5.5.01 Posta ve telgraf giderleri : 100 YTL<br />
06 Toplam : 12000 YTL<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
Ocak 2009- Şubat 2009 Altyapı hazırlıklarının yapılması<br />
Mayıs 2009-Haziran 2009 Hayvan Alınması, Uygulamanın başlaması<br />
Haziran 2009- Ağustos 2009 Deneysel Aşama tamamlanacak, Hayvanların Kesimi<br />
Eylül 2009 - Mayıs 2010 Numunelerin analizleri yapılarak değerlendirilmesi ve sonuç<br />
raporunun hazırlanması<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1. Koçak Ç., Yalçın S. (1993). Ördek Yetiştirme. Ege Üniversitesi Basımevi Bornova, İzmir.<br />
2. Sundaram TST. (1989). Comparative Egg Production Efficiency of Chickens Ducks and<br />
Quails. Poultry Int. May 28(5):60.<br />
3. Chang-hai Z., Sigeru O., Kei-ichi T. (2000). Carcass Composition, Parts Proportion and Fat<br />
Deposition of Meat-Type Groving Ducks. Japanase Poultry Science. Vol. 37: 357-364.<br />
4. Şenköylü N. (1989). Ördek Yetiştirme ve Besleme. Yem Sanayi Dergisi. Ekim 65.<br />
5. Freeman B.M.(1985): Stress and the Domestic Fowl: Physiological Factor Fantasy? World’s<br />
Poult Sci J.; 41: 45-51.<br />
6. Freeman B.M. (1987): The Stress Syndrome. World’s Poult. Sci. J.; 43: 15-19.<br />
7. Koçak Ç. (1985): Bıldırcın Üretimi. Ege Zootekni Dern. Yay. 1, Bilgehan Basımevi, Bornova,<br />
İzmir.<br />
8- Onderci M, Sahin N, Cikim G, Vijaya J, Kucuk O. (2005): Biol. Trace Elem. Res.<br />
Aug;106(2):165-76. Effects of dietary combination of chromium and biotin on growth<br />
performance, carcass characteristics, and oxidative stress markers in heat-distressed Japanese quail.<br />
9- Gornal A. G., Bardawill C. J and David M. M. (1975). Determination of serum proteins by<br />
means of the biüret reaction. J. Biol. Chem. 177: 751.<br />
10- Goth L. (1991). A simple method for determination of serum catalase activity and revision of<br />
reference range. Clin. Chim. Acta. 196: 143–152.<br />
11- Kayden H. J., Chow C. K. and Bjarnson L. K. (1973). Spectrophotometric method for<br />
determination of tocopherol in red blood cells. J. Lip. Res. 14: 533–540.<br />
12- Lawrence R. A. and Burk R. F. (1976). Glutathione peroxidase activity in selenium-deficient<br />
rat liver. Bioch. Bioph. Res Commun. 71: 4, 952–958.<br />
13- Matkovics B., Szabo I. and Varga I. S. (1988). Determination of enzyme activities in lipid<br />
Peroxidation and Glutathione Pathways (in Hungarian). Lab. Diag. 15, 248–249.<br />
14- Suzuki J, Katoh N. (1990): A Simple an cheap methods for measuring serum vitamin A in<br />
cattle usingy only a spectrophotometer. Jpn Vet Sci 1990; 52 (6): 1282–1284.<br />
15- Sedlak J. and Lindsay R. H. C. (1968). Estimation of total protein bound and nonprotein<br />
sulfhydryl groups in tissue with Ellmann’s reagent. Anal Biochem. 25: 192–205.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Yrd. Doç. Dr. Zeki ERİŞİR<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Ünal KILINÇ<br />
14.3. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : F.Ü Vet. Fak. Biyokimya A.B.D.<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : F.Ü Sivrice MYO<br />
129
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE ÖN TEKLİFİ<br />
TAGEM TARAFINDAN DOLDURULACAKTIR<br />
Araştırma Alan kodu : Araştırma Öncelik Puanı :<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplanan proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1-Proje Başlığı :<br />
Elazığ Yöresindeki Tavuk ve Sineklerden Campylobacter jejuni ve Campylobacter<br />
coli’nin İzolasyonu ve İzolatların Moleküler Tiplendirilmesi<br />
“Molecular Typing of Isolates and Isolation of Campylobacter jejuni and Campylobacter<br />
coli from chickens and flies in Elazig region”<br />
2. Araştırma Enstitüsü : Elazığ Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
3. Proje Lideri<br />
Adı Soyadı: Yrd.Doç.Dr. Gökben ÖZBEY<br />
Kurumu: Fırat Üniversitesi, Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksek Okulu<br />
4. Projenin ilgili Olduğu AFA / Program<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta<br />
Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı : Kanatlı Yetiştiriciliği □ □<br />
■ Araştırma Programı : Kanatlı Hastalıkları □ □<br />
■<br />
5. PROJE SÜRESİ : 12 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : Şubat 2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : Şubat 2010<br />
6. Projenin Özet Tanıtımı:<br />
Campylobacteriosis tüm dünyada insanlarda ve <strong>hayvan</strong>larda ishallere neden olan<br />
gıda kaynaklı bir enfeksiyondur. Campylobacter türleri içerisinde en sık görülen tür<br />
Campylobacter jejuni’dir.<br />
Bu çalışmada Elazığ ilindeki kümeslerden elde edilecek tavuklarda, bu kümeslerin<br />
yakınındaki sineklerde termofilik Campylobacter’lerin klasik yöntemler ile izolasyonu,<br />
izole edilen etkenlerden elde edilen DNA’lar ile genotiplendirme çalışmaları [polymerase<br />
chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)] yapılarak<br />
izolatların genetik profillerinin saptanması ve bu profillerin karşılaştırması yapılacaktır.<br />
Böylelikle insanlardaki ishallerin en önemli sebebi olarak bilinen Campylobacter’lerin<br />
kanatlılardaki kolonizasyonunda sineklerin rolünün açıklanmasına dair önemli bilgiler elde<br />
edilebilecektir..<br />
Araştırmada Temmuz-Ağustos ayları arasında, daha önceden tespit edilen 5 farklı<br />
kümesteki tavuklardan steril koşullarda fekal swab örnekleri toplanacaktır. Ayrıca<br />
kümeslerin yakınındaki sineklerde toplanacaktır. Bu swablar Brain Heart Infusion (BHI)<br />
broth içerisinde laboratuara getirilecektir. Sonra swablar modifiye Cefoperazone Charcoal<br />
130
Deoxylcholate Agar (mCCDA) (CM739 + SR155 ilave edilmiş blood-free agar base)<br />
üzerine yayılarak ekim yapılacaktır. Besiyerleri mikroaerofilik şartlarda (%6 O2, %6 CO2,<br />
%4 H2 ve %84 N2) 42ºC’de 48 saat inkubasyona bırakılacaktır.<br />
Sinekler steril bir havanda 2 ml %0,9 tuzda süspanse edilecektir. Karışım 15,870 x<br />
g’de 7 dakika santrifüj edilecektir. Pelet 2 ml Bolton broth (SR0183 ve SR0048’li<br />
CM0983) içerisinde tekrar süspanse edilecektir ve zenginleştirme için 37 ºC’de 24 saat<br />
inkubasyondan önce vortekslenecektir. Zenginleştirmeden sonra, tüp tekrar santrifüj<br />
edilecek ve örneğin 100 µl’si modifiye Cefoperazone Charcoal Deoxylcholate Agar’a<br />
(mCCDA) (CM739 + SR155 ilave edilmiş blood-free agar base) ekim yapılacaktır. Petri<br />
kutuları mikroaerobik atmosferde (%6 O2, %6 CO2, %4 H2 ve %84 N2) 42ºC’de 48 saat<br />
inkube edilecektir. İzole edilen kolonilere geleneksel identifikasyon testleri yapılacaktır ve<br />
bu testler neticesinde Campylobacter şüpheli izolatların DNA’ları ekstrakte edilecektir.<br />
Sonra izolatlardan elde edilen DNA’lar ile spesifik DNA dizileri çoğaltılarak restriksiyon<br />
enzimleri (PCR-RFLP yöntemi) ile kesildikten sonra elektroforez yapılacak, jel ethidium<br />
bromide ile boyanacak ve ultraviyole transilluminatör’de oluşturdukları DNA profilleri<br />
incelenerek izolatlar arasındaki farklı genotipler saptanacaktır.<br />
7. Anahtar Kelimeler: Tavuk, sinek, Campylobacteriosis, PCR-RFLP.<br />
Summary: Campylobacteriosis is a foodborne infection which causes enteritis in human<br />
and animals in all world. C. jejuni is the most common species within Campylobacter<br />
species.<br />
In this study, Campylobacter spp will be isolated from chickens and files around<br />
flocks in Elazığ by classiccal methods. Genotyping studies will be performed to determine<br />
genetic profiles and to compare these profiles. Thus, important informations relating to<br />
explain of role of flies in avian colonization of Campylobacter spp. which known as the<br />
most important reason of enteritis in humans will be obtained.<br />
In this study, The fecal swabs will be collected from five different flocks and files<br />
around this flocks from July to August when files peak in activity. Swabs in Brain Heart<br />
Infusion (BHI) broth will be transported to the laboratory. Then, fecal swab samples from<br />
chickens will be streaked on modified Cefoperazone Charcoal Deoxylcholate Agar<br />
(mCCDA). These plates will be incubated at 42ºC for 48 h in microaerobic atmosphere<br />
((%6 O2, %6 CO2, %4 H2 and %84 N2).<br />
Each fly will be macerated in a steril mortar, suspended in 2 ml of 0.9% saline. The<br />
suspension will be centrifuged at 15,870 x g for 7 min. Following centrifugation, the pellet<br />
will be resuspended in 2ml Bolton broth (CM0983 with SR0183 and SR0048) and<br />
vortexed before incubation for enrichment at 37ºC for 24 h. After enrichment, the tube will<br />
again be centrifuged, and 100 µl of the sample from each of tubes will be cultured on<br />
modified Cefoperazone Charcoal Deoxylcholate Agar (mCCDA) (blood-free agar base<br />
supplemented with CM739 + SR155. Agar plates will be incubated at 42ºC for 48 h in<br />
microaerophilic conditions (%6 O2, %6 CO2, %4 H2 ve %84 N2). The isolates will be<br />
performed by conventional biochemical tests and DNA of Campylobacter suspected<br />
isolates will be extracted. Then, extracted DNA will be amplified. After digested using<br />
restriction enzymes (PCR-RFLP), products will be electrophoresed and stained by<br />
ethidium bromide. DNA fragments will be visualised under UV illumination.<br />
Key Words: Chicken, fly, Campylobacteriosis, PCR-RFLP.<br />
131
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1. Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Bu çalışmada, Elazığ ilindeki kümeslerdeki piliçlerde, bu kümeslerin yakınındaki<br />
sineklerde termofilik Campylobacter’lerin klasik yöntemlerle izolasyonu, bu suşların<br />
moleküler yöntemler kullanılarak genotiplendirilmesi amaçlanmaktadır.<br />
Ülkemizde şimdiye kadar yapılan çalışmalarda termofilik Campylobacterler’in<br />
konvansiyonel ve moleküler yöntemlerle izolasyonu, identifikasyonu ve<br />
genotiplendirilmesi yapılmıştır. Ancak hastalığın rezervuarları olan sineklerden<br />
izolasyonları ile ilgili bir çalışma mevcut değildir. Diğer ülkelerde de bu konuda çok az<br />
çalışma yapılmıştır ve kanatlılarda Campylobacteriosis’in oluşumunda rol oynayan<br />
sineklerin önemi ile ilgili detaylı çalışmalar bulunmamaktadır.<br />
Bu çalışma ile, Türkiye’de ilk defa sineklerden termofilik Campylobacter’ler izole<br />
edilecek, bu suşların genotiplendirmesi yapılarak yaygın olan genotipler saptanacak ve<br />
tavuk ve sineklerden elde edilen alt tiplerin karşılaştırması yapılacaktır.<br />
8.2. Literatür Özeti:<br />
Campylobacteriosis global önemi olan şiddetli gastroenterik insan hastalığıdır (1).<br />
C. jejuni’nin sebep olduğu Campylobacteriosis gelişmiş ülkelerde her yıl milyonlarca<br />
hastalık vakasına sebep olur ve en yaygın gıda kaynaklı bir enfeksiyondur (2). Tavuk<br />
ürünleri insan Campylobacteriosis’inin en önemli kaynaklarından birisidir (2). Vakaların<br />
sayısının kışın en düşük ve yazın en yüksek olduğu bildirilmiştir (3). Danimarka’da<br />
Campylobacter türleriyle enfekte tavuk kümeslerinin prevalansı yaz aylarında %60-80’e<br />
ulaşmıştır (4). Sıcak bölgelerde yazın daha yüksek oranda rastlanabilen Campylobacter<br />
infeksiyonları için identifiye edilen risk faktörleri direkt <strong>hayvan</strong> teması, ızgara türü<br />
yiyeceklerin yenmesi, havuzlarda yüzme, akarsulardan temin edilen işlenmemiş su ve diğer<br />
doğal kaynaklardır (5,6, 7,8). Bununla birlikte, bu faktörlerin tümü sporadik vakaların en<br />
fazla %50’sini açıklıyabilir (3). Izgara ve Campylobacteriosis arasındaki ilişki önceden<br />
varsayıldığı gibi, pişirilmemiş et veya kros-kontaminasyonlardan ziyade, sineklerle gıdanın<br />
kontaminasyonuna bağlı olabilir (9). Sinekler bakterilerin naklinde daha önemli bir rol<br />
oynarlar (9). İngiltere’de yapılan bir çalışmada Campylobacteriosis insidensi ve sinek<br />
yoğunluğunun arasında yakın bir ilişki olduğu gösterilmiştir (10). Sinekler, özellikle<br />
evlerde ve gıda fabrikalarında yaygın olarak bulunan Musca domestica türü, şiddetli bazı<br />
enterik bakteriyel hastalıkların iyi bilinen vektörleridir (11) ve Campylobacter türlerini<br />
taşıdıkları bildirilmiştir (12,13,14,15,16). Ventilasyon havasıyla broyler kümesine çok<br />
sayıda sinek girebildiği için vektör sinekler dışarıdaki çiftlik <strong>hayvan</strong>larından broyler’lere<br />
Campylobacter türlerini nakleder (15,17). Ayrıca sinekler insanlara Campylobacter<br />
türlerinin direkt naklinde de bir rol oynayabilirler (18,19). Bir sineğin kontamine feçes’i<br />
ziyaret edip etmediği ve bir insanın nasıl infekte olduğu şüpheli olduğu için epidemiyolojik<br />
araştırma güçtür (10).<br />
Campylobacteriosis’in epidemiyolojisi hala geniş ölçüde açıklanamamıştır (3).<br />
1983’de Rosef ve Kapperud sineklerin <strong>hayvan</strong>lardan insan gıdasına Campylobacter’in<br />
nakledilmesinde rol oynayabildiğini ifade etmişlerdir (12). Ondan sonra birkaç araştırıcı<br />
kanatlı Campylobacteriosis’in epidemiyolojisinde sineklerin rolünü belirtmişlerdir (13,15),<br />
fakat insan Campylobacter infeksiyonunda önemli vektörler olarak rol oynayan sinekler<br />
büyük ölçüde ihmal edilmiştir (20). Danimarka’da broyler kümesinin dışında yakalanan<br />
sivrisineklerin %8,2’sinin tavuklara C. jejuni’yi nakletme potansiyeline sahip olduğu<br />
bildirilmiştir (15). Aynı çalışmada 3 <strong>hayvan</strong>dan (broyler, koyun ve sinekler) ve broyler<br />
kümesinin hem içinden hem de dışarısından elde edilen 28 izolatın Pulsed Field Gel<br />
Electrophoresis (PFGE)’i neticesinde 27’sinin aynı klona ait olduğu tespit edilmiştir (15).<br />
132
Danimarka’da, 2003 yılında yapılan bir çalışmada; 489 C.jejuni izolatlarının flaA<br />
tiplendirme ile 30 alt tip gösterdiği rapor edilmiştir (21).<br />
Elazığ ilinde 2004 yılında yapılan bir çalışmada, tavuklardan izole edilen 57 adet C.<br />
jejuni ve 45 adet C. coli izolatlarının RFLP analizi sonucu 7 farklı alt tip elde edilmiştir<br />
(22). Kayseri’deki insan, köpek, sığır ve tavuklardan alınan örneklerden sırasıyla %1,43,<br />
%43,50, %31,16 ve %56 oranlarında C. jejuni izole edilmiştir ve izolatların DdeI enzimi<br />
ile RFLP analizi sonucu 20 farklı bant profili saptanmıştır (23). Yine aynı çalışmada HinfI<br />
enziminin suşların tiplendirilmesinde ayırıcı olmadığı ve farklı kaynaklardan izole edilen<br />
suşlar arasında benzer bant profili veren suşların bulunmadığı bildirilmiştir (23).<br />
8.3. MATERYAL VE METOT<br />
Örnek alınması<br />
Araştırma sinek populasyonunun yoğun olduğu Temmuz-Ağustos ayları arasında<br />
gerçekleştirilecektir. Araştırma süresince tespit edilen 5 kümesteki tavuklardan her hafta<br />
alınan fekal swab örnekleri BHI broth içinde laboratuara getirilecektir. Broyler<br />
kümeslerinin çevresindeki sineklerde Campylobacteriosis’in prevalansını belirlemek için<br />
sinekler küçük tek kullanımlık plastik torbalarla hazırlanan raketlerle kümesten 50 m<br />
uzaklıkta yakalanacaktır. Sinekler aynı gün içinde içerisinde laboratuara getirilerek<br />
izolasyon çalışmalarına başlanacaktır. (15).<br />
Kültür<br />
BHI broth içerisindeki bakteri süspansiyonundan bir öze dolusu alınacak ve<br />
modifiye Cefoperazone Charcoal Deoxylcholate Agar (mCCDA) (CM739 + SR155 ilave<br />
edilmiş blood-free agar base) üzerine yayılarak ekim yapılacaktır. Mikroaerofilik şartlarda<br />
(%6 O2, %6 CO2, %4 H2 ve %84 N2) 42ºC’de 48 saat inkubasyona bırakılacaktır. İzole<br />
edilen kolonilere geleneksel identifikasyon testleri yapılacaktır (15).<br />
Campylobacter saptanması için; sinekler steril bir havanda 2 ml %0,9 tuzda<br />
süspanse edilecektir. Karışım 15,870 x g’de 7 dakika santrifüj edilecektir. Pelet 2 ml<br />
Bolton broth (SR0183 ve SR0048’li CM0983) içerisinde tekrar süspanse edilecektir ve<br />
zenginleştirme için 37 ºC’de 24 saat inkubasyondan önce vortekslenecektir.<br />
Zenginleştirmeden sonra, tüp tekrar santrifüj edilecek ve örneğin 100 µl’si modifiye<br />
Cefoperazone Charcoal Deoxylcholate Agar’a (mCCDA) (CM739 + SR155 ilave edilmiş<br />
blood-free agar base) ekim yapılacaktır. Petri kutuları mikroaerobik atmosferde (%6 O2,<br />
%6 CO2, %4 H2 ve %84 N2) 42ºC’de 48 saat inkube edilecektir. İzole edilen kolonilere<br />
geleneksel identifikasyon testleri yapılacaktır (15).<br />
DNA teknikleri<br />
Önce izolatlardan DNA’larının ekstraksiyon işlemi yapılacaktır. Sonra izolatlardan<br />
elde edilen DNA’lar ile spesifik DNA dizileri çoğaltılarak restriksiyon enzimleri (PCR-<br />
RFLP yöntemi) ile kesildikten sonra elektroforez yapılacak, jel ethidium bromide ile<br />
boyanacak ve ultraviyole transilluminatör’de oluşturdukları DNA profilleri incelenerek<br />
izolatlar arasındaki farklılıkların varlığı araştırılacaktır.<br />
8.4. Bugüne Kadar Yapılan Çalışmalar, Elde Edilen Bulgular:<br />
Ülkemizde ve Elazığ İlinde şimdiye kadar yapılan çalışmalarda termofilik<br />
Campylobacterlerin geleneksel veya moleküler yöntemlerle izolasyon-identifikasyonu ve<br />
genotiplendirilmesi yapılmıştır (22,23,24,25). Yıldız ve Diker (24) iki farklı tavuk<br />
mezbahasında 170 karkastan alınan örneklerden %56 oranında C. jejuni ve %41.6 oranında<br />
C. coli izole etmişlerdir. Elazığ İlinde 2002 yılında yapılan bir çalışmada, broilere ait 150<br />
adet karaciğer ve barsak örneğinden toplam 25 (%16,6) C. coli ve 32 (%21,3) C. jejuni<br />
tespit edilmiştir (26). Yine Elazığ İlinde 2004 yılında yapılan bir çalışmada, tavuklardan<br />
izole edilen 57 adet C. jejuni ve 45 adet C. coli izolatlarının RFLP analizi sonucu 7 farklı<br />
133
alt tip elde edilmiştir (22). Ankara İlinde bulunan kafes kuşlarından alınan toplam 130<br />
dışkı örneğinin 14’ü (%11) termofilik Campylobacter türleri yönünden pozitif bulunmuştur<br />
(25). Kayseri’deki insan, köpek, sığır ve tavuklardan alınan örneklerden sırasıyla %1,43,<br />
%43,50, %31,16 ve %56 oranlarında C. jejuni izole edilmiştir ve izolatların DdeI enzimi<br />
ile RFLP analizi sonucu 20 farklı bant profili saptanmıştır (23). Yine aynı çalışmada HinfI<br />
enziminin suşların tiplendirilmesinde ayırıcı olmadığı ve farklı kaynaklardan izole edilen<br />
suşlar arasında benzer bant profili veren suşların bulunmadığı bildirilmiştir (23).<br />
Ancak hastalığın rezervuarı olan sineklerden izolasyonları ile ilgili bir çalışma<br />
mevcut değildir. Diğer ülkelerde de bu konuda çok az çalışma yapılmıştır ve kanatlılarda<br />
ve insanlarda Campylobacteriosis’in oluşumunda rol oynayan sineklerin önemi ile ilgili<br />
detaylı çalışmalar bulunmamaktadır.<br />
Bu çalışma ile, Türkiye’de ilk defa sineklerden termofilik Campylobacter’ler izole<br />
edilecek, bu suşların genotiplendirmesi yapılarak yaygın olan genotipler saptanacak ve<br />
tavuk ve sineklerden elde edilen alt tiplerin karşılaştırması yapılacaktır. Bu alt tiplerin<br />
ortaya konulması hastalığın epidemiyolojisinde, bulaşma yollarının tespitinde ve hastalıkla<br />
mücadelede izlenecek metotların tespiti açısından önemlidir. Ayrıca, bu çalışma ile<br />
ülkemizde bu konuda gelecekte yapılacak çalışmalara önemli veriler sağlamayı<br />
amaçlamaktayız.<br />
8.5. Beklenen Yararlar/ uygulamaya Aktarma/ Ekonomiye Katkı:<br />
Son yıllarda insanlarda Campylobacter türlerinin neden olduğu gastroenterit<br />
olgularında bir artış görülmektedir ve bu artışın sebebi tam olarak bilinmemektedir.<br />
Campylobacter’ler kanatlılarda çok önemli derecede ekonomik kayıplara neden olmazlar;<br />
fakat bu etkenler barsaklarda yerleşerek kesim sırasında karkas kontaminasyonuna ve<br />
böylece gıdalar aracılığı ile insanlara bulaşarak insanlarda gastroenteritis’in oluşumunu<br />
sağlarlar. Ülkemizde şimdiye kadar kanatlıların ve insan infeksiyonlarının rezervuarları<br />
ve potansiyel kaynakları olarak sineklerin önemi ile ilgili hiçbir çalışma yapılmamıştır. Bu<br />
çalışma ile, tavuklar ve sineklerden Campylobacter türleri izole edilerek, bu izolatların<br />
RFLP analizleri ile alt tipleri belirlenecektir. Bu alt tiplerin ortaya konulması hastalığın<br />
epidemiyolojisinde, bulaşma yollarının tespitinde ve hastalıkla mücadelede izlenecek<br />
metotların tespiti açısından önemlidir. Ayrıca, bu çalışma ülkemizde bu konuda gelecekte<br />
yapılacak çalışmalara önemli veriler sağlayacaktır.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ<br />
9.1.Proje Lideri: Yrd. Doç.Dr.Gökben ÖZBEY: Mikrobiyoloji Anabilim Dalı<br />
9.2.Yardımcı Araştırıcı: Dr. Bülent TAŞDEMİR: Biyokimya Anabilim Dalı’nda<br />
doktora.<br />
9.3. Yardımcı Araştırıcı: Dr. M. Nuri AÇIK: Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’nda doktora<br />
9.4..Yardımcı Araştırıcı: Doç.Dr.H.Basri ERTAŞ: Mikrobiyoloji Anabilim Dalı<br />
9.5. Yardımcı Araştırıcı: Doç.Dr. Hakan KALENDER: Mikrobiyoloji Anabilim Dalı<br />
9.6. Yardımcı Araştırıcı: Prof. Dr. Adile MUZ: Mikrobiyoloji Anabilim Dalı<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım: PCR thermal cycler, mikrosantrifüj, etüvler, derin<br />
dondurucu, elektroforez tankı ve güç kaynağı<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım: Yok<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri:<br />
1- Tavuklarda Ornithobacterium rhinotracheale İle Oluşturulan Deneysel Enfeksiyonlarda<br />
Kültür, PCR İle Tespiti ve Biyokimyasal Parametrelerdeki Değişikliklerin Saptanması,<br />
2- Tavuklarda Deneysel Salmonella enteritis Enfeksiyonlarda Etken Saptanması ve<br />
Antibiyotik Kullanımının Bazı Biyokimyasal Parametreler Üzerine Etkisi;<br />
134
3- Bal ve Polenin Kadmiyum Verilen Sıçan (Rat)’lardaki Lipit Peroksidasyonu Üzerine<br />
Antioksidan Etkileri;<br />
4- Çörek Otu Tohumunun Kurşun Verilen Sıçan (Rat)’lardaki Lipit Peroksidasyonu Üzerine<br />
Antioksidan Etkisi isimli araştırma projeleri yürütülmektedir. Ayrıca laboratuara normal olarak<br />
gelen numunelerin rutin analizleri yapılmaktadır<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI 5000<br />
06.2-MENKULSERMAYE ÜRETİM GİDERLERİ 7500<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI -<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
-<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
1500<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM -<br />
GİDERLERİ<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM GİDERLERİ -<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA) -<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER -<br />
TOPLAM 14000<br />
IV. 2008 YILI YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI:<br />
06.1.3.04 Laboratuvar gereçleri alımları : 5000 YTL<br />
06.2.3.01 Gıda ürünleri, içecekler ve tütün alımları : 1000 YTL<br />
06.2.6.01 Kağıt ve kağıt ürünleri alımı : 1000 YTL<br />
06.2.7.01 Kimyevi madde ile kauçuk ve plastik ürün alımları: 2500 YTL<br />
06.2.9.01 Diğer alımlar : 3000 YTL<br />
06.5.4.01 Yakacak alımları : 500 YTL<br />
06.5.4.02 Akaryakıt ve yağ alımları : 500 YTL<br />
06.5.4.03 Elektrik alımları : 400 YTL<br />
06.5.5.01 Posta ve telgraf giderleri : 100 YTL<br />
06 Toplam : 14000 YTL<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ<br />
Testlerin optimizasyonu Referens kültürler kullanılarak kültür, PCR-RFLP 1-3<br />
yöntemlerinin optimize edilmesi<br />
Materyallerin toplanması ve Temin edilecek materyallerin kültürü 3-5<br />
kültü ü<br />
İzolatların RFLP ile İzolatlardan elde edilen DNA’ların bildirilen 5-8<br />
incelenmesi<br />
yöntemlerle incelenerek etkenlerin tiplendirilmesi<br />
Kesin rapor yazımı Elde edilen sonuçlar değerlendirilerek literatürlerin 8-12<br />
ışığında kesin rapor yazılması<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1- Hald B, Sommer H, Skovgård H. Use of Fly Screens to Reduce Campylobacter spp. Introduction in<br />
Broiler Houses. Emerg Infect Dis. 2007 Dec; [Epub ahead of print].<br />
2- Tauxe RV. Incidence, trends and sources of campylobacteriosis in developed countries: an overview. In:<br />
The increasing incidence of human campylobacteriosis. Report and proceedings of a consultation of experts.<br />
21–25 Nov 2000, Copenhagen, Denmark. WHO/CDS/CSR/APH 2001.7. Geneva: World Health<br />
Organization; 2001. p. 42–3.<br />
135
3- Nylen G, Dunstan F, Palmer SR, Andersson Y, Bager F, Cowden J, Feierl G, Galloway Y, Kapperud G,<br />
Megraud F, Molbak K, Petersen LR, Ruutu P. The seasonal distribution of campylobacter infection in nine<br />
European countries and New Zealand. Epidemiol Infect. 2002; 128(3): 383-90.<br />
4- Danish Poultry Council. Database. Danish Meat Association, Copenhagen, Denmark. 2006.<br />
5- Kapperud G, Skjerve E, Bean NH, Ostroff SM, Lassen J. Risk factors for sporadic Campylobacter<br />
infections: results of a case-control study in southeastern Norway. J Clin Microbiol. 1992; 30: 3117–21.<br />
6- Eberhart-Phillips J, Walker N, Garrett N, Bell D, Sinclair D, Rainger W, Bates M. Campylobacteriosis in<br />
New Zealand: results of a case-control study. J Epidemiol Community Health. 1997; 51: 686–91.<br />
7- Studahl A, Andersson Y. Risk factors for indigenous Campylobacter infection: a Swedish case-control<br />
study. Epidemiol Infect. 2000; 125: 269–75.<br />
8- Schönberg-Norio D, Takkinen J, Hänninen ML, Katila ML, Kaukoranta SS, Mattila L, Rautelin H.<br />
Swimming and Campylobacter infection. Emerg Infect Dis. 2004; 10: 1474–7.<br />
9- Ekdahl K, Normann B, Andersson Y. Could flies explain the elusive epidemiology of campylobacteriosis?<br />
BMC Infect Dis. 2005; 5(1): 11.<br />
10- Nichols GL. Fly transmission of Campylobacter. Emerg Infect Dis. 2005;11:361–4<br />
11- Busvine JR. Disease transmission by insects: its discovery and 90 years of effort to prevent it.<br />
Berlin/Heidelberg: Springer-Verlag; 1993.<br />
12- Rosef O, Kapperud G. House flies (Musca domestica) as possible vectors of Campylobacter fetus subsp.<br />
jejuni. Appl Environ Microbiol. 1983; 45: 381–3.<br />
13- Shane SM, Montrose MS, Harrington KS. Transmission of Campylobacter jejuni by the housefly (Musca<br />
domestica). Avian Dis. 1985; 29: 384–91.<br />
14- Gregory E, Barnhart H, Dreesen DW, Stern NJ, Corn JL. Epidemiological study of Campylobacter spp.<br />
in broilers: source, time of colonization, and prevalence. Avian Dis. 1997; 41: 890–8.<br />
15- Hald B, Skovgård H, Bang DD, Pedersen K, Dybdahl J, Jespersen JB, Madsen, M. Flies and<br />
Campylobacter infection of broiler flocks. Emerg Infect Dis. 2004; 10: 1490–2.<br />
16- Szalanski AL, Owens CB, McKay T, Steelman CD. Detection of Campylobacter and Escherichia coli<br />
O157:H7 from filth flies by polymerase chain reaction. Med Vet Entomol. 2004; 18: 241–6.<br />
17- Hald B, Skovgård H, Pedersen K, Bunkenborg H, Madsen M. Insect screen against Campylobacter, an<br />
intervention study in broiler houses. In: Abstracts of Scientific Presentation, 13th International Workshop on<br />
Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms; Gold Coast, Queensland, Australia; September 4–8,<br />
2005.<br />
18- Rosenquist H, Nielsen NL, Sommer HM, Nørrung B, Christensen BB. Quantitative risk assessment of<br />
human campylobacteriosis associated with thermophilic Campylobacter species in chickens. Int J Food<br />
Microbiol. 2003; 83: 87–103.<br />
19- Nelson W, Harris B. Flies, fingers, fomites, and food. Campylobacteriosis in New Zealand, foodassociated<br />
rather than food-borne. N Z Med J. 2006; 119: U2128.<br />
20- Chin J.; ed. Control of communicable diseases manual. 17. Washington DC:American Public Health<br />
Association; 2000.<br />
21- Bang DD, Nielsen EM, Knudsen K, Madsen M. A one-year study of campylobacter carriage by<br />
individual Danish broiler chickens as the basis for selection of Campylobacter spp. strains for a chicken<br />
infection model. Epidemiol. Infect. 2003; 130: 323-333.<br />
22- Ertas HB, Cetinkaya B, Muz A, Ongor H. Genotyping of broiler-originated Campylobacter jejuni and<br />
Campylobacter coli isolates using fla typing and random amplified polymorphic DNA method. Int. J. Food<br />
Microbiol. 2004; 94: 203-209.<br />
23- Aydın F, Gümüşsoy KS, İça T, Sümerkan B, Eşel D, Akan M, Özdemir A. The prevalence of<br />
Campylobacter jejuni in various sources in Kayseri, Turkey, and molecular analysis of isolated strains by<br />
PCR-RFLP. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 2007; 31: 13-19.<br />
24- Yıldız A, Diker KS. Campylobacter contamination in chicken carcasses. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 1992;<br />
16: 433-<br />
25- Şeker E, Çelik A, Yardımcı H. Ankara İli’nde kafes kuşu dışkılarından termofilik Campylobacter<br />
izolasyonu. Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg., 2007; 54, 43-46.<br />
26- Ertas H.B., Cetinkaya, B., Muz, A., Ongor, H. Campylobacter jejuni by Polymerase Chain Reaction<br />
(PCR). Turk. J. Vet. Anim. Sci., 2002; 26: 1447-1452.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1. Proje Lideri : Yrd.Doç.Dr. Gökben ÖZBEY 25.01.2008<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Ünal KILINÇ 25.01.2008<br />
136
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI : İnaktif Mavidil Aşı Üretimi.<br />
“Production of Inactivated Bluetounge Vaccine”<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Arşt Enst.<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Özden KABAKLI<br />
Kurumu : Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu AFA/Program Veteriner ilaçları ve <strong>hayvan</strong> aşıları<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı: ______________________<br />
Araştırma Programı : _______________________<br />
5. PROJE SÜRESİ : 24 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : 01.01.2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : 01.01.2011<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Türkiye’ de 1978 yılından itibaren BT-4 suşundan hazırlanan monovalan attenue mavidil<br />
aşısı üretilmekte ve kullanılmaktadır. 1998- 2000 yıllarında görülen mavidil vakalarında<br />
serotiplerin BT-9, BT-16 gibi farklı olması ve serotipler arası kross bağışıklık olmaması<br />
sebebiyle bu serotipleri ve ileride ortaya çıkabilecek farklı serotiplere karşı monovalan<br />
veya polyvalan mavidil aşılarının kullanılması gerektiği ortaya çıkmıştır.<br />
Bu çalışmamızda attenuasyon çalışmaları tamamlanıncaya kadar mücadeleye<br />
devam edilebilmesi için inaktif mavidil aşı üretim tekniğinin Laboratuvarımıza<br />
yerleştirilmesi ve bugün için BT-4,BT-9, BT-16 serotiplerine karşı monovalan ve<br />
polyvalan inaktif aşı üretiminin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır.<br />
Bu aşı vero veya tercihen BHK 21 hücrelerinde üretilecek, Beta-propiolakton ile<br />
inaktive edilerek, adjuvant olarak Montanide ISA 206 kullanılarak inaktif mavidil aşısı<br />
üretimi çalışmaları yapılacaktır. Aşının kobay ve farelerdeki zararsızlık,<br />
koyunlarda,keçilerde potens, bağışıklık çalışmaları Enstitümüz deneme <strong>hayvan</strong> ünitesinde,<br />
koyunlarda yapılacak olan saha denemeleri TİGEM işletmelerinin ilgili Ünitesinde iki<br />
kurumun ortak çalışması şeklinde yürütülecektir.<br />
Summary: In Turkey since 1978, attenue monovalent BTV-4 vaccine has been produced<br />
and used. Incursions of different BTV serotypes, i.e. BT-9, BT-16, occurred between 1998<br />
and 2000, and cross neutralization lacking between different serotypes brought out the<br />
requirements of using monovalent or polyvalent inactivated vaccine against emerging new<br />
serotypes.<br />
137
In this study, the establishment of inactivated BT vaccine production technic in our<br />
laboratory, and for now production of serotype BT-4, BT-9, BT-16 monovalent or<br />
polyvalent inactivated vaccine was aimed in order to control BT until the attenuation<br />
studies are completed.<br />
The vaccine virus will be propagated in Vero or BHK-21 cell cultures, and<br />
inactivated with Beta-propiolactone. Subsequently by using adjuvant Montanide ISA 206<br />
inactivation studies will be carried out.<br />
Potens and efficacy tests at goat and sheep, safety tests at rat and mouse will be<br />
carried out in our Institute. Field study at sheep and cattle will be executed in TİGEM with<br />
cooperation of two foundations.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER:<br />
Mavidil-sığır-keçi-koyun-inaktif aşı-aşı- virus- virus nötralizasyon<br />
Bluetounge-cattle-goat-sheep-inactivated vaccine-vaccine-virus- virus<br />
neutralisation<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Mavidil virus hastalığı, Reoviridae familyasına ait Orbivirus genusunda yer alan<br />
mavidil virusu tarafından meydana gelen infeksiyöz, bulaşıcı olmayan bir hastalıktır.<br />
(3,7,13) Hastalık etkeni Ceratopogonidae familyasından Culicoides genusundaki sokucu<br />
sineklerle bulaşır. 24 serotipi bulunan mavidil virusuna bağlı gelişen infeksiyon, özellikle<br />
koyun ve keçiler başta olmak üzere diğer evcil ve yabani ruminantlarda önemli ekonomik<br />
kayıplara neden olmaktadır (3,7,13). Hastalık sığırlarda nadir görülür, görüldüğünde de<br />
hafif şiddette klinik belirtilere sebep olmaktadır. Ancak sığırlardaki önemi özellikle,<br />
subklinik seyreden hastalık uzun bir viremi dönemi bulunmasından dolayı insektlerin<br />
bulunmadığı dönemlerde virusun varlığını muhafaza etmesi açısından ve uluslar arası<br />
Ticaret kurallarının bu hastalıkta sığırlar için ağır şartlar taşıyor olmasından dolayı<br />
ekonomik olarak önem kazanmaktadır. Mavidil hastalığı Uluslar arası salgın Hastalıklar<br />
Organizasyonunun ( OIE) A listesinde yer almaktadır (3,7,13).<br />
Türkiye’ de mavidil hastalığı, klinik olarak 1944 yılında görülmüş , 1978 yılında<br />
Yonguç ve ark.( 19) tarafından serolojik olarak hastalık etkeni BT-4 olarak tespit<br />
edilmiştir. 1999 - 2000 yıllarında çıkan mavidil salgınında Etlik Merkez Veteriner Kontrol<br />
ve Araştırma Enstitüsü Viroloji Teşhiş Laboratuvarında elde edilen izoletler Pirbright<br />
Hayvan Sağlığı Enstitüsünde sırasıyla BT-9 ve BT-16 olarak identifiye edilmiştir. 1998<br />
den beri Akdeniz’ den Balkanlar’a ve Orta Avrupa’ ya kadar yayılan mavidil infeksiyonu<br />
salgınlarında bugüne kadar 7 serotip tespit edilmiş olup bunlar BT-2,BT-4, BT-8, BT-<br />
9,BT-15 ve BT-16 dır ( 9).<br />
Hastalıktan korunmada en önemli mücadele yöntemi aşılama ile bağışık sürülerin<br />
elde edilmesi olup, dünyada bugüne kadar mavidil salgınlarında monovalan veya<br />
polyvalan olarak attenue mavidil aşısı kullanılmıştır (1,8,11,12,13,14,18). Attenue aşılar<br />
inaktif aşılara göre daha ekonomik olup, daha iyi immun yanıt alınmaktadır. Özellikle<br />
hastalığın endemik olduğu bölgelerde klinik mavidil hastalığı salgınlarının kontrol<br />
edilmesinde oldukça etkilidir (11 ). Fakat bunun yanı sıra uluslarası <strong>hayvan</strong> ve <strong>hayvan</strong>sal<br />
ürünlere ilişkin kurallar gereği ve gebelik dönemindeki koyunlara , koç katımı döneminde<br />
koçlara uygulanamaması ve değişik araştırmacılar tarafından bildirildiği gibi (10) aşı<br />
suşlarının patojen saha suşları ile birlikte risk oluşturabileceği kaygısıyla son zamanlarda<br />
inaktif mavidil aşı çalışmaları tüm Avrupa Ülkelerinde önem kazanmıştır (2,11,15,17).<br />
Türkiye’ de 1978 yılından itibaren BT-4 suşundan hazırlanan monovalan attenue mavidil<br />
aşısı üretilmekte ve kullanılmaktadır. 1998- 2000 yıllarında görülen mavidil vakalarında<br />
138
serotiplerin farklı olması ve serotipler arası tam kross bağışıklık olmaması sebebiyle (16)<br />
bu serotipleri ve ileride ortaya çıkabilecek farklı serotiplere karşı monovalan veya<br />
polyvalan mavidil aşılarının kullanılması gerektiği ortaya çıkmıştır.<br />
Bugüne kadar tespit edilen BT-9, BT-16 serotipleri ile farklı serotiplerde salgın<br />
olması durumunda elde edilecek izoletlerin attenuasyon çalışmalarının<br />
gerçekleştirilebilmesi için uzun bir zaman gerekmektedir. Böyle bir durumda hastalıkla<br />
mücadelede erken davranabilmek için daha kısa sürede hazırlanabilen inaktif bir aşıya<br />
ihtiyaç duyulmaktadır.<br />
Bu çalışmamızda attenuasyon çalışmaları tamamlanıncaya kadar uygulamaya<br />
geçilebilmesi için inaktif mavidil aşı üretim tekniğinin Laboratuvarımıza yerleştirilmesi ve<br />
BT-4, BT-9, BT-16 serotiplerine karşı monovalan ve polyvalan inaktif aşı üretiminin<br />
gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır.<br />
8.2 Literatür Özeti:<br />
Mavidil virusu , Reoviridae familyasına ait Orbivirus genusunda yer alan çift<br />
iplikçikli RNA yapısında, 60-80 nm virion büyüklüğündedir. İç protein katmanının majör<br />
kompanentleri VP3 ve VP7, minör proteinleri VP1,VP4 ve VP6 dır. Kapsit ise VP2 ve<br />
VP5 olarak isimlendirilen iki proteinden oluşur.( 16 ). VP2 proteini nötralizan antijene<br />
sahip olup değişken sekansları nedeniyle virusun 24 serotipe ayrılmasına neden olur.<br />
Nötralizan antikorlar oluşturma özelliğinden dolayı hastalıktan korunmada da önemlidir<br />
(8). Mavidil virusu +4 ve –70°C de dayanıklı iken -20°C de daha az dayanır. Ultraviole ve<br />
gamma irradyasyon ışınlarına nisbeten daha dayanıklıdır. Stabil kaldığı pH 6,5-8<br />
civarındadır. Eter, kloroform gibi lipit solventlere daha dayanıklı iken asit,alkali, sodyum<br />
hipoklorit ve iodoforlar içeren dezenfaktanlarla inaktive olur (3). Hastalık etkeni<br />
Ceratopogonidae familyasından Culicoides genusundaki sokucu sineklerle bulaşır. mavidil<br />
virusuna bağlı gelişen bulaşıcı olmayan infeksiyon, , özellikle koyun ve keçiler başta<br />
olmak üzere diğer evcil ve yabani ruminantlarda önemli ekonomik kayıplara neden<br />
olmaktadır. Hastalık sığırlarda nadir görülür, görüldüğünde de hafif şiddette klinik<br />
belirtilere sebep olmaktadır. Ancak sığırlardaki önemi özellikle, subklinik seyreden<br />
hastalık uzun bir viremi dönemi bulunmasından dolayı insektlerin bulunmadığı<br />
dönemlerde virusun varlığını muhafaza etmesi açısından ve uluslar arası Ticaret<br />
kurallarının bu hastalıkta sığırlar için ağır şartlar taşıyor olmasından dolayı ekonomik<br />
olarak önem kazanmaktadır ( 3,7,13). Hastalıkta morbidite %80 ve mortalite %5-10<br />
arasında değişiklik göstermektedir.<br />
Türkiye’ de mavidil hastalığı, klinik olarak 1944 yılında görülmüş , 1978 yılında<br />
Yonguç ve ark.( 19) tarafından serolojik olarak hastalık etkeni BT-4 olarak tespit<br />
edilmiştir. 1999 - 2000 yıllarında çıkan mavidil salgınında Etlik Merkez Veteriner Kontrol<br />
ve Araştırma Enstitüsü Viroloji Teşhiş Laboratuvarında elde edilen izoletler Pirbright<br />
Hayvan Sağlığı Enstitüsünde sırasıyla BT-9 ve BT-16 olarak identifiye edilmiştir. 1998<br />
den beri Akdeniz’ den Balkanlar’a ve Orta Avrupa’ ya kadar yayılan mavidil infeksiyonu<br />
salgınlarında bugüne kadar 7 serotip tespit edilmiş olup bunlar BT-2,BT-4, BT-8, BT-<br />
9,BT-15 ve BT-16 dır ( 9 ).<br />
Hastalıktan korunmada vektör mücadelesinin yanısıra , en önemli mücadele<br />
yöntemi aşılama ile bağışık sürülerin elde edilmesi olup, dünyada bugüne kadar mavidil<br />
salgınlarında monovalan veya polyvalan olarak attenue mavidil aşısı kullanılmıştır<br />
(1,8,11,12,13,14,18). Attenue mavidil aşısının dışında inaktif ve rekombinant teknoloji ile<br />
geliştirilmiş aşılar mevcuttur (2,8,11,15,17). Attenue aşılar inaktif aşılara göre daha<br />
ekonomik ve daha iyi immun yanıt alınmaktadır. Özellikle hastalığın endemik olduğu<br />
bölgelerde klinik mavidil hastalığı salgınlarının kontrol edilmesinde oldukça etkilidir (11<br />
).Fakat bunun yanı sıra uluslararası <strong>hayvan</strong> ve <strong>hayvan</strong>sal ürünlere ilişkin kurallar gereği ve<br />
gebelik dönemindeki koyunlara , koç katımı döneminde koçlara uygulanamaması ve<br />
139
değişik araştırmacılar tarafından bildirildiği gibi ( 10) aşı virusunun geri dönüşüm riski<br />
olabileceğinden dolayı son zamanlarda inaktif mavidil aşı çalışmaları tüm Avrupa<br />
Ülkelerinde önem kazanmıştır ( 1,2,11,14,15,17). Türkiye’ de 1978 yılından itibaren BT-4<br />
suşundan hazırlanan monovalan attenue mavidil aşısı üretilmekte ve kullanılmaktadır.<br />
1998- 2000 yıllarında görülen mavidil vakalarında serotiplerin farklı olması ve serotipler<br />
arası kross bağışıklık olmaması sebebiyle (16) bu serotipleri ve ileride ortaya çıkabilecek<br />
farklı serotipleri içeren monovalan veya polyvalan mavidil aşılarının kullanılması gerektiği<br />
ortaya çıkmıştır.<br />
Bugüne kadar tespit edilen BT-9, BT-16 serotipleri ile farklı serotiplerde salgın<br />
olması durumunda elde edilecek izoletlerin attenuasyon çalışmalarının<br />
gerçekleştirilebilmesi için uzun bir zamana ihtiyaç duyulmaktadır . Böyle bir durumda<br />
hastalıkla mücadelede erken önlem alınabilmesi için inaktif aşı üretimine ihtiyaç<br />
duyulması nedeniyle bu çalışma önem kazanmaktadır.<br />
İnaktif mavidil aşı üretiminde farklı inaktivantlar denenmiş aşı çalışmaları mevcut<br />
olup ( 1,2,12,14,15,17,18), Parker ve arkadaşları (14) ile Savini ve arkadaşlarının (17)<br />
bildirdiği şekilde Beta propiolakton ve gamma irradiasyon ile inaktivasyon yöntemlerinin<br />
daha etkili olduğu bildirilmiştir (11,17). Adjuvant olarak Parker ve arkadaşları (14)<br />
tarafından gerçekleştirilen inaktif aşı üretimi sırasında çift yağ emilsüyonlu adjuvantlar<br />
kullanılmış. Savini ve arkadaşlarının (17) uyguladığı yöntemde hazır adjuvantlardan olan<br />
Montanide ISA 206 ‘nın daha etkili olduğunu bildirmişlerdir. Çalışmamızda da Parker ve<br />
arkadaşları (14) ile Savini ve arkadaşlarının (17) bildirdiği şekilde deneme üretimi<br />
yapılacaktır.<br />
8.3. MATERYAL VE METOT:<br />
MATERYAL:<br />
Virus suşu:<br />
Mavidil tip 4 : 1977 yılı Ekim ayında Aydın’da görülen mavidil salgınında hastalık<br />
etkenini Onderstepoort Veteriner Araştırma Enstitüsün’de mavidil virus serotip 4 olarak<br />
konfirme edilmiştir. Aşı üretim çalışmaları için aşı suşu, suş üretiminde kullanılacak vasat<br />
ve BHK 21 (pasaj 38) hücresi Uluslar arası Referens Pirbright Hayvan Sağlığı<br />
Enstitüsü’nden (IAH Pirbright) Dr. Sellers tarafından 12 Ağustos 1978 tarihinde<br />
getirilmiştir. Aşı suşu, Güney Afrika orijinli embriyolu tavuk yumurtasında 72, kuzu<br />
böbrek hücre kültürlerinde 2, BHK hücrelerinde de 4 üncü pasajı yapılan attenüe S.A.<br />
BT./4 –BHK/4 PDAM suşudur. İlk ana tohum suşu Dr. Sellers tarafından primer kuzu<br />
böbrek ve BHK 21 hücreleri kullanılarak üretilmiştir Liyofilize edilerek -40ºC de<br />
muhafaza edilmektedir.<br />
Mavidil tip 9,16 : 1999-2001 yılları arasında Türkiye’ deki mavidil virus hastalığı salgını<br />
sırasında sahadan yapılan izoletlerin Referens Pirbright Hayvan Sağlığı Enstitüsü’nde<br />
(IAH Pirbright) tiplendirmeleri yapılmış olup E2BHK9 pasajdaki patojen suşlardır.<br />
Hücre: CIRAD EMVT Laboratuvarından temin edilen vero hücreleri ve Şap Enstitüsü<br />
Hücre Bankasından temin edilen BHK 21 hücrelerinin kalite kontrol testleri yapılmış<br />
analiz sertifikaları mevcuttur. MDBK hücreleri ATCC den temin edilmiştir.<br />
Vasat: Glasgow MEM, Minimum essential medium- NAHCO3 lı Earl’ s vasatı , % 10<br />
FCS’lu hücre ve virus üretme vasatı olarak.<br />
Fötal Dana Serumu: Hücre kültürü üretmek için vasata katılacaktır.( serumun<br />
Mycoplasma, BVD ve diğer viral ajanlar yönünden ariliği test edilmiştir.)<br />
BT antikor C- ELISA: Ticari olarak temin edilecektir.<br />
Hyperimmun serum: Mavidil virus Tip 4, Tip 9 ve Tip 16 tip spesifik hyperimmun serum<br />
( Ticari olarak temin edilecektir.)<br />
Beta propiolakton : Ticari olarak temin edilecektir<br />
140
Montanide ISA 206 ( Seppic) adjuvant:. Ticari olarak temin edilecektir<br />
Thiomersol : Ticari olarak temin edilecektir<br />
Tris :Ticari olarak temin edilecektir<br />
Deneme <strong>hayvan</strong>ları: Enstitünün deneme <strong>hayvan</strong>ları bölümündeki fare, kobay,koyun,keçi<br />
ve TİGEM işletmelerindeki koyunlar, sığırlar.<br />
Aşı üretim ve kontrol metodu<br />
Attenue mavidil aşı üretiminde kullanılan SABT 4 ana tohum suşu inaktif aşı üretimi<br />
içinde kullanılacaktır. Bakteri,virus ve mikoplazmal kontaminantlar yönünden sterilite<br />
testleri tamamlanan ve identifikasyon testi serum nötralizasyon test ve Referens Pirbright<br />
Hayvan Sağlığı Enstitüsü’nde (IAH Pirbright) tiplendirmeleri yapılmış olan E2BHK9<br />
pasajdaki BT16 ve BT 9 saha izoletleri ile ana tohum virus üretimi vero hücrelerinde<br />
yapılacaktır. Parker ve arkadaşları (9) ile Savini ve arkadaşlarının (11) bildirdiği şekilde<br />
deneme üretimi tamamlanacak ve European Pharmacopoeia’ e göre (4,5,6,) kalite kontrol<br />
testlerinin tamamlanmasını müteakip koyunlarda ,keçilerde,sığırlarda bağışıklık,<br />
zararsızlık testleri ile saha denemelerine geçilecektir. Daha sonra aşının stabilite ve<br />
bağışıklık süresi tespit çalışmaları yapılacaktır.<br />
üretim şeması<br />
1. Yeterli miktarda hücre kültürü çoğaltılması<br />
2. % 80 –90 Monolayer hücre kültürlerine virus inokulasyonu ve inkubasyon<br />
3. CPE yönünden muayeneler ve bulk ürünün toplanması<br />
4. Bulk ürün kontrol testleri; Titre tayini ,İdentity,Sterilite( OIEManual of standarts of<br />
diagnostic tests and vaccines (13) ve European pharmacopea ‘ ye göre (6))<br />
5. Klarifikasyon ve Protein konsantrasyonu ( santrifügasyon ve ultrafiltrasyon ile)<br />
6. İnaktivasyon : Konsantre virüs sıvısına pH 8.0 1M Tris-hydroxymethyl-aminomethane<br />
( Tris) ilave edilir 10 dakika oda ısısında karıştırılır. PBS içinde pH 7.4 olarak dilue<br />
edilen Beta propiolakton final konsantrasyon % 0.2 (v/v) olacak şekilde ilave edilir, 3<br />
saat 37ºCde karıştırılır. Hydralizasyon için 18 saat 5ºCde karıştırılarak inkübe edilir.<br />
İnaktivasyon sonrası in vitro ve invivo inaktivasyon kontrol testleri yapılır<br />
7. İnaktivasyon kontrol testleri<br />
İn vivo test: 20 ml İnaktive olan virus suspansiyonundan 4 adet mavidil seronegatif<br />
koyuna inokulasyon yapılır. İki adet aşılanmamış koyun negatif kontrol olarak bırakılır. 21<br />
gün boyunca beden ısıları kontrol edilir ve klinik olarak anormal bir belirti olup olmadığı<br />
yönünden gözlenir. İki günde bir 21 gün boyunca EDTA ‘ lı tüplere kan alınarak mavidil<br />
virus varlığı yönünden test edilir.<br />
İn vitro test: Üç adet 175 cm 2 monolayer BHK-21 hücrelerine 10ml inaktive olan virus<br />
süspansiyonundan inokulasyon yapılır. Üç pasaj sonra CPE varlığı ile BTV yönünden test<br />
edilir.<br />
8. Adjuvant ve koruyucu ilave edilmesi: İnaktivasyon gerçekleştikten ve test edildikten<br />
sonra eşit hacimde Montanide ISA 206 adjuvanla 50:50(v/v) oranında karıştırılarak<br />
emülsifiye edilir. Önce 12 saat 27ºC de bekletilir, daha sonra oda ısısında 2 saat, +4ºC de<br />
12 saat manyetik karıştırıcı ile karıştırılır konsantrasyon 1: 10 000 olacak şekilde<br />
koruyucu olarak %5 solusyondan Thiomersol katılır.<br />
1. Final ürün kontrol testleri: OIE Manual (18) ve European pharmacopea ‘ ye göre<br />
(5));Titre tayini, İdentity, Sterilite, zararsızlık, potens ve immunite<br />
141
Titre tayini: İnaktivasyondan önce ; konsantrasyon öncesi ve sonrası virus titresi tespit<br />
edilerek saptanır .<br />
Saha çalışmaları:<br />
Saha çalışmaları için kontrol testleri tamamlanmış olan monovalan tip 4, tip 9, tip 16 ve<br />
polyvalan (4,9,16) 3 seri aşıdan TİGEM işletmelerindeki koyun, Hayvancılık Merkez<br />
Araştırma Enstitüsündeki sığırlara ve Enstitümüz deneme <strong>hayvan</strong> ünitesindeki keçilere tek<br />
saha dozu aşı uygulaması yapılıp 28 gün sonra rapel yapıldıktan sonra 78. günde serum<br />
örnekleri alınarak BT nötralizan antikorlar yönünden ELISA ve VN ile test edilecektir. Bu<br />
amaçla BT seronegatif 100 baş koyun, 20 baş keçi ve 10 baş dana kullanılacaktır.<br />
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
İnaktif mavidil aşı üretimi tekniğinin laboratuvarımıza yerleştirilmesi ile 1998<br />
yılından beri Avrupa’ da ve dolayısı ile ülkemizde de zaman zaman salgınlara neden olan<br />
farklı serotipteki mavidil viruslarına karşı attenuasyon çalışmalarını beklemeden sahanın<br />
ihtiyacı olan homolog inaktif aşı ile mücadeleye başlamak mümkün olacaktır. Böylece<br />
mavidil virus hastalığına bağlı oluşan ekonomik kayıpların önüne geçilecektir. Mevcut<br />
mavidil aşısı yalnızca koyunlarda uygulanabiliyor iken üretilecek olan bu aşı gerektiğinde<br />
sığır ve keçilerde de uygulanabilecektir. Attenue aşılarda söz konusu olan gebelik<br />
dönemlerinde atıklara sebep olması, koç katımı sırasında koçlarda geçici bir infertilite<br />
oluşturması gibi yan etkileri olmadığı için yılın her döneminde ihtiyaç olduğunda<br />
uygulanabilecektir.<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Dr. Özden KABAKLI<br />
9.2. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Dr. Elvin ÇALIŞKAN<br />
9.3. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Biyolog Süreyya YÖNDEM<br />
9.4. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Dr.Nedret ÇELİK ( Şap Enstitüsü)<br />
9.5. Yardımcı Teknik Eleman Adı-Soyadı: Laborant Murat SIRIM<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Proje Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü bünyesinde gerçekleştirilecektir.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım : TİGEM koyun işletmeleri, Lalahan<br />
Hayvancılık Merkez Araştırma Enstitüsü sığırları.<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri: “Vero hücrelerinde<br />
ısıya dayanıklı Sığır vebası aşı üretimi” isimli proje.<br />
142
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI. Toplam: 67.950 YTL<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
03.2.1.01 Kırtasiye Alımları<br />
03.2.1.04 Diğer Yayın Alımları<br />
03.2.4.03 Yem Alımları<br />
03.2.6.01 Laboratuar Malzemesi ile Kimyevi<br />
ve Temrinlik Malzeme Alımları<br />
25.000<br />
200<br />
250<br />
2000<br />
03.3- YOLUKLAR<br />
03.3.1.01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları :<br />
4- GÖREV GİDERLERİ<br />
03.5- HİZMET ALIMLARI<br />
03.6- TEMSİL VE TANITMA GİDERLERİ<br />
03.7- MENKULMAL, GAYRİMADDİ HAK<br />
ALIM, BAKIM VE ONARIM GİDERLERİ<br />
03.8- GAYRİMENKUL MAL BAKIM VE<br />
ONARIM GİDERLERİ<br />
03.9- TEDAVİ VE CENAZE GİDERLERİ<br />
500<br />
TOPLAM 25.000 2950<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI<br />
Laboratuar Cihazı Alımları<br />
40.000<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK<br />
ONARIM GİDERLERİ<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.8- STOK ALIMLARI<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER<br />
TOPLAM 40.000<br />
143
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
I.YIL 2.YIL 3.YIL<br />
a- üç seri deneme üretim ve kalite a . Deneme aşı serileri ile pilot saha<br />
kontrol testlerinin yapılması. bağışıklık testlerinin uygulanması<br />
b. Deneme üretim yapılan aşı serileri<br />
ile stabilite ve bağışıklık süresi tespiti<br />
çalışmalarının yapılması<br />
c- proje <strong>değerlendirme</strong> ve yazım.<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1. BERRY, L.J., OSBURN, B.I., STOTT, J.L., FARVER, T., HERON, B., PATTON, W.<br />
(1981). Inactivated Bluetongue Virus Vaccine in Lambs: Differential Serological<br />
Responses Related to Breed. Vet. Res. Comm., 5(3): 289-293.<br />
2. DI EMIDIO, B., NICOLUSSI, P., PATTA, C., RONCHI, G.F., MONACO, F.,<br />
SAVINI, G., CIARELLI, A., CAPORALE, V. (2004). Efficacy and safety studies on an<br />
inactivated vaccine against bluetongue virus serotype 2. Vet. Ital., 40 (4): 640-644<br />
3. ERASMUS,B.J. (1990). Bluetounge virus In: Virus Infections of Ruminants. Ed: Z.<br />
Dinter and B.Morein. Elsevier Sciencer Publishers B.V.p:227-237.<br />
4. European Commission. (1991). Commission Directive 91/412/EEC of 23 July 1991<br />
laying down the principles and guidelines of good manufacturing practice for veterinary<br />
medicinal products. Off. J., L228, 17/08/1991, 70-73.<br />
5. European Council. (1981). Council Directive 81/852/EEC on the approximation of the<br />
laws of the Member States relating to analytical, pharmacotoxicological and clinical<br />
standarts and protocols in respect of the testing of veterinary medicinal products. Off. J., L<br />
317, 06/11/1981, 53-98.<br />
6. European Pharmacopoeia. (2001). Addendum No. 0016. Council of Europe,<br />
Strasbourg, 1657-1661.<br />
7. GORMAN,B.M. ( 1994). The Bluetounge Viruses. İn: Current Topics in Microbiology<br />
and Immunology. Ed: P.Roy and B.M. Gorman Springer Verlag-Berlin. 162:1-15.<br />
8. LOBATO,Z.I.P., COUPAR,B.E.H.,GRAY, C.P.,LUNT,R., ANDREW, M.E. ( 1997) .<br />
Antibody Responses and Protective Immunity to Recombinant Vaccinia Virus-expressed<br />
Bluetounge Virus Antigens. Vet. Immunol. And Immunopathol. 59:293-309.<br />
9. MELLOR, P.S, WITMANN, E.J. ( 2002). Bluetounge virus in Mediterranean Basin.<br />
1998-2001. Vet.J. 164, 20-37.<br />
10. MONACO, F., CAMMA, C., SERINI, S., SAVINI, G. ( 2006). Differentiation<br />
between field and vaccine strain of Bluetounge virus serotype 16. Vet. Microbiol. 116, 45-<br />
52.<br />
11. MURRAY, P.K., EATON, B.T. (1996). Vaccine for Bluetongue. Aust. Vet. J., 73:<br />
207-210.<br />
12. ODEON,A.C.,GERSWIN,L.J.,OSBURN,B.I. (1999): IgE responses to bluetounge<br />
viruse (BTV) serotype 11 after immunization with inactivated BTV and challenge<br />
infection. Comp. Immun. Microb. Infec.Disease 22 : 145-162.<br />
144
13. Office International des Epizooties (OIE). (2000). Bluetongue , Chapter 2.1..9 In<br />
Manual of standarts of diagnostic tests and vaccines. OIE, Paris, 153-167.<br />
14. PARKER, J., HERNIMANN, K.A.J., GIBBS. (1975). An experimental inactivated<br />
vaccine against bluetongue. Vet.Rec. 96: 284-287.<br />
15. RAMAKRISHNAN, M.A., PANDEY, A.B., SINGH, K.P., SINGH, R., MEHROTRA,<br />
M.L. (2005). Immune response and protuctive efficacy in sheep immunised with<br />
hydroxylamine-inactivated bluetongue virus vaccine. Vet. Ital. 41(3): 149-155.<br />
16. ROY,P. ( 1992). Bluetounge virus proteins. J.Gen. Virol. 73:3051-3064<br />
17. SAVINI,G., RONCHİ,G.F., LEONE,A., CIARELLI,A., MIGLIACCIO,P.,<br />
FRANCHİ,P.,MERCANTE,M.T., PINI,A. ( 2007). An inactivated vaccine for the control<br />
of luetounge virus serotype 16 infection in sheep in Italy. Vet.Micrb.124: 140-146<br />
18. STOTT,J.L,BARBER,T.L.,OSBURN,B.I. (1985): Immunologic response of sheep to<br />
inactivated and virulent bluetounge virus. Am.J. Vet. Res. Vol46(5): 1043-1049.<br />
19. YONGUÇ, A.D., TAYLOR, W.P.,CSONTOS,L., WORRAL,E. ( 1982) Bluetounge in<br />
westwern Turkey. Veterinary Record .111: 144-146<br />
1. TEKLİF ONAYI:<br />
14.1.Proje Lideri : Dr. Özden KABAKLI<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Dr. Nahit YAZICIOĞLU<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar :<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar :TİGEM, Şap Enstitüsü, Hayvancılık Merkez<br />
Araştırma Enstitüsü LALAHAN<br />
145
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI : Mavidil Virus İzolatlarının Attenüasyon Çalışmaları<br />
“Attenuation Studies of Bluetongue Virus Isolates”<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Elvin ÇALIŞKAN<br />
Kurumu : Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu AFA/Programı: Veteriner ilaçları ve <strong>hayvan</strong> aşıları<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı: ______________________<br />
Araştırma Programı : _______________________<br />
5. PROJE SÜRESİ : 36 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : 01.01.2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : 01.01.2012<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu çalışmada ülkemizde varlığını devam ettirmekte olan ve 1999-2000 salgınları sırasında<br />
saha çalışmalarından izole edilen Mavidil 9 ve 16 serotiplerinin ileride aşı çalışmalarında<br />
kullanılmak üzere attenüasyonuna çalışılacaktır. Buna ek olarak söz konusu virusların,<br />
belirlenen gen segmentleri düzeyinde, moleküler yapılarına ait verilerin elde edilmesi ve<br />
attenüasyon sonucunda moleküler düzeyde meydana gelecek muhtemel değişimlerinin<br />
araştırılması da amaçlanmıştır<br />
SUMMARY<br />
The aim of the proposed study is, the attenuation of BT-9 and BT-16 isolates, which are<br />
isolatede during 1999-2000 outbreak, for further vaccine studies. Besides, by using<br />
molecular technics to get information about specified gene segments and investigation of<br />
probable differences related to attenuation was aimed.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER:<br />
Mavidil serotip 9, Mavidil serotip 16, Attenüasyon, Aşı, RT-PZR, Dizin analizi<br />
146
Bluetongue serotype 9, Bluetongue serotype 16, Attenuation, Vaccine, RT-PCR, Sequence<br />
Analysis<br />
8. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1. Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Mavidil, çiftlik <strong>hayvan</strong>larının önemli bir enfeksiyonundur. Mavidil enfeksiyonu koyun,<br />
keçi, sığır ve diğer birçok ruminant türünü de enfekte etmektedir. Virulens ve ölüm<br />
oranları virus suşuna bağlı olduğu kadar, enfekte ettiği türle de ilişkilidir. Koyunlarda, %50<br />
mortalite ile sonuçlanabilen ve ciddi boyutlarda verim kayıplarına sebep olan bu<br />
enfeksiyonun son yıllarda Kuzey Avrupa’da ki salgınlarda sığırlarda da belirgin klinik<br />
semptomlar meydana getirdiği saptanmıştır.<br />
Enfeksiyonun dünya çapında, yıllık 3 milyar dolar zarara sebep olduğu düşünülmektedir.<br />
Enfeksiyona bağlı kayıpların yanı sıra, enfekte bölgelerde <strong>hayvan</strong> ve <strong>hayvan</strong>sal ürünlere<br />
uygulanan ambargolar sonucunda büyük ekonomik kayıplar ortaya çıkmaktadır.<br />
Enfeksiyon, Kuzey Avrupa’ da 1998 yılına kadar her defasında tek bir serotipin meydana<br />
getirdiği periyodik ve kısa süreli epizootiler şeklinde ortaya çıkmaktaydı. Ancak, 1996 ve<br />
2006 yılları arasında Avrupa kıtasında, altı farklı serotipin (serotip 1, 2 ,4, 8, 9 ve 16)<br />
oluşturduğu en az on adet enfeksiyon çıkışı rapor edildi. Enfeksiyon 1998 yılından bu yana<br />
kademeli olarak yayılımına devam etmektedir. Ağustos 2006 da, Hollanda, Belçika,<br />
Almanya ve Kuzey Fransa da ilk defa BTV-8 salgınları ile BT enfeksiyonu ortaya<br />
çıkmıştır. Son olarak enfeksiyon 2007 yılında serotip 8 ile İngiltere’ de ilk defa kendini<br />
göstermiştir.<br />
Ülkemizde Mavidil virusunun varlığı ilk olarak 1944 yılında Hatay bölgesinde<br />
bildirilmiştir. Bunu takiben 1978 ve 1979 yılları arasında Yonguç ve ark. tarafından ikinci<br />
bir mavidil salgını rapor edilmiş ve etken serotip 4 olarak tanımlanmıştır. Uzun bir aradan<br />
sonra 1998 ve 1999 yılları arasında Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
Viroloji Teşhis Laboratuvarı tarafından Edirne ilinde mavidil enfeksiyonu tespit<br />
edildi. Sinek popülasyonunun aktif olduğu dönemde ise enfeksiyon Ege ve Akdeniz<br />
bölgelerine yayıldı. Türkiye’de halen tip 4, 9 ve 16 olmak üzere 3 farklı serotipinin<br />
bulunduğu bildirilmektedir. Mavidil enfeksiyonunun daimi varlığı ve artan insidansı ile<br />
beraber yeni suşların ortaya çıkışı epidemiyolojik anlamda kademeli bir değişimin açık<br />
kanıtlarını oluşturmaktadır.<br />
Aşılama, mavidil ile enfekte bölgelerde hastalığın kontrol ve eradikasyonunda en önemli<br />
yollardan biridir. Günümüzde Mavidil enfeksiyonu ile mücadele, ülkemizde ve diğer<br />
birçok ülkede attenüe canlı aşılar ile gerçekleştirilmektedir. Modifiye canlı aşıların tek<br />
dozluk uygulamadan sonra gerekli olan koruyucu bağışık düzeyi oluşturduğu ve klinik<br />
enfeksiyonun gelişmesini engellediği bilinmektedir. Mavidil virusunun bilinen 24 adet<br />
farklı serotipinin bulunması ve segmentli genom yapısına sahip bu virusun farklı serotipleri<br />
arasında meydana gelebilecek genetik alışverişler, sirkülasyondaki virustan daha farklı<br />
suşların ortaya çıkması açısından her zaman varolan bir tehlikedir. Bu sebeple modifiye<br />
canlı aşıların kullanımı sırasında, sahada sirküle eden virus ile aşı virusu arasındaki ilişki<br />
çok önemlidir. Serotipler arasında çapraz koruma düzeyinin düşük olması ve serotipler<br />
arasındaki gen değişim riskini en aza indirmek amacıyla, aşıların mevcut serotiplere karşı<br />
üretilmesi ve uygulanması, enfeksiyondan korunmada önemli bir rol oynayacaktır.<br />
147
Ülkemizde BT-4 suşundan hazırlanan mavidil aşısı üretilmekte ve kullanılmaktadır.<br />
Bununla birlikte ülkemizde BTV-9 ve BTV-16’ nın varlığı da bilinmektedir. Bilinen bu<br />
serotiplerin gelecek yıllarda tekrar alevlenerek yeni salgınlar oluşturması ve daha önce<br />
açıklanan sebepler de dikkate alınarak, BTV-9 ve BTV-16’ yı içeren mono veya polivalan<br />
mavidil aşılarının kullanılması gerekliliği ortaya çıkmıştır.<br />
Modifiye canlı aşıların üretiminde, embriyolu tavuk yumurtası (ETY) ya da farklı bir türe<br />
ait hücre kültürlerinde tekrarlanan seri pasajlar ile elde edilen attenüe tohum suşlar<br />
kullanılmaktadır. Son yıllarda ki çalışmalarda, uygulama kolaylığı ve maliyet hesapları göz<br />
önüne alınarak, modifiye canlı aşıların üretiminde hücre kültürlerinde kullanılmaya<br />
başlanmıştır. Bilindiği üzere aynı coğrafyada sirküle eden saha suşları arasında dahi<br />
virulens farkları bulunmaktadır. Bu sebepten dolayı atenüasyon amacıyla yapılan seri<br />
pasajlarda en uygun attenüasyon düzeyini yakalamak esas ilkedir. Yapılan çalışmalarda<br />
ETY’da pasaj sayısının 30-72 arasında değiştiği belirtilmektedir.<br />
Günümüzde attenüasyon mekanizması tam olarak anlaşılamamış olsa da, saha ve<br />
aşı suşlarının ayrımını yapabilmek, virulens ve attenüasyon mekanizmalarına ait bilgiler<br />
elde etmek amacıyla moleküler epidemiyolojik yöntemler kullanılmaktadır. Moleküler<br />
düzeyde attenüasyon mekanizmalarına ilgili gen segmentlerini araştırmak amacıyla birçok<br />
etkin primer dizaynları ve protokoller geliştirilmiştir. Bu doğrultuda segment 2 (VP2),<br />
segment 5 (NS1), segment 6 (VP5), segment 7 (VP7) ve segment 10 (NS3) sıklıkla<br />
çalışılan gen segmentleridir.<br />
Çalışmada 1999-2001 yıllarında sahadan izole edilen BTV-9 ve BTV-16 serotiplerinin<br />
Vero hücre hatlarında ve ETY’ da eş zamanlı olarak attenüasyon çalışmalarının<br />
gerçekleştirilmesi ve buna ek olarak iki sistemin karşılaştırılması amaçlanmıştır.<br />
Ayrıca attenüasyon çalışmaları sonucunda elde edilen virusların belirlenen gen segmentleri<br />
düzeyinde moleküler yapılarına ait verilerin oluşturulması, bununla birlikte söz konusu<br />
viruslarda attenüasyon sonucunda moleküler düzeyde meydana gelebilecek değişimlerin<br />
araştırılması da çalışmanın amaçlarındandır.<br />
8.2. Literatür Özeti:<br />
Mavidil, ruminantların bulaşıcı olmayan, enfeksiyöz ve vektörler ile nakledilen bir virus<br />
hastalığıdır. Hastalık, Reoviridae ailesi içerisinde yer alan Orbivirus genusuna dahil<br />
Mavidil virusu tarafından oluşturulur (6). Mavidil virus genomu 10 adet çift zincirli RNA<br />
segmentinden meydana gelir. Her genom segmenti bir viral proteini kodlar. Toplamda<br />
virusa ait yedi adet yapısal (VP1-VP7) ve dört adet yapısal olmayan (NS1-NS3/A) protein<br />
mevcuttur. En dış tabaka (dış kapsid) VP2 ve VP5 (segment 2 ve 6) proteinlerinden oluşur,<br />
VP2 proteini hedef hücre reseptörlerine tutunmada, hücreye girişte ve virulenste görevlidir.<br />
Ayrıca virusun en değişken proteinleri olup, nötralizan antikorlar ile ilişkileri virusun<br />
serotipini belirler (15, 20). İç kapsid VP7 ve VP3 (segment 7 ve 3) tarafından oluşturulan<br />
iki tabaka halindedir. Çift katlı kapsid tabakasının içerisinde viral genom ile birlikte viral<br />
enzim aktivitelerini gerçekleştiren VP1, VP4 ve VP6 proteinleri bulunur. Yapısal olmayan<br />
NS1 proteini 5. segment tarafından kodlanır. Bu protein viral replikasyon sırasında hücre<br />
sitoplazmasında, görevi halen tanımlanmamış olan tubuler yapıları oluşturur. Virulenste<br />
görevli olan NS3/NS3A proteinleri segment 10’ dan sentezlenirler ve glikozlanmış<br />
proteinlerdir. Bu proteinler mavidil virusunun serotipleri ve suşları arasında oldukça iyi<br />
148
korunmuştur (15, 18, 20). Günümüzde mavidil virusuna ait, aralarında çapraz bağışıklık<br />
bulunmayan 24 farklı serotipi tespit edilmiştir (6).<br />
Mavidil virusunun bilinen tüm ruminant türlerini enfekte edebildiği düşünülmektedir.<br />
Enfeksiyon sığır ve vahşi ruminantlarda genellikle asemptomatiktir (15). Bununla birlikte<br />
koyunlarda özellikle de yüksek verime sahip ırklarda, yüksek ateş, nazal akıntı baş<br />
bölgesinde ödem, oral mukozalarda hiperemi ve ülserasyon, dilde siyanoz ve ayak<br />
leyonları ile seyreden klinik tablo oluşturur. Ayrıca döl veriminde azalma, abort ve<br />
konjenital anomalilere de neden olmaktadır (13, 16).<br />
Hastalık duyarlı bireyler arasında Culicoides türü sokucu sinekler tarafından<br />
nakledilmektedir (4). Afrika, Orta Doğu ve Avrupa kıtasının çeşitli bölgelerinde hastalığın<br />
naklinde C. imicola birincil vektör olarak kabul edilmektedir (4,21). Ancak meydana gelen<br />
iklimsel değişikliklerin varolan vektörün yayılımını etkilediği gibi farklı Culicoides alt<br />
türlerinin de hastalık naklinde etkin hale gelmelerine sebep olabileceği düşünülmektedir<br />
(21). Enfeksiyon özellikle Culicoides popülasyonunun ortaya çıktığı yaz sonu ve sonbahar<br />
aylarında görülmektedir (13).<br />
Enfekte sığırlar, 12-14 haftaya kadar uzayabilen viremi dönemi ile mavidil<br />
epidemiyolojisinde önemli rezervuarlardır. Bu rezervuarlarda kış aylarında varlığını devam<br />
ettiren virus, kış sonunda sokucu sinekler yolu ile duyarlı konaklardaki yayılımına devam<br />
eder (6, 13, 16).<br />
Mavidil enfeksiyonu, Uluslararası Salgınlar Ofisi’nin düzenlediği A grubu hastalıklar<br />
listesinde yer almaktadır. Mavidil virusu uygun koşulları yakaladığı dönemlerde hızlı bir<br />
şekilde yayılma özelliğine sahiptir. Tüm bunlarla birlikte salgın meydana gelen ülkede<br />
<strong>hayvan</strong> ve <strong>hayvan</strong>sal ürünlerde uygulanan ambargolar, ciddi sosyo-ekonomik problemleri<br />
de beraberinde getirmektedir (8,13,19).<br />
Günümüzde 35 o güney ve 50 o kuzey enlemleri arasında kalan bölgede global bir yayılım<br />
gösteren Mavidil enfeksiyonu, 1940’ lara kadar sadece Güney Afrika’ da tanımlanırken,<br />
1943 yılında Kıbrıs’ ta ve 1956-1957 yıllarında Portekiz ve İspanya’da ortaya çıkan<br />
enfeksiyon takip eden yıllarda Amerika, Orta Doğu, Asya ve daha sonrada Avusturalya’ da<br />
da görülmeye başlanmıştır (13, 16). Enfeksiyon, Kuzey Avrupa’ da 1998 yılına kadar her<br />
defasında tek bir serotipin meydana getirdiği periyodik ve kısa süreli epizootiler şeklinde<br />
ortaya çıkmaktaydı. Ancak, 1996 ve 2006 yılları arasında Avrupa kıtasında, altı farklı<br />
serotipin (serotip 1, 2 ,4, 8, 9 ve 16) oluşturduğu en az on adet enfeksiyon çıkışı rapor<br />
edildi. Enfeksiyon 1998 yılından bu yana kademeli olarak yayılımına devam etmektedir.<br />
Ağustos 2006 da, Hollanda, Belçika, Almanya ve Kuzey Fransa da ilk defa BTV-8<br />
salgınları ile BT enfeksiyonu ortaya çıkmıştır (2, 3). Kuzey Afrika da ortaya çıkan BTV-1,<br />
buradan Sardunya adasına geçmiştir. Kıbrıs adasında BTV-4 varlığına ek olarak, BTV-16<br />
tespit edilmiştir (14).<br />
Ülkemizde Mavidil virusunun varlığı ilk olarak 1944 yılında Hatay bölgesinde<br />
bildirilmiştir. Bunu takiben 1978 ve 1979 yılları arasında Yonguç ve ark.(22) tarafından<br />
ikinci bir mavidil salgını rapor edilmiş ve etken serotip 4 olarak tanımlanmıştır. Uzun bir<br />
aradan sonra 1999 ve 2001 yılları arasında Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü Viroloji Teşhis Laboratuvarı tarafından Edirne ilinde mavidil enfeksiyonu<br />
tespit edildi. Sinek popülasyonunun aktif olduğu dönemde ise enfeksiyon Ege ve Akdeniz<br />
149
ölgelerine yayıldı. Türkiye’de halen tip 4, 9 ve 16 olmak üzere 3 farklı serotipinin<br />
bulunduğu bildirilmektedir (7).<br />
Modifiye canlı aşıların üretiminde, embriyolu tavuk yumurtası (ETY) ya da farklı bir türe<br />
ait hücre kültürlerinde tekrarlanan seri pasajlar ile elde edilen attenüe tohum suşlar<br />
kullanılmaktadır (1,6,9,15) . Tek bir serotipe özgü aşı ile genellikle diğer serotiplere karşı<br />
koruyucu bağışık yanıt düzeyine ulaşılamaz (6). Bununla birlikte segmnetli virusların<br />
doğası gereği farklı serotipler arasında çeşitli genetik alışverişlerin varlığı da bilinmektedir<br />
(7,9). Modifiye canlı aşılar ile yapılan aşılama çalışmalarında sahada sirküle eden serotipin<br />
belirlenerek, kullanılan aşıların bunlara uygunluk göstermesi tavsiye edilmektedir<br />
(8,11,12,17).<br />
Modifiye canlı aşıların üretiminde, embriyolu tavuk yumurtası (ETY) ya da farklı bir türe<br />
ait hücre kültürlerinde tekrarlanan seri pasajlar ile elde edilen attenüe tohum suşlar<br />
kullanılmaktadır (11,17). Son yıllarda ki çalışmalarda, uygulama kolaylığı ve maliyet<br />
hesapları göz önüne alınarak, modifiye canlı aşıların üretiminde hücre kültürlerinde<br />
kullanılmaya başlanmıştır (5). Bilindiği üzere aynı coğrafyada sirküle eden saha suşları<br />
arasında dahi virulens farkları bulunmaktadır. Bu sebepten dolayı atenüasyon amacıyla<br />
yapılan seri pasajlarda en uygun attenüasyon düzeyini yakalamak esas ilkedir. Yapılan<br />
çalışmalarda ETY’da pasaj sayısının 30-72 arasında değiştiği belirtilmektedir (1,5,11).<br />
Son yıllarda yapılan birçok çalışmada, saha ve aşı viruslarının moleküler düzeyde<br />
farklılıklarını belirlemek ve ayrımlarını yapabilmek amacıyla sıklıkla 2., 5., 6., ve 10.<br />
segmentlere ait dizinlerden faydalanılmıştır (4,11,12,13,14,15,18). Çalışmalarda genom<br />
segmentleri 2 ya da 2 ve 6’ nın virusun virulens ve attenüasyon özelliklerinde bir öneme<br />
sahip olduğu ve elde edilen sonuçlar ile birlikte, 5.genom segmentinin de bu noktalar ile<br />
ilgili olduğu da saptanmıştır (9,11,16).<br />
Çalışmada 1999-2001 yıllarında sahadan izole edilen BTV-9 ve BTV-16 serotiplerinin<br />
Vero hücre hatlarında Kemeny ve Drehle (10) ve ETY’ da Alexander ve ark. (1) tarafından<br />
bildirilen yöntemler ile eş zamanlı olarak attenüasyon çalışmalarının gerçekleştirilmesi ve<br />
buna ek olarak iki sistemin karşılaştırılması amaçlanmıştır.<br />
Mavidil virusu ile ilgili olarak son yıllarda giderek artan moleküler düzeydeki çalışmalar<br />
(4,11,12,13,14,15,18) dikkate alınarak, attenüasyon çalışmaları sonucunda elde edilen<br />
virusların belirlenen gen segmentleri düzeyinde moleküler yapılarına ait verilerin<br />
oluşturulması, bununla birlikte söz konusu viruslarda attenüasyon sonucunda moleküler<br />
düzeyde meydana gelebilecek değişimlerin araştırılması da çalışmanın amaçlarındandır.<br />
8.3. MATERYAL VE METOT:<br />
MATERYAL<br />
Mavidil tip 9 ve 16 izolatları: 1999-2001 yılları arasında Türkiye’ deki mavidil virus<br />
hastalığı salgını sırasında sahadan izole edilen ve Referens Pirbright Hayvan Sağlığı<br />
Enstitüsü’nde (IAH Pirbright) tiplendirmeleri yapılan E2BHK9 pasajdaki patojen<br />
suşlardır.<br />
150
Hücre Kültürü: CIRAD EMVT Laboratuvarından temin edilen Vero ve Şap Enstitüsü<br />
Hücre Bankasından temin edilen BHK-21 hücre hatları kullanılacaktır. Hücre kültürlerinin<br />
kalite kontrol testleri yapılmış analiz sertifikaları mevcuttur.<br />
Embriyolu Tavuk Yumurtası: Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsünden<br />
temin edilecek SPF yumurtalar kullanılacaktır.<br />
Vasatlar: Eagle minimal essential medium ve G-MEM kullanılacaktır.<br />
Fötal Dana Serumu: Vero ve BHK-21 hücre hatlarının üretiminde vasata katılmak üzere<br />
kullanılacaktır.<br />
Hiperimmün Serum: Mavidil serotip 9 ve 16 için tip spesifik ticari olarak temin edilecek<br />
hiperimmün serum kullanılacaktır.<br />
Deneme Hayvanı: Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü bünyesindeki<br />
deneme <strong>hayvan</strong>ları bölümünde bulunan fare, kobay, koyunlar kullanılacaktır.<br />
METOT<br />
Attenüasyon Çalışması: 1999–2001 yılları arasında Türkiye’ deki mavidil virus hastalığı<br />
salgını sırasında sahadan izole edilen BTV-9 ve BTV-16 saha izolatlarının attenüasyon<br />
çalışması ETY’ de Alexander ve ark.(1) bildirdikleri yönteme göre yapılacaktır. Çalışmada<br />
ETY ile birlikte paralel olarak vero hücre hatlarında da attenüasyon çalışmaları Kemeny ve<br />
Drehle (10) tarafından bildirilen yönteme göre gerçekleştirilecektir. Her iki sistemde de<br />
yapılacak pasaj sayısı 30-72 pasaj arasında düşünülmüştür. Hücre kültürü pasajları devam<br />
ederken ortalama her 10 pasaj sonunda ETY’ a geçilerek, patojenite denemeleri<br />
yapılacaktır. ETY pasajları ise, embriyolarda damar lezyonları ve ölümler ortadan kalkana<br />
kadar devam edecektir. Pasajlar sonrasında toplanan virusların enfeksiyözite güçleri BHK-<br />
21 veya Vero hücre hatları kullanılarak tespit edilecektir. Virusların enfeksiyözite<br />
güçlerinin tespiti OIE manual of standards for diagnostic tests and vaccines (2000) (19) de<br />
bildirilen protokole göre yapılacaktır.<br />
Virus Saflaştırması: Virusların saflaştırılması amacıyla plak test yapılacaktır. Bu amaçla<br />
Channell ve Stott (5) tarafından bildirilen yönteme kullanılacak, ayrıca virusların<br />
enfektivite titreleri pfu/ml (plak oluşturma ünitesi) olacak şekilde de tespit edilecektir.<br />
Sterilite, Ekstra ajanlar yönünden testler: Testler European Pharmacopoeia (2001) (23)<br />
ve OIE manual of standards for diagnostic tests and vaccines (2000) (19) göre yapılacaktır.<br />
Zararsızlık: Bu amaçla, ETY’ de, damar lezyonları ve ölümlerin ortadan kalkmasını<br />
takiben, kobay ve fareler kullanılacaktır.<br />
- 4 adet kobaya intraperitoneal olarak 2ml inoküle edilecek, 4 adet kobay aşısız kontrol<br />
olarak bırakılacak.<br />
- 12 adet fareye intraperitoneal olarak 0,5ml inoküle edilecek, 12 adet fare aşısız kontrol<br />
olarak bırakılacak.<br />
Kobay ve fareler uygulamadan sonra 14 gün boyunca klinik gözlem altında tutulacaktır.<br />
Potens ve immünojenite: Attenüe edilen virusların immünolojik etkileri, mavidil<br />
antikorları yönünden seronegatif koyunlar üzerinde yapılacak inokulasyonlar ile<br />
151
elirlenecektir. Bu <strong>değerlendirme</strong>ler zararsızlık testlerini takiben<br />
gerçekleştirilecektir. İzleme sırasında koyunların günde iki kez beden ısısı ölçülecek ve<br />
herhangi bir klinik bulgu gösterip göstermediklerine bakılacaktır. İzleme süresi 28 gün<br />
olarak belirlenmiştir. Süre sonunda deneme ve kontrol grubundaki <strong>hayvan</strong>lardan defibrine<br />
kan ve kan serum örnekleri alınacaktır.<br />
Serolojik ve Virolojik Kontroller: Bu amaçla hücre kültürleri ve ticari ELISA<br />
sistemlerinden yararlanılacaktır. İnokule edilen <strong>hayvan</strong>lardaki serokonversiyonun takibi<br />
amacıyla virus nötralizasyon testi OIE manual of standards for diagnostic tests and<br />
vaccines (2000) (19) de bildirilen protokole göre yapılacak, ayrıca ELISA testinden de<br />
yararlanılacaktır. Olası virus saçılımının takibi için ise defibrine kanlardan ETY’ na OIE<br />
manual of standards for diagnostic tests and vaccines (2000) (19) de bildirilen protokole<br />
göre ekimler yapılacak ve antijen yakalama (capture) ELISA (c-ELISA) sistemi<br />
kullanılacaktır.<br />
Nükleik asit ekstraksiyonu: Viral RNA eldesi, Trizol ayracı kullanılarak üretici firmanın<br />
talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilecektir.<br />
Reverz Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Elde edilen viral RNA’ lar, her iki<br />
virus içinde segment 2 ve segment 10 gen bölgelerine ait DNA ürünlerinin elde edilesi<br />
amacıyla reverz transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonuna tabi tutulacaktır. Her hedef<br />
sekans için spesifik primerler kullanılacaktır. Reaksiyonlar BTV-9 ve BTV-16’ nın<br />
segment 2 ve segment 10’ a ait primereri ile Mertens ve ark. (14) tarafından bildirilen<br />
yönteme uygun olarak gerçekleştirilecektir.<br />
Dizin analizi: Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü bünyesinde bulunan<br />
Dizin Analiz cihazı ile RT-PZR işlemleri tamamlanarak elde edilen DNA ürünlerinin dizin<br />
analizleri gerçekleştirilecektir.<br />
8.4. Beklenen Yararlar/ Uygulamaya Aktarma/ Ekonomiye Katkı:<br />
Bu çalışmada Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsünde bulunan BTV-9<br />
ve BTV-16 serotiplerinin attenüasyonu ve attenüe olan viruslara ait moleküler düzeyde<br />
verilerin elde edilmesi hedeflenmiştir. Bu çalışma sonucunda elde edilecek attenüe suşlar<br />
ile elimizde bulunan attenüe BT4 serotipine ek olarak iki yeni attenüe serotipe daha sahip<br />
olunacaktır. Ayrıca elde edilecek olan bu yeni attenüe serotipler, ülkemizde varlığı bilinen<br />
BT-9 ve BT-16 serotiplerine karşı, gelecekte yapılacak çalışmalar ile bu serotiplere ait<br />
milli aşıların geliştirilmesine basamak olacak ve yeni bir kaynak imkanı oluşturacaktır.<br />
Tüm bunlara ek olarak, bu çalışmalar önemli bir bilgi ve deneyim birikimi sağlayacaktır.<br />
9.ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı Soyadı : Dr. Elvin ÇALIŞKAN<br />
“Türkiye’ de Mavidil virus moleküler epidemiyolojisi ve profilaktik yaklaşımlar”<br />
isimli TÜBİTAK projesinde yardımcı araştırıcı.<br />
“Köpek Gençlik Hastalığı Virus İzolasyonu H proteini Kodlayan Gen Bölgesinin<br />
Karakterizasyonu ve Seroepidemiyolojisi” konulu tez çalışması.<br />
152
9.2.Yardımcı Araştırmacı Adı Soyadı : Dr. Özden KABAKLI<br />
9.3.Yardımcı Araştırmacı Adı Soyadı : Dr. Arife ERTÜRK<br />
9.4.Yardımcı Araştırmacı Adı Soyadı : Dr. Şirin G. ÇİZMECİ<br />
9.5. Yardımcı Araştırmacı Adı Soyadı : Dr. M. Fatih BARUT<br />
9.6.Yardımcı Araştırmacı Adı Soyadı : Dr. Hikmet ÜN<br />
9.7.Yardımcı Araştırmacı Adı Soyadı : Biyolog Süreyya YÖNDEM<br />
9.8.Yardımcı Teknik Eleman Adı-Soyadı : Laborant Murat SIRIM<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETRLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım: Proje Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü bünyesinde gerçekleştirilecektir.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım: Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve<br />
Araştırma Enstitüsü bünyesinde bulunan ELISA reader, Dizin Analiz cihazı<br />
kullanılacaktır.<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri: “Vero<br />
hücrelerinde ısıya dayanıklı Sığır vebası aşı üretimi” isimli proje.<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE:<br />
I. YATIRIM TUTARI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
12,800 2,000 15,200<br />
03.3- YOLUKLAR<br />
4- GÖREV GİDERLERİ<br />
03.5- HİZMET ALIMLARI<br />
03.6- TEMSİL VE TANITMA GİDERLERİ<br />
03.7- MENKULMAL, GAYRİMADDİ HAK ALIM,<br />
BAKIM VE ONARIM GİDERLERİ<br />
03.8- GAYRİMENKUL MAL BAKIM VE ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
03.9- TEDAVİ VE CENAZE GİDERLERİ<br />
TOPLAM 12,800 2,000 15,200<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM GİDERLERİ<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA)<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER<br />
TOPLAM<br />
153
II. YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI.<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE<br />
MALZEME ALIMLARI<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE<br />
MALZEME ALIMLARI<br />
03.2.1.01 Kırtasiye Alımları<br />
03.2.4.03 Yem Alımları<br />
03.2.6.01 Laboratuar Malzemesi ile Kimyevi ve<br />
Temrinlik Malzeme Alımları<br />
12,800<br />
2,000<br />
200<br />
15,000<br />
03.3- YOLUKLAR<br />
03.3.1.01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları :<br />
4- GÖREV GİDERLERİ<br />
03.5- HİZMET ALIMLARI<br />
03.6- TEMSİL VE TANITMA GİDERLERİ<br />
03.7- MENKULMAL, GAYRİMADDİ HAK<br />
ALIM, BAKIM VE ONARIM GİDERLERİ<br />
03.8- GAYRİMENKUL MAL BAKIM VE<br />
ONARIM GİDERLERİ<br />
03.9- TEDAVİ VE CENAZE GİDERLERİ<br />
TOPLAM 12,800 2,000 15,200<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
I.YIL 2.YIL 3.YIL<br />
BTV-9 ve 16 izolatlarının ETY a- BTV-9 ve 16 izolatlarının a-Potens ve immünojenite<br />
ve Vero hücre kültürlerinde ETY ve Vero hücre<br />
testleri<br />
seri pasajları<br />
kültürlerinde seri pasajları b-Attenüasyona ilgili<br />
b-Virus saflaştırması,<br />
moleküler genetik araştırmalar<br />
zararsızlık testleri<br />
c-Proje <strong>değerlendirme</strong> ve<br />
c- Potens ve immünojenite<br />
testleri<br />
yazım<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1. ALEXANDER, R.A., HAİG, D.A. (1951). The use of egg attenuated bluetongue virus in the<br />
production of a polyvalent vaccine for sheep. Onderstepoort J. Vet. Res. 25 (1): 3-15.<br />
2. Anonim (1999) Bluetongue emergency in Bulgaria, Turkey and Greece. In, EMPRES<br />
Transboundary Animal Diseases Bulletin. Erişim:<br />
[http://www.fao.org/documents/show_cdr.asp?url_file=/docrep/X3444e/x3444e04.htm]<br />
3. Anonim (2004a) Bluetongue in Croatia. Serological findings in sentinel bovine animals.<br />
Follow-up report no:1. In, Disease Information, 3 December 2004, Erişim<br />
[http://www.oie.int/eng/info/hebdo/AIS_16.HTM#Sec0]<br />
4. BRÉARD, E., SAILLEAU, C., COUPIER, H.,MURE-RAVAUD, K., HAMMOUMI, S.,<br />
GICQUEL, B., HAMBLIN, C., DUBOURGET, P., ZIENTARA, S. (2003)Comparison of genome<br />
segments 2, 7 and 10 of bluetongue viruses serotype 2 for differentiation between field isolates and<br />
the vaccine strain. Vet. Res. 34: 777-89.<br />
5. CHANNELL, M., STOTT, J.L. (1989). Bluetongue virus propagation and plaque assay:<br />
variation due to medium and serum supplement. J. Virol. Meth. 24: 265-74.<br />
6. ERASMUS, B. J. (1990). Bluetongue virus. In: Virus Infections of Ruminants, Ed: Dinter, Z.,<br />
Morein, B., Elsevier Science Publishers, Chapter 21, p.: 227-237.<br />
7. ERTÜRK, A., TATAR, N., KABAKLİ, O. , INCOGLU, S., CİZMECİ, S.G., BARUT, F.M.<br />
(2004) The current situation of bluetongue in Turkey. Vet. Ital., 40 (3), 137-140<br />
154
8. European Commision Health Consumer Protection Directorate- General<br />
( Sanco/C3/AH/R19/2000) Possible use of vaccination against Bluetongue in Europe. Scientific<br />
Committee on animal health and animal welfare. Adopte 27 june 2000.<br />
9. HAMMOUMİ, S., BREARD, E., SAILLEAU, C., RUSSO, P., GRILLET, C., CETRE-<br />
SOSSAH, C., ALBINA, E., SANCHIS, R., PEPIN, M., GUIBERT, J., ZIENTRA, S. (2003).<br />
Studies on the Safety and Immunogenicity of the South African BluetongueVirus Serotype 2<br />
Monovalent Vaccine: Specific Detection of the Vaccine Strain Genome by RT-PCR. J. Vet. Med. B<br />
50: 316-21.<br />
10. KEMENY, L., DREHLE. (1961). The use of tissue culture- propagated bluetongue virus for<br />
vaccine prepartion. Am. J. Vet. Res. Sep. 921-25.<br />
11. KIRKLAND, P.D., HAWKES, R.A. (2004). A comparisation of laboratory and wild strains<br />
of bluetongue virus- is there any difference and dose it matter? Vet. Ital. 40 (4): 448-55.<br />
12. MANN, N., MANN, S., SINGH, K.P., SAMUEL, A. R., MERTENS, P., Development of<br />
reverse transcriptase-polymerase chain reaction-basedassays and sequencing for typing European<br />
strains of bluetongue virusand differential diagnosis of field and vaccine strains. Vet. Ital. 40 (4):<br />
552-61.<br />
13. MELLOR, P. S., WITTMANN, E. J. (2002). Bluetongue virus in the mediterranean basin<br />
1998-2001. Vet J 164(1): 20-37.<br />
14. MERTENS, P., MANN, N., PRASAD, G., SAMUEL, A. R., SHAW, A. E., POTGİETER,<br />
A. C., ANTHONY, S. J., MANN, S. (2007). Design of primers and use of RT-PCR assays<br />
fortyping European bluetongue virus isolates: differentiation of field and vaccine strains. J.Gen.<br />
Virol. 88:2811-23.<br />
15. MONACO, F., CAMMA, C., SERINI, SAVINI, G. (2006). Differentiation between field and<br />
vaccine strain ofbluetongue virus serotype 16. Vet. Microb. 166: 45-52.<br />
16. MURPHY, F. A., GIBBS, J. E. P., HORZINECK, C. M., STUDDENT, M.J. (1999).<br />
Veterinary Virology, 3th Edition, Raven Press Ltd. Nev York.1999.<br />
17. MURRAY, P.K., EATON, B.T. (1996) Vaccines for bluetongue. Aust Vet J, 73(6):207-10.<br />
18. NIKOLAKAKI, V., NOMİKOU, K., KOUMBATI, M., MANGANA, O.,<br />
PAPANASTASSOPOULOU, M., MERTENS, P., PAPADOPOULOS, O. (2006). Molecular<br />
analysis of the NS3/NS3A gene of Bluetongue virus isolatesfrom the 1979 and 1998–2001<br />
epizootics in Greece andtheir segregation into two distinct groups. Vir. Res. 114: 6-14<br />
19. OIE Manual of Standarts for Diagnostic Tests and Vaccines (2000). Bluetongue. Chapter<br />
2.1.9. http://www.oie.int.norms.MMANUAL/A_00026.htm<br />
20. ROY.,P. (1992).BluetongueVirus Proteins. J.Gen. Virol. 73:3051-64.<br />
21. WITTMANN, E., MELLR, P., BAYLIS, M. (2001). Using climate data to map the potential<br />
distribution of Culicoides imicola (Diptera: Ceratopogonidae) in Europe. Rev Sci Tech. 2001<br />
Dec;20(3):731-40<br />
22. YONGUÇ, A.D., TAYLOR, W.P., CSONTOS, L., WORRALL, E. (1982). Bluetongue in<br />
Western Turkey. Vet. Rec. Aug. 111: 144-46.<br />
23. European Pharmacopoeia. (2001). Addendum No. 0016. Council of Europe, Strasbourg,<br />
1657-1661.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1. Proje Lideri : Dr. Elvin ÇALIŞKAN<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Dr. Nahit YAZICIOĞLU<br />
155
TC<br />
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI<br />
PROJE TEKLİFİ<br />
Araştırma Alan Kodu : Araştırma Öncelik Puanı:<br />
Araştırma Programı Kodu : Toplam Proje Puanı :<br />
Yeni Proje Numarası :<br />
1. PROJE ADI : İnaktif EHV-1 (Equine Rhinopneumonitis) aşısı Üretimi.<br />
“Production of Inactivated EHV-1 (Equine Rhinopneumonitis) Vaccine”<br />
2. YÜRÜTÜCÜ KURULUŞ : Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Arşt Enst.<br />
3. PROJE LİDERİ<br />
Adı Soyadı : Özden KABAKLI<br />
Kurumu : Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Arşt. Enst<br />
.<br />
4 . Projenin İlgili Olduğu AFA/Program (Veteriner ilaçları ve <strong>hayvan</strong> aşıları)<br />
Öncelik<br />
Yüksek Orta Düşük<br />
Araştırma Fırsat Alanı: __________________<br />
Araştırma Programı : __________________<br />
5. PROJE SÜRESİ : 24 Ay<br />
5.1. Başlama Tarihi : 01.01.2009<br />
5.2. Bitiş Tarihi : 01.01.2011<br />
6. PROJENİN ÖZET TANITIMI:<br />
Bu çalışmamızda daha önce attenue EHV-1 aşısı ( Kısrakların virusi abortus aşısı)<br />
üretiminde kullanılan attenue RACH EHV-1 suşu ile inaktif EHV-1aşı üretim tekniğinin<br />
Laboratuvarımıza yerleştirilmesi amaçlanmıştır.<br />
Bu aşı BHK 21 hücrelerinde üretilecek, Beta-propiolakton ile inaktivasyon<br />
çalışması yapılacak, adjuvant olarak Mantonide ISA 206 kullanılarak inaktif EHV-1 aşısı<br />
üretimi çalışmaları yapılacaktır.<br />
Aşının kobay ve farelerdeki zararsızlık, hamsterlerde potens ve bağışıklık<br />
çalışmaları Enstitümüz deneme <strong>hayvan</strong> ünitesinde, 3 ay üzeri taylar ile kısraklarda<br />
yapılacak olan bağışıklık testleri TİGEM işletmelerinin ilgili Ünitesinde iki kurumun<br />
ortak çalışması şeklinde yürütülecektir.<br />
Summary: The aim of the proposed study is to establish inactivated EHV-1 (Equine<br />
Rhinopneumonitis) vaccine prodution technic with attenue RACH EHV-1 strain,<br />
previously used for attenue EHV-1 vaccine, in our laboratory.<br />
The vaccine virus will be propagated in BHK-21 cell cultures, and inactivated with<br />
Beta-propiolactone. Subsequently by using adjuvant Montanide ISA 206 inactivation<br />
studies will be carried out.<br />
156
Potens and efficacy tests at hamsters, and safety tests at rat and mouse will be carried<br />
out in our Institute. Efficacy tests at foals over 3 months old and mare will be executed in<br />
TİGEM with cooperation of two foundations.<br />
7. ANAHTAR KELİMELER: EHV-1 – inaktif aşı –aşı- virus- virus nötralizasyon<br />
EHV-1-inactivated vaccine-vaccine-virus- virus neutralisation<br />
7. PROJE TEKLİFİ HAKKINDA AYRINTILI BİLGİ:<br />
8.1 Araştırmanın Amacı ve Gerekçesi:<br />
Atların ve eşeklerin Equine rhinopneumonitisi yada viral atıkları , Equine herpesvirus tip<br />
1’in sebep olduğu bulaşıcı , epidemik ve sporadik solunum sistemi hastalığı, atıklar,<br />
neonatal mortalite ve ensefalomiyelitis ile karakterize önemli bir enfeksiyonudur (2,18,24)<br />
. EHV-1 enfeksiyonunda ortaya çıkan abortlar, nörolojik bozukluklar ve solunum sistemine<br />
ilişkin bozukluklardan kaynaklanan performans düşüklüğünden dolayı yarış atı<br />
yetiştiriciliği ve diğer atçılık sektörlerinde önemli ekonomik zararlara sebep olmaktadır .<br />
EHV-1 enfeksiyonlarının yayılmasının sınırlandırılması ya da önlenmesi için alınan<br />
tedbirlerin başında aşı uygulamaları gelmektedir (1,2,17,18,21 ). Bu amaçla etkene karşı<br />
ticari inaktive edilmiş , attenüye , modifiye canlı herpesvirus aşıları kullanılmakta ve aşı<br />
geliştirme çalışmaları devam etmektedir (4,6,7,9,12,13,14,18,20,22,26,30). Ülkemizde de<br />
1970 yılından beri attenue EHV-1 aşısı kullanılmaktadır (29).<br />
Bu çalışmamızda daha önce attenue EHV-1 aşısı ( Kısrakların virusi abortus aşısı)<br />
üretiminde kullanılan attenue RACH EHV-1 suşu ile inaktif EHV-1aşı üretim tekniğinin<br />
Laboratuvarımıza yerleştirilmesi amaçlanmıştır.<br />
8.2 Literatür Özeti:<br />
Atların ve eşeklerin Equine rhinopneumonitisi yada viral atıkları , Equine herpesvirus tip<br />
1’in sebep olduğu bulaşıcı , epidemik ve sporadik solunum sistemi hastalığı, atıklar,<br />
neonatal mortalite ve ensefalomiyelitis ile karakterize önemli bir enfeksiyonudur<br />
(18,19,24) . Hastalığın neden olduğu abortlar, nörolojik bozukluklar ve solunum<br />
enfeksiyonlarına bağlı şekillenen performans düşüklüğünden dolayı yarış atı yetiştiriciliği<br />
ve diğer atçılık sektörlerinde önemli ekonomik zararlara sebep olmaktadır (18,24).<br />
Enfeksiyon etkeni “herpesviridae “familyasının “ alphaherpesviridae” alt grubunda yer<br />
alır. Etken çift iplikçi DNA taşmakta olup, moleküler ağırlığı yaklaşık 140 kbp dir . EHV-<br />
1, ikosahedral simetri gösteren bir kapside sahiptir. Kapsid herpes simpleks virusun<br />
homoloğu olan en az 12 farklı glikoprotein taşıyan lipid bir zarfla çevrilmiştir . Bu zarfın<br />
kolay parçalanabilir olması EHV-1’in çevre şartlarında canlılığını sınırlamakta ve<br />
dezenfektanlar karşısında inaktivasyonunu kolaylaştırmaktadır (8,24). Virus, hücre<br />
kültürlerinde sitopatik etki (CPE) gösteren üreme özelliğine sahiptir (18,24). Etkene<br />
duyarlı türler arasında atlar (equus caballus) ve eşekler (equus asinus) ilk sırayı<br />
alır.Virusun duyarlı türlerde yayılması nasal akıntı, aerosol yolla, atıklar, kontamine yem<br />
ve ekipmanla temas sonucu olur (18,24). EHV-1 ilk olarak ABD’ de Dimock ve Edwards<br />
tarafından 1933 yılında kısraklarda şekillenen abortların etkeni olarak tanımlanmıştır (29).<br />
İlerleyen yıllarda serolojik çalışmalar sırasında elde edilen kanıtlar, dünya genelinde<br />
yaygın bir enfeksiyon oluşturduğunu göstermektedir. Gerek tek başına EHV-1, gerekse de<br />
EHV-4 ile ortak olarak oluşturduğu enfeksiyonlar bu güne kadar Avustralya, İngiltere,<br />
Japonya, Yeni Zelanda, ABD, Çin ve Kanada başta olmak üzere bir çok ülkede tespit<br />
edilmiştir (18,24,27). Türkiye’ de kısrakların virusi abortusu ilk kez İyigören ve Yılmaz<br />
tarafından 1962 yılında Tarım Bakanlığına sunulan raporda , Karacabey Harası<br />
kısraklarında çıkan salgın yavru atma vakalarında ana kısraklardan alınan kan serumlarının<br />
157
Macaristan ‘ da yapılan inceleme sonucu spesifik EHV-1 antikorlarının varlığı serolojik<br />
olarak kanıtlanmıştır ( 29). Daha sonraki yıllarda ise Başkaya ve çalışma arkadaşları (3)<br />
yine Karacabey Harasında çıkan salgın kısrak abortuslarında atık marazi maddelerden<br />
doku kültüründe etken olan virusu izole etmişler ve izolet Federal Almanya’da EHV-1<br />
virusu olarak identifiye edilmiştir. Yılmaz (28) yine adı geçen harada çıkan kısraklardaki<br />
salgın abortuslarda atık fötal organlardan domuz böbreği primer hücre kültüründe CPE<br />
yapan bir virus izole etmiş ve bu ajan Hannover Yük.Vet.Okulunda EHV-1 Equine Herpes<br />
Virusu olarak identifiye edilmiştir.<br />
EHV-1 nedenli enfeksiyonun rhinopnömoni formu genellikle taylarda ve genç<br />
atlarda sonbahar ve kış mevsimlerinde üst solunum yolu enfeksiyonu epidemilerine neden<br />
olmaktadır. (18,25).<br />
EHV-1 enfeksiyonu geçiren gebe kısraklarda abortlar görülebilir.Gebe kısraklarda<br />
EHV-1 enfeksiyonu sonucu oluşan atıklar genel olarak gebelik döneminin son dört ayında<br />
olur (18,23).Eğer yavru intrauterin yaşamda EHV-1 ile enfekte ise, doğduğu zaman zayıf<br />
,depresif ve vucut ısısı yüksek olabilir ve birkaç saat içinde ölür (23).<br />
EHV-1 enfeksiyonlarının yayılmasının sınırlandırılması ya da önlenmesi için alınan<br />
tedbirlerin başında aşı uygulamaları gelmektedir (1,2,17,18,21). Bu amaçla etkene karşı<br />
ticari inaktive edilmiş , attenüye , modifiye canlı herpesvirus aşıları kullanılmakta ve aşı<br />
geliştirme çalışmaları devam etmektedir (4,6,7,9,12,13,14,18,20,22,26,30). Ülkemizde de<br />
1970 yılından beri attenue EHV-1 aşısı kullanılmaktadır (29). Türkiye’de atların EHV-1<br />
enfeksiyonuna karşı kullanılmak üzere 1969 yılında Tarım Bakanlığı Veteriner İşleri<br />
Genel Müdürlüğünün 04.07.1969 tarih ve 300 no’lu Sağlık Müşavere Kurul Kararı ile aşı<br />
üretimine geçilmiştir. Bu amaçla hazırlanan aşı üretiminde kullanılan attenüe<br />
rhinopneumonitis ( EHV-1) aşı suşu domuz böbrek hücre kültüründe 256. pasajda attenüe<br />
edilmiş EHV-1 RAC H suşudur. Almanya Münih Üniversitesi Enfeksiyon Hastalıkları ve<br />
Mikrobiyoloji Enstitüsü’ nden temin edilmiştir. Suş attenuasyon çalışmaları A.Mayr ve ark<br />
(16) tarafından bildirilmiştir.<br />
Doğal EHV-1 enfeksiyonları yaşam siklusunun ilk 18 ayında oluşur ve etken bu<br />
süre zarfında immun sistemi hazırlayarak trigeminal ganglionlarda yerleşen viral latentlik<br />
oluşturur (11,23,24). Doğal enfeksiyon esnasında komplementi bağlayan antikorlar ile<br />
virus nötralizan antikorlar yüksek titrelere ulaşır (7,9,13,15). Bunlardan komplementi<br />
bağlayan antikorlar virus nötralizan antikorlara nazaran daha kısa süre etkilidir ( < 3 ay).<br />
virus nötralizan antikorlar ise daha uzun süreli (> 1 yıl ) kalır (25). İnaktive edilmiş virus<br />
aşılarının kullanılması sirkulasyonda komplementi bağlayan antikorlar ve virus nötralizan<br />
antikorların miktarını arttırır. Aşılama ile EHV-1 nedenli respiratorik enfeksiyonlar ve<br />
atıklar önlenemez; ancak kısa süreli immunizasyon sağlanır ve EHV-1 nedenli respiratorik<br />
semptomların şiddeti ve atık vakaları azalır ancak virus salınımı önlenemez.<br />
(4,6,7,9,12,13,14,18,20,22,26,30). Günümüzde çeşitli yöntemlerle inaktive edilen ve<br />
adjuvant ilave edilmiş inaktif EHV-1 aşısı ile ilgili gerek atlarda gerekse deney<br />
<strong>hayvan</strong>larında model olarak bağışıklık ve etkinlik çalışmaları yapılarak test edilmiştir<br />
(1,3,5). Thomson ve ark (20) formaldehit ile inaktive edilip adjuvant ilave edilerek<br />
hazırlanmış inaktif EHV-1 aşısı ile iyi bir humoral yanıt alınmasına rağmen eprüvasyon<br />
sonrası klinik hastalık tablosunun ve atıkların kısmen önlenebildiğini ve virus salımına<br />
engel olamadığını bildirmişlerdir. Karbomer adjuvantlı hazırlanan inaktif EHV1-4 aşısı<br />
eprüvasyon sonrası ponilerde kısmi olarak klinik olayları ve virus saçılımının engellendiği<br />
bildirilmiştir (10). Aynı aşı ile 3 kez aşılanan gebe kısraklarda önemli ölçüde atıkların<br />
önlendiği ancak epruvasyon sonrası hücreye bağlı viremiye karşı korumadığı bildirilmiştir<br />
(10). Avustralya’ da EHV ‘ye bağlı hastalıkla mücadelede İnaktif aşı uygulaması sonucu<br />
atıkların insidansının düştüğü bildirilmiştir (8). Genelde EHV-1 inaktif aşılar uzun süreli<br />
koruma sağlamazlar, ancak carbomer -adjuvantlı bir aşı ile klinik hastalık lara karşı 6 ay<br />
158
süreli bir koruma sağlandığı bildirilmiştir (10). Davies ve ark. ( 5) EHV-1 RACH suşu ile<br />
BHK hücrelerinde ,çift inaktivan olarak deterjan ve formoldehitle inaktive ederek<br />
hazırladıkları inaktive EHV-1 aşısı ile başarılı sonuçlar aldıklarını bildirmişlerdir. EHV-1<br />
enfeksiyonunda başarılı bir immunizasyon için enfeksiyon mukozal yüzeylerden<br />
başlamasından dolayı sitotoksik T-lenfositler, mukozal ve sistemik antikorların<br />
kombinasyonundan oluşan bir immun yanıta ihtiyaç duyulur. Bu amaçla EHV-1<br />
enfeksiyonundan korunmada intranazal yöntemle immunize edilen aşı çalışmaları da<br />
gerçekleştirilmiştir (13,15).<br />
8.3. MATERYAL VE METOT:<br />
MATERYAL:<br />
Virus suşu:<br />
Aşı üretiminde kullanılan attenüe rhinopneumonitis ( EHV-1) aşı suşu domuz böbrek hücre<br />
kültüründe 256. pasajda attenüe edilmiş EHV-1 RAC H suşudur. Almanya Münih<br />
Üniversitesi Enfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyoloji Enstitüsü’ nden temin edilmiş olup<br />
Tarım Bakanlığı Veteriner İşleri Genel Müdürlüğünün 04.07.1969 tarih ve 300 no’lu<br />
Sağlık Müşavere Kurul Kararı ile aşı üretimine geçilmiştir. Suş attenuasyon çalışmaları<br />
A.Mayr ve ark. (16) tarafından bildirilmiştir. Primer kuzu böbrek hücre kültürlerinde<br />
üretilen ana tohum suş liyofilize formda -70 ºC’de muhafaza edilmektedir.<br />
Hücre: ATCC den temin edilen MDBK , RK 13 hücreleri ve Şap Enstitüsünden temin<br />
edilen BHK 21 hücreleri<br />
Vasat: Minimum essential medium- NAHCO3 lı Earl’ s vasatı , G.MEM % 10 FCS’lu<br />
hücre ve virus üretme vasatı olarak.<br />
Fötal Dana Serumu: Hücre kültürü üretmek için vasata katılacaktır.( serumun<br />
Mycoplasma, BVD ve diğer viral ajanlar yönünden ariliği test edilmiştir.)<br />
Hyperimmun serum: EHV-1 spesifik hyperimmun serum ( Ticari olarak temin<br />
edilecektir.)<br />
EHV-1 antikor ELISA: Ticari olarak temin edilecektir.<br />
Deneme <strong>hayvan</strong>ları: Enstitünün deneme <strong>hayvan</strong>ları bölümündeki fare, kobay,hamster ve<br />
TİGEM işletmelerindeki atlar<br />
Beta propiolakton : Ticari olarak temin edilecektir<br />
Montanide ISA 206 ( Seppic) adjuvant:. Ticari olarak temin edilecektir<br />
Thiomersol : Ticari olarak temin edilecektir<br />
Tris :Ticari olarak temin edilecektir<br />
METOT:<br />
Attenue EHV-1 aşı üretiminde kullanılan RAC H ana tohum suşu inaktif aşı üretimi<br />
içinde kullanılacaktır. Deneme üretimi gerçekleştirildikten sonra ve kalite kontrol<br />
testlerinin tamamlanmasını müteakip kobay, hamster, fareler,3-6 aylık taylar ve kısraklarda<br />
bağışıklık, zararsızlık testleri ( OIE Manual of standarts of diagnostic tests and vaccines<br />
(18) ve European pharmacopea ‘ ye göre (5))ile saha denemelerine geçilecektir. Daha<br />
sonra aşının stabilite ve bağışıklık süresi tespit çalışmaları yapılacaktır.<br />
Üretim metodu:<br />
159
1. Yeterli miktarda BHK 21 hücre kültürü çoğaltılması<br />
2. Monolayer olan hücrelere ( %90) virus inokulasyonu (MOI 0,01 ) ve 37˚C ‘de<br />
inkubasyon<br />
3. CPE yönünden muayeneler ( % 90-95 CPE )ve bulk ürünün toplanması (3-6 gün<br />
içinde )<br />
4. Bulk ürün kontrol testleri ( OIE Manual of standarts of diagnostic tests and<br />
vaccines (18) ve European pharmacopea ‘ ye göre (5));Titre tayini, İdentity,<br />
Sterilite<br />
5. Klarifikasyon ve Protein konsantrasyonu ( santrifügasyon ve ultrafiltrasyon ile)<br />
6. İnaktivasyon : Konsantre virüs sıvısına pH 8.0 1M Tris-hydroxymethylaminomethane<br />
( Tris) ilave edilir 10 dakika oda ısısında karıştırılır. PBS içinde pH<br />
7.4 olarak dilue edilen Beta propiolakton final konsantrasyon % 0.2 (v/v) olacak<br />
şekilde ilave edilir, 3 saat 37ºCde karıştırılır. Hydralizasyon için 18 saat 5ºCde<br />
karıştırılarak inkübe edilir. İnaktivasyon sonrası in vitro ve invivo inaktivasyon<br />
kontrol testleri yapılır<br />
7. İnaktivasyon kontrol testleri<br />
İn vivo test: 5 ml İnaktive olan virus suspansiyonundan 4 adet EHV-1 seronegatif<br />
hamstere inokulasyon yapılır. İki adet aşılanmamış hamster negatif kontrol olarak<br />
bırakılır. 21 gün boyunca klinik olarak anormal bir belirti olup olmadığı yönünden<br />
gözlenir. İki günde bir 21 gün boyunca EDTA ‘ lı tüplere kan alınarak EHV-1 virus<br />
varlığı yönünden test edilir.<br />
İn vitro test: Üç adet 175 cm 2 monolayer BHK 21 hücrelerine 10ml inaktive olan<br />
virus süspansiyonundan inokulasyon yapılır. Üç pasaj sonra CPE varlığı ile EHV-<br />
1 yönünden test edilir.<br />
8. Adjuvant ve koruyucu ilave edilmesi: İnaktivasyon gerçekleştikten ve test<br />
edildikten sonra eşit hacimde Montanide ISA 206 adjuvanla 50:50(v/v) oranında<br />
karıştırılarak emülsifiye edilir. Önce 12 saat 27ºC de bekletilir, daha sonra oda<br />
ısısında 2 saat, +4ºC de 12 saat manyetik karıştırıcı ile karıştırılır konsantrasyon 1:<br />
10 000 olacak şekilde koruyucu olarak %5 solusyondan Thiomersol katılır.<br />
9. Final ürün kontrol testleri: OIE Manual of standarts of diagnostic tests and vaccines<br />
(18) ve European pharmacopea ‘ ye göre (5));Titre tayini, İdentity, Sterilite,<br />
zararsızlık, potens ve immunite<br />
Titre tayini: İnaktivasyondan önce ; konsantrasyon öncesi ve sonrası virus titresi tespit<br />
edilerek saptanır .<br />
Saha çalışmaları: EHV-1 antikorları yönünden negatif 25 kısrak immunite testi için<br />
kullanılacak.<br />
- 20 kısrak 1 saha dozu derin i.m aşılanır<br />
- 5 kısrak aşısız kontrol olarak bırakılır.<br />
İmmunite yönünden aşılanan atlar 3 hafta boyunca beden ısıları alınır klinik tablo izlenir.<br />
Bu süre sonunda deneme <strong>hayvan</strong>larından EHV-1 antikorları yönünden test edilmek üzere<br />
kaolinli tüplere kan örnekleri alınır . Aşılama sonrası 3. haftada alınan kan serum örnekleri<br />
EHV-1 antikorları yönünden VNT ve ELISA ile test edilir. Aşılı atlarda kan serumları en<br />
az 1/4 dilüsyonda EHV-1 antikorları yönünden sero pozitif olmalıdır.<br />
8.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:<br />
İnaktif EHV-1 aşı üretimi tekniğinin laboratuvarımıza yerleştirilmesi ile 1969 yılından<br />
beri ülkemizde zaman zaman atıklara neden olan EHV-1 neden olduğu enfeksiyonlara<br />
karşı canlı aşı ile mücadele edilirken , inaktif aşı ile mücadeleye devam etmek mümkün<br />
olacaktır. Gebe kısraklarda güvenli kullanımı ile aşılama takvimi kesintisiz devam<br />
160
edecektir (5-7-9.aylarda) . Böylece EHV-1 hastalığına bağlı oluşan atıklardan kaynaklanan<br />
ekonomik kayıpların önüne geçilecektir<br />
9. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
9.1. Proje Lideri Adı-Soyadı : Dr. Özden KABAKLI<br />
9.2. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Vet. Hekim Elvin ÇALIŞKAN<br />
9.3. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Biyolog Süreyya YÖNDEM<br />
9.4. Yardımcı Araştırmacı Adı-Soyadı : Dr.Nedret ÇELİK ( Şap Enstitüsü)<br />
9.5. Yardımcı Teknik Eleman Adı-Soyadı: Laborant Murat SIRIM<br />
10. ARAŞTIRMA BİRİMİNİN YETERLİLİĞİ:<br />
10.1. Birimde Mevcut Donanım : Proje Etlik Merkez Veteriner Kontrol<br />
ve Araştırma Enstitüsü bünyesinde gerçekleştirilecektir.<br />
10.2. Birim Dışında Yararlanılabilecek Donanım : TİGEM atçılık işletmeleri<br />
10.3. Birimde Yürütülmekte Olan Araştırma-Geliştirme Etkinlikleri: “Vero hücrelerinde<br />
ısıya dayanıklı Sığır vebası aşı üretimi” isimli proje.<br />
11. TALEP EDİLEN BÜTÇE<br />
I. YATIRIM TUTARI: Toplam: 61.200 YTL<br />
YATIRIM TUTARININ DAĞILIMI<br />
03 MAL VE HİZMET ALIM<br />
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
03.1- ÜRETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
03.2- TÜKETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME<br />
ALIMLARI<br />
03.2.1.01 Kırtasiye Alımları<br />
03.2.4.03 Yem Alımları<br />
03.2.6.01 Laboratuar Malzemesi ile Kimyevi<br />
ve Temrinlik Malzeme Alımları<br />
03.3- YOLUKLAR<br />
03.3.1.01 Yurtiçi Geçici Görev Yollukları :<br />
20.000<br />
200<br />
500<br />
500<br />
4- GÖREV GİDERLERİ<br />
03.5- HİZMET ALIMLARI<br />
03.6- TEMSİL VE TANITMA GİDERLERİ<br />
03.7- MENKULMAL, GAYRİMADDİ HAK ALIM,<br />
BAKIM VE ONARIM GİDERLERİ<br />
03.8- GAYRİMENKUL MAL BAKIM VE ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
03.9- TEDAVİ VE CENAZE GİDERLERİ<br />
TOPLAM 20.000 1200<br />
161
YILLARA GÖRE DAĞILIM<br />
06 SERMAYE GİDERLERİ 1.Yıl 2.Yıl 3.Yıl 4.Yıl<br />
06.1-MAMUL MAL ALIMLARI<br />
06.1.2.04 Laboratuar Cihazı Alımları 40.000<br />
06.2-MENKUL SERMAYE ÜRETİM GİDERLERİ<br />
06.3-GAYRİMADDİ HAK ALIMLARI<br />
06.4-GAYRİMENKUL ALIMLARI VE<br />
KAMULAŞTIRILMASI<br />
06.5-GAYRİMENKUL SERMAYE ÜRETİM<br />
GİDERLERİ<br />
06.6- MENKUL MALLARIN BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.7- GAYRİMENKUL BÜYÜK ONARIM<br />
GİDERLERİ<br />
06.8- STOK ALIMLARI (SAVUNMA DIŞINDA)<br />
06.9- DİĞER SERMAYE GİDERLER<br />
TOPLAM 40.000<br />
12. ÇALIŞMA TAKVİMİ:<br />
I.YIL 2.YIL 3.YIL<br />
a- üç seri deneme üretim ve a . Deneme aşı serileri ile pilot saha<br />
kalite kontrol testlerinin bağışıklık testlerinin uygulanması<br />
yapılması.<br />
b. Deneme üretim yapılan aşı serileri<br />
ile stabilite ve bağışıklık süresi tespiti<br />
çalışmalarının yapılması<br />
c- proje <strong>değerlendirme</strong> ve yazım.<br />
13. LİTERATÜR LİSTESİ:<br />
1. ALLEN,GP, STOKES, A., PULLEN, LA., MURRAY,KP. ( 1989) : A Hamster<br />
Model of Equine Herpesvirus Type 1 ( EHV-1) İnfection; Passive protection by<br />
monoclonal antibodies to EHV-1 Glycoproteins 13,14 and 17/18. J.Gen.Virol.<br />
70,1173-1183.<br />
2. ALLEN GP (2003 ): Respiratory infections by equine herpesvirus types 1 and 4. In<br />
Equine Respiratory Diseases, Lekeux P.International Veterinary Information Service<br />
(www.ivis.org),<br />
3. BAŞKAYA,H., KESKİNTEPE,H., DOĞUER, M., İYİGÖREN,B., YILMAZ,S.,<br />
DEMİRYONGUÇ,A. ( 1968): An Outbreak equine virus abortion in Turkey. 1.<br />
isolation and identification of Rhinopneumonitis virus in cell cultures. A.Ü. Vet.<br />
Fakültesi dergisi, cilt: XV,no: 3-4.<br />
4. BRYANS, JT.,ALLEN,GP( 1982): Application of a chemically inactivated,<br />
adjuvanted vaccine to control abortigenic infection of mares by equine herpes virus 1.<br />
Dev. Biol. Stand. 52:493-8.<br />
5. EUROPEAN PHARMACOPOEİA. (2001). Addendum No. 0016. Council of<br />
Europe, Strasbourg, 1657-1661.<br />
6. DAVIES, J., COLLIS, K., WOLLEN, R., JAGGER, D,SKINNER ,G.R.B.(<br />
1996): Immunogenecıty of equine herpes vaccine NFU.DIAL. EHV.1 (S.BHK).<br />
Vaccines and control of infectious disease: The way forward. 14th international<br />
symposium 1996.Scotland UK.<br />
162
7. ELLIS,J.A., BOGDAN,J.R., KANARA, E.W., MORLEY, PS., HAINES,<br />
D.M.(1995): Cellular and antibody responses to Equine Herpesviruses 1 and 4<br />
following vaccination of horses with modified live and inactivated viruses. J. Am.<br />
Vet. Med. Assoc. 15; 206(6): 823-<br />
8. FENNER F (1987): Herpesviridae.In Veterinary Virology, Academic Press ,London<br />
,359-373<br />
9. FOOTE,C.E., GILKERSON,J.R., WHALLEY,J.M., LOVE, D.N.( 2003):<br />
Seroprevalance of Equine Herpesvirus 1 in mares and foals on a large Hunter Valley<br />
Stud farm in years pre and post vaccination. Aust.Vet. J.Vol.81(5): 283-288.<br />
10. HASEBE R, KİMURA T, NAKAMURA K; OKAZAKİ K; OCHİAİ K;<br />
WADA R; UMEMURA T (2002): Passage of equine herpesvirus 1 in suckling<br />
mouse brain enhances extraneural virus growth and subsequent hematogenous<br />
neuroinvasion.J.Vet.Med.Scie., 10:907-912<br />
11. HELDENS J.G., HANNANT D., CULLİNANE A.A.,PRENDERGAST M.J.,<br />
MUMFORD J.A., NELLY M.,KYDD J.H., WESTSTRATE M.W., VAN DER<br />
HOVENR.,( 2001) Clinical and virological evaluation of the efficacy of an<br />
inactivated EHV1and EHV4 whole virus vaccine (Duvaxyn EHV1,4).<br />
Vaccination/challenge experiments in foals and pregnant mares, Vaccine 19:97–144<br />
12. KONDO T, MC GREGOR M, CHU Q, CHEN D, HORİMOTO T,<br />
KAWAOKA Y (2004): A protective effect of epidermal powder immunization in<br />
mouse model of equineherpesvirus 1 infection. Virology, 318: 414-419<br />
13. KYYD JH, WATTRANG E, HANNANT D (2003) : Preinfection frequencies of<br />
equine herpesvirus 1 spesific cytotoxic T lymphocytes corralate with protection<br />
against abortion following experimental infection of pregnant mares. Vet. Immunol<br />
& immunpathol., 96:207-217<br />
14. LUNN,P.,BREATHNACH,C.(2005): Immune Response to an Inactivated Equine<br />
Herpesvirus 1 vaccine by Epidermal powder Immunization. SRP Bio Program.,<br />
Biology: 39-42.<br />
15. MAYER,G.A., AUSTIN,F.W., JONES,D., RAUNEN,A.R.(1997): Serum<br />
Neutralizing Antibody Response to the Administration of Modified Live Equine<br />
Herpesvirus 1 Vaccine. AAEP Proceedings. Vol.43:20-21.<br />
16. MAYR,A.,PETTE,J.,PETZOLDT,K.,WAGENER,K. (1968): Untersuchungen zur<br />
Entwicklung eines Lebendimpfstoffes gegen die Rhinopneumonitis ( stutenabort) der<br />
Pferde. Zbl.Vet.Med. B,15,406-418.<br />
17. MINKE,JM., AUDONNET, J.C., FISCHER, L.( 2004): Equine Viral Vaccines:<br />
the past,present and future. Vet. Res. 35: 425-443.<br />
18. Office International des Epizooties (OIE). (2000). Equine rhinopneumonitis , Chapter<br />
3.4..7 In Manual of standarts of diagnostic tests and vaccines. OIE, Paris,<br />
19. SIEDEK ME, WHELAN M, EDİNGTON N, HAMBLİN A (1999): Equine herpes<br />
virus type 1 infects dendritic cells in vitro:stimulation of T lymphocyte proliferation<br />
and cytotoxicity by infected dendritic cells. Vet. Immunol&immunpathol., 67:17-32<br />
20. SKINNER,G.R., DAVIES, J.(2000): Efficacy of an Inactivated Vaccine for Equine<br />
Herpesvirus type 1 in a novel hamster model. Int. Virol. 43(1):27-35.<br />
21. STRAUB,OC. (1996): Herpesviruses: To Vaccinate or Eradicate. Vaccines and<br />
control of infectious disease: The way forward. 14th international symposium<br />
1996.Scotland UK.<br />
22. THOMSON,G.R., MUMFORD,J.A., SMITH,I.M. (1979): Experimental<br />
immunization against respiratory disease due to equid herpesvirus 1 infection (<br />
rhinopneumonitis) using formalin-inactivated virus with various adjuvants. Vet.<br />
Microb. 4:3; 209-222.<br />
163
23. TRAPP,S.,EINEM,J.V., HOFMANN,H.,KÖSTLER,J., WILD,J., WAGNER, R.,<br />
BEER,M., OSTERRIEDER ,N. ( 2005) : Potential of Equine Herpesvirus 1 as a<br />
vector to immunization. J.Virol. 79(9): 5445-5454.<br />
24. WALKER C, LOVE ND, WHALLEY MJ (1999) : Comparison of pathogenesis of<br />
acute equine herpesvirus 1 (EHV-1) infection in the horse and mouse model:a<br />
review. Vet Microbiol. , 68: 3-1<br />
25. WANG,L. ( 2003): An investigation of the association between herpes viruses and<br />
respiratory disease in racehorses in Western Australia. PhD Doctorate Thesis.<br />
http://www.lib.murdoch.edu.au/adt/pubfiles/adt-U20040820.112222/02whole.pdf.<br />
26. WHALLEY MJ, FOOTE CE, LOVE ND; GİLKERSON;RJ<br />
(2003):Investigations of equine herpesvirus 1 cycle of infection in Foals.. A report<br />
for the Rural Industries Research Development Corporation RIRDC web<br />
publication No: W03/006, May 2003<br />
27. WHALLEY,J.M., FOOTE,C.E.,RAIDAL,S.(2005): Evaluating Equine Immune<br />
Responses to New EHV-1 vaccine Candidates. Areport for Rural Industries Research<br />
and Development Corporation Australian Goverment.<br />
28. WILKS,C.R.( 1976): Equine herpesvirus type 1 . The immune response.<br />
Dissertation-Abstracs-International. 36B: 12,6010.<br />
29. YAZICI,Z. (2004): Atların Herpesvirus- 1 Enfeksiyonu. YYU Vet Fak Derg.<br />
2004, 15 (1-2):103-106<br />
30. YILMAZ,S. ( 1971): Domuz Böbreği epitel hücre kültüründe izole ve identifiye<br />
edilen “ rhinopneumonitis virusu” .Etlik Veteriner Bakterioloji Enstitüsü<br />
Dergisi.,3,11-12,55-62.<br />
31. YILMAZ,S., GİRGİN,H., YONGUÇ,A.D., AKÇORA,A., KARAMAN,Z.,<br />
TATAR,N., ERTÜRK,A., CARİOĞLU,B. ( 1985): Türkiye Jokey Klübü İzmit<br />
Harası safkan İngiliz kısraklarında tespit edilen “EHV-1” ( Kısrakların Virusu<br />
Abortusu) enfeksiyonu, koruyucu aşılamalar ve alınan sonuçlar. 8 (1): 230-237.<br />
32. ZHANG Y; SMİTH MP, TARBET BE, OSTERRİEDER N, JENNİNGS RS,<br />
O’CALLAGHAN JD (1998): Protective immunity againist equine herpesvirus type<br />
1(EHV-1) infection in mice induced by recombinant EHV-1 gD. Virus Res., 56:11-<br />
26.<br />
14. TEKLİF ONAYI:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
14.1.Proje Lideri : Dr. Özden KABAKLI<br />
14.2. Öneren Kuruluş Müdürü : Dr. Nahit YAZICIOĞLU<br />
14.3. Destekleyen Kuruluşlar :<br />
14.4. İşbirliği Yapılan Kuruluşlar : TİGEM,Şap Enstitüsü<br />
164
SONUÇLANAN<br />
PROJELER<br />
165
DOĞAL ENFEKTE VE AŞILI SIĞIR VE KOYUNLARDA<br />
BRUSELLOZİSİN TEŞHİSİNDE KOMPETETİF ELISA<br />
TEKNİĞİNİN UYGULANMASI<br />
Dr. Asiye DAKMAN, Dr. Uğur KÜÇÜKAYAN<br />
Vet. Hek. Ufuk ÜLKER, Yük. Zir. Müh. Mustafa Ö. DEMİR<br />
Etlik Veteriner Merkez Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
ÖNSÖZ<br />
Bir <strong>hayvan</strong>cılık ülkesi olarak bilinen ancak <strong>hayvan</strong> varlığının giderek azaldığı<br />
ülkemizde görülen zoonoz hastalıkların en önemlilerinden biri de Brusellozistir.<br />
Ülkemizde 1984 yılından başlatılan Brusellozis Mücadele <strong>program</strong>ı kapsamında belli<br />
aralıklarla sero-survey çalışmaları yapılmakta ve yoğun aşılama <strong>program</strong>ları<br />
uygulanmaktadır. 1997–1999 yılları arasında yapılan en son ülkesel sero-survey<br />
çalışmasında alınan sonuçlar göstermiştir ki Brusellozis ülkemizin en önemli sorunlarından<br />
biri olmaya devam etmektedir.<br />
Hastalığın kesin teşhisi etken izolasyonu ve identifikasyonuna bağlı olmasına<br />
rağmen, Brusellozisin bir sürü hastalığı olması, etken izolasyonunda yaşanan güçlükler ve<br />
zaman kaybı nedeniyle teşhis, kontrol ve eradikasyon <strong>program</strong>ları serolojik testlerle<br />
reaktörlerin saptanması esasına dayandırılmıştır. Brusellozis’in indirekt teşhisinde Rose<br />
Bengal Plate Test (RBPT), Yavaş Tüp Aglütinasyon Testi (SAT), Komplement Fikzasyon<br />
testi (CFT), ELISA gibi serolojik yöntemler kullanılmaktadır. Uluslararası standartlara<br />
göre bu testlerden RBPT’nin tarama testi , CFT’nin ise standart doğrulama testi olarak<br />
kullanılması önerilmiştir. OIE’de Sığır Brucellosisinin teşhisinde kullanılan testler arasında<br />
standart test kabul edilen CFT’nin yanında Kompetitif-ELISA (C-ELISA) da<br />
bulunmaktadır. C-ELISA ilgili yapılan çalışmalarda diğer testlere göre spesifite ve<br />
sensivite oranlarının yüksekliği, testin uygulamasındaki kolaylık ve kısa zamanda sonuç<br />
alınabilmesi nedeniyle özellikle tercih edildiği bildirilmektedir. Ayrıca C-ELISA<br />
yönteminin aşılı ve doğal infekte <strong>hayvan</strong>ların ayrımında diğer testlere göre daha güvenilir<br />
sonuç verdiği bildirilmiştir.<br />
Bu çalışmada sığır ve koyun Brucellosis’inin serolojik tanısında rutin olarak<br />
kullanılan testlerle kompetitif ELISA (C-ELISA) testinin karşılaştırılması, aşılı sığır ve<br />
koyunlarla doğal infekte <strong>hayvan</strong>ların ayırt edilmesinde C-ELISA’nın rolünün araştırılması<br />
amaçlanmıştır.<br />
Bu çalışma TAGEM tarafından TAGEM/HS/01/02/05/101 nolu proje olarak<br />
desteklenmiştir.<br />
İşbirliği Yapılan Kuruluşlar:<br />
Tarım Ve Köyişleri Bakanlığı Polatlı Tarım İşletmesi<br />
ÖZ<br />
Bu çalışmada Brucella S19 genç aşısı ile aşılanan danalar ile Brucella spp. ile<br />
infekte sığırlar ve Brucella Rev-1 genç aşısı ile aşılanmış koyunlar ile Brucella spp ile<br />
infekte koyunlara ait kan serumları konvansiyonel testler ve Kompetitif-ELISA ile test<br />
edilerek <strong>hayvan</strong>lardaki humoral immun yanıt değerlendirilmiştir. İnfekte sığır sürülerinde<br />
de atık yapmış <strong>hayvan</strong>ların % 94’ü RBPT, %98’i SAT, %92’si CFT ve %95’i C-ELISA,<br />
ile pozitif bulunmuştur. Aşı yapılan danalara, aşılama günü 0. gün kabul edilerek 21., 45.,<br />
90., 120. ve 180. günlerde aynı testler uygulanmıştır. Antikor titrelerinde test zamanlarına<br />
166
göre testler arasında farklılıklar meydana gelmiştir. 90. günde SAT ile bütün <strong>hayvan</strong>lar<br />
negatif sonuç vermiştir. 180. günde ise C-ELISA ve CFT ile %3 pozitiflik bulunurken<br />
RBPT ve SAT testleri ile negatif sonuç alınmıştır. Bu çalışmada aşılı danalarda CFT ve<br />
CELISA testlerinde benzer sonuçlar alınmıştır. İnfekte koyun sürülerinde atık yapmış<br />
<strong>hayvan</strong>ların % 91,16 RBPT, %91,16’i SAT, %85,63’u CFT ve % 86,74 C-ELISA, ile<br />
pozitif bulunmuştur. Aşılı koyunlara aşılama günü 0. gün kabul edilerek 14.,21., 45., 90.,<br />
120. 180. ve 270. günlerde aynı testler uygulanmıştır. 45. günden itibaren bütün testlerde<br />
antikor titreleri düşme eğilimi görülmüş, 90. günden itibaren antikor titrelerinde testlere<br />
göre önemli farklılıklar meydana gelmiştir. 120.günde SAT’da örneklerin tamamının<br />
negatif olduğu tespit edilmiştir. 120,180 ve 270. günlerde 270. günlerde RBPT ve C-<br />
ELISA pozitiflik oranı benzer bulunurken, CFT ile ancak 270. günde pozitiflik oranı diğer<br />
testlere yakın bir orana düşmüştür. Genel olarak C-ELISA yöntemimin özellikle CFT’ye<br />
bir alternatif test olarak teşhiste kullanılabileceği ancak aşılı ve doğal infekte <strong>hayvan</strong>ların<br />
ayrımı konusunda ülkemizde daha kapsamlı çalışmalar yapılması gerektiği kanaatine<br />
varılmıştır.<br />
ABSTRACT<br />
In this study, blood sera from vaccinated calves with Brucella S19 vaccine and<br />
infected cattle with Brucella spp., and vaccinated lambs with Brucella Rev- 1 vaccine and<br />
infected sheep with Brucella spp. were tested with conventional tests and Competitive-<br />
ELISA, humoral immune response of the calves was evaluated. Of the cattles which<br />
aborted in the infected herds 94% in RBPT, 98% in SAT, 92% in CFT and 95% in C-<br />
ELISA were found positive. The same tests were applied to the calves, fixing the<br />
vaccination day as “0”, on days 21, 45, 90, 120 and 180. Differences were found between<br />
the tests in antibody titers on the basis of testing times. All animals were found negative in<br />
SAT on day 90. On day 180, 3% poisitivity in C-ELISA and CFT were found while RBPT<br />
and SAT tests yielded negative results. The results obtained in CFT and C-ELISA in<br />
vaccinated calves were similar. Of the aborted animals that in infected flocks, 91,16% in<br />
RBPT, 91,16% in SAT, 85,63% in CFT and 86,74% in C-ELISA were found positive. The<br />
same tests were applied to the lambs, fixing the vaccination day as “0”, on days 14, 21, 45,<br />
90, 120, 180.and 270. Tendency to decreasing of the antibody titers for all testts was seen<br />
after 45days, after 90. day significant differences in antibody titers were occured according<br />
to statistical the tests. All samples were found negative in SAT on day 120. While the rate<br />
of positives in RBPT and C-ELISA were found similar, in CFT only on day 270 the rate of<br />
positives came down close to the other tests. It was concluded that in general, C-ELISA<br />
method could be used in the diagnosis as alternative especially to CFT, however, more<br />
detailed studies should be carried out for the differentiation of vaccinated and naturally<br />
infected animals<br />
1.GİRİŞ<br />
Brucellosis dünyanın birçok ülkesinde olduğu gibi ülkemizde de yaygın olarak<br />
görülen ve ekonomik olarak önemli zoonoz bir hastalıktır. Hastalık abortus, süt verimi<br />
kaybı, damızlık değeri kaybı ve infertiliteye sebep olması nedeniyle <strong>hayvan</strong>sal üretimde<br />
kayıplara yol açarken, infekte <strong>hayvan</strong>larla direk temas veya kontamine süt ve süt<br />
ürünlerinin tüketimi ile önemli bir halk <strong>sağlığı</strong> problemi oluşturmaktadır. Hastalığın kesin<br />
teşhisi etken izolasyonu ve identifikasyonuna bağlı olmasına rağmen, kontagiyöz bir sürü<br />
enfeksiyonu olması, etkenin hücre içi yerleşmesi, etken izolasyonun ve identifikasyonunda<br />
yaşanan güçlükler nedeniyle serolojik testler de oldukça önemli hale gelmektedir. Bu<br />
nedenle hastalığın teşhisi, kontrol ve eradikasyon <strong>program</strong>ları serolojik testlerle<br />
reaktörlerin saptanması esasına dayandırılmıştır. Brucellosis’in serolojik teşhisinde Rose<br />
Bengal Plate Test (RBPT), Yavaş Tüp Aglütinasyon, Rivanol Aglütinasyon, Coombs<br />
167
Aglütinasyon, Komplement Fikzasyon testi (CFT) gibi testler kullanılmaktadır. Son<br />
yıllarda bu testlerin yanında ELISA yöntemi de dünyada yaygın olarak kullanım alanı<br />
bulmuştur. Bu testler arasında CFT, Brucellosis teşhisinde standart test olarak kabul<br />
edilmektedir. Ancak bu testin uygulaması ve standardizasyonunda güçlükler<br />
yaşanmaktadır. Bunlar ise testin güvenirliğini doğrudan etkileyen faktörlerdir. Son yıllarda<br />
OIE’de Sığır Brucellosisinin teşhisinde kullanılan testler arasında standart test kabul edilen<br />
CFT’nin yanında C-ELISA da bulunmaktadır. Kompetitif-ELISA (c-ELISA) ilgili yapılan<br />
çalışmalarda diğer testlere göre spesifite ve sensivite oranlarının yüksekliği, testin<br />
uygulamasındaki kolaylık ve kısa zamanda sonuç alınabilmesi nedeniyle özellikle tercih<br />
edildiği bildirilmektedir. Ayrıca c- ELISA yönteminin aşılı ve doğal infekte <strong>hayvan</strong>ların<br />
ayrımında diğer testlere göre daha güvenilir sonuç verdiği bildirilmiştir. C-ELISA<br />
yönteminin KF testinden çok daha kolay olması, kısa bir sürede çok daha fazla serum<br />
örneğinin test edilmesine imkân tanıması ve sonuçlarının 1,5 saat gibi kısa bir sürede<br />
alınması nedeniyle rutin olarak laboratuarlarımızda kullanılmasının mücadele <strong>program</strong>ına<br />
önemli katkılar sağlayacağı düşünülmektedir. Özellikle mücadele <strong>program</strong>ı kapsamında<br />
yapılacak serosurvey çalışmalarını kolaylaştıracaktır.<br />
2. LİTERATÜR ÖZETİ<br />
Brucellosis dünyanın birçok ülkesinde yaygın ve ekonomik olarak önemli zoonotik<br />
bir hastalıktır. Brucella etkenlerinin neden olduğu Brusellozis; sığır, koyun, keçi, domuz,<br />
geyik, köpek ve diğer pek çok <strong>hayvan</strong>da görülmektedir. Sığırlarda hastalığa öncelikle<br />
Brucella abortus sebep olurken koyun ve keçi Brusellozis’inde ise B.melitensis önem<br />
taşımaktadır. Etken özellikle testis, meme, uterus, gibi organlara yerleşerek abortus, süt<br />
verimi kaybı, damızlık değeri kaybı, infertiliteye sebep olması nedeniyle <strong>hayvan</strong>sal<br />
üretimde kayıplara yol açarken, infekte <strong>hayvan</strong>larla direk temas veya kontamine süt ve süt<br />
ürünlerinin tüketimi ile önemli bir halk <strong>sağlığı</strong> problemi oluşturmaktadır (Alton ve<br />
ark.1988, Arda ve ark. 1987, Aydın 1997).<br />
Kuzey Avrupa, Kanada, Avustralya ve Yeni Zelanda da yıllar süren yoğun<br />
çabalarla Brusellozis büyük ölçüde eradike edilmiştir. Buna karşın Akdeniz bölgesi,<br />
Ortadoğu, Batı Asya’nın gelişmekte olan ülkelerinde, Afrika ve Latin Amerika’nın bir<br />
kısmında insan ve <strong>hayvan</strong>larda yaygınlığını sürdürmektedir. Akdeniz bölgesinde yer alan<br />
ülkemizde de Brusellozis insanlarda ve <strong>hayvan</strong>larda yaygın olarak görülen ve önemli<br />
sorunlara neden olan bir hastalıktır (Arda 1991, Aydın 1989, Aydın 1991).Ülkemizde 1983<br />
yılında planlanan ve 1984 yılından beri uygulanan Brusellozis Mücadele <strong>program</strong>ı<br />
uygulanmaktadır(Anon 1989). Bu kapsamda belli aralıklarla sero-survey çalışmaları<br />
yapılmakta (1986,1990,1991,1999) ve yoğun aşılama <strong>program</strong>ları uygulanmaktadır (Anon<br />
1989,Anon1991, İyisan ve ark. 2000). 1997-1999 yılları arasında yapılan en son ülkesel<br />
sero-survey çalışması sonucunda Türkiye’de Brusellozis prevelansı sığır popülasyonunda<br />
% 1,43 koyun popülasyonunda ise % 1,97 olarak tespit edilmiştir (İyisan 2000). Alınan<br />
sonuçlar göstermiştir ki Brusellozis ülkemizin en önemli sorunlarından biri olmaya devam<br />
etmektedir.<br />
Brusellozis’in teşhisinde direkt (etken izolasyonu ve identifikasyonu) ve İndirekt<br />
(serolojik testler, vb.) tanı metotları kullanılmaktadır. Hastalığın kesin teşhisi etken<br />
izolasyonu ve identifikasyonuna bağlı olmasına rağmen, infekte <strong>hayvan</strong>dan etken<br />
izolasyonunun her zaman mümkün olmayışı, izolasyonun uzun zaman alması ve çok<br />
sayıda <strong>hayvan</strong> söz konusu olduğunda kültürel muayenelerle infekte <strong>hayvan</strong>ları saptamak<br />
saha ve laboratuar personeli için pratik değildir. Bu nedenle hastalığın teşhisi kontrol ve<br />
eradikasyon <strong>program</strong>ları serolojik testlerle reaktörlerin saptanması esasına dayandırılmıştır<br />
(Alton ve ark. 1988, OIE Manual 2004a, OIE Manual 2004b). Ancak her bir testin farklı<br />
immunglobulinleri incelemesi ve yanlış pozitifliklerin görülmesi, kronik ve aktif infekte<br />
168
<strong>hayvan</strong>ların serolojik testlere düzensiz yanıt verebilmesi gibi nedenlerle İnkubasyon<br />
devresinde serolojik yanıtın oluşmaması, aşı ile doğal infeksiyonun karışması gibi<br />
olumsuzluklarından dolayı Brucellosis’in serolojik tanısında en az iki testin birlikte<br />
yapılarak sonuçların <strong>değerlendirme</strong>sinin yapılması tavsiye edilmektedir. (Alton ve<br />
ark.,1975; Fekete ve ark.,1990; Aydın,1997).<br />
Brucella infeksiyonlarına karşı immun yanıt <strong>hayvan</strong> bireyleri içinde farklıdır<br />
(Sutherland ve Searson, 1990). Bu farklılık alınan suşun miktarına, virulensine,<br />
infeksiyonun akut, kronik veya inkubasyon süresi içinde olmasına, konakçının cinsel<br />
olgunluğuna, immun durumuna ve infeksiyonun lokalize olduğu dokuya ( genital kanal,<br />
meme, eklem gibi) bağlıdır (Plommet, 1984). Ayrıca aşılamalar (aşının tipi, aşının metot<br />
ve dozu,<strong>hayvan</strong>ın aşılama yaşı, aşılama peryodu) ve sürünün durumu da test sonuçlarını<br />
etkilemektedir (Crawford ve ark.,1990; Garin Bastuji, 1992).<br />
Hayvanların Brucella infeksiyonlarına karşı primer antikor yanıtının IgM sınıfı<br />
antikorların üretimini takiben IgG’lerin ortaya çıkmasıyla karakterize olduğu<br />
bilinmektedir. İnfeksiyona karşı kronik veya sekonder immun yanıt ise IgG antikorları ile<br />
karakterizedir. İmmun yanıt en iyi aşılı <strong>hayvan</strong>larda gözlenmektedir. Aşılı <strong>hayvan</strong>ların<br />
serumunda ilk belirlenen antikorlar, aşılamadan 5 gün sonra ortaya çıkan, 13-20. günde<br />
maksimum düzeye ulaşan IgM’lerdir. IgG’ler ise daha sonra (13-21 gün) ortaya çıkar ve<br />
aşılamadan sonraki 28-42. günde en üst düzeye ulaşır (Morgan, 1982). Doğal infeksiyona<br />
yakalanmış sığırlarda infeksiyon sonucunda IgM ve IgG düzeylerinde artma oluşur. IgM<br />
titresi zamanla düşerek dominant olarak IgG kalır. Bazı kronik vakalarda ise <strong>hayvan</strong>larda<br />
zayıf aglutinasyon veren, ayrıca serumda bulunabilecek IgM antikorlarının etkin<br />
aglutinasyon özelliğini maskeleyen yüksek IgG1 titreleri bulunabilir (Quinn ve ark., 1994).<br />
Konjunktiva yoluyla virulent B. abortus inokule edilen <strong>hayvan</strong>larda antikor üretimi süresi<br />
değişmektedir. Bunlarda IgG titreleri inokulasyondan 25-45 gün sonra IgM titrelerini<br />
aşmakta ve 63-84 gün boyunca yaygın antikor tipi olarak kalmaktadır (Sutherland,1980).<br />
Brucella ile infekte olan ve olmayan <strong>hayvan</strong>ları ayırmak için yapılan çalışmalarda S19 ile<br />
aşılı <strong>hayvan</strong>ların serumlarındaki IgM, IgG1, IgG2 antikorlarının orantısal dağılımının<br />
B.abortus ile infekte olanlarınkinden farklı olduğu ortaya konmuştur. İnfekte <strong>hayvan</strong>ların<br />
serumlarında en fazla IgG1 sınıfı antikorlar hakim bulunurken, S19 ile aşılanan sığır ve<br />
buzağıların serumunda oluşan antikorların büyük çoğunluğu IgM ve IgG1 sınıfına aittir.<br />
IgG2’ler ise daha az miktarlarda bulunmaktadır (Arda ve ark.,1989).<br />
Brucella sp’lerin hücre duvarındaki lipopolisakkarit molekülünün bir parçası olan<br />
O-polisakkarit antijeni B.abortus, B. melitensis ve B.suis türlerinde büyük miktarlarda<br />
bulunurken B. ovis ve B. canis türlerinde ölçülebilir düzeyde<br />
bulunmamaktadır(Nielsen2002). İlk 3 brucella türünde smooth LPS molekülünde ortak<br />
epitoplar bulunması nedeniyle, bu etkenlere karşı oluşan antikorların tespit edilmesinde<br />
kullanılan serolojik testlerde B. abortus antijeni ortak olarak<br />
kullanılmaktadır(Nielsen2002).<br />
Brusellozis’in indirekt teşhisinde Rose Bengal Plate Test (RBPT), Yavaş Tüp<br />
Aglütinasyon Testi (SAT), Komplement Fikzasyon testi (CFT), ELISA gibi serolojik<br />
yöntemler kullanılmaktadır(Alton ve ark 1988, OIE Manual 2004a, OIE Manual 2004b,<br />
Nielsen 2002). Bu testlerden bazılarında kros reaksiyonların (Diaz-Aparicio ve ark. 1993,<br />
İzgür ve ark.1992, Mittal ve Tizard 1981, Öngör 1999) ve nonspesifik antikorların (Trap ve<br />
ark. 1985) yanlış sonuçlar alınmasına neden olmaktadır. Uluslararası standartlara göre bu<br />
testlerden RBPT’nin tarama testi olarak, CFT’nin ise standart konfirmasyon testi olarak<br />
kullanılması önerilmiştir (OIE Manual 2004a, OIE Manual 2004b, Nicoletti 1989, Olds<br />
1989).<br />
169
RBPT basit spot agglutinasyon testi olup testte rose bengal ile boyanmış ve<br />
genellikle 3.65± 0.05 gibi düşük PH’ya ayarlanmış antijen kullanılır. (Morgan ve<br />
ark.1969). bu sayede IgM’lerin yanında IgG1’lerin aglutinasyona katılması sağlanmış olur<br />
(Nielsen 2002, Quinn 1994). Oldukça duyarlı bir test olan RBPT zaman zaman S19 aşısı<br />
ile aşılanmış <strong>hayvan</strong>larda yanlış pozitif sonuçlar ortaya çıkabilir. Bu reaksiyonların nedeni<br />
olarak aşı sonucu meydana gelen IgM’lerin kros reaksiyon vermesi gösterilmiştir<br />
(Sutherland,1980).Yanlış negatiflik ise nadir görülür. Genellikle bu durum prozon<br />
fenomeninden kaynaklanır ve dilüe edilen serum tekrar test edilerek sorun çözülür. Bu gibi<br />
sorunlara rağmen RBPT testi infekte sürülerde hastalığın tespiti ya da Brucella’dan ari<br />
sürülerde negatifliğin garanti altına alınmasında tarama test olarak önerilmektedir.(OIE<br />
2004a) . Bunun yanında özellikle aşılı <strong>hayvan</strong>larda yanlış pozitif reaksiyonlara da<br />
rastlanmaktadır.<br />
SAT ilk olarak Wright ve Smith (1897) tarafından brucellozin serolojik teşhisinde<br />
kullanılmak üzere geliştirilmiş serolojik bir testtir. Nötral veya hafif düşük pH’da aktif<br />
olan aglutininlerin en önemli kısmını IgM isotipi teşkil eder. Bu nedenle SAT ile kros<br />
reaksiyon veren antikorlarla yanlış pozitif reaksiyon verme olasılığı çok yüksektir. Bu<br />
nedenle OIE Manuel’in 2000 versiyonunda brusellozis teşhisinde kulanılan testler<br />
arasından çıkarılması önerilmiştir (Nielsen 2002). SAT bir alternatif test olarak<br />
önerilmemesine rağmen çok eski yılardan beri surveylans ve kontrol <strong>program</strong>larında<br />
sıklıkla kullanılmaktadır.(OIE 2004a). SAT’da tampon solusyon olarak kullanılan FTS’nin<br />
sığır serumları için %0,85’liği, koyun ve keçi serumları için yüksek konsantrasyonda<br />
bulunan ve aglutine olmayan IgG1 yüzünden oluşan prozonu önlemek için %5’liği<br />
kullanılmaktadır (Mac Millan,1990; Garin-Bastuji,1992).<br />
CFT’de rol oynayan antikorlar IgG1’lerdir. IgG2‘lerin kobay komplementini fikze<br />
edici özelliğinde olmaması nedeniyle testte etkinliği yoktur. IgM’lerin etkinliği<br />
inaktivasyon derecesinden dolayı azdır. Serumun inaktivasyon derecesi yükseldikce (65 0 C)<br />
IgM inaktif olur (Alton ve ark.,1988).CFT sığır, koyun ve keçilerin serum dilusyonları ile<br />
önceden titrasyonu yapılmış komplementin bir arada tutulur. Ortama indikatör sistem<br />
olarak koyun eritrositi ve bu eritrosite karşı duyarlılaştırılmış tavşan antikoru ilave<br />
edildiğinde Şayet serumda IgG1 antikorları var ise antijene bağlanarak komplementi aktive<br />
eder.ve eritrositler lize olmaz. Antikor yok ise komplement tavşan antikorlarının Fc<br />
porsiyonunda bulunan reseptöre bağlanır, bu durumda eritrositler lize olur (Nielsen<br />
2002).Geniş ölçüde doğrulama testi olarak kullanılmasına rağmen CFT oldukça karmaşık,<br />
uygulaması ve testte kullanılan reagentlerin standardizasyonu bir hayli zor ve iyi bir<br />
laboratuar alt yapısı gerektiren serolojik bir testtir. Ayrıca her örneğin bir seri<br />
dilusyonunun test edilmesi gerekmektedir. Sayısız varyasyonları olan CFT en sık<br />
kullanıldığı şekli mikrotiter şeklidir. CFT oldukça spesifik bir test olmasına rağmen diğer<br />
bütün serolojik testlerde olduğu gibi aşılı <strong>hayvan</strong>larda yanlış pozitif sonuç alınabilir.<br />
Ayrıca kötü kalite serumlar (Hemolitik ve antikomlementer etkili) CFT testi için uygun<br />
değildir(Nielsen 2002, Stack ve ark. 1999).<br />
Son yıllarda yapılan çalışmalara göre ELISA Testi Brucella teşhisinde büyük önem<br />
kazanmıştır ve Brucella teşhisinde kullanılan referans testler arasına girmiştir (OIE Manual<br />
2004a, OIE Manual 2004b). Yardımcı(1980) koyun kan serumlarını PT, RBPT, SAT ve<br />
ELISA ile incelemiş PT ile %35.4, RBPT ile %36.5, SAT ile % 39.4 ve ELISA ile %45.3<br />
pozitif bulmuş ve pozitifleri saptamada ELISA ve SAT testini daha duyarlı bulmuştur.<br />
Öngör(1999), yapmış olduğu çalışmada, ELISA testinin rutin testlerle karşılaştırıldığında<br />
oldukça duyarlı ve spesifik olduğunu, koyun Brusellozis’i teşhisinde kullanılmasının yarar<br />
sağlayacağını bildirmiştir. Brusellozis mücadele <strong>program</strong>ında yer alan aşılama uygulaması,<br />
Brusellozis’in serolojik teşhisinde bir takım güçlüklere neden olmaktadır. Ülkemizde<br />
170
sığırlarda Brucella S19, Koyunlarda ise Brucella Rev1 atenüe canlı aşılar uygulanmaktadır.<br />
Ülkemizde ve dünyada kullanılan konvansiyonel serolojik teşhis yöntemleri ile aşılı ve<br />
doğal infekte <strong>hayvan</strong>ların ayırt edilmesinde yaşanan bazı güçlükler nedeniyle<br />
konvansiyonel teşhis yöntemlerine kompetitif-ELISA, Floresans Polarizasyon vb. alternatif<br />
yöntemler gündeme gelmiştir (OIE Manual 2004a, OIE Manual 2004b, Biancifori ve<br />
ark.2000, Nielsen ve ark.1995)<br />
Pirimer bağlanma testlerinden biri olan C-ELISA antijenle kaplı mikropleytte test<br />
edilecek serum ile Monoklonal antikor (Mab) ilave edilerek serumda bulunan antikorlar ile<br />
Mab’nin yarışması, antijen-antikor kompleksine enzimle işaretli anti-mause antikorlarının<br />
bağlanması ve reaksiyonun substrat ilavesi ile renklendirilmesi esasına dayanmaktadır.<br />
Test edilen serumda antikor varlığında reaksiyon renksizdir. Antikor yokluğunda ise<br />
renklenme şekillenir. Reaksiyonun optikal dansitesi ölçülerek pozitiflik değerlendirilir. C-<br />
ELISA ‘da OPS için spesifik Monoklanal antikorların kullanıldığı C-ELISA’nın indirekt<br />
ELISA ya göre daha spesifik olduğu bildirilmiştir (MacMillan ve ark. (1990), Nielsen ve<br />
ark.1995, Stack ve ark. 99).<br />
ELISA’da kullanılan lipopolisakkarit antijeni polisiteren matrikse lipid A ucundan<br />
bağlandığı, antijen olarak o-polisakkarit seçildiğinde ise matrikse bağlanmanın epitop1,<br />
epitop2 ya da her iki ucdan birlikte gerçekleştiği bildirilmiştir (Nielsen 1992). Bu şekilde<br />
ortamda antijenin antikor ile bağlanmaya hazır epitop2 ucu daha fazla bulunur. Brucella<br />
S19 aşısı ile aşılanmış <strong>hayvan</strong>larda epitop1’e karşı oluşan antikorlar büyük bir kısmını<br />
teşkil ederken doğal infekte <strong>hayvan</strong>larda ise hem epitop1 hem de epitop 2ye karşı oluşan<br />
antikorlar bulunmaktadır. Bu nedenle aşılı <strong>hayvan</strong>larda oluşan antikorların Mab ile<br />
yarışması ve bağlanma affinitesi göstermesi zordur. Ancak infekte <strong>hayvan</strong>alr antijene<br />
bağlanma affinitesi gösterir ve MAb ile yarışablirler.(Nielsen 1992)<br />
Yapılan çalışmalarda c-ELISA yönteminin spesifite ve sensitivitesinin yüksek<br />
olduğu, bazı diğer Gram negatif bakterilerle oluşabilecek kros reaksiyonları en aza<br />
indirdiği, komplement fikzasyon testi ile karşılaştırıldığında eşit ya da ondan daha iyi<br />
sonuçlar alındığı belirtilmektedir. Bazı c-ELISA kitleri ile aşılı ve doğal infekte<br />
<strong>hayvan</strong>ların ayırt edilebilmesinin bu teste bir üstünlük sağladığı bildirilmiştir. Farklı<br />
türlerdeki <strong>hayvan</strong>lara ait serum örneklerinin birlikte test edilebilmesi, testin yapılışının<br />
kolay olması, kısa zamanda sonuç alınması gibi özelliklerinin büyük bir avantaj<br />
sağladığından söz edilmektedir (Biancifori ve ark. 2000, Nielsen ve ark. 1995, Samartino<br />
ve ark.1999).<br />
Nielsen ve ark. (1995), yapmış oldukları bir çalışmada Plate test, CFT, indirekt<br />
ELISA ve c-ELISA yöntemleri ile sığır serumlarını test etmişler, aşılı <strong>hayvan</strong>larda c-<br />
ELISA testinin diğer testlere göre daha duyarlı olduğunu bildirmiştir. Biancifiori ve ark.(<br />
2000) koyun ve keçilerde Brusellozisin teşhisinde c-ELISA yönteminin diğer indirekt<br />
ELISA yöntemlerine göre duyarlılığının %99.4 ve spesifitesinin %98.9 olduğunu, ayrıca<br />
aşılı ve doğal infekte koyun ve keçilerin ayrımında c-ELISA yöntemi kullanıldığında %93<br />
düzeyinde başarılı olduklarını bildirmişlerdir. Samartino ve ark.( 1999), c-ELISA<br />
yönteminin aşılı sığırlarda Brusellozis’in teşhisinde konvansiyonel testlere göre daha<br />
spesifik, serolojik testler sırasında karşılaşılan istenmeyen reaksiyonların eliminasyonunda<br />
diğer testlerden daha iyi olduğunu, ayrıca c-ELISA nın Brucella abortus S-19 aşılaması<br />
yapılan Arjantin ve diğer ülkelerde Brusellozis kontrol ve mücadele <strong>program</strong>ını<br />
tamamlayıcı bir yöntem olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir.<br />
3.MATERYAL VE METOT:<br />
3.1.Standart Pozitif Grup<br />
171
Etlik merkez veteriner Kontrol ve araştırma Enstitüsüne gelen atıklardan B. abortus<br />
izole edilen 26 adet sığır ve B. melitensis izole edilen 29 adet koyuna ait kan serum<br />
örnekleri standart pozitif gruplar olarak kabul edildi.<br />
3.2.Standart Negatif Grup<br />
Brusellozis öyküsü olmayan, düzenli sağlık ve <strong>hayvan</strong> hareketi kontrolü yapılan<br />
sığır ve koyun sürülerinde bulunan 28 adet 6 aylık aşısız dana ile 32 adet 6 aylık aşısız<br />
kuzuya ait kan serum örnekleri standart negatif grup olarak kullanıldı.<br />
3.3.Doğal İnfekte Gruplar<br />
3.3.1. İnfekte Sığırlar<br />
Brucella spp.izole edilen <strong>hayvan</strong>lar (n=26)<br />
İnfekte sürüde atık yapmış <strong>hayvan</strong>lar (n=94)<br />
Toplam 120<br />
3.3.2. İnfekte Koyunlar<br />
Brucella spp.izole edilen <strong>hayvan</strong>lar (n=29)<br />
İnfekte sürüde atık yapmış <strong>hayvan</strong>lar (n=152)<br />
Toplam 181<br />
3.4.Aşılı Gruplar<br />
29 adet 6 aylık dana (Polatlı Tarım İşletmesi)<br />
32 adet 6 aylık kuzu (Polatlı Tarım İşletmesi)<br />
3.4.1.Hayvanların Aşılanması<br />
Danalar Pendik Veteriner Kontrol ve araştırma enstitüsü tarafından üretilen Genç<br />
Brucella S19 canlı aşısı ile deri altı olarak aşılandı<br />
Kuzular Pendik Veteriner Kontrol ve araştırma enstitüsü tarafından üretilen Genç<br />
Brucella Rev1 canlı aşısı ile deri altı olarak aşılandı.<br />
3.4.2.Aşılı Grupta Örneklerin Toplanması<br />
Hem sığır hem de koyunlarda aşı yapılan gün 0 kabul edilerek 0., 21., 45., 90.,<br />
120., ve 180. ve 270.gün kan serum örnekleri alınarak serolojik testlere tabii tutuldu. Bu<br />
süre sonunda pozitifliği devam eden <strong>hayvan</strong>lardan 2 ayda bir kan serum örneği alınarak 1<br />
yıl süre ile takip edildi<br />
3.5.Uygulanan Testler<br />
3.5.1.Rose Bengal Plate Testi<br />
Test antijeni, Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü’nden sağlandı.<br />
Alton ve ark (1988) tarafından bildirilen yönteme göre yapıldı. Testte, 30 μl serum ile bir<br />
damla RBPT antijeni lam üzerinde cam bagetle karıştırıldı. Lamın oval hareketleri sonucu<br />
4–5 dakika içinde oluşan ++’lık aglutinasyon pozitif, homojen görüntü negatif olarak kabul<br />
edildi.<br />
3.5.2.Serum Aglutinasyon Testi<br />
Test Antijeni Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü tarafından üretilen ve B.abortus S99 suşundan hazırlanan tüp aglutinasyon<br />
antijeni kullanıldı.<br />
Alton ve ark.’nın (1988) bildirdiği yönteme göre yapıldı. Bir seri tüp alınarak ilk<br />
tüpe 0,8 ml diğer tüplere 0,5 ml sığırlarda fenollü (%0,5) %8,5 fizyolojik tuzlu su,<br />
koyunlarda ise fenollü(%0,5) %5’lik tuzlu su konulduktan sonra birinci tüpe 0,2 ml serum<br />
ilave edilerek karıştırıldı. Birinci tüpteki serum sulandırmasından ikinci tüpe 0,5 ml<br />
aktarıldı ve bu işlem son tüpe kadar tekrarlanarak son tüpten 0,5 ml atıldı ve böylece<br />
serumların iki katlı sulandırılmaları (1/5, 1/10, 1/20, 1/40) gerçekleştirildi. Her tüpe<br />
172
standart Brucella tüp aglutinasyon antijeninden 0,5 er ml konularak 1/ 10 dan 1/ 80 e kadar<br />
serum sulandırmaları elde edildi. Tüpler çalkalandıktan sonra 37 0 C’de 1 gece inkubasyona<br />
bırakıldı. Dantela şeklindeki çökeltinin görüldüğü son tüpteki sulandırma, serum titresi<br />
olarak kabul edilerek, aglutinasyon derecesi üst sıvının berraklığına göre, 4+, 3+, 2+, + ve<br />
tüpteki homojen bulanıklık negatif olarak gözle değerlendirildi. Sığırlarda 1/40 ++ ve üstü<br />
koyunlarda ise 1:20 dilusyonda (++)’lik, pozitif olarak değerlendirildi (Anon,1990).<br />
3.5.3.Mikro Komplement Fikzasyon Testi:<br />
Antijen olarak, Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Pendik Veteriner Kontrol ve<br />
Araştırma Enstitüsü tarafından üretilen ve Brucella abortus S99 suşundan hazırlanan tüp<br />
aglutinasyon test antijenin tuzlu su ile 3 defa yıkanarak fenolünün giderilmesiyle elde<br />
edilen konsantre solusyon 5±3 0 C’ de saklandı. Titresi Tarım Orman ve Köyişleri<br />
Bakanlığının Brucellosis mücadele talimatnamesinde (Anon,1990) belirtilen yönteme göre<br />
yapıldı.<br />
Komplement; Alton ve ark.’nın (1988) bildirdiği yönteme göre hazırlandı<br />
komplement olarak kobay kan serumu kullanıldı. Kan alınmadan önce 12 saat süreyle aç<br />
bırakılan kobaylardan kan alınarak oda derecesinde bekletildi ve serumu çıkartıldı. Elde<br />
edilen serumlar santrifüj edildikten sonra 2’şer ml olarak tüplere taksim edildi ve<br />
kullanılıncaya kadar -20 0 C’de saklandı. Komplementin titresi Tarım Orman ve Köyişleri<br />
Bakanlığının Brucellosis mücadele talimatnamesinde (Anon,1990) belirtilen yönteme göre<br />
yapıldı.<br />
Amboseptör; Alton ve ark.’nın (1988) bildirdiği yönteme göre hazırlandı. yaklaşık<br />
2 kg. ağırlığındaki tavşanlara yıkanmış koyun eritrositlerinin %10’luk süspansiyonundan<br />
dört gün ara ile 5’er ml miktarında dörder defa intravenöz olarak verildi. Son<br />
enjeksiyondan 7 gün sonra 24 saat aç bırakılmış tavşanların kanları alınarak serumları<br />
ayrıldı. Titresi belirlenen seruma %0,1 sodyum azid (NaN3) prezervatif olarak ilave<br />
edilerek +4 o C’de buzdolabında saklandı. Amboseptör titresi, Tarım Orman ve Köyişleri<br />
Bakanlığının Brucellosis mücadele talimatnamesinde (Anon,1990) belirtilen yönteme göre<br />
yapıldı.<br />
Berrak, hemolizli ve kontamine olmayan veronal buffer (VB) dilusyonu ile 1/5<br />
sulandırılan sığır serumları 58 0 C’de, koyun serumları ise 60 0 C’de 50 dakika süreyle su<br />
banyosunda inaktive edildi. İnaktif serum CFT, OİE (2004), Aimes test protokolü (2000)<br />
ve Alton ve ark.’nın (1988) bildirdiği yönteme göre yapıldı.<br />
Testte 96 gözlü U tabanlı mikroplate kullanıldı. VB’den B den F ye kadar 25µl<br />
kondu. Serum: A, B ve F ye 25µl kondu. B gözünden itibaren E ye kadar iki misli dilusyon<br />
yapılarak, G gözünden 25µl atıldı. (1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/5 ) Antijen A dan E ye:<br />
25µl kondu (son göz hariç diğer gözlere) Komplementten tüm gözlere 50µl kondu.<br />
Reagentlerin kontrolü için aşağıdaki tabloda gösterilen miktarlar kondu.<br />
1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 ACC*<br />
VBD 25 25 25 25 25<br />
Serum 25 25 - - - 25<br />
Antijen 25 25 25 25 25 -<br />
komplement 50 50 50 50 50 50<br />
173
Reagentlerin kontrolü için de aşağıdaki tabloda gösterilen miktarlar konuldu<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
VBD 25 75 50 75 50 100 125 75 100<br />
Antijen 25 25 - - 25 - - - 25<br />
Komplement 50 50 25 25 - - 50 -<br />
VBD 25 75 50 75 50 100 125 75 100<br />
Plate, Bir dakika plate çalkalayıcıda çalkalandıktan sonra 1 saat 37 0 C inkubasyona<br />
bırakıldı. İnkubasyon süresi sırasında Sensitize eritrosit (SRBC) hazırlandı. Bunun için<br />
%2 eritrosit ile titresi tespit edilmiş veya belirli tirede olan Amboseptör (anti koyun<br />
eritrositi, hemolizin) eşit miktarda hazırlanarak 37 0 C’de 10 dakika su banyosunda inkube<br />
edildi. SRBC A dan F gözüne kadar 50µl kondu.<br />
SRBC 50 50 50 50 50 50 - - -<br />
%2 Eritrosit - - - - - - 25 25 25<br />
Plate Bir dakika plate çalkalayıcıda çalkalandı. 37 0 c de 15 dakika inkubasyona<br />
bırakıldı. Plate Bir dakika plate çalkalayıcıda çalkalandıktan sonra tekrar 15 dakika 37 0 C<br />
inkubasyona bırakıldı.<br />
Her test yapılırken pozitif ve negatif kontrol serumları kullanıldı. Hemoliz<br />
görülmeyen en son tüpteki serumun sulandırma dilusyonu ve sıvının bulanıklık derecesine<br />
göre +4, +3, +2 ve + pozitif olarak değerlendirildi. Eritrosit’ler tam lize olmuşsa negatif<br />
olarak değerlendirildi. Serumun antikomplementer etkisini göstermek için kullanılan son<br />
tüpte eritrositin tamamen lize olması serumun antikomplementer olmadığını gösterdi.<br />
Sığırlarda 1/10 ++ ve üstü koyunlarda ise 1:5 dilusyonda (++)’lik değer pozitif olarak<br />
değerlendirildi (Anon,1990).<br />
3.5.4.Kompetitife ELISA (C-ELISA):<br />
Brucella abortus S-LPS kaplanmış 96 gözlü mikrotiter plate kullanılan ticari<br />
kit(Svanova Biotech) ile prosedürüne uygun olarak yapıldı. Antijen kaplı pleyt serum<br />
örnekleri ve arkasından monoklonal antikor ilave edilerek oda sıcaklığında inkube edildi.<br />
İnkubasyon sonrasında pleytler iyice yıkanarak bağlanmayan antikorlar ortamdan<br />
uzaklaştırıldı. Pleyte enzimle işaretli antimause IgG antikor konjugatı konularak oda<br />
sıcaklığında inkubasyona bırakıldı. Yıkama işleminin ardından reaksiyonu görüntülemek<br />
maksadıyla substrat koyuldu ve reaksiyon stop solusyonu ile durdurularak ELISA<br />
okuyucuda 450nm’de okundu. PI (Percent Inhibition) değeri ≥30 pozitif ,
Hayvanların %94’ü RBT, %98’i SAT, %92’si CFT ve %95’i C-ELISA ile pozitif<br />
bulunmuştur. Bu grupta yer alan Brucella spp izole edilen sığırların tamamı ise bütün<br />
testlerle pozitif sonuç vermiştir.<br />
RBPT SAT CFT<br />
C-<br />
ELISA<br />
Hayvan Sayısı 113 117 110 114<br />
% 94 98 92 95<br />
Tablo1: Doğal infekte sığırlarda farklı testlerle tespit edilen pozitiflik oranları (%)<br />
4.1.2.Aşılı Sığırlar<br />
Aşılı sığırlarda aşılama günü 0. gün kabul edilerek 21., 45., 90., 120. ve 180.<br />
günlerde RBPT, SAT, CFT ve C-ELISA testleri uygulanmıştır.<br />
0.Gün: Bütün testlerle aynı sonuç alınmıştır. 1 <strong>hayvan</strong>da Maternal antikor varlığı<br />
tespit edilmiştir.Testler arasında istatistiksel bir fark yoktur.<br />
21Gün: Testler arasında istatistiksel olarak önemli bir fark yoktur.<br />
45. Gün: Testler arasında istatistiksel olarak önemli bir fark yoktur. RBPT ve SAT<br />
testlerinde pozitiflik oranı 21. günde en yüksek seviyede iken CF ve C-ELISA testlerinde<br />
45.günde gerçekleşmiştir.<br />
90. Gün: Testler arasında önemli farklılıklar meydana gelmiştir (p
% Pozitif Hayvanların Oranı<br />
100<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
0.G 21.G 45.G 90.G 120.G 180.G<br />
Test Aralığı<br />
RBPT<br />
SAT<br />
CFT<br />
C-ELISA<br />
Grafik-1: Aşılı Sığırlarda Farklı Testlerle Belirli Günlerde Tespit Edilen<br />
Pozitiflik Oranları (%)<br />
4.2.KOYUNLARDA ELDE EDİLEN BULGULAR<br />
Standart pozitif ve standart negatif gruplarda CFT ve C-ELISA sonuçları tam<br />
olarak benzerdir. C-ELISA testinin spesifitesi ve sensitivitesi %100 bulundu<br />
4.2.1.Doğal İnfekte Koyunlar<br />
Hayvanların % 91,16 RBPT, %91,16’i SAT, %85,63’u CFT ve % 86,74 C-ELISA<br />
ile pozitif bulunmuştur.Bu grupta yer alan Brucella melitensis izole edilen koyunların<br />
tamamı ise bütün testlerle pozitif sonuç vermiştir.<br />
RBPT SAT CFT C-ELISA<br />
Hayvan Sayısı 165 165 155 157<br />
Pozitiflik Oranı<br />
91,16 91,16 85,63 86,74<br />
(%)<br />
Tablo3: Doğal infekte koyunlarda farklı testlerle tespit edilen pozitiflik oranları<br />
(%)<br />
4.2.2.Aşılı Koyunlar<br />
Projenin koyunlarla ilgili bölümünde aşılı <strong>hayvan</strong>lar sığır grubundan farklı olarak<br />
daha kısa aralıklarla daha uzun bir süre takip edilmiştir. Aşılı koyunlara aşılama günü 0.<br />
gün kabul edilerek 14.,21., 45., 90., 120. 180. ve 270. günlerde RBPT, SAT, CFT ve C-<br />
ELISA testleri uygulanmıştır. Toplam 32 <strong>hayvan</strong> ile çalışılmış ancak bu koyunların 2’sinde<br />
antikomplementer özellikleri nedeniyle CFT’leri değerlendirilememiştir. Aşılı koyunların<br />
istatistiksel çalışmaları 30 <strong>hayvan</strong> üzerinden gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar Tablo.4 ve<br />
Grafik.2’de gösterilmiştir<br />
0.Gün: Bütün testlerle aynı sonuç alınmıştır.Testler arasında istatistiksel bir fark<br />
yoktur.<br />
14. Gün: 14. günde yöntemler arasında pozitiflik oranı bakımından önemli bir farklılık<br />
bulunmamaktadır. SAT testinde pozitiflik oranı en fazla bu günde tespit edilmiştir.<br />
176
21Gün: Testler arasında istatistiksel olarak önemli bir fark yoktur. RBPT, CFT ve<br />
C-ELISA testlerinde en yüksek pozitiflik oranı 21. gün olarak tespit edilmiştir.<br />
45. Gün: 45. günde yöntemler arasında pozitiflik oranı bakımından önemli farklılıklar<br />
meydana gelmiştir (p
zaman kaybı nedeniyle teşhis, kontrol ve eradikasyon <strong>program</strong>ları, serolojik testlerle<br />
reaktörlerin saptanması esasına dayandırılmıştır. Brusellozis’in indirekt teşhisinde Rose<br />
Bengal Plate Test (RBPT), Yavaş Tüp Aglütinasyon Testi (SAT), Komplement Fikzasyon<br />
testi (CFT), ELISA gibi serolojik yöntemler kullanılmaktadır. Uluslararası standartlara<br />
göre bu testlerden RBPT’nin tarama testi , CFT’nin ise standart doğrulama testi olarak<br />
kullanılması önerilmiştir. OIE’de Sığır Brucellosisinin teşhisinde kullanılan testler arasında<br />
standart test kabul edilen CFT’nin yanında Kompetitif-ELISA (C-ELISA) da<br />
bulunmaktadır (Alton ve ark. 1988, OIE Manual 2004a, OIE Manual 2004b).<br />
Brusellozis mücadele <strong>program</strong>ında yer alan aşılama uygulaması, Brusellozis’in<br />
serolojik teşhisinde bir takım güçlüklere neden olmaktadır. Ülkemizde sığırlarda Brucella<br />
S19, Koyunlarda ise Brucella Rev1 atenüe canlı aşılar uygulanmaktadır. Ülkemizde ve<br />
dünyada kullanılan konvansiyonel serolojik teşhis yöntemleri ile aşılı ve doğal infekte<br />
<strong>hayvan</strong>ların ayırt edilmesinde yaşanan bazı güçlükler nedeniyle konvansiyonel teşhis<br />
yöntemlerine kompetitif-ELISA, Floresans Polarizasyon vb. alternatif yöntemler gündeme<br />
gelmiştir (OIE Manual 2004a, OIE Manual 2004b, Biancifori ve ark.2000, Nielsen ve<br />
ark.1995)<br />
Ülkemizde 1984 yılından beri Brusellozis Mücadele <strong>program</strong>ı uygulanmaktadır.<br />
Mücadele <strong>program</strong>ı gereği 3-8 aylık danalar Brucella S 19, 3-8 aylık koyunlar ise Brucella<br />
Rev-1 aşısı ile aşılanmaktadır. Bu çalışmada Brucella S19 genç aşısı ile aşılanan danalar ile<br />
Brucella spp. ile infekte sığırlar ve Brucella Rev-1 genç aşısı ile aşılanmış koyunlar ile<br />
Brucella spp ile infekte koyunlara ait kan serumları Rose Bengal Plate Test (RBPT), Serum<br />
Aglutinasyon Test (SAT), Mikrokomplement Fiksazyon Testi (CFT) ve Competative-<br />
ELISA ile test edilerek <strong>hayvan</strong>lardaki humoral immun yanıt değerlendirilmiştir.<br />
Brucella abortus izole edilen sığırların bulunduğu sürülerde atık yapmış<br />
<strong>hayvan</strong>ların % 94’ü RBPT, %98’i SAT, %92’si CFT ve %95’i C-ELISA ile pozitif<br />
bulunmuştur. Enfekte koyun grubunda ise bu oran aynı testlere göre sırasıyla %91,16,<br />
%91,16, %85,63 ve % 86,74 C-ELISA ile pozitif bulunmuştur. Enfekte sığr ve koyunlarda<br />
bütün testlerle oldukça yüksek pozitif sonuç alınmıştır. Ancak RBPT ve SAT’leri ile alınan<br />
pozitiflik oranlarının CFT ve C-ELISA ya göre nispeten yüksek olduğu görülmüştür. Bu<br />
sonuçlarr etken izole edilen ve enfeksiyonun akut seyrettiği sürülerdeki atık yapmış<br />
<strong>hayvan</strong>lara ait sonuçlardır. Hayvanların Brucella infeksiyonlarına karşı primer antikor<br />
yanıtının IgM sınıfı antikorların üretimini takiben IgG’lerin ortaya çıkmasıyla karakterize<br />
olduğu bilinmektedir. İnfeksiyona karşı kronik veya sekonder immun yanıt ise IgG<br />
antikorları ile karakterizedir. SAT ile Nötral veya hafif düşük pH’da aktif aglutininlerin<br />
en önemli kısmını teşkil eden IgM lerin varlğı ortaya konulurken, RBPT ile hem IgM hem<br />
de IgG1’ler reaksiyona girer. CFT ve C-ELISA ise IgG1lerin varlığını ortaya koyan<br />
testlerdir (Nielsen 2002, Quinn 1994). Samartino ve ark. Arjantin’de yapmış oldukları<br />
çalışmada CFT pozitif enfekte sığırların %97.1’i RBPT ile %97.5’u sLPS kullanılan C-<br />
ELISA ile pozitif bulmuştur<br />
SAT testi uluslar arası normlara göre Brucella teşhisi için alternatif bir test olarak<br />
önerilmemekle beraber hem ülkemizde hem de dünyadaki pek çok ülkede yaygın olarak<br />
kullanıldığı için bu çalışmada <strong>değerlendirme</strong>ye alınmıştır. Aşılı sığırlarda SAT’de<br />
titrelerin 21. gün , aşılı koyunlarda ise SAT testinde 14. gün gün pik yaptığı, sığırlarda 90.<br />
günden itibaren bütün <strong>hayvan</strong>lar negatif bulunurken koyunlarda aynı dönemde pozitiflik<br />
oranı %16,66’ya düşmüştür.120. günde ise bütün koyunlar negatif olarak bulunmuştur.<br />
Buna rağmen SAT’nin aşılı sığır ve koyunların enfekte <strong>hayvan</strong>lardan ayırt edilmesinde<br />
önemli bir değeri bulunmamaktadır. SAT ile IgM antikorlarının varlığının ortaya<br />
konulması nedeniyle oluşan IgG antikorları değerlendirilememektedir. Ayrıca kros ve<br />
nonspesifik reaksiyonlar ndedeniyle yanlış pozitif reaksiyon verme olasılığı çok yüksektir.<br />
178
(Nielsen 2002). Ayrıca hastalığın erken inkubasyon ve geç kronik dönemlerinde özellikle<br />
yüksek titreli serumlarda bulunan prozon ve diğer bloke edici fenomenler nedeni ile serum<br />
aglutinasyon testinde yanlış negatif sonuçlar görüldüğü bildirilmiştir (Sutherland, 1980).<br />
Aşılı sığırlarda IgG1’lerin değerlendirildiği RBPT, CFT ve C-ELISA testleri<br />
birlikte değerlendirildiğinde RBPT titresini 21. gün pik yaptığı, CFT ve C-ELISA testleri<br />
ile bu dönemin 45. gün olduğu görülmüştür. 90. günden itibaren bütün testlerde antikor<br />
titreleri düşme eğilimi göstermiş, pozitiflik oranları %17 RBPT, %31CFT, %55 C-ELISA<br />
bulunmuştur. 120. günden itibaren CFT ve CELISA testlerinde aynı sonuçlar alınırken<br />
180. günden itibaren buna RBPTde katılmıştır.<br />
Sığırlarda Aşılamadan 21 gün sonra RBPT ile CFT ve C-ELISA göre daha kısa<br />
zamanda titrelerin pik yaptığı görülmüştür. RBPT’de CFT ve C-ELISA’dan farklı olarak<br />
IgG1 antikoru yanında humoral immun yanıtın başlangıcında ortaya çıkan IgM isotopları<br />
da reaksiyona girmektedir(Nielsen 1992)<br />
Nielsen ve ark. (1995), yapmış oldukları bir çalışmada Plate aglutinasyon test,<br />
CFT, indirekt ELISA ve c-ELISA yöntemleri ile sığır serumlarını test etmişler, aşılı<br />
<strong>hayvan</strong>larda c-ELISA testinin diğer testlere göre daha duyarlı olduğunu bildirmiştir.<br />
Gall ve ark.(1998) yapmış oldukları çalışmada RBPT ve CFT pozitif bulunan sığır<br />
kan serumları ile yapmış oldukları çalışmada C-ELISA-OC ve C-ELISA-sLPS le test<br />
etmişler sonuçlar % 96,08 ve % 96,51 düzeyinde uyumlu bulunmuştur.<br />
Samartino ve ark () Rose Bengal, 2-mercaptoethanol, komplement fikzasyon ,İ-<br />
ELISA ve C-ELISA testleri ile Brucella negatif, Brucella S19 aşısı ile aşılanmış ve enfekte<br />
sürüleri test etmişler. Aşılı 1000 <strong>hayvan</strong>ın 28’i CFT ile 27 si OPS kullanılan C-ELISA ile<br />
ve 17 sLPS kullanılan C-ELISA ile pozitif vermiş ve aşılı sürülerde C-ELISA’nın diğer<br />
testlerden daha spesifik olduğunu bildirmiştir.<br />
Samartino ve ark.(1999), çalışmalarında Brucellanın teşhisinde indirekt ELISA ile<br />
c-ELISA yöntemlerini konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırmışlar, c-ELISA yöntemini<br />
aşılanmış <strong>hayvan</strong>larda diğer testlere göre daha spesifik olduğunu, bu testin istenmeyen<br />
serolojik reaksiyonların eliminasyonunu sağladığını ve B. abortus S–19 aşılaması yapılan<br />
ülkelerde, Brucellosis kontrol ve eradikasyon <strong>program</strong>ını tamamlayıcı bir yöntem olarak<br />
kullanılmasını önermişlerdir.<br />
Aşılı koyunlarda RBPT, CFT ve C-ELISA titreler 21. günde pik yapmış 45. günden<br />
itibaren bütün testlerde antikor titreleri düşme eğilimi göstermiştir. 90. günden itibaren<br />
antikor titrelerinde testlere göre önemli farklılıklar meydana gelmiş ve pozitiflik oranları<br />
RBPT’de % 47, SAT’de %16,66, CFT’de %60 ve C-ELISA’da % 20 bulunmuştur. 180<br />
ve 270. günlerde RBPT ve C-ELISA ile pozitiflik oranı %7 bulunmuştur., CFT ile sırasıyla<br />
bu oran %16,66 ve %10 olarak belirlenmiştir.<br />
Stournara ve ark .(2007) yapmış oldukları bir çalışmada ergin ve genç koyunları<br />
Brucella Rev1 aşısı ile konjiktival yolla aşılayarak aşılama günüden itibaren 21 gün<br />
aralıklarla 330. güne kadar 21 gün aralıkla fluorescence polarization assay (FPA), Rose<br />
Bengal plate test (RBPT), komplement fiksazyon test (CFT), modified Rose Bengal test<br />
(m-RBT), indirekt ELISA (i-ELISA) ve competitive ELISA (c-ELISA) ile serolojik<br />
immun yanıtı takip etmişlerdir. Çalışmada 3-6 aylık koyunlarla yapılan çalışmada RBPT,<br />
CFT ve C-ELISA ile sırasıyla % 100, %89.79 ve %79,59 pozitif sonuç almışlar. 45.<br />
günden itibaren bütün testlerde antikor titreleri düşme eğilimi göstermiştir. 91. günden<br />
itibaren antikor titreleri önemli düzeyde düşmüş oranları RBPT’de % 4,08, CFT’de %2,04<br />
ve C-ELISA’da % 6,12 bulunmuştur. 125.günde bütün testlerde negatif sonuç alınmıştır.<br />
179
Ülkemizde sığır ve koyunlar için subkutan canlı brucella S tipiaşıları<br />
kullanılmaktadır. Bu çalışmada aşılı sığırlardan 1(%3) aşılı koyunlarda ise2 (%7) <strong>hayvan</strong> 1<br />
yıl süre ile pozitif kalmıştır. Subcutan canlı aşı uygulamalarında persiste enfekte<br />
<strong>hayvan</strong>ların ortaya çıkması mümkündür. Bu nedenle konjiktival yolla aşılama ve R tipi<br />
aşıların kullanılması gibi alternatif aşı ve aşılama yöntemleri geliştirilmiştir (Díaz-Aparicio<br />
ve ark.1994, Marin C.M.1999).<br />
Stournara ve ark .(2007) nın yapmış oldukları çalışmada Brucella Rev-1 aşısını<br />
konjiktival yolla uygulamaları, ülkemizde ise subcutan uygulanması elde ettiğimiz<br />
pozitiflik oranlarının yüksek kalmasına sebep olabilir.<br />
Biancifori ve ark(2000) yapmış oldukları çalışmada Brucella Rev1 ile aşılanmış<br />
sağlıklı sürülerden alınan 221 koyun ve keçi serumunu C-ELISA ile test etmiş ve %90<br />
düzeyinde negatif sonuç almıştır.<br />
Çalışmamızda aşılı koyunların 2sine ait kan serumları antikomplementer etki<br />
vermiş bu nedenle CFT testi ile değerlendirilememiştir. Ancak C-ELISA ile<br />
<strong>değerlendirme</strong>k mümkün olmuştur. Stack ve ark. 1999 Yapmış oldukları çalışmada CFT<br />
testi ile değerlendirilemeyen kötü kalitedeki 50 adet serumu C-ELISA testi ile doğru olarak<br />
değerlendirebildiklerini bildirmişlerdir.<br />
Sonuç olarak C-ELISA nın gold standart test olarak kabul edilen CFT ile<br />
karşılaştırıldığında aşılı sığırlarda benzer sonuçlar alınması nedeniyle uygulaması daha<br />
kolay ve kısa sürede sonuç vermesi nedeniyle Brusellozis teşhisinde CFT’ye alternatif<br />
olarak başarılı bir şekilde uygulanabileceği düşünülmektedir. Aşılı koyunlarda ise C-<br />
ELISA testi ile CFT’den çok daha kısa sürelerde negatif sonuç alınması bu testin aşılı ve<br />
infekte <strong>hayvan</strong>ların ayrımında oldukça önemli olduğunu göstermektedir. Ayrıca CFT testi<br />
ile değerlendirilemeyen hemolizli ve antikomplementer etkili serum örnekleri ile kolaylıkla<br />
sonuç almak mümkündür. C-ELISA testi ile Ancak kesin bir kanaate varmak için ülke<br />
genelinde çok daha geniş kapsamlı çalışmalar yapmak yararlı olacaktır.<br />
ÖZET<br />
Ülkemizde 1984 yılından beri Brusellozis Mücadele <strong>program</strong>ı uygulanmaktadır.<br />
Mücadele <strong>program</strong>ı gereği 3-8 aylık danalar Brucella S 19, 3-8 aylık koyunlar ise Brucella<br />
Rev-1 aşısı ile aşılanmaktadır. Bu çalışmada Brucella S19 genç aşısı ile aşılanan danalar ile<br />
Brucella spp. ile infekte sığırlar ve Brucella Rev-1 genç aşısı ile aşılanmış koyunlar ile<br />
Brucella spp ile infekte koyunlara ait kan serumları Rose Bengal Plate Test (RBPT), Serum<br />
Aglutinasyon Test (SAT), Mikrokomplement Fiksazyon Testi (CFT) ve Competative-<br />
ELISA ile test edilerek <strong>hayvan</strong>lardaki humoral immun yanıt değerlendirilmiştir.<br />
Brucella abortus izole edilen sığırların bulunduğu sürülerde atık yapmış<br />
<strong>hayvan</strong>ların % 94 RBPT, %98 SAT, %92’si CFT ve %95 C-ELISA ile pozitif<br />
bulunmuştur. Aşı yapılan danalara aşılama günü 0. gün kabul edilerek 21., 45., 90., 120. ve<br />
180. günlerde aynı testler uygulanmıştır. RBPT ve SAT’de titrelerin 21. gün pik yaptığı,<br />
CFT ve C-ELISA testleri ile bu dönemin 45. gün olduğu görülmüştür. 90. günden itibaren<br />
bütün testlerde antikor titreleri düşme eğilimi göstermiş, pozitiflik oranları %17 RBPT,<br />
%0 SAT, %31CFT, %55 C-ELISA bulunmuştur. 180. günde ise CELISA ve CFT ile %3<br />
pozitiflik bulunurken diğer RBPT ve SAT testleri ile negatif sonuç alınmıştır. Yapılan<br />
çalışmada CFT ve CELISA testlerinde benzer sonuçlar alınmıştır. .<br />
Brucella melitensis izole edilen koyunların bulunduğu sürülerde atık yapmış<br />
<strong>hayvan</strong>ların % 91,16 RBPT, %91,16’i SAT, %85,63’u CFT ve % 86,74 C-ELISA ile<br />
pozitif bulunmuştur. Aşılı koyunlara aşılama günü 0. gün kabul edilerek 14.,21., 45., 90.,<br />
120. 180. ve 270. günlerde aynı testler uygulanmıştır. RBPT, CFT ve C-ELISA titreleri 21.<br />
180
günde pik yaparken SAT titrelerinin 14. günde pik yaptığı görülmüştür. 45. günden<br />
itibaren bütün testlerde antikor titreleri düşme eğilimi göstermiştir.90. günden itibaren<br />
antikor titrelerinde testlere göre önemli farklılıklar meydana gelmiş ve pozitiflik oranları<br />
RBPT’de % 47, SAT’de %16,66, CFT’de %60 ve C-ELISA’da % 20 bulunmuştur.<br />
120.günde CFT pozitiflik oranı %30 bulunurken, bu oran RBPT ile %10 ve C-ELISA ile<br />
%7’ye düşmüş, SAT’da ise örneklerin tamamının negatif olduğu tespit edilmiştir. 180 ve<br />
270. günlerde RBPT ve C-ELISA ile pozitiflik oranı %7 bulunmuştur., CFT ile sırasıyla bu<br />
oran %16,66 ve %10 olarak belirlenmiştir.<br />
ELISA’da kullanılan lipopolisakkarit antijeni polisiteren matrikse lipid A ucundan<br />
bağlandığı, antijen olarak o-polisakkarit seçildiğinde ise matrikse bağlanmanın epitop1,<br />
epitop2 ya da her iki ucdan birlikte gerçekleştiği bildirilmiştir (Nielsen 1992). Bu şekilde<br />
ortamda antijenin antikor ile bağlanmaya hazır epitop2 ucu daha fazla bulunur. Brucella<br />
S19 aşısı ile aşılanmış <strong>hayvan</strong>larda epitop1’e karşı oluşan antikorlar büyük bir kısmını<br />
teşkil ederken doğal infekte <strong>hayvan</strong>larda ise hem epitop1 hem de epitop 2ye karşı oluşan<br />
antikorlar bulunmaktadır. Bu nedenle aşılı <strong>hayvan</strong>larda oluşan antikorların Mab ile<br />
yarışması ve bağlanma affinitesi göstermesi zordur. Ancak infekte <strong>hayvan</strong>alr antijene<br />
bağlanma affinitesi gösterir ve MAb ile yarışablirler.(Nielsen 1992)<br />
Yapılan çalışmalarda c-ELISA yönteminin spesifite ve sensitivitesinin yüksek<br />
olduğu, bazı diğer Gram negatif bakterilerle oluşabilecek kros reaksiyonları en aza<br />
indirdiği, komplement fikzasyon testi ile karşılaştırıldığında eşit ya da ondan daha iyi<br />
sonuçlar alındığı belirtilmektedir. Bazı c-ELISA kitleri ile aşılı ve doğal infekte<br />
<strong>hayvan</strong>ların ayırt edilebilmesinin bu teste bir üstünlük sağladığı bildirilmiştir. Farklı<br />
türlerdeki <strong>hayvan</strong>lara ait serum örneklerinin birlikte test edilebilmesi, testin yapılışının<br />
kolay olması, kısa zamanda sonuç alınması gibi özelliklerinin büyük bir avantaj<br />
sağladığından söz edilmektedir (Biancifori ve ark. 2000, Nielsen ve ark. 1995, Samartino<br />
ve ark.1999).<br />
Sonuç olarak C-ELISA nın gold standart test olarak kabul edilen CFT ile<br />
karşılaştırıldığında aşılı sığırlarda benzer sonuçlar alınması nedeniyle uygulaması daha<br />
kolay ve kısa sürede sonuç vermesi nedeniyle Brusellozis teşhisinde CFT’ye alternatif<br />
olarak başarılı bir şekilde uygulanabileceği düşünülmektedir. Aşılı koyunlarda ise C-<br />
ELISA testi ile CFT’den çok daha kısa sürelerde negatif sonuç alınması bu testin aşılı ve<br />
infekte <strong>hayvan</strong>ların ayrımında oldukça önemli olduğunu göstermektedir. Ayrıca CFT testi<br />
ile değerlendirilemeyen hemolizli ve antikomplementer etkili serum örnekleri ile kolaylıkla<br />
sonuç almak mümkündür. C-ELISA testi ile Ancak kesin bir kanaate varmak için ülke<br />
genelinde çok daha geniş kapsamlı çalışmalar yapmak yararlı olacaktır.<br />
SUMMARY<br />
Brucellosis control <strong>program</strong>me has been implemented in Turkey since 1984. In<br />
accordance with the control <strong>program</strong>me, calves of 3-8- month- old have been vaccinated<br />
with Brucella S 19, and sheep of 3-8 –month-old has been vaccinated with Brucella Rev-1<br />
vaccine. In this study, blood sera from calves vaccinated with Brucella S19 young vaccine<br />
and cattle infected with Brucella spp., and sheep vaccinated with Brıcella Rev- 1 young<br />
vaccine and sheep infected with Brucella spp. were tested with Rose Bengal Plate Test<br />
(RBPT), Serum Agglutination Test (SAT), Mikrocomplement Fixation Test (CFT) and<br />
Competative-ELISA thus humoral immune response in the animals was evaluated.<br />
Of the animals that aborted in the infected cattle herds where cattle from which<br />
Brucella abortus had been isolated were found, 94% in RBPT, 98% in SAT, 92% in CFT<br />
and 95% in C-ELISA were found positive. The same tests were applied to the calves,<br />
fixing the vaccination day as “0”, on days 21, 45, 90, 120 and 180. The titers reached the<br />
181
peak in RBPT and SAT’ on day 21, in KFT and C-ELISA on day 45. After day 90 the<br />
antibody titers in all tests displayed the tendency for decreasing and the rates of pisitives<br />
were found 17% in RBPT, 0% in SAT, 31% in CFT, 55% in C-ELISA. On day 180, 3%<br />
poisitivity in C-ELISA and CFT were found while RBPT and SAT tests yielded negative<br />
results. The results obtained in CFT and C-ELISA were similar.<br />
Of the animals that aborted in infected sheep flocks where sheep from which<br />
Brucella melitensis had been isolated were found 91,16% in RBPT, 91,16% in SAT,<br />
85,63% in CFT and 86,74% in C-ELISA were found positive. The same tests were applied<br />
to the vaccinated sheep, fixing the vaccination day as “0”, on days 14, 21, 45, 90, 120,<br />
180.and 270. RBPT, CFT and C-ELISA titers reached peak level on day 21 while SAT<br />
titers reahed its peak level on day 14. Tendency to decreasing after day 45 was seen in<br />
antibody titers in all tests, after day 90. important differences in antibody titers occured<br />
according to the tests and the rates of positives were found as 47% in RBPT, 16,66% in<br />
SAT, 60% in CFT and 20% in C-ELISA. The rate of positives in CFT was found 30% on<br />
day 120 and 10% in RBPT and as low as 7% in C-ELISA on the same day. All samples<br />
were found negative in SAT on day 120. On days 180 and 270, the rate of positives in<br />
RBPT and C-ELISA was found 7% which were the same. These rates for CFT were<br />
16,66% and 10% respectively.<br />
When C-ELISA is compared to CFT, since similar results are obtained in<br />
vacinated cattle, because of the ease of the application and giving the results in shorter<br />
times, it can be used in Brucellosis diagnosis as alternative to CFT effectively. In<br />
vaccinated sheep C-ELISA test gives negative results in much shorter times than CFT and<br />
that shows that this test is important in the differentiation of vaccinated and infected<br />
animals However, to reach a final decison more detailed studies throughout the country are<br />
nee<br />
182
Literatür Listesi<br />
Agresti, A. (2002). Categorical data analysis, 2nd ed.<br />
Alton, G.G., Jones, L.M. And Pietz, D.E. (1975a): Laboratory Techniques in Brucellosis. 2 nd ed.<br />
Geneva, World Health Organisation, Monograph Series, No: 55.<br />
Alton, G.G., Jones, L.M., Angus, R.D. and Verger, J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis<br />
laboratory. I.N.R.A. Paris.<br />
Anon. (1989).1989 yılı epidemiyolojik sero-survey raporu.<br />
Anon. (1991).1991 yılı epidemiyolojik sero-survey raporu.<br />
Anon-a. (2004) Bovine Brucellosis: in OIE Manual of Standard’s for Diagnostic tests and<br />
vaccines. 328-345<br />
Anon-b.(2004) Brucellosis in Sheep,Goats and Svine. OIE Manual0 1996 Manual of Standard’s for<br />
Diagnostic tests and vaccines.<br />
Arda, M., Akay, Ö. Ve Esendal, Ö. M. (1989) : Brucellozisin immunolojisi. Uluslararasi Brucella<br />
Sempozyumu 18-20 ekim 1988, Pendik Hyv. Hst: Mrk.Araşt. Ens. Derg., 9: 90-107.<br />
Arda, M., Akay, Ö.,Esendal, Ö.M. (1991). Bovine Brucellosis (in relation to epidemiology and<br />
human infection). p. 67-72. Tümbay,E., Hilmi,S. ve Anğ, Ö. Brucella and Brucellosis in man and<br />
animals. Publication of the Turkish microbiology society No.16.Istanbul<br />
Arda,M. (1987). Türkiyede <strong>hayvan</strong> Brucellosis’inin genel durumu ve Brucellosis Mücadele Projesi.<br />
I. Ulusal İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi,20-23 Nisan, İzmir, Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti<br />
yayınları No.11: 166-178.<br />
Arda,M., Bisping,W., Aydın, N., İstanbulluoğlu, E., Akay, Ö., İzgür,M. Diker, S.ve Karaer, Z.<br />
(1987). Orta Anadolu bölgesi koyunlarında abortus olgularının etiyolojisi ve serolojisi üzerine bir<br />
çalışma. A.Ü. Vet. Fak. Derg., 34(2): 195-206.<br />
Aydın, N. (1997) : Gram negatif küçük çomaklar : Özel Mikrobiyoloji. Arda, M., Minbay, A.,<br />
Leloğlu, N., Aydın, N., Kahraman, M., Akay, Ö., Ilgaz, A., İzgür, M. ve Diker, K.S., Medisan-<br />
Ankara, 26:107-124.<br />
Aydın, N.(1997). Brucella infeksiyonları. p.110-124. Arda,M., Minbay, A., Leloğlu, N.,<br />
Kahraman,M., Akay, Ö., Ilgaz, A., İzgür, M. ve Diker, S. Özel Mikrobiyoloji, Epidemiyoloji,<br />
Bakteriyel ve Mikotik İnfeksiyonlar, Medisan yayın Serisi No: 26,4. baskı, Ankara.<br />
Aydın,N., Erdeğer, J. ve Yardımcı (1989). Brusella mikroorganizmaları ile diğer<br />
mikroorganizmalar arasındaki antijenik ilişkiler. Uluslar arası Brucellosis sempozyumu, Pendik<br />
Hay. Hast. Merk. Araşt. Enst. Yay., 9: 47-54.<br />
Aydın,N., Minbay,A., İzgür, M. ve Yardımcı,H. (1991). Brucellosis in sheep and goats (in relation<br />
to epidemiology and human infection). P. 51-65. Tümbay,E., Hilmi,S. ve Anğ, Ö. Brucella and<br />
brucellosis in man and animals. Publication of the Turkish microbiology society No.16.Istanbul<br />
Biancifiori F., Garrido,F., Nielsen, K., Moscati, L., Duran, M. and Gall, D. (2000). Assesment of a<br />
monoclonal antibody-bade competitive enzyme linked immunosorbent assay (cELISA ) for<br />
diagnosis of Brucellosis in infected and REV.1 vaccinated sheep and goats. New Microbiol. 23(4):<br />
399-406.<br />
Crawford, R.P., Huber, J. D. And Adams, B. S. (1990) : Epidemiology and surveillance. in :<br />
Animal Brucellosis. Eds.: K. Nielsen and J.R. Duncan CRC Press, Boca Raton Florida, 132-151.<br />
Díaz-Aparicio E., Marín C., Alonso B., Aragón V., Pérez S., Pardo M., Blasco J.M., Díaz R. &<br />
Moriyón I. (1994). Evaluation of serological tests for diagnosis of Brucella melitensis infection of<br />
goats. J. Clin. Microbiol., 32, 1159-1165.<br />
Diaz-Aparicio, E., Aragon, V., Marin, C., Alonso, B., Front, M., Moreno, E., Perez-Ortiz, S.,<br />
Blasco, J.M., Diaz, R. and Moriyon, I. (1993). Comperative Analysis of Brucella serotype A and M<br />
and Yersinia enterocolitica 0:9 polysaccharides for serological diagnosis of Brucellosis in cattle,<br />
sheep and goats. J. Clin. Microbiol., 31(29: 3136-3147.<br />
Fekete, A., Bantle, J.A., Halling, M.S. And Sanborn, M.R. (1990): Preliminary development of a<br />
diagnostic test for Brucella using Polymerase Chain Reaction. J.App.Bacteriol., 69: 216-227.<br />
Gall D, Colling A, Marino O, Moreno E, Nielsen K, Perez B, Samartino L.(1998).Enzyme<br />
immunoassays for serological diagnosis of bovine brucellosis: A trial in Latin America.Clin. Diag.<br />
Lab. Immunol. 5(5): 654-661<br />
183
Garin – Bastuji, B. (1992): Reliability of serological tests in the diagnosis and control of<br />
Brucellosis with regard to species and herd prevalence review of current research. Expert<br />
consultation on strategie in diagnosis and control of Brucellosis in Asia Beijing. 5-9. Oct. 1992.<br />
Garin-Bastuji B., Blasco J.M., Grayon M. & Verger J.M. (1998). Brucella melitensis infection in<br />
sheep: present and future. Vet. Res., 29, 255-274<br />
İyisan,A.S., Akmaz, Ö., Düzgün, S.G., Ersoy, Y., Eskiizmirliler, S., Güler, L., Gündüz, K., Işık, N.,<br />
İçyerioğlu,A.K., Kalender, H., Karaman, Z., Küçükayan, U., Özcan, C., Seyitoğlu, Ş., Tuna, İ.,<br />
Tunca, T., Üstünakın, K. ve Yurtalan S.(2000). Türkiye’de sığır ve koyunlarda Brucellosis’in seroepidemiyolojisi.<br />
Pendik Vet. Mikrobiol. Derg. 31(1): 21-34.<br />
İzgür M., Akay, Ö., Arda, M. ve Erdeğer, J. (1992). Sığır Brucellosis’inin Teşhisinde EDTA ve 56<br />
ºC’de Aglutinasyon testlerinin kullanılması. A.Ü. Vet. Fak. Derg. 39(1-2): 191-200.<br />
Mac Millan, A. (1990): Conventional serological tests. In: Animal Brucellosis. Eds.: K. Nielsen<br />
andJ.R. Duncan, CRC press Boca Raton Florida. 154-197.<br />
MacMillan A.P., Greiser-Wilke I., Moennig V. & Mathias L.A. (1990). A competition enzyme<br />
immunoassay for brucellosis diagnosis. Dtsch Tierarztl. Wochenschr., 97, 83-85.<br />
Marin C.M., Moreno E., Moriyon I., Diaz R. & Blasco J.M. (1999) Performance of competitive<br />
and indirect enzyme-linked immunosorbent assays, gel immunoprecipitation with native hapten<br />
polysaccharide, and standard serological tests in diagnosis sheep brucellosis. Clin. Diagn. Lab.<br />
Immunol., 6, 269-272.<br />
Minas A., Stournara A., Christodoulopoulos G. and Katsoulos P.D. (2007). Validation of<br />
competative ELISA for diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep and goats. Vet. J. 14:<br />
1757<br />
Mittal, K.R. and Tizard, I. (1981). Serological cross reaction between brucella abortus and<br />
Yersinia enterocolitica serotype 0:9. Vet. Bull.,51. 501-505.<br />
Morgan W.J.B., MacKinnon D.J., Lawson J.R. & Cullen G.A. (1969). The rose bengal plate<br />
agglutination test in the diagnosis of brucellosis. Vet. Rec., 85, 636-641.<br />
Nicoletti, P. (1989). Sığır Brucellosis’i. Uluslararası Brucellosis Sempozyumu.Pendik Hay. Hast.<br />
Merk. Araşt. Enst. Yay., 9: 1-2.<br />
Morgan, W.J.B. (1982): Brucella abortus. In: Handbuch der bakteriellen infektionen bei tieren<br />
Band IV Eds.: H. Blobel and T. Schlieber, Gustav Fischer Verlag -Stutgart. 53-213.<br />
Nielsen K. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Vet. Microbiol. 90:447-459<br />
Nielsen K., Gall D., Kelly W., Henning D. And Garcia M. (1992). Enzyme Immunoassay<br />
Applicaion to diagnosis of bovine brucellosis. Agriculture Canada, Animal disease research<br />
Institute,Neapan, Ontorio Canada. ISBN0-662-19838—7:<br />
Nielsen, K.H., Kelly, L., Gall, D., Nicoletti,P. And Kelly, W. (1995). Improved Competitive<br />
enzyme immunoassay for diagnosis of bovine brucellosis.Vet. Immunol. Immunopathol. 46(3-<br />
4):285-291.<br />
Olds, R.J. (1989). Ortadoğu ülkelerinde Brucellosis ve kontrolü. Uluslararası Brucellosis<br />
Sempozyumu.Pendik Hay. Hast. Merk. Araşt. Enst. Yay., 9: 28-35.<br />
Öngör, H. (1999). Elazığ yöresinde atık yapmış koyunlarda Brucellosis’in kan srumunda ELISA ile<br />
teşhisi ve diğer serolojik testlerle karşılaştırmalı araştırması. Doktora tezi. F.Ü. Sağlık Bil. Enst.,<br />
Elazığ.<br />
Plommet, M. (1984) : Les dernieres etapes de la prophylaxie de la brucellose bovine Bull. Soc. Vet.<br />
Prat. De France. 68(8): 507.<br />
Quinn, P.J., Carter, M.E., Markoy, B. And Carter, G. R. (1994): Clinical Veterinary Microbology,<br />
Wolfe publishing, Spain.<br />
Samartino L.E., Gregoret R.J. and Sigal G. Field trial of a brucellosis Competative Enzyme<br />
Linked Immunosorbent Assay(ELISA)<br />
http://www-naweb.iaea.org/nafa/aph/public/samartino-competitive-1055.pdf<br />
Samartino,L. Gall, D. and Nielsen, K. (1999). Validation of enzyme-linked immunosorbent assays<br />
for the diagnosis of bovine brucellosis. Vet. Microbiol. 70(3-4): 193-200<br />
Stack j.A., Perrett L.L., Brew S.D.(1999). Competitive ELISA for bovine brucellosis suitable for<br />
testig poor quality samples.Vet. Rec.145:735-736<br />
Stournara A, Minas A, Bourtzi-Chatzopoulou E, Stack J, Koptopoulos G, Petridou E, Sarris K<br />
(2007).Assessment of serological response of young and adult sheep to conjunctival vaccination<br />
184
with Rev-1 vaccine by fluorescence polarization assay (FPA) and other serological tests for B.<br />
melitensis. Vet Microbiol. 2007 Jan 17;119(1):53-64.<br />
Sutherland, S.S. (1980): Immunology of bovine Brucellosis. Vet.Bull., 50(5) : 359-368.<br />
Sutherland, S.S. And Searson, J. (1990): The immune response to Brucella abortus: Humoral<br />
response in: Animal Brucellosis. Eds.: K. Nielsen and J.R. Duncan. CRC Press, Boca Raton<br />
Florida, 65.<br />
Trap, D., Garin, B., Moutou, F. et Gaumont, R. (1985). Brucella bovine: Elimination des<br />
seroaglutinations non-spesifiques par l’emploi de l’EDTA et de l’agglutination a 56 ºC . Rev. Med.<br />
Vet., 136:399-409.<br />
Yardımcı, H. (1989). Koyunlarda brucelle melitensis infeksiyonlarının Aglutinasyon, Rose Bengal<br />
ve ELISA testleriyle ortaya konması ve bu testlerin teşhisteki değeri üzerine bir araştırma. Doktora<br />
tezi. A. Ü. Sağlık Bil. Enst., Ankara<br />
Dr. Asiye DAKMAN<br />
1970 yılında Ankara’da doğdum. İlk,orta ve lise eğitimimi Ankara’da<br />
tamamladıktan sonra 1988 yılında Ankara Üniversitesi (AÜ) Veteriner Fakültesi’nde<br />
eğitime başladım, 1993 yılında mezun oldum. Aynı yıl AÜ. Veteriner Fakültesi<br />
Mikrobiyoloji Anabilim dalında doktora eğitimine başladım.1994-98 yılları arasında<br />
Adnan Menderes Üniversitesi (ADÜ) Veteriner Fakültesi’nde araştırma görevlisi olarak<br />
çalıştım. 1997 yılında evlendim. 1998 yılında Afyon Kocatepe Üniversitesi (AKÜ)<br />
Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’nda araştırma görevlisi olarak çalışmaya<br />
başladım.2000 yılında doktora eğitimimi tamamladım. Aynı yıl ailevi nedenlerle<br />
üniversitedeki görevimi bırakarak Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü’nde göreve başladım. Halen aynı enstitüde Kanatlı Hayvan Hastalıkları Teşhis<br />
Laboratuarı Şefi olarak görev yapmaktayım<br />
Dr. Uğur KÜÇÜKAYAN<br />
1961 yılı Ankara doğumluyum. 1978 yılında A.Ü.Veteriner Fakültesini Kazandım.<br />
1983 yılında mezun oldum. Aynı yıl Tarım bakanlığının açmış olduğu sınavı kazanarak<br />
1984 yılında Kayseri Veteriner İşleri Müdürlüğünde göreve başladım. 1991 yılında Etlik<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsüne tayin oldum. 1996 yılında Bakteriyoloji<br />
dalında uzmanlık eğitimini tamamladım 2000 yılında A.Ü. Sağlık Bilimleri Enstiütüsünde<br />
Mikrobiyoloji Dalında Doktora eğitimini tamamladım. Halen aynı Enstitüde yetiştirme<br />
hastalıkları laboratuvarında çalışmaktayım .<br />
Veteriner Hekim Ufuk ÜLKER<br />
1969 Yılında Erzurum’da doğdum. İlk,orta ve lise tahsilimi değişik okullarda<br />
tamamladım. 1987 yılında İstanbul Üniversitesi Veteriner fakültesini kazandım. 1993<br />
yılında mezun oldum. 1994 Aralık-1995 Mart arasında Yedek Subay olarak<br />
Kars/Subatan’da askerlik görevimi yerine getirdim. 1995-1996 arasında<br />
Kayseri/Sarıoğlan /Çiftlik kasabasında klınik açtım.1996-1997 arasında Gima Marketlerde<br />
Muayene Hekimi ve Yönetici olarak çalıştım. 1997 ‘de memuriyete başladım. 1999-2000<br />
arasında Sivas/Hafik Tarım İlçe Müdürlüğünde çalıştım. 2000 yılında Merkez Etlik<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’ne atandım. Halen aynı Enstitü’ nün Yetiştirme<br />
Hastalıkları Teşhis Labaratuarın’da çalışmaktayım. Gazi Üniversitesi Fen Edebiyat<br />
Fakültesi Biyoloji Bölümünde(Mikrobiyoloji anabilim dalı) Doktora öğrencisiyim. Orta<br />
düzeyde İngilizce ve Almanca bilmekteyim. Evli olup iki kız çocuk sahibiyim.<br />
185
TÜRKİYE’DE ATLARDA BABESİA ETKENLERİNİN SAPTANMASINDA PCR<br />
TEKNİĞİNİN UYGULANMASI<br />
Dr. Ahmet DENİZ, Dr. F. Çiğdem PİŞKİN, Dr. İbrahim BALKAYA, Dr. Bengi<br />
DÜNDAR Prof. Dr. Zafer KARAER, Prof. Dr. Ayşe ÇAKMAK, Doç.Dr. Zati<br />
VATANSEVER,<br />
Doç.Dr. Serpil NALBANTOĞLU<br />
Etlik Veteriner Merkez Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
ÖZ<br />
Babesiosis, tropik ve subtropik bölgelerde evcil ve yabani <strong>hayvan</strong>larda yaygın<br />
olarak görülen, Ixodidae ailesine bağlı vektör keneler tarafından transovarial ve<br />
transstadial olarak nakledilen protozoer bir hastalıktır. Atlarda hastalığa Babesia caballi ve<br />
Theileria equi (Babesia equi) (Mehlhorn and Schein, 1998) türleri sebep olmaktadır.<br />
Hastalık ateş, anemi, bilirubinüri ve hemoglobinüri ile karakterizedir.<br />
Bu çalışma 2005-2007 tarihleri arasında Türkiye’nin farklı coğrafik bölgelerinden<br />
(Adana, Ankara, Aydın, Bartın, Bitlis, Diyarbakır, Edirne, İstanbul, İzmir, Kilis, Konya,<br />
Malatya, Samsun, Şanlıurfa) seçilen illerde CFT (Komplement Fikzasyon Test), IFAT<br />
(Indirekt Floresan Antikor Test) ve nested-PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ile atlarda<br />
Babesia caballi ve Theileria equi türlerinin tanısını yapmak, tanı yöntemlerinin<br />
karşılaştırmalı geçerliliğini tespit etmek ve PCR testinin rutin olarak laboratuvarda<br />
kullanılabilirliğini ortaya koymak amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla farklı coğrafik<br />
bölgelerde 14 ilden 300 adet at kan serumu ve EDTA’lı kan örneği toplanmıştır.<br />
Örneklerin muayenesi sonucunda testlere göre, mikroskobik bakıda %6,6; CFT<br />
testinde %34,6 (T.equi %33; B.caballi %0,3; %1,3 T.equi+B.caballi); IFAT testinde %61<br />
(T.equi %34,3; B.caballi %10; %16,6 T.equi+B.caballi) ve PCR testinde %52 (T.equi<br />
%44,6; B.caballi %2,3; %5 T.equi+B.caballi) oranında pozitiflik tespit edilmiştir.<br />
Anahtar Kelimeler: Babesia caballi, Theileria equi, CFT, IFAT, nested-PCR, At<br />
ABSTRACT: In this study, detection of Babesia caballi and Theileria equi species in<br />
horses with microscopic examination, CFT (complement fixation test), IFAT (Indirect<br />
fluorescent antibody test) and nested-PCR (Polymerase Chain Reaction); to compare the<br />
diagnosis methods; in addition to detect the value of and the routine utilization of PCR<br />
analysis in laboratories was aimed and carried on in cities which are selected from various<br />
geographical regions of Turkey (Adana, Ankara, Aydın, Bartın, Bitlis, Diyarbakır, Edirne,<br />
İstanbul, İzmir, Kilis, Konya, Malatya, Samsun, Şanlıurfa) between 2005-2007. For this<br />
purpose, 300 horse sera and blood samples with EDTA from 14 cities in different<br />
geographical regions were collected. The blood smears prapered from blood samples were<br />
stained with giemsa and investigated according to Babesia sp. piroplasms.<br />
As a result of investigation of samples according to tests, postivities were found 6,6% in<br />
microscopic investigation, 34,6% in CFT analysis (T.equi 33%; B.caballi 0,3%; 1,3%<br />
T.equi+B.caballi), %61 in IFAT (T.equi %34,3; B.caballi %10; %16,6 T.equi+B.caballi)<br />
and 52% in PCR analysis (T.equi 44,6%; B.caballi 2,3%; 5% T.equi+B.caballi). In<br />
comparison of sensitivity and specifity of methods with nested-PCR, sensitivities were<br />
detected as 12,8% in microscipic investigation , 43% in CFT, and 70,5% in IFAT.<br />
Key Words: Babesia caballi, Theileria equi, CFT, IFAT, nested-PCR, At<br />
186
1.GİRİŞ<br />
Babesiosis, babesia türlerinin neden olduğu, tropik ve subtropik bölgelerde evcil ve<br />
yabani <strong>hayvan</strong>larda yaygın olarak görülen, Ixodidae ailesine bağlı vektör keneler<br />
tarafından transovarial ve transstadial nakledilen protozoer bir hastalıktır. Bugüne kadar<br />
hastalığa sebep olan 73’den fazla tür tanımlanmış, türlerin 18’inin evcil memelilerde<br />
hastalığa neden olduğu bildirilmiştir. Babesia türlerinin coğrafik dağılımı vektör kenelerin<br />
yayılışları ile yakından ilgilidir (Levine, 1985; Friedhoff, 1988).<br />
Tektırnaklılarda Babesia caballi (Nuttall,1910) ve Theileria equi (Mehlhorn and<br />
Schein, 1998) türleri babesiosis’e sebep olmaktadır. Atlarda Babesia bigemina’ya<br />
benzeyen inraeritrositik hemoparazitler ilk olarak 1899’da Guglielmi tarafından rapor<br />
edilmiştir. 1901 yılında Levran küçük babesia etkenlerini Babesia equi olarak<br />
isimlendirmiştir. Theiler 1905’de B.equi’yi zebralarda tespit etmiş ve kan inokulasyonu ile<br />
zebradan ata nakletmiştir. Son yıllarda Babesia equi’nin hem omurgalıda hem de vektör<br />
kenede gelişmesi deneysel olarak ortaya konmuş ve Theileria soyundaki türlerle aynı<br />
gelişmeye sahip olması sebebiyle Theileria equi olarak isimledirilmiştir (Mehlhorn ve<br />
Schein, 1998).<br />
Hastalık ateş, anemi, bilirubinüri ve hemoglobinüri ile karakterizedir. B. caballi’nin<br />
eritrositler içinde, 2-5 µm büyüklükte, amoeboid, yuvarlak, genellikle tek veya çift armut<br />
formunda; B. equi’nin ise 1.5-3 µm. büyüklüğünde, yuvarlak, oval, amoeboid veya armut<br />
formlarında, karakteristik olarak haç formunda görüldüğü belirtilmiştir.<br />
Atlarda babesia türleri eritrositler içinde endodiyogeni ve endopoligeni yoluyla<br />
çoğalmaktadır. Bu bölünme sonucunda meydana gelen merozitler eritrositleri parçalayarak<br />
yeni eritrositleri enfekte ederek eşeysiz çoğalmalarını sürdürmektedir. Theileria equi<br />
türünde şizogoni gelişme safhası lenfosit hücrelerinde meydana gelmektedir. Vektör kene,<br />
enfekte <strong>hayvan</strong>dan kan emmesi esnasında, eritrositler içindeki etkenleri de alır. Kenenin<br />
bağırsağında gametogoni safhası sonucunda meydana gelen zigot bağırsak epitel hücreleri<br />
içinde gelişmesini sürdürmekte ve çok sayıda sporokinet meydana gelmektedir. Meydana<br />
gelen sporokinetler hemolenf aracılığı ile vektör kenenin kas fibrilleri, malpighi tubul<br />
hücreleri, tükrük bezlerine ve dişi kenelerde ovaryum hücrelerini bulunduran çeşitli<br />
dokularına girerler. Transovarial nakil Theileria equi türünde görülmemektedir. Tükrük<br />
bezlerine giren kinetler sporogoni yoluyla çoğalarak önce sporablastlar daha sonra<br />
sporozoitler meydana gelir.<br />
Hastalık etkenleri bir <strong>hayvan</strong>dan diğerine Ixodidae ailesine bağlı keneler tarafından<br />
nakledilmektedir. Theileria equi türünü, Dermacentor marginatus, D. reticulatus,<br />
Hyalomma marginatum, H.uralense, H.anatolicum excavatum, H.dromedari,<br />
Rhipicephalus bursa, R.sanguineus, R.evertsi, Boophilus microplus; Babesia caballi<br />
türünü, Rhipicephalus bursa, R.sanguineus, Dermacentor marginatus, H.dromedari,<br />
Hyalomma dromedari, Hyalomma marginatum türlerinin taşıdığı bildirilmiştir<br />
(Sonenshine, 1993; Mehlhorn ve Schein, 1998; Battsetseg ve ark., 2001).<br />
At babesiosis’inin teşhisinde etkenin bizzat kendisinin değil de, ona karşı oluşan<br />
antikorların tespiti esasına dayanan CFT, IFAT ve ELISA gibi serolojik yöntemler yaygın<br />
olarak kullanılmaktadır (Madden ve ark., 1968; Alton ve ark., 1988; Tenter ve ark., 1986;<br />
Kumar ve ark., 1997; Bashiruddin ve ark., 1999; Donnelly ve ark., 1980; Friedhoff, 1982;<br />
Joyner ve ark., 1981; Posnett ve ark., 1991; Weiland, 1986). Ancak bu yöntemlerde,<br />
özellikle hastalığın erken dönemlerinde ve latent dönemlerinde duyarlılıklarının düşük<br />
olması, çapraz reaksiyonlara bağlı yanlış sonuçlar verdiği bildirilmiştir (Kumar ve ark.,<br />
1997; Papadopoulos ve ark., 1996).<br />
Hastalık etkenlerinin teşhisinde gerek mikroskobik gerekse serolojik yöntemlerde<br />
karşılaşılan olumsuzluklar moleküler biyolojik çalışmalara pararlel olarak geliştirilen PCR<br />
187
tekniği ile giderilmeye çalışılmıştır. Bu teknik ile özellikle taşıyıcı <strong>hayvan</strong>larda babesia<br />
türlerini de içine alan birçok patojen etkeni duyarlı ve özgül şekilde teşhis edebilmektedir<br />
(Posnett ve ark., 1991; Fornelio-Criado ve ark., 2003; Bashuriddin ve ark., 1999;<br />
Rampersad ve ark., 2003; Nicolaiewsky ve ark., 2001).<br />
Bu çalışma 2005-2007 tarihleri arasında Türkiye’nin farklı coğrafik bölgelerinden<br />
(Adana, Ankara, Aydın, Bartın, Bitlis, Diyarbakır, Edirne, İstanbul, İzmir, Kilis, Konya,<br />
Malatya, Samsun, Şanlıurfa) seçilen illerde CFT (Komplement Fikzasyon Test), IFAT<br />
(Indirekt Floresan Antikor Test) ve nested-PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ile atlarda<br />
Babesia caballi ve Theileria equi türlerinin tanısını yapmak, tanı yöntemlerinin<br />
karşılaştırmalı geçerliliğini tespit etmek ve PCR testinin rutin olarak laboratuvarda<br />
kullanılabilirliğini ortaya koymak amacıyla yapılmıştır.<br />
1.2. Literatür Özeti<br />
Joyner ve ark, 1976-79 yılları arasında İngiltere’de B. equi ve B. caballi yönünden<br />
Equine piroplasmosisi komplement fikzasyon (CF) testiyle analiz etmişlerdir. Bu çalışma<br />
neticesinde İngiliz adalarında yaşayan atlarda seropozitiflik bulunmamıştır. Ancak İspanya,<br />
Portekiz, Belçika, Fransa, Polonya, Rusya ve Arap Ülkeleri gibi vektörlerin mevcut olduğu<br />
ülkelerde bulunan atlarda pozitif sonuçlar elde etmişlerdir.<br />
Donnelly ve ark, Yemen Krallığında bulunan atlarda B. equi ve B. caballi<br />
yönünden IFA ve CF testleri ile karşılaştırmalı olarak iki yıl aralıklarla yaptıkları<br />
araştırmada sırası ile %94,6-97,7 ve %76,8-75,0 oranında seropozitiflik tespit etmişler ve<br />
oranlar arasındaki farklılığın testlerin duyarlılığından kaynaklandığını bildirmişlerdir. Aynı<br />
araştırıcılar tarafından ithal edilen atlarda yapılan araştırmada B. equi’nin IFAT ile % 60,4,<br />
CFT ile % 62,5, B. caballi’nin ise sırası ile % 6,3 ve % 8,3 oranında yaygın olduğu<br />
belirlenmiştir.<br />
Tenter ve ark, Colombia’nın Cordoba bölgesinde atlarda yaptıkları bir araştırmada,<br />
B. equi’nin IFAT ile % 94, CFT ile % 65, B.caballi’nin ise sırası ile % 90 ve % 41<br />
oranında yaygın olduğunu bildirmişlerdir.<br />
Madden ve ark, deneysel olarak enfekte edilen atlarda B.caballi ve B. equi’ye karşı<br />
şekillenen antikorları IFA testi ile belirlemişlerdir. Ayrıca bu etkenler arasında çapraz<br />
reaksiyonların görülmediğini ortaya koymuşlardır.<br />
Weiland, atlarda babesiosisi CFT, IFAT ve ELISA ile tür spesifik olarak teşhis<br />
etmiş ve son iki metotla uzun süren latent enfeksiyon döneminde de pozitif sonuçların<br />
alındığını ve dolayısı ile babesiosisin seroepidemiyolojisinde CFT’nin yanısıra IFAT’ın da<br />
kullanılması gerektiğini bildirmiştir.<br />
Nicolaiewsky ve ark, yaptıkları bir çalışmada, kronik enfekte atlarda B.equi’nin<br />
rutin teşhisi için nested PCR tekniğinin daha elverişli olduğunu belirtmişlerdir. Yine bu<br />
çalışmalarında 10 8 equine eritrositleri içerisinde 6 adet enfekte hücre (% 0,000006) tespit<br />
etmişler.<br />
Bashiruddin ve ark., PCR ile 23 at kan örneğinin 22’sinde B.equi, 8 örnekte<br />
B.caballi enfekte olduğunu tespit etmişler ve at ihracat ve ithalatında hastalığın tespiti için<br />
kullanılan serolojik testlere oranla daha duyarlı olduğunu bildirmişlerdir.<br />
Batgar Battsetseg ve ark, Mongolia’da Dermacentor nuttali türü kenelerde PCR ve<br />
nested PCR metotları kullanarak B.equi ve B.caballi mix enfeksiyonları tespit etmişlerdir.<br />
Rampersad ve ark, yaptıkları çalışmada, hem kan frotilerinin Giemsa ile<br />
boyanması, hem basit PCR hem de nested PCR yöntemlerini kullanmışlar ve nested<br />
PCR’ın gerek boyama gerekse basit PCR’a göre çok daha iyi sonuç verdiğini tespit<br />
etmişlerdir.<br />
Hastalık dünyanın her yerinde görülmesine rağmen Ülkemizde gerek vektör keneler<br />
bakımından gerekse direkt teşhise dayalı sınırlı sayıda çalışma bildirilmiştir.<br />
188
Aktaş ve Dumanlı, Malatya Sultansuyu Tarım İşletmesi atlarında subklinik B.equi<br />
ve B.caballi enfeksiyonları üzerinde çalışmışlardır. Bu araştırmada, mikroskobik muayene<br />
ile 130 atın 15’inde B.equi, 4’ünde B.caballi, 2’sinde hem B.equi hem de B.caballi olmak<br />
üzere toplam 21’inde subklinik babesia olgusu belirlemişlerdir.<br />
İnci, Gemlik Askeri Harası atlarında Babesia caballi ve Babesia equi’nin<br />
mikroskopik olarak muayenesinde 133 atın 16’sında (%12) B. caballi, 8’inde (%6) B. equi<br />
saptamıştır. Ayrıca 6’sında (%4,5) da B. caballi ve B.equi’yi miks olarak tespit etmiştir.<br />
Atlar üzerinden ve meradan toplanan keneler, Hyalomma marginatum ve Rhipicephalus<br />
turanicus olarak teşhis edilmiştir.<br />
İnci, Kayseri yöresinde mikroskobik muayenesini yaptığı 89 atın 7’sinde (% 7,86)<br />
B.caballi, 4’ünde (% 4,49) ise B.equi saptamıştır. Ayrıca atların 4’ünde (% 4,49) B.caballi<br />
ve B.equi’yi miks olarak saptamıştır. Paraziti tespit ettiği <strong>hayvan</strong>ların hiçbirinde klinik<br />
babesiosis gözlememiştir. Topladığı ergin keneleri ise Rhipicephalus turanicus olarak<br />
teşhis etmiştir.<br />
Deniz ve ark., Türkiye’de 4470 adet at kan serumundan CFT ile 740 (%16,55)’ında<br />
Theileria equi, 26 (%0,58)’sında Babesia caballi ve 16 (%0,35)’sında hem Babesia caballi<br />
hem de Theileria equi antikorları tespit etmişlerdir.<br />
Balkaya, Türkiye genelinde 666 atta IFAT ile %25,7 T.equi, %11,1 B.caballi, CFT<br />
ile ise %19,7 T.equi, %0,9 B.caballi antikorları yönünden pozitiflik tespit etmiştir.<br />
Özcel ve ark., Kars’da halk elinde yetiştirilen 108 adet yerli ırk atlarda IFAT ile<br />
%25 oranında T.equi antikorları tespit etmişlerdir.<br />
Ankara bölgesinde Güçlü ve Karaer, atlarda PCR testi ile %10 oranında pozitiflik<br />
(%7 T.equi, %3 B.caballi) saptamıştır.<br />
2.MATERYAL VE METOT<br />
2.1.Saha Çalışmaları<br />
Çalışma materyalini Türkiye’nin farklı coğrafik bölgelerinde 14 ilden (Adana, Ankara,<br />
Aydın, Bartın, Bitlis, Diyarbakır, Edirne, İstanbul, İzmir, Kilis, Konya, Malatya, Samsun,<br />
Şanlıurfa) seçilen halk elinde yetiştirilen yerli ırk atlardan toplanan 300 adet kan serumu ve<br />
EDTA’lı kan örnekleri oluşturmuştur. Toplanan EDTA’lı kan örneklerinden yayma froti<br />
yapılmıştır.<br />
2.2.Laboratuvar Çalışması<br />
Steril serum tüplerine alınan at kanları CFT ve IFAT testlerinde kullanılıncaya kadar -20<br />
ºC’de saklanmıştır. PCR testinde kullanılacak olan ETDA’lı kan örneklerinden DNA<br />
ekstraksiyonu yapılmıştır. Yapılan yayma frotiler ise tekniğine uygun şekilde boyanarak<br />
mikroskopta incelemeye hazır hale getirilmiştir.<br />
2.3.Komplement Fikzasyon Testi (CFT)<br />
Test Antijenleri ve Kontrol serumlar<br />
Theileria equi ve Babesia caballi Antijenleri: USDA National Veterinary Services<br />
Laborotories-Ames, IOWA’dan temin edilmiştir.<br />
Negatif Antijen: USDA National Veterinary Services Laborotories-Ames, IOWA’dan<br />
temin edilmişir.<br />
Pozitif Serumlar (Düşük (LC, LE) ve Yüksek titreli (HC, HE) serumlar): USDA National<br />
Veterinary Services Laborotories-Ames, IOWA’dan temin edilmişir.<br />
Negatif Equine Serum: USDA National Veterinary Services Laborotories-Ames,<br />
IOWA’dan temin edilmişir.<br />
189
Komplement: EMVKA Enstitüsü Tüberküloz Paratüberküloz ve Ruam Teşhis<br />
Laboratuvarından temin edilmiştir. Sulandırma basamağı test protokolünde belirtildiği<br />
şekilde yapılarak tespit edilmiştir.<br />
Hemolizin: Ticari olarak satın alınmaktadır.<br />
CFT’nin Uygulanışı<br />
Test, USDA National Veterinary Services Laborotories Testing Protocol ve Alton<br />
ve ark. (1988)’nın bildirdiği şekilde yapılmıştır.<br />
Negatif serum, düşük titre (LC ve LE) ve yüksek titre (HC ve HE) pozitif serumlar<br />
porsiyonlandıktan sonra kullanılacak miktarları 1/5 oranında VBD ile sulandırılır ve 1/5<br />
oranında VBD ile sulandırılmış at test serumları ile beraber 58˚C' da su banyosunda 35<br />
dakika inaktive edilir. İlgili gözlere VBD' ler konur. TSC plate’in LC ve LE gözlerinin<br />
1/10 dan 1/320 ye kadar olan kısmına ve AC gözüne, HC ve HE gözlerinin 1/10 dan 1/320<br />
ye kadar olan kısmına ve AC gözüne 25' er µl VBD konur. ERC, CRC ve NRC’ nin de 1.<br />
gözüne 25 µl, 2.,3. ve 4. gözlerine 50 µl, 5. göze 25 µl, 6.,8. ve 9. gözlere 75 µl ve 7. göze<br />
100 µl VBD konur. Ayrıca CSS platein tüm AC gözlerine 25' er µl VBD konur. TSC<br />
platein LC ve LE gözlerinin 1/5 ve 1/10' una ve AC gözüne 25' er µl LC ve LE serum<br />
konur. 1/10 dan itibaren pipet ile 25 µl alınıp bırakılarak 1/320 ye kadar sulandırılması<br />
yapılır. En son 1/320 den 25 µl atılır. Ayrıca CSS platein LC ve LE sırasının TE ve AC'<br />
sine 25 µl LC ve LE konur. TSC platein HC ve HE gözlerinin 1/5 ve 1/10' una ve AC<br />
gözüne 25' er µl HC ve HE serum konur. 1/10 dan itibaren pipet ile 25 µl alınıp bırakılarak<br />
1/320 ye kadar sulandırılması yapılır. En son 1/320 den 25 µl atılır. Ayrıca CSS platein HC<br />
ve HE sırasının TE ve AC' sine 25 µl HC ve HE konur. İlgili gözlere NS' ler konur (CSS<br />
platein NS sırasının TE ve AC' sine 25 µl NS konur). C' ve 1/2' lik C' hazırlanır. Test<br />
serumları konur (İlgili serumun 1/5' lik sulandırmasından ilgili TE ve AC gözlerine 25' er<br />
µl konur). Antijen konur (TSC platein LC ve LE gözlerinin 1/5 den 1/320 ye kadar olan<br />
kısmına 25' er µl dilüe antijen konur ancak AC gözüne konmaz, HC ve HE gözlerinin 1/5<br />
den 1/320 ye kadar olan kısmına 25' er µl dilüe antijen konur ancak AC gözüne konmaz).<br />
İlgili antijene göre CRC, ERC ve NRC’ nin 1, 2, 5 ve 9. gözlerine 25' er µl dilüe antijen<br />
konur. CSS platein TE gözlerinin B. caballi ise caballi sırasının, B. equi ise equi sırasının,<br />
negatif antijen ise negatif sırasının tümüne 25' er µl dilüe antijen konur. C' konur (TSC<br />
platein CRC, ERC ve NRC hariç tüm gözlerine 25 µl C' konur. CRC, ERC ve NRC ' nin<br />
1,3 ve 8. gözlerine 25 µl C' konur. CSS platein hem TE hem de AC gözlerinin tümüne 25<br />
µl C' konur). 1/2' lik C' konur (CRC, ERC ve NRC ' nin 4 ve 5. gözlerine 25 µl 1/2' lik C'<br />
konur). 1/2' lik C' konduktan sonra shakerda 1 dakika karıştırılır. Parafilmle kapatılıp 37°C'<br />
da 1 saat etüvde tutulur. Testte kullanılacak miktar dikkate alınarak % 2' lik eritrosit<br />
hazırlanır (Yani %2’ lik eritrosit ile hemolizinin toplamı göz sayısıX50 µl şeklinde<br />
hesaplanmalıdır). % 2’ lik eritrosit aynı zamanda ERC, CRC ve NRC’ nin 7, 8, 9.<br />
gözlerine 25' er µl şeklinde konur. 1/1000' lik hemolizin hazırlanır. Hazırlanan % 2’ lik<br />
eritrosit ve 1/1000’ lik hemolizin 4 °C' da 20 dakika bekletilir. 4 °C' de 20 dakika<br />
bekletilen eritrositten ve hemolizinden eşit miktarlarda karıştırılır ve 37 °C' da su<br />
banyosunda 10 dakika bekletilir. İlgili gözlere konmadan önce tüp birkaç kez alt üst edilir<br />
(Bu karışımdan CRC, ERC ve NRC ' nin 7, 8 ve 9. gözleri hariç tüm gözlere 50' şer µl<br />
konur). % 2' lik eritrosit konur (CRC, ERC ve NRC ' nin 7,8,9. gözlerine 25' er µl konur).<br />
Pleytler parafilmle kapatılır. 1 dakika shakerda karıştırılır. 37°C' lık etüvde 20 dakika<br />
tutulur. Tekrar 1 dakika shakerda karıştırılır. 37°C' lık etüvde 25 dakika daha tutulur. 300<br />
g' de 5 dakika santrifüj edilir.<br />
CFT’de Kullanılan Kimyasal Madeler<br />
STOK MgCl2 (1 molar) CaCl2 (0.3 molar)<br />
190
♦ 100 ml distile su 250 ml lik erlene konur.<br />
♦ 20.3 gr MgCl26H2O eklenir.<br />
♦ 3.32 gr CaCl2 eklenir.<br />
♦ Karıştırılır ve +4ºC' da saklanır.<br />
STOK VERONAL BUFFER SOLÜSYONU (VBS)<br />
♦ 1500 ml sıcak su içinde 23 gr barbital, 15 gr sodyum barbital ve 340 gr sodyum klorid<br />
çözdürülür.<br />
♦ 20 ml stok MgCl2 CaCl2 solüsyonundan eklenir.<br />
♦ Distile su ile 8 litreye tamamlanır.<br />
JELATİN SOLÜSYONU (%10)<br />
♦ 100 ml distile su içinde 10 gr Bacto gelatin çözdürülür.<br />
♦ Vida kapaklı tüplere 10' ar ml olarak bölüştürülür.<br />
♦ 121ºC' da 15 dakika otoklav edilir.<br />
♦ +4ºC' da saklanır.<br />
♦ Kullanılacağı zaman 56ºC' da su banyosunda yumuşatılır.<br />
VERONAL BUFFER DİLÜENT (VBS' nin 1/5' lik sulandırması)<br />
♦ VBS' den 200 ml alınır. Üzerine 790 ml distile su ve 10 ml jelatin solüsyonu eklenir.<br />
♦ Manyetik karıştırıcıda iyice karıştırılır.<br />
♦ +4ºC' da saklanır.<br />
2.4.İndirek Floresan Antikor Testi (IFAT)<br />
Antijen<br />
Indirek floresan antikor (IFA) testi için gerekli Babesia caballi ve Theileria equi<br />
antijenleri Fuller Laboratories Fullerton, California USA’dan temin edilmiştir. Babesia<br />
caballi ve Theileria equi antijenleri için 1:80 temel titre olarak kabul edilmiştir.<br />
Konjugat<br />
Indirek floresan antikor testinde konjugat olarak FITC (Fluorescent Isothiocyanate)<br />
ile işaretlenmiş rabbit anti-horse IgG (Sigma, F-3762) kullanılmıştır. Derin dondurucuda (-<br />
20 o C) 20µl’lik porsiyonlar halinde tutulan konjugat, en iyi floresan veren sulandırma<br />
basamağı Schachbrett titrasyonu ile tespit edilmiştir. Her testten önce PBS (Phosphat<br />
Buffered Saline) ve Evans Blue (1 kısım Evans Blue+3 kısım PBS) ile 1:32 oranında<br />
sulandırılmıştır (Çakmak, 1987).<br />
IFAT’da Kullanılan Kontrol Maddeleri<br />
Buffer kontrol olarak PBS (pH 7.2), konjugat kontrol için de sulandırma basamağı<br />
tespit edilmiş konjugat kullanılmıştır. Pozitif kontrol serumu ve negatif serum Fuller<br />
Laboratories Fullerton, California USA’dan temin edilmiştir.<br />
IFAT’ın Uygulanışı<br />
Testin uygulanışı Çakmak (1987)’ın bildirdiğine göre yapılmıştır. İşlenecek<br />
serumlar bir gün önce derin dondurucudan çıkarılarak +4 o C’lik buzdolabına alınmıştır.<br />
Önceden hazırlanan antijen preparatları derin dondurucudan çıkarılarak içinde nem çekici<br />
olarak CaCI2 bulunan kapalı kaba alınmış ve 2 saat oda ısısında bekletilmiştir. Serumlar<br />
mikrotitrasyon kaplarında 1:10 ile 1:80 arasında PBS ile sulandırılmıştır. Nem çekici kapta<br />
2 saat duran preparatlar, içinde ıslatılmış kurutma kağıdı bulunan geniş tabanlı rutubetli<br />
191
kaplara yerleştirilmiş, numaralandırılmış ve üzerlerine çeşitli sulandırma basamaklarındaki<br />
serumlar damlatılmıştır. Rutubetli kaplar kapatılarak 37 o C’lik etüvde 30 dakika<br />
tutulmuştur. Etüvden çıkarılan preparatlar bir defa elde, iki defa da 5 dakika süre ile<br />
manyetik karıştırıcıda PBS ile yıkanmıştır. Daha sonra distile suda 2-3 dakika yıkanıp<br />
sıcak hava akımında kurutulmuşlardır. Kurutulan preparatlar yeniden rutubetli ortama<br />
konmuş ve üzerlerine konjugat damlatılarak tekrar 37 o C’lik etüvde 30 dakika tutulmuştur.<br />
Bu süre sonunda PBS ve distile su ile yıkama işlemi tekrarlanmıştır. Kurutulan preparatlar<br />
üzerine gliserinli buffer damlatılarak lamel ile kapatılmıştır. Bir saat bekletildikten sonra<br />
preparatlar karanlık odada Olympus floresan mikroskobunda x40 Neofluar objektifle<br />
incelenmiştir.<br />
IFAT’da Kullanılan Kimyasal Maddeler<br />
Fosfat Buffer Salin (PBS) Potasyumsuz<br />
Alkali kısım: 17,44 gr NaCI<br />
7,16 gr Na2HPO4 X 12H2O<br />
24,60 gr 2000 ml distile suya tamamlanır.<br />
Asit kısım: 8,72 gr NaCI<br />
1,38 gr NaH2PO4 X H2O<br />
10,10 gr 1000 ml distile suya tamamlanır.<br />
Bu iki karışım birbirleri ile karıştırılarak pH: 7,2’ye ayarlanmıştır.<br />
Evans Blue Merck, Cat. No: 3169<br />
Floresan mikroskop için gliserin Merck, Cat. No: 4095<br />
İmmersiyon yağı Merck, Cat. No: 4699<br />
Konjugat Sigma, Cat. No: F-3762<br />
2.5.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)<br />
DNA ekstraksyonu için QIAamp (Qiagen) blood extraksiyon kiti kullanılmıştır. Elde<br />
edilen DNA miktarı spektrofotometri ile ölçüldü (NanoDrop-ND-100) ve PCR testinde<br />
kullanılıncaya kadar -20ºC’de saklanmıştır. Testlerde kullanılan DNA miktarı için bu<br />
ölçümler esas alınmıştır. Yapılan ölçümlerde pozitif kontrol olarak kullanılan T.equi<br />
DNA’sı 686 ng/µl, B.caballi DNA’sı 28 ng/µl olarak tespit edildi. Bu miktarlar 10 -6 ’ya<br />
kadar dilue edildi ve bu sulandırma basamağına kadar pozitiflik elde edildi.<br />
Nested-PCR’ın Yapılışı<br />
Nested-PCR Rampersad ve ark. (2003)’nın bildirdiği şekilde yapılmıştır. PCR için MJ<br />
Research PTC-100 PCR makinesi kullanılmıştır. Reaksiyonda primer olarak Theileria equi<br />
ve Babesia caballi türlerinin 18S ssu rRNA (Small subunit ribosomal RNA) geninin<br />
büyüklüğü 709-665 ve 814-659 bp (base pairs=baz çifti) arasında değişen bir parçayı<br />
amplifiye eden primerler kullanılmıştır. Reaksiyon karışımı 50 μl final konsantrasyonda<br />
hazırlanmıştır.<br />
• Reaksiyon karışımı;<br />
10X PCR buffer (Sigma ve Fermentas)<br />
1,5 mM MgCl2 (Sigma ve Fermentas)<br />
200 μM herbir (dATP, dCTP, dGTP), 100 mM (dTTP, dUTP) deoxynucleotiden<br />
(Sigma ve Fermentas)<br />
20 pmol herbir primerden<br />
0,5 U Taq DNA polymerase (Sigma ve Fermentas)<br />
5 μl DNA örneği şeklinde hazırlanmıştır.<br />
192
• Karışım herbiri 500 μl’lik ısıya dayanıklı özel PCR reaksiyon tüplerine 45 μl<br />
reaksiyon karışımı 5 μl DNA olmak üzere porsiyonlanmıştır.<br />
Reaksiyon için tüpler otomatik PCR makinesine yerleştirilmiş ve PCR kondisyonu 94<br />
°C’de 15 saniye, 57 °C’de 30s, 72 °C’de 60s amplifikasyon 30 siklus ve son uzama 72<br />
°C’de 5 dak. olarak uygulanmıştır.<br />
Pozitif ve Negatif Kontroller<br />
Çalışmada pozitif konrol olarak Fuller laboratoriesden elde edilen Theileria equi ve<br />
Babesia caballi antijenlerinden elde edilen DNA’lar kullanılmıştır. Negatif control olarak<br />
su kullanılmıştır.<br />
Çizelge 2.1PZR’da Kullanılan Primerler<br />
Primerin Adı Dizilişi Tür Kaynak<br />
BeqF1<br />
BeqR1<br />
BeqF<br />
BeqR<br />
BcaF<br />
BcaR<br />
5`TTCGTTGACTGCGCTTGGCG`3<br />
5`CTAAGAAGCGGAAATGAAA`3 T.equi Rampersad et al. 2003<br />
5`CATCGTTGCGGCTTGGTTGG`3<br />
5`CCAAGTCTCACACCCTATTT`3 T.equi Bahiruddin et al. 1999<br />
5`TTCGCTTCGCTTTTTGTTTTTACT`3<br />
5`GTCCCTCTAAGAAGCAAACCCAA`3 B.caballi Bahiruddin et al. 1999<br />
BallF 5`GTAATTCCAGCTCCAATAG`3 T.equi Rampersad et al. 2003<br />
BallR 5`AAAGTCCCTCTAAGAAGC`3 B.caballi Rampersad et al. 2003<br />
PCR Ürünlerinin Görüntülenmesi<br />
PCR ürünleri agar jel elektroforezis ile analiz edilmiştir. Bu amaçla 1/10000 oranında<br />
ethidium bromide içeren %1,5 agar hazırlanmıştır. Elde edilen DNA bantları Farmasi<br />
biotec görüntüleme sistemi analiz edilmiştir.<br />
2.6.Kan Frotilerinin Tespiti, Boyanması ve Muayenesi<br />
Her bir <strong>hayvan</strong>dan yapılan ince frotiler laboratuvarda metil alkolde 5 dakika tespit<br />
edildikten sonra %5’lik Giemsa boya solusyonu ile oda ısında 30-45 dakika boyanmıştır.<br />
Daha sonra preparatlar mikroskopta immersiyon yağı damlatılarak mikroskobun 100’lük<br />
objektifi altında incelenmiştir.<br />
2.7.İstatistiksel Değerlendirmeler<br />
Testlerin sonuçları arasındaki farklılıkların istatistiksel olarak önemliliği x 2 (ki kare),<br />
uyumlulukları ise Kappa testi ile incelenmiştir. Bu istatistiksel testler için SPSS 15.0<br />
<strong>program</strong>ı kullanılmıştır.<br />
3.BULGULAR<br />
Bu çalışma ile 300 adet atın mikroskobik bakı, CFT, IFAT ve nested-PCR ile babesiosis<br />
pozitiflikleri saptanmış ve Çizelge 3.1’de gösterilmiştir.<br />
193
Çizelge 3.1 Mikroskobik bakı, CFT, IFAT ve nested-PCR sonuçlarının çalışma merkezlerine<br />
dağılımı<br />
Çalışma<br />
Merkezleri<br />
Mikroskobik<br />
Hayva<br />
IFAT PCR<br />
CFT<br />
Bakı<br />
n sayısı<br />
Pozitif % Pozitif % Pozitif % Pozitif %<br />
Ş.Urfa 20 5 25 12 60 17 85 2 10<br />
Kilis 20 8 40 10 50 16 80 2 10<br />
Adana 20 7 35 13 65 13 63 2 10<br />
Samsun 20 2 10 8 40 4 20 0 0<br />
İstanbul 20 3 15 15 75 14 70 2 10<br />
Bitlis 20 4 20 12 60 10 50 0 0<br />
Ankara 20 6 30 8 40 5 25 1 5<br />
İzmir 30 17 56,6 23 76,6 15 50 3 10<br />
Edirne 20 5 25 14 70 12 60 2 10<br />
Aydın 25 12 48 15 60 13 52 2 8<br />
Diyarbakır 25 11 44 22 88 20 80 2 8<br />
Bartın 20 9 45 11 55 7 35 1 5<br />
Malatya 20 5 25 9 45 3 15 0 0<br />
Konya 20 10 50 11 55 7 35 1 5<br />
Toplam 300 104 34,6 183 61 156 52 20 6,6<br />
Bu çizelgeden de anlaşılacağı gibi (Çizelge 3.1) atlarda babesiosis prevalans<br />
değerlerinin mikroskobik bakıda %6,6, CFT’de %34,6, IFAT’da %61 ve nested-PCR’da<br />
%52 olduğu tespit edilmiştir.<br />
Çizelge 3.1’e ait rakamsal değerlerin daha belirgin ifadesi Şekil 3.1’de sütun grafik<br />
olarak gösterilmiştir.<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Ş.Urfa<br />
Kilis<br />
Adana<br />
Samsun<br />
İstanbul<br />
Bitlis<br />
Ankara<br />
İzmir<br />
Edirne<br />
Aydın<br />
Diyarbakır<br />
Bartın<br />
Malatya<br />
Konya<br />
CFT<br />
IFAT<br />
PCR<br />
Şekil 3.1 Mikroskobik bakı, CFT, IFAT ve nested-PCR sonuçlarının çalışma merkezlerine<br />
dağılımı<br />
MB<br />
194
Çizelge3.2 Nested-PCR ile babesia türlerinin çalışma merkezlerine dağılımı<br />
Çalışma<br />
Merkezleri<br />
Nested-PCR T.equi B.caballi<br />
T.equi<br />
+<br />
B.caballi<br />
Ş.Urfa 17/20 17 0 0<br />
Kilis 16/20 14 0 2<br />
Adana 13/20 11 2 0<br />
Samsun 4/20 4 0 0<br />
İstanbul 14/20 6 2 6<br />
Bitlis 10/20 10 0 0<br />
Ankara 5/20 5 0 0<br />
İzmir 15/30 10 2 3<br />
Edirne 12/20 11 0 1<br />
Aydın 13/25 9 1 3<br />
Diyarbakır 20/25 20 0 0<br />
Bartın 7/20 7 0 0<br />
Malatya 3/20 3 0 0<br />
Konya 7/20 7 0 0<br />
Toplam 156/300 134 7 15<br />
Nested-PCR testi ile 300 attan 156 (156/300)’sının babesia türlerini taşıdığı,<br />
bunlardan 141’nin tek bir türle (134’de Theileria equi, 7’sinde Babesia caballi) 15’nin her<br />
iki türle enfekte olduğu tespit edilmiştir. Çalışma merkezlerinin tamamında Theileria equi<br />
görülürken, sadece Adana, İstanbul, İzmir ve Aydın’da Babesia caballi, iki türe birlikte<br />
Kilis, İstanbul, İzmir, Edirne ve Aydın illerinde görülmüştür.<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Ş.Urfa<br />
Kilis<br />
Adana<br />
Samsun<br />
T.equi B.caballi T.equi + B.caballi<br />
İstanbul<br />
Bitlis<br />
Ankara<br />
Şekil 3.2 Nested-PCR sonuçlarına gore babesia türlerinin çalışma merkezlerine dağılımı<br />
Şekil 3.2’de nested-PCR ile babesia türlerinin çalışma merkezlerine dağılımı sutun grafik<br />
olarak gösterilmiştir.<br />
İzmir<br />
Edirne<br />
Aydın<br />
Diyarbakır<br />
Bartın<br />
Malatya<br />
Konya<br />
195
Çizelge 3.3 Serolojik çalışmaların çalışma merkezlerine dağılımı<br />
Çalışma<br />
Merkezleri<br />
CFT<br />
Hayvan<br />
sayısı T.equi B.caballi<br />
T.equi<br />
+<br />
B.caballi<br />
IFAT<br />
T.equi B.caballi<br />
T.equi<br />
+<br />
B.caballi<br />
Ş.Urfa 20 4 0 1 8 0 4<br />
Kilis 20 6 0 2 5 1 4<br />
Adana 20 7 0 0 9 1 3<br />
Samsun 20 2 0 0 8 0 0<br />
İstanbul 20 3 0 0 6 6 3<br />
Bitlis 20 3 1 0 8 2 2<br />
Ankara 20 6 0 0 6 0 2<br />
İzmir 30 17 0 0 5 6 12<br />
Edirne 20 4 0 1 12 1 1<br />
Aydın 25 12 0 0 6 3 6<br />
Diyarbakır 25 11 0 0 10 5 7<br />
Bartın 20 9 0 0 9 1 1<br />
Malatya 20 5 0 0 4 3 2<br />
Konya 20 10 0 0 7 1 3<br />
Toplam 300 99 1 4 103 30 50<br />
Çizelge 3.3’e gore CFT’de Theileria equi %33, Babesia caballi %0,3 her iki tür<br />
%1,3, IFAT’da T.equi %34,3, B.caballi %10 her iki tür %16,6 oranında seropozitif olarak<br />
saptanmıştır. Çalışma merkezlerinin tamamında her iki serolojik metotla Theileria equi<br />
antikorları saptanırken, CFT ile Babesia caballi sadece Bitlis’de saptanırken; IFAT ile<br />
Babesia caballi Şanlıurfa, Ankara, Samsun hariç diğer çalışma merkezlerinin hepsinde<br />
tespit edilmiştir.<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Ş.Urfa<br />
CFT T.equi CFT B.caballi CFT T.equi + B.caballi<br />
IFAT T.equi IFAT B.caballi IFAT T.equi + B.caballi<br />
Kilis<br />
Adana<br />
Samsun<br />
İstanbul<br />
Bitlis<br />
Ankara<br />
Şekil 3.3 Çalışma merkezlerine gore seroprevalans değerlerinin dağılımı<br />
Şekil 3.3’de çalışma merkezlerinde CFT ve IFAT ile babesiosis’in seroprevalansı<br />
gösterilmiştir.<br />
Çalışmada uygulanan tanı yöntemlerinin istatistiksel <strong>değerlendirme</strong>lerinin<br />
yapılabilmesi amacıyla CFT, IFAT ve nested-PCR’dan elde edilen sonuçlar Çizelge 3.4’de<br />
verilmiştir.<br />
İzmir<br />
Edirne<br />
Aydın<br />
Diyarbakır<br />
Bartın<br />
Malatya<br />
Konya<br />
196
Çizelge 3.4 Nested-PCR, CFT ve IFAT sonuçlarının karşılaştırılması<br />
Nested-PCR<br />
- + Toplam<br />
CFT-;IFAT- 66 32 98<br />
CFT-;IFAT+ 41 57 98<br />
CFT+;IFAT- 5 14 19<br />
CFT+;IFAT+ 32 53 85<br />
Toplam 144 156 300<br />
Bu çizelgeye göre nested-PCR esas alındığında CFT’nin duyarlılığı %43, özgüllügünün<br />
%74 olduğu görülmüştür. Aynı şekilde IFAT’ın duyarlılığı %70,5, özgüllüğünün %49,3<br />
olduğu tespit edilmiştir. CFT ve IFAT’ın uyumluluğu %27 olarak görülmüştür.<br />
Mikroskobik bakının duyarlılığı %12,8, özgüllüğü %100 olarak tespit edilmiştir.<br />
Çalışmada nested-PCR <strong>değerlendirme</strong>si, agaroz jel elektroforeze tabi tutulan PCR<br />
ürünlerinin oluşturduğu bantlar Farmasi biotec görüntüleme sistemi analiz edilmiştir (Şekil<br />
3.4).<br />
Şekil 3.4. Nested-PCR sonucunda elde edilen 665 bp uzunlundaki T.equi ürünleri ve 659 bp<br />
uzunlundaki B.caballi ürünlerinin DNA bantları. M: 100 bp size marker, P: Pozitif T.equi ve<br />
B.caballi control DNA, N: Negatif control, 1-7 T.equi pozitif örnekler, 1, 2, 4 B.caballi pozitif<br />
örnekler ve 3 B.caballi negative örnek.<br />
4.TARTIŞMA<br />
Tek tırnaklılarda Babesiosis, kenelerle nakledilen, Türkiye’nin de içinde bulunduğu<br />
tropik ve subtropik ülkelerde yaygın olarak görülen ve ekonomik kayıplara yol açan<br />
önemli bir hastalıktır (Mehlhorn-Schein, 1998; Sonenshine, 1993). Hastalık Ixodidae<br />
ailesine bağlı vector kene türleri tarafından transovarial ve transstadial olarak<br />
nakledilmektedir. Vektör kenelerin bulunduğu dünyanın her yerinde hastalığa rastlamak<br />
mümkündür (Sonenshine, 1993; Bose ve ark., 1995). Hastalık OIE (Office International<br />
des Epizooties)’in B grubu listesinde yer almakta, özellikle yarış atlarında ve at<br />
nakillerinde üzerinde hassasiyetle durulmaktadır. Uluslararası at hareketlerinde Theileria<br />
equi ve Babesia caballi’ye karşı antikor taşıdığı saptanmış atların bir çok ülkeye girişine<br />
izin verilmemektedir (OIE, 2000).<br />
197
Bugüne kadar babesiosis’in teşhisinde perifer kan frotilerinin mikroskobik<br />
muayenesi, serolojik muayene gibi teknikler kullanılmış, son yıllarda bunlara PCR gibi<br />
moleküler biyolojik yöntemler de eklenmiştir. Bu teşhis yöntemlerin birbirine gore çeşitli<br />
avantaj ve dezavantajları görülmektedir (Böse ve ark., 1995).<br />
Babesiaosis yarış ve gösteri atlarında performansı olumsuz yönde etkilemekte,<br />
özellikle ağır tempolu çalışmalar hastalığın şiddetini arttırmaktadır. Hastalığı atlatan<br />
<strong>hayvan</strong>lar uzun sure vücutlarında, az miktarda parazit taşıyarak vector kenelerin<br />
enfeksiyon kaynağını oluşturmakta ve hastalık için portörlük yapmaktadırlar. Bu<br />
durumdaki subklinik <strong>hayvan</strong>larda mikroskobik muayene ile etkenleri teşhis etmek<br />
güçleşmekte ve yanılgılara sebep olmaktadır (Hailat ve ark., 1997; Böse ve ark., 1995;<br />
Bashiruddin ve ark.,1999). Mikroskobik bakıda etkenin saptanmasının güçlüğü yanında tür<br />
ayrımında da zorluklarla karşılaşılmaktadır. Özellikle miks enfeksiyonlarda karışıklıklara<br />
sbep olmaktadır (Figueroa ve Buenning, 1995).<br />
At babesiosis’inin teşhisinde etkenin bizzat kendisinin değil de, ona karşı oluşan<br />
antikorların tespiti esasına dayanan CFT, IFAT ve ELISA gibi serolojik yöntemler yaygın<br />
olarak kullanılmaktadır (Madden ve ark.1968; Alton ve ark., 1988; Tenter ve ark., 1988;<br />
Kumar ve ark., 1997; Bashiruddin ve ark., 1999; Donnelly ve ark., 1980; Friedhoff, 1982;<br />
Joyner ve ark., 1981; Posnett ve ark., 1991; Weiland, 1986). Ancak bu yöntemlerde,<br />
özellikle hastalığın erken dönemlerinde ve latent dönemlerinde duyarlılıklarının düşük<br />
olması, çapraz reaksiyonlara bağlı yanlış sonuçlar verdiği bildirilmiştir (Kumar ve ark.,<br />
1997; Papadopoulos ve ark., 1996).<br />
Hastalık etkenlerinin teşhisinde gerek mikroskobik gerekse serolojik yöntemlerde<br />
karşılaşılan olumsuzluklar moleküler biyolojik çalışmalara pararlel olarak geliştirilen PCR<br />
tekniği ile giderilmeye çalışılmıştır. Bu teknik ile özellikle taşıyıcı <strong>hayvan</strong>larda babesia<br />
türlerinide içine alan birçok patojen etkeni duyarlı ve özgül şekilde teşhis edebilmektedir<br />
(Posnett ve ark., 1991; Fornelio-Criado ve ark., 2003; Bashuriddin ve ark., 1999;<br />
Rampersad ve ark., 2003; Nicolaiewsky ve ark., 2001).<br />
PCR ile paraziteminin çok düşük olduğu (%0,000083) durumlarda bile<br />
saptanabilmesi, latent enfeksiyonların tanısında PCR’ın önemli bir tanı yöntemi olduğunu<br />
göstermektedir (Bashiruddin ve ark., 1999; Rampesad ve ark., 2003; Nicolaiewsky ve ark.,<br />
2001).<br />
Bu çalışmada mikroskobik bakı, serolojik yöntemler ve PCR’ın duyarlılık<br />
bakımından karşılaştırması yapılmış, PCR’a gore mikroskobik bakının duyarlılığı %12,8,<br />
CFT’nin %43 ve IFAT’ın duyarlılığı %70.5 olarak saptanmıştır. Dört yöntem arasında<br />
atlarda babesiosis’in teşhisi için PCR’ın daha duyarlı ve özgül olduğu tespit edilmiştir.<br />
Diğer taraftan bu çalışmada kullanılan teşhis metotlarından CFT, IFAT ve PCR’da<br />
saptanan pozitiflikler karşılaştırıldığında, CFT ile pozitif bulunan 37 örneğin ve IFAT’da<br />
pozitif bulunan 73 örneğin PCR’da negative olması Kuttler (1981)’in bildirdiği gibi sahada<br />
yoğun olarak kullanılan babesia etkenlerine karşı kullanılan bileşiklerin <strong>hayvan</strong>ı tamamen<br />
piroplazmlardan arındırdığını düşündürmektedir. Bunun yanında CFT ve IFAT’da negative<br />
olan 32 örneğin PCR’da pozitif olması babesia enfeksiyonlarında oluşan antikorların bir<br />
sure sonra azalmasına karşın piroplazmların uzun sure kalmalarına bağlı olduğu<br />
düşünülmektedir (Martin-Sanchez ve ark., 1999).<br />
Hastalık dünyanın her yerinde görülmesine rağmen Ülkemizde gerek vector keneler<br />
bakımından gerekse direkt teşhise dayalı sınırlı sayıda çalışma bildirilmiştir. Bu<br />
çalışmalardan sadece bir tanesinde PCR testi kullanılmıştır (Aktaş ve ark.,2000; Alibaşoğlu<br />
ve Yalçıner,1965; Özcan, 1961,Öncel ve ark., 2005; İnci, 1997; İnci, 2002; Güçlü ve<br />
Karaer, 2007; Deniz ve ark.07)<br />
Bu çalışmalarda mikroskobik muayene sonuçlarına gore, Malatya’da %16.1 (%11,5<br />
T.equi %3 B.caballi %1,5 T.equi+B.caballi) (Aktaş ve ark., 2000), Gemlik Askeri<br />
198
Harasında 16 atın B.caballi 8 atın T.equi ve 6 atta T.equi+B.caballi (İnci, 1997),<br />
Kayseri’de %15,3 (%4,49 T.equi %7,86 B.caballi ve %4,49 T.equi+B.caballi) (İnci, 2002),<br />
Ankara’da 9 atta T.equi 23 atta B.caballi (Özcan, 1961), Ankara’da 35 atta T.equi 33 atta<br />
B.caballi (Alibaşoğlu ve ark., 1965), Ankara’da %3 (Güçlü ve Karaer, 2007) oranında<br />
pozitiflik tespit edilmiştir.<br />
Bu çalışmada ise 14 ilde mikroskobik bakıda atlarda babesiosis’in prevalansı %6,6<br />
olarak tespit edilmiştir.<br />
Türkiye’de CFT ve IFAT testi ile yapılan yoklamalarda, Kars’da IFAT ile %25<br />
T.equi (Özcel ve ark., 2005), Türkiye genelinde IFAT ile %25,7 T.equi %11,1 B.caballi<br />
CFT ile %19,7 T.equi %0,9 B.caballi (Balkaya, 2004), Türkiye genelinde CFT ile %16,55<br />
T.equi %0,58 B.caballi ve %0,35 T.equi+B.caballi (Deniz ve ark., 2007) oranında<br />
bulunmuştur.<br />
Bu çalışmada ise IFAT ile %34,3 T.equi %1 B.caballi %16,6 T.equi+B.caballi miks<br />
olarak, CFT ile %33 T.equi %0,3 B.caballi %1,3 T.equi+B.caballi miks olarak tespit<br />
edilmiştir. Bu sonuçlar Balkaya (2004) ve Deniz ve ark. (2007)’nın sonuçları ile<br />
uyumluluk göstermektedir.<br />
Bugüne kadar Türkiye’de atlarda babesia türlerinin teşhisi konusunda moleküler<br />
biyolojik metotlarla yapılan bir adet çalışma mevcuttur. PCR ile atlarda babesiosis’in<br />
teşhisi ilk olarak Ankara bölgesinde Güçlü ve Karaer (2007) tarafından yapılmış ve %10<br />
oranında pozitiflik (%7 T.equi, %3 B.caballi) saptanmıştır.<br />
Bu çalışmada ise Türkiye’de 14 ilde PCR ile atlarda Theileria equi ve Babesia<br />
caballi’nin prevalansı %52 (%44,6 T.equi, %2,3 B. caballi, %5 T.equi+B.caballi) olarak<br />
tespit edilmiştir. Sonuçlar karşılaştırıldığında aradaki farkın çalışmanın yürütüldüğü farklı<br />
endemik özelliklere sahip yerleşim birimlerinden ve kullanılan PCR metodunun farkından<br />
kaynaklandığı düşünülmektedir.<br />
ÖZET: Bu çalışma 2005-2007 tarihleri arasında Türkiye’nin farklı coğrafik bölgelerinden<br />
(Adana, Ankara, Aydın, Bartın, Bitlis, Diyarbakır, Edirne, İstanbul, İzmir, Kilis, Konya,<br />
Malatya, Samsun, Şanlıurfa) seçilen illerde Mikroskobik bakı, CFT (Komplement<br />
Fikzasyon Test), IFAT (Indirekt Floresan Antikor Test) ve nested-PCR (Polimeraz Zincir<br />
Reaksiyonu) ile atlarda Babesia caballi ve Theileria equi türlerinin tanısını yapmak, tanı<br />
yöntemlerinin karşılaştırmalı geçerliliğini tespit etmek ve PCR testinin rutin olarak<br />
laboratuvarda kullanılabilirliğini ortaya koymak amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla farklı<br />
coğrafik bölgelerde 14 ilden 300 adet at kan serumu ve EDTA’lı kan örneği toplanmıştır.<br />
Toplanan EDTA’lı kan örneklerinden yayma frotiler yapılıp Giemsa ile boyanmış ve<br />
Babesia sp. piroplazmları yönünden incelenmiştir.<br />
Örneklerin muayenesi sonucunda testlere göre, mikroskobik bakıda %6,6; CFT<br />
testinde %34,6 (T.equi %33; B.caballi %0,3; %1,3 T.equi+B.caballi); IFAT testinde %61<br />
(T.equi %34,3; B.caballi %10; %16,6 T.equi+B.caballi) ve PCR testinde %52 (T.equi<br />
%44,6; B.caballi %2,3; %5 T.equi+B.caballi) oranında pozitiflik tespit edilmiştir.<br />
Kullanılan yöntemlerin duyarlılık ve özgüllükleri karşılaştırıldığında nested-PCR’a göre,<br />
mikroskobik bakının %12,8, CFT’nin %43 ve IFAT’ın %70,5 oranında duyarlı olduğu<br />
tespit edilmiştir.<br />
Anahtar Kelimeler: Babesia caballi, Theileria equi, CFT, IFAT, nested-PCR, At<br />
LİTERATÜR LİSTESİ<br />
1.Alton GG, Lois MJ, Angus RD, Verger JM (1988). Diagnostic test Procedures. In: Techniques for the<br />
Brucellosis Laboratory. Institute National De La Recherche Agronomique. 147 rue de I’Universite, 75007<br />
Paris.<br />
2.Alibaşoğlu M, Yalçıner Ş (1965). 1933-1961 yılları arasında Ankara ve yöresinde atlarda görülen<br />
hastalıklara toplu bir bakış. AÜ Vet Fak Derg, 12 (1-2): 98-111.<br />
3.Aktaş M, Dumanlı N (2000). Malatya Sultansuyu Tarım İşletmesi Atlarında Subklinik Babesia equi ve<br />
Babesia caballi Enfeksiyonları.Türkiye Parazitoloji Derg, 24 (1), 55-56.<br />
199
4.Balkaya İ (2004). Türkiye’nin farklı bölgelerinde atlarda Babesia equi ve Babesia caballi’nin yayılışının<br />
mikroskobik ve serolojik yöntemlerle araştırılması (Doktora Tezi), Fırat üniversitesi Veteriner Fakültesi.<br />
5.Bashiruddin JB, Cama C, Rebelo K (1999). Molecular detection of Babesia equi and Babesia caballi in<br />
horse blood by PCR amplification of part of the 16S rRNA gene. Veterinary Parasitology, 84,75-83.<br />
6.Battsetseg B, Xuan X, Ikadai H, Bautista JLR, Byambaa B, Boldbaatar D, Batur B, Battsetseg G,<br />
Batsukh Z, Igarashi I, Nagasawa H, Mikami T, Fujisaki K (2001). Detection of Babesia caballi and<br />
Babesia equi in Dermacentor nuttali adult ticks. International Journal for Parasitology, 31, 384-386.<br />
7.Böse R, Jorgensen WK, Dalgliesh R J, Friedhoff K T, De Vos A J (1995). Current state and future<br />
trends in the diagnosis of babesiosis. Vet. Parasitol., 57: 61-74.<br />
8.Deniz A, Pişkin FÇ, Balkaya İ, Dündar B (2007). Türkiye’de Atlarda Babesia caballi ve Theileria<br />
equi’nin Seroprevalansı. XV. Ulusal Parazitoloji Kongresi, 18-23 Kasım 2007, Kayseri-Ürgüp.<br />
9.Donnely J, Joyner LP, Graham-Jones O, Ellis CP (1980). A comparison of the complement fixation and<br />
immunofluorescent antibody tests in a survey of the prevalance of Babesia equi and Babesia caballi in horses<br />
in the Sultanate of Oman. Trop Anim Health Prod, 12 (1):50-60.<br />
10.Fornelio-Criado A, Martinez-Marcos A, Buling-Sarana A, Barba-Carretero JC (2003). Molecular<br />
studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in southern Europe Part I. Epizootiological aspects. Vet.<br />
Parasitol. 113: 189-201.<br />
11.Figueroa JV, Buening GM. (1995). Nucleic acid probes as a diagnostic method for tick-borne<br />
hemoparasites of veterinary importance. Vet.Parasitol., 75: 75-92.<br />
12.Güçlü Z ve Karaer KZ (2007). Ankara yöresinde sportif ve gösteri amaçlı yetiştirilen atlarda Babesia<br />
caballi ve Theileria equi’nin yayılışının Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile araştırılması. Türk. Parazitol. Derg.<br />
31(2): 89-93.<br />
13.Hailat NQ, Lafi SQ, Al-Darraji AM, Al-Ani FK (1997). Equine Babesiosis Associated with strenuous<br />
exercise: Clinical and Pathological Studies in Jordan. Vet Parasitol., 69 (1-2): 1-<br />
14.İnci A. (1997).Gemlik Askeri Harası Atlarında Babesia caballi (Nuttall, 1910) ve Babesia equi (Laveran,<br />
1901)’nin mikroskopik muayeneyle saptanması. Tr J Vet Anim Sci, 21:43-46.<br />
15.İnci A.(2002). Kayseri yöresinde tek tırnaklılarda Babesia equi (Laveran, 1901) ve Babesia caballi<br />
(Nuttall, 1910) yaygınlığının mikroskobik muayene ile araştırılması. FÜ Sağlık Bil Derg, 16(1), 85-88.<br />
16.Joyner LP, Donnelly J, Huck RA (1981). Complement Fixation tests for equine piroplasmosis (Babesia<br />
equi and B. caballi) performed in the UK during 1976 to 1979. Equine Vet J, 13(2):103-6.<br />
17.Kumar S, Malhotra DV, Dhar D (1997). Serodiagnosis of Babesia equi infection comparison of dot-<br />
ELISA, complement fixation test, complement fixation test and capillary tube agglutination test. Vet.<br />
Parasitol. 69: 171-176.<br />
18.Levine ND (1985). Veterinary Protozoology. Iowa State University Press Ames.<br />
19.Madden PA et al (1968). Equine Piroplasmosis: Indirect Fluorescent Antibody Test for Babesia caballi.<br />
Am J Vet Res, Vol. 29, No.1:117-23.<br />
20.Mehlhorn H, Schein E (1998). Redescription of Babesia equi Laveran, 1901 as Theileria equi Mehlhorn,<br />
Schein 1998. Parasitol Res, 84: 467-475.<br />
21.Nicolaiewsky TB, Richter MF, Lunge VR, Cunha CW, Delagostin O, Ikuta N, Fonseca AS, Da Silva<br />
SS, Ozaki LS (2001). Detection of Babesia equi (Laveran, 1901) by nested polymerase chain reaction.<br />
Veterinary Parasitology, 101, 9-21.<br />
22.OIE, Manuel of standards for diagnostic tests and vaccines, Office International des Epizooties<br />
(2000). Capter 2.5.6. Equine Piroplasmosis, p. 558-564.<br />
23.Öncel T, Vural G, Gıcık Y, Arslan MO (2005). Kars yöresinde Atlarda Babesia equi’nin seropozitifliği.<br />
14. Ulusal Parazitıloji Kongresi, 18-25 Eylül 2005, İzmir.<br />
24.Özcan HC (1961). Ankara ve civarında evcil <strong>hayvan</strong>larda görülen piroplasmose vak’aları ve tedavileri<br />
üzerine araştırmalar. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yayınları No: 143, Ank.<br />
25.Papadopoulos B, Perie NM, Uilenberg G (1996). Piroplasms of domestic animals in the Macedonia<br />
region of Greece 1. Serological cross-reactions. Vet.Parasitol., 63: 41-56.<br />
26.Posnett ES, Fehrsen J, De Waal DT, Ambrosio RE (1991). Detetction of Babesia equi in infected<br />
horses and carrier animals using a DNA probe. Vet. Parasitol. 39: 19-32<br />
27.Rampersad J, Cesar E, Campbell MD, Samlal M, Ammons D (2003). A field avaluation of PCR for<br />
routine detection of Babesia equi in horses. Veterinary Parasitology, 114, 81-87.<br />
28.Sonenshine, D.E. (1993). Biology of Ticks. Oxford University Press. Volume 2.<br />
29.Tenter AM, Otte MJ, Gonzales CA, Abuabara Y (1988). Prevalance of piroplasmosis in equines in the<br />
Colombian province of Cordoba. Trop Anim Health Prod, 20(2):93-8.<br />
30.Weiland G (1986). Species-spesific serodiagnosis of equine piroplasma infections by means of<br />
complement fixation test (CFT), indirectimmunofluorescence (IIF), and enzyme-linked immunosorbent assay<br />
(ELISA). Vet Parasitol, 20 (1-3):43-8<br />
200
ÖNSÖZ<br />
AYDIN VE İZMİR BÖLGESİNDEKİ SIĞIRLARDAN<br />
PASTEURELLA MULTOCİDA’NIN İZOLASYONU,<br />
TİPLENDİRİLMESİ VE ANTİBİYOTİKLERE DUYARLILIKLARI<br />
Dr. Göksel ERBAŞ<br />
Bornova Veteriner Kontrol Araştırma Enstitüsü<br />
İnsanların beslenmesinde vazgeçilmez bir role sahip proteinin sağlandığı en önemli<br />
kaynakların başında et ve süt gelmektedir. Bu gün dünyanın birçok yerinde süt ve kırmızı<br />
et ihtiyacının büyük bir bölümü sığırlardan sağlanmaktadır.<br />
Ülkemiz <strong>hayvan</strong>cılığı içerisinde sığır yetiştiriciliği önemli bir yer tutmaktadır. Sığır<br />
eti ürünleri Dünya’ da ve Türkiye’ de nüfus artışına paralel olarak artan <strong>hayvan</strong>sal protein<br />
ihtiyacının karşılanmasında ilk sırayı almaktadır.<br />
Gelişen taşımacılık imkânları ile birlikte ülkenin çeşitli bölgelerinde kurulan<br />
<strong>hayvan</strong> pazarlarına gelen sığırlar, birbirinden farklı salgın ve bulaşıcı hastalığın da hızla<br />
yayılmasına neden olmaktadır. Bu pazarlardan besi ve yetiştirme için satın alınan sığırlarda<br />
görülen en önemli hastalıklardan biriside solunum sistemi hastalıklarıdır.<br />
Sığırlarda görülen üst solunum yolu hastalıkları yemden yararlanma, süt veriminde<br />
düşme ve canlı ağırlık azalışlarına neden olduğu gibi ilaç ve bakım masraflarının artmasına<br />
yol açmaktadır.<br />
Sığırlarda görülen solunum yolu hastalıklarından hemen hemen en önemlisi olan<br />
Pnömonik Pastörolloz, P. multocida ve P. haemolytica ile ilişkili olup, bronkopnömoni,<br />
toksemi, eksudatif pnömoni ile karakterizedir).<br />
Pasteurella multocida sığırlarda Solunum Yolu Hastalığı (Bovine Respiratorik<br />
Diseases - BRD) olarak bilinen hastalıkların yanında Hemorojik Septisemi(HS)’ye de<br />
sebebiyet vermektedir.<br />
Bu araştırma ile Aydın ve İzmir yöresinde bulunan sığırlardaki Pasteurella<br />
multocida varlığının ortaya çıkarılması ve serotiplendirmelerinin yapılması hedeflenmiştir.<br />
Bu araştırma, Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri birimi<br />
(VTF 06007 numaralı proje) ve Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tarımsal Araştırmalar Genel<br />
Müdürlüğü (HS/01/02/07/120 numaralı proje) tarafından desteklenerek gerçekleştirilmiştir.<br />
Aydın ve İzmir Bölgesindeki Sığırlardan Pasteurella multocida’nın İzolasyonu,<br />
Tiplendirilmesi ve Antibiyotiklere Duyarlılıkları<br />
ÖZ: Bu çalışmada, Pasteurella multocida izolasyonu amacıyla kullanılan toplam 570 adet<br />
sığır intratracheal svabının 350 adedi İzmir ilinde, 220 adedi ise Aydın ilinde bulunan<br />
mezbahalardan temin edildi. Araştırmada kullanılan 570 adet örneğin 28 (%4,9)’inden P.<br />
multocida izolasyon ve identifikasyonu yapıldı. İzmir ilinden alınan 350 örnekten 18 adet<br />
(% 5,14) ve Aydın ilinden alınan 220 örnekten 10 adet (% 4,54) P. multocida izolasyon ve<br />
identifikasyonu yapılmıştır.Yapılan çalışmada 28 adet saha suşunun 15 (% 53,6) adedi tip<br />
B, 10 (% 35,7) adedi tip A ve 1 (% 3,5) adedi de tip D olarak tespit edildi. İzolatlardan 2<br />
(% 7,2) adedi ise tiplendirilememiştir.P. multocida suşlarının % 93,0 flourphenicole’e, %<br />
61,0 enrofloxacine’e, % 54,0 oxytetracycline’e duyarlı olduğu bulundu. P. multocida<br />
suşlarının tümünün erytromycine ve sulphamethaxsazole – trimethoprim’e % 82,0,<br />
gentamycine’e % 64,0 ve amoxycilline clavulanic acid’e ise % 61,0 oranlarında dirençli<br />
olduğu tespit edilmiştir.<br />
Anahtar Kelimeler: Pasteurella multocida, izolasyon, identifikasyon, tiplendirme<br />
201
The Isolation, Serotyping and Antimicrobial Susceptibility of Pasteurella multocida<br />
strains in cattle in the region of Aydın and İzmir<br />
Abstract: In this study, a total of 570 intratracheal swabs were examined for the<br />
Pasteurella multocida isolation that were taken 350 of from İzmir region slaughterhouse<br />
and were taken 220 of from Aydın region slaughterhouse. P. multocida was identified from<br />
28 (4,9%) of 570 intratracheal swabs that were examined in this study. Pasteurella<br />
multocida was identified from 18 (5,14%) of 350 in İzmir region and 10 (4,54) of 220 in<br />
Aydın region. In the study, a total of 28 field Pasteurella multocida strains were serotyped<br />
as ; 15 (53,6 %) type B, 10 (35,7%) type A and 1 (3,5%) type D, respectively. Of 2<br />
Pasteurella multocida strains were untypeable. The Pasteurella multocida strains were<br />
found to be susceptible to Flourphenicol (93,0 %), Enrofloxacine (61,0 %),<br />
Oxytetracycline (54,0 %) and were found to be resistant to Erythromycine (82,0 %),<br />
Sulphamethaxsazole-Trimethoprim (82,0 %), Gentamycine (64,0 %) and Amoxycilline-<br />
Clavulanic acid (61,0 %).<br />
Key words: Pasteurella multocida, isolation, identification, serotyping<br />
1. GİRİŞ<br />
Ülkemiz <strong>hayvan</strong>cılığı içerisinde sığır yetiştiriciliği önemli bir yer tutmaktadır. Sığır<br />
eti ürünleri Dünya’ da ve Türkiye’ de nüfus artışına paralel olarak artan <strong>hayvan</strong>sal protein<br />
ihtiyacının karşılanmasında ilk sırayı almaktadır. Geçmiş yıllarda sığır yetiştiriciliğinin<br />
modern tekniklerle yapılmaması pek çok problemin çıkışını oluşturmaktaydı. Son<br />
zamanlarda ülkesel bir gelişim olarak yetiştiricilerin bilinç kazanmasıyla birlikte sığır<br />
yetiştiriciliği de modern kombinelerde yapılmaya başlanmıştır. Buna paralel olarak da<br />
Veteriner Hekimlikte artık münferit vaka sağaltımından ziyade sürü denetimleri ön plana<br />
çıkmakta ve koruyucu hekimlik günden güne daha fazla önem kazanmaktadır.<br />
Sığırlarda görülen üst solunum yolu hastalıkları yemden yararlanma, süt veriminde<br />
düşme ve canlı ağırlık azalışlarına neden olduğu gibi ilaç ve bakım masraflarının artmasına<br />
yol açmaktadır. Hastalığın ortaya çıkışında taşıma, sütten kesme, kalabalık ahırlarda<br />
barınma, ve ani iklim değişiklikleri gibi stres faktörleri ile birden fazla mikroorganizma<br />
[(virüsler (Infeksiyöz Bovine Rhinotracheitis (IBR), Bovine Viral Diarrhea Virüs (BVD),<br />
Parainfluensa-3 (PI-3), Respiratory Syncytial virüs (RSV)], mantar, çeşitli bakteriler<br />
(Pasteurella spp., Streptococcus spp., Echerichia coli, Acinetobacter spp., Mycoplasma<br />
spp. vb) ve parazit türleri rol oynadığından etiyolojik olarak komplex bir yapıya sahip<br />
olduğu kabul edilmektedir. Pasteurella grubu mikroorganizmalar insanlarda ve<br />
<strong>hayvan</strong>larda birçok enfeksiyonun primer etkenleridir.<br />
Sığırlarında görülen solunum yolu hastalıklarından hemen hemen en önemlisi olan<br />
Pnömonik Pastörolloz, P. multocida ve P. haemolytica ile ilişkili olup, bronkopnömoni,<br />
toksemi, eksudatif pnömoni ile karakterizedir.<br />
Pasteurella multocida sığırlarda Solunum Yolu Hastalığı (Bovine Respiratorik<br />
Diseases - BRD) olarak bilinen hastalıkların yanında Hemorojik Septisemi(HS)’ye de<br />
sebebiyet vermektedir.<br />
Bu çalışmada, Aydın ve İzmir illerinde önemli ekonomik kayıplara neden<br />
olabilecek Üst solunum yolu hastalıkları ve Hemorojik septisemi’ye sebebiyet veren P.<br />
multocida’nın, hangi kapsüler serotiplerinin daha etkin olduğunun belirlenmesi ve etkenin<br />
duyarlı olduğu antibiyotiklerin tespiti ve aşı geliştirme çalışmalarında yardımcı olunması<br />
hedeflenmiştir.<br />
202
2. LİTERATÜR ÖZETİ<br />
Sığır solunum sistemi hastalıklarının, et ve süt sığırcılığında, özellikle Amerika,<br />
Kanada, İngiltere ve Avrupa başta olmak üzere dünyanın birçok bölgesinde halen büyük<br />
kayıplara neden olduğu bilinmektedir (17, 44). Pnömonik Pastörolloz’un Kuzey<br />
Amerika’da sığır endüstrisini yılda en az 640 milyon doların üzerinde bir kayba uğrattığı<br />
(8, 25) ve kayıpların stres faktörlerinin ve/veya virüs ve bakterilerin etkisi ile daha da<br />
arttığı ortaya konulmuştur (16, 43).<br />
Pasteurella multocida, sığırlarda pnömoniye, meningoensefalitis ve mastitise (38),<br />
hemorajik septisemiye (11), domuzlarda atrofik rinit ve pnömoniye (13), koyunlarda nadir<br />
bir şekilde pnömoniye (18), laboratuvar <strong>hayvan</strong>larında çeşitli enfeksiyonlara (30) sebep<br />
olmaktadır. Özellikle üst solunum yolu hastalıklarında etken tek başına hastalığı<br />
oluşturabilmesi yanında diğer mikroorganizmalar, viruslar ve bakım koşulları da bu<br />
hastalıklara hazırlayıcı faktör olabilirler. Hastalık genelde sığırlarda IBR, BVD gibi viral<br />
hastalıklarla kombine seyretmektedir. Mikroorganizma, <strong>hayvan</strong>ın direnci kırıldığı<br />
durumlarda patojenitesini artırmakta ve pnömoni tablosunu güçlendirmektedir. Hemorajik<br />
septisemi hastalığı ise akut ve oldukça ölümcül seyreden ve P. multocida’nın çeşitli<br />
serotiplerinin neden olduğu septisemik bir hastalıktır.<br />
Pasteurella multocida, kapsüler ve somatik antijenlerine göre<br />
tiplendirilebilmektedir. P. multocida’nın A, B, D, E ve F olmak üzere 5 kapsüler serotipi<br />
tanımlanmıştır. Ayrıca P. multocida’nın 16 somatik serotipi vardır. Pasteurella<br />
multocida’nın serogrup tiplerinin tayininde en önemli rolü bakterinin kapsülü<br />
üstlenmektedir (40). Pasteurella multocida serogrup B ve E sığır ve buffalolarda hemorajik<br />
septisemi ile ilgilidir (11), serogrup A kanatlı <strong>hayvan</strong>larda kanatlı kolerasına neden olur,<br />
serogrup D ise domuzlarda atrofik rhinitis’le ilgilidir (9). Sığır hemorajik septisemisinden<br />
Güneydoğu Asya’da B:6, Afrika’da E:6 sorumlu tutulmuştur, hâlbuki sığır solunum yolu<br />
hastalığı başlıca serogrup A ile ilgilidir (11).<br />
Veteriner Hekimlerin hasta sağaltımında, Antibiyotiklere karşı olan direnç en<br />
büyük problemlerden biridir. Bu problemin kaynağı ise antimikrobiyal ilaçların genellikle<br />
çok yüksek dozlarda ve hatalı seçimlerinden kaynaklandığı belirtilmektedir (12)<br />
Solunum sistemi hastalıklarının tedavisinde özellikle geniş spektrumlu<br />
antibiyotikler, sulfonamidler veya bunların kombinasyonları etkilidir (27). Akgül ve ark<br />
(1), pneumonili buzağılarda tilmicosinin, Picavet ve ark. (36), ise tilmicosin ile linkomisin<br />
+ spektinomisin kombinasyonlarının, Gruenau (20) bronkopnömonili buzağı ve besi<br />
danalarında tilmicosin, procainpenisilin, gentamisin ve linkomisin+spektinomisin<br />
kombinasyonlarının, Aslan ve ark (5), enzootik pnömonili danalarda penisilin +<br />
streptomisin kombinasyonlarının, Gül ve ark (21) ise enzootik pnömonili dana ve<br />
kuzularda amoksisilin uygulamalarının etkili olduğunu bildirmektedirler.<br />
3. MATERYAL VE METOT<br />
3.1. Materyal:<br />
Örnekler: Bu çalışmada, Pasteurella multocida izolasyonu amacıyla kullanılan<br />
toplam 570 adet sığır intratrcheal svabın 350 adedi İzmir ilinde, 220 adedi ise Aydın ilinde<br />
bulunan mezbahalardan temin edildi. İntratracheal svaplar, <strong>hayvan</strong>lar kesimleri sonrasında<br />
sığırların trachealarına steril olarak yapılan kesitlerden alınmıştır. Örneklerin tamamı 1 yaş<br />
ve üstü sığırlardan temin edilmiştir. Alınan svap örnekleri ADÜ Veteriner Fakültesi<br />
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Rutin Teşhis laboratuvarına soğuk zincir altında getirilmiştir.<br />
Standart P. multocida Suşları: P. multocida’nın 5 serotipinden olan A (7320), B<br />
(7372) ve D (6985) serotipleri Çek Cumhuriyeti’ndeki National Institute of Public Health<br />
enstitüsünden temin edilmiştir. Fakat çalışmada kullanılması hedeflenen E ve F<br />
203
serotiplerine ise hiçbir yurtiçi ve yurtdışı kaynaktan ulaşılamadığı için bu iki serotip<br />
tiplendirmede kullanılmamıştır.<br />
Deney Hayvanları: Standart P. multocida suşlarından antiserum hazırlamak<br />
amacıyla her bir suş için 3’er adet olmak üzere 1,5 – 2 kg ağırlığındaki Yeni Zelanda<br />
tavşanlarından 9 adet, kullanılmıştır. Yeni Zelanda tavşanları Bornova Veteriner Kontrol<br />
ve Araştırma Enstitüsü Deneme Hayvanları Yetiştirme Biriminden sağlanmıştır.<br />
Antibiyotik Standartları: Flourphenicol, Oxytetracycline, Enrofloxacine,<br />
Amoxycilline - Clavulanic acid, Gentamycine, Erythromycine, Sulphamethaxsazole –<br />
Trimethoprim etken maddeleri içeren antibiyotiklerin enjektable formları piyasadan temin<br />
edilerek dilüsyonların hazırlanmasında kullanılmıştır.<br />
Kullanılan Besiyerleri: İzolasyon ve identifikasyon için, %7 koyun kanlı agar<br />
(Merck 1.10886), Mac Conkey Agar (Oxoid CM 115), Lassen’in Üçlü Tüp Besiyerleri,<br />
İndol test ortamı, nitrat test ortamı, P. multocida serotiplerinden ve saha izolatlarından<br />
antijen hazırlanmasında Brain Heart Infusion Broth (Oxoid CM 225), Antibiyotiklere<br />
Duyarlılık Testinde Kullanılan Besiyerleri, Tyriptone Soya Broth (Oxoid CM 129),<br />
Mueller – Hinton Agar (Oxoid CM 0337) kullanıldı.<br />
Ayıraçlar: İndol Ayıracı (Kovaks ayıracı), Nitrat ayıraçları<br />
Solüsyonlar: Formollü (% 0,3) Fosfat Buffer Tuz Solusyonu<br />
Otomatize İdentifikasyon Sistemi: Otomatize identifikasyon amacıyla Bornova<br />
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsünde bulunan Vitec II Compact (Fransa –<br />
Biomerioux) cihazı kullanılmıştır.<br />
3.2. Metot:<br />
İzolasyon ve İdentifikasyon: Mezbahalarda kesim sonrası sığır akciğerlerine ait<br />
trachealarından alınan svap örnekleri soğuk zincir altında laboratuara getirildi ve % 7 lik<br />
kanlı agara ekimleri yapıldı. Besiyerleri 37 °C’de 24 – 48 saat inkübe edildi (31). İzolasyon<br />
besiyerinde üreyen bakterilerin koloni morfolojileri, hemoliz özellikleri ve gram boyama<br />
özellikleri incelenerek, Çizelge 1’de belirtilen kriterlere göre Pasteurella multocida<br />
türünün identifikasyonuna gidildi (11).<br />
Çizelge 1: Pasteurella multocida türünün identifikasyon kriterleri<br />
Biyokimyasal Özellikler P. multocida<br />
Gram boyama negatif<br />
Hemoliz negatif<br />
İndol pozitif<br />
Üreaz negatif<br />
Nitrat pozitif<br />
Oksidaz pozitif<br />
Mac Conkey üreme negatif<br />
Koyun kanlı agarda 24 – 48 saat inkübasyon sonucu üreyen kolonilerin hemoliz<br />
özellikleri incelendi. Gram negatif üreyen bakterilerin kolonileri; P. multocida ve diğer<br />
gram negatif bakterilerin identifikasyonu yönünden, kanlı agarda saf kültürleri hazırlanıp,<br />
Lassen’in üçlü besiyerine geçildi. Pasteurella spp. şüpheli koloniler, oksidaz, nitrat<br />
redüksiyonu, indol oluşumu, üreaz aktivitesi ve Mac Conkey agarda üreme durumlarına<br />
göre identifikasyona gidildi. Klasik yöntemler ile Pasteurella multocida olarak identifiye<br />
edilen bakteriler Vitek II cihazı gram negatif identifikasyon kiti ile bakıldı.<br />
İzole Edilen P. multocida Suşlarının Antibiyotiklere Duyarlılık Testi: P.<br />
multocida izolatlarının gecelik subkültürlerinden alınan koloniler 0,5 Mc Farland<br />
204
ulanıklığına eşit olacak şekilde serum fizyolojik içerisinde hazırlandı. Besi yeri olarak<br />
Müller-Hinton agar kullanıldı. Bakteri inokulumları steril plastik özelerle 0,0312 – 256<br />
mg/L antibiyotik içeren agar plaklarına ekildi. Her antibiyotik için antibiyotik içermeyen<br />
kontrol agar plağı hazırlandı. Plaklar 35 °C’de 24 saat inkube edildi. Minimum inhibitör<br />
konsantrasyon (MİK) gözle görülür üremenin olmadığı en düşük antibiyotik<br />
konsantrasyonu olarak tanımlandı. Antibiyotik duyarlılık sınırları NCCLS (32) M100-<br />
S13’e göre okundu. İzolatların %50’sini inhibe eden en düşük antibiyotik konsantrasyonu<br />
MİK50, %90’nını inhibe eden en düşük konsantrasyon ise MİK90 olarak tanımlandı.<br />
Kontrol suşu olarak standart P. multocida suşları kullanıldı.<br />
İzole Edilen P. multocida Suşlarının Kapsüler Özelliklerine Göre<br />
Serotiplendirilmesi: Standart Serotiplerden Antijen Hazırlanması, Standart Serotiplerden<br />
Hiperimmun Antiserum Hazırlanması, Saha Suşlarından Antijen Hazırlanması, Rapid slayt<br />
aglütinasyon (RSA) ve Agar Gel İmmundiffusion (AGID) teknikleri ile Saha Suşlarının<br />
Serotiplendirilmesi işlemleri OİE 2000’de tanımlanan metotlara göre yapıldı(33).<br />
4. BULGULAR VE TARTIŞMA<br />
4.1. Bulgular<br />
İzmir ve Aydın illerinden alınan 570 adet örneğin 28 (%4,9)’inden P. multocida<br />
izolasyon ve identifikasyonu yapıldı. İzmir ilinden alınan 350 örnekten 18 adet (% 5,14)<br />
ve Aydın ilinden alınan 220 örnekten 10 adet (% 4,54) P. multocida izolasyon ve<br />
identifikasyonu yapıldı.<br />
Yapılan çalışmada 28 adet saha suşunun 15 (% 53,6)’i tip B, 10 (% 35,7)’u tip A ve<br />
1 (% 3,5)’i de tip D olarak tespit edildi. İzolatlardan 2 (% 7,2)’si ise tiplendirilememiştir.<br />
Çalışmada, izole edilen 28 P. multocida suşlarının MİK değerleri tespit edildi.<br />
Uygulanan test sonucunda P. multocida suşlarının % 93 oranında flourphenicol’e , % 61<br />
oranında enrofloxacine’e, % 54 oranında oxytetracycline’e duyarlı olduğu bulundu. P.<br />
multocida suşlarının tümünün erythromycine ve sulphamethaxsazole – trimethoprim’e %<br />
82 oranlarında, gentamycine’e % 64 oranında ve amoxycilline - clavulanic acid’e ise % 61<br />
oranında dirençli olduğu tespit edilmiştir. Yapılan antibiyogramlar sonucunda<br />
oxytetracycline, amoxycilline - clavulanic acid, erythromycine ve Sulphamethaksazole –<br />
trimethoprim MİK 50 değerlerinin 4 mg/L olduğu görülmüştür. Bununla beraber<br />
erythromycine, gentamycine ve sulphamethaxsazole – trimethoprim’in MİK 90<br />
değerlerinin 16 mg/L olduğu tespit edilmiştir. flourphenicol’ün MİK 50 değerinin 0,25<br />
mg/L ve MİK 90 değerinin 0,5 mg/L olması önem arz etmektedir.<br />
Araştırmada kullanılan antibiyotiklerin MİK değerleri Çizelge 2’de<br />
gösterilmektedir.<br />
205
Çizelge 2: Araştırmada kullanılan antibiyotiklerin MİK değerleri ve duyarlılıkları<br />
Antibiyotik<br />
MİK mg/L<br />
Aralık MİK 50 MİK 90 Duyarlılık (%)<br />
Flourphenicol 0,0312 – 64 0,25 0,5 93<br />
Oxytetracycline 1 – 256 4 32 54<br />
Enrofloxacine 0,125 – 8 1 4 61<br />
Amoxycilline -<br />
Clavulanic Acid<br />
0,25 – 4 4 4 39<br />
Sulphamethaxsazole<br />
– Trimethoprim<br />
0,25 – 128 4 16 18<br />
Gentamycine 2 – 256 8 16 36<br />
Erythromycine 0,25 – 16 4 16 18<br />
4.2. Tartışma<br />
Sığırlarda görülen solunum sistemi hastalıkları tüm dünyada sığır yetiştiriciliğinde<br />
önemli kayıplara yol açmaktadır. Sığırların karşı karşıya kaldıkları çevre koşulları,<br />
beslenme şartları ve çeşitli stres faktörleri solunum sistemi hastalıklarının oluşmasında<br />
önemli rol oynamaktadır (17, 44).<br />
Sığır pnömonilerinin yayılışı genel olarak ülkeler ve bölgeler arasında farklılık<br />
göstermektedir. Bu farklılıklar coğrafi şartlara, <strong>hayvan</strong>ların yaşına, cinsiyetine, ırklarına,<br />
bireysel dirençlerine, beslenme durumuna ve bulundukları yerin hijyenik şartlarının<br />
farklılığına bağlıdır. Pnömoni oranını % 65,83’lere kadar bildiren araştırmacılar (23)<br />
olmakla birlikte, çok sayıda materyal kullanılarak yapılan çalışmalarda (2, 34, 35, 39) bu<br />
oranın % 5 ile 9,5 arasında değiştiği dikkat çekmektedir. Oranın yüksek (% 40) çıktığı<br />
çalışmada materyal sayısı genellikle düşük olup, araştırmalar sadece belirli sayıda <strong>hayvan</strong><br />
populasyonu üzereinde gerçekleştirilmiştir (10, 23, 41). Ayrıca bu sınırlı sayıdaki<br />
gruplarda, <strong>hayvan</strong>ların genel olarak sağlıklı olması veya bulaşıcı bir hastalık etkisi altında<br />
bulunması gibi nedenlerle de oran olduğundan daha düşük yada daha yüksek çıkabilir.<br />
Genel olarak pazarlama ve yetiştirmede kullanılan metotlar da hastalığın şiddetine katkıda<br />
bulunabilir ve <strong>hayvan</strong>ları hastalığa karşı duyarlı hale getirebilir. Yine pnömonilerin sıkça<br />
görüldüğü İngiltere, Kuzey Amerika, Kanada gibi ülkelerde iklimin hastalıkta önemli rol<br />
oynadığı ve özellikle pnömoni oranının yüksek oranda bulunduğu İngiltere gibi ılıman ve<br />
nemli iklime sahip ülkelerde ruminantların önemli bir problemi olarak kendini<br />
göstermektedir (8).<br />
Sığırlarda pnömoni oranının aylara ve mevsimlere göre dağılımını belirlemek<br />
amacıyla yapılan bir epidemiyolojik çalışmada pnömoni oranı yaz döneminde % 16,0,<br />
yağışlı aylarda % 21,7 ve kış döneminde de % 23,0 olarak tespit edilmiştir (29). Aynı<br />
çalışmada en yüksek oranın (% 27,7) Kasım ayında ve en düşük oranın (% 13,9) da<br />
Haziran ayında olduğu tespit edilmiş ve pnömoni oranının ortalama olarak % 20,1 olduğu<br />
bildirilmiştir. Ayrıca bu çalışma sığırlarda pnömoni oranının mevsimlere göre önemli<br />
ölçüde değişebileceğini ve kış aylarında daha yüksek bir oran ile seyrettiğini saptamıştır.<br />
Hazıroğlu ve ark (24) 1995 Mart ile 1996 Haziran ayları arasında pnömoni lezyonu<br />
görülen 100 adet buzağı üzerinde yürüttükleri bir çalışmada lezyonlu akciğerlerden<br />
42’sinde P. haemolytica, 8’inde P. multocida ve 10 adedinde de H. somnus bakteriyel<br />
etkenlerini, vakaların 7’sinde hem P. haemolytica hem de H. somnus’u, 2’sinde ise hem P.<br />
haemolytica hem de P. multocida’yı izole etmişlerdir. Diğer bir araştırmada pnömonili<br />
sığırların akciğerlerinden % 6 oranında P. multocida izole edildiği bildirilmiştir (26) Allan<br />
ve ark(4)’nın yapmış oldukları bir çalışmada % 15,8 P. multocida izole edildiği<br />
206
ildirilmektedir. Erzurum’da ise pnömonili sığır akciğerlerinden % 4,5 oranında P.<br />
multocida izole edilmiştir (15). Gündüz ve Erganiş Konya’da yaptıkları bir araştırmada P.<br />
multocida izolasyon oranının % 15,9 olduğunu tespit etmişlerdir (22). Elazığ’da yapılan<br />
diğer bir çalışmada Sığır akciğerlerinden bakteri izolasyonlarında % 6 oranında P.<br />
multocida izolasyonu yapılmıştır (28).<br />
Araştırmamızda İzmir ilinden alınan 350 örnekten 18 adet (% 5,14) ve Aydın<br />
ilinden alınan 220 örnekten 10 adet (% 4,54) P. multocida izolasyon ve identifikasyonu<br />
yapılmıştır. Toplam identifikasyon sayısı ise 570 örnekte 28 (% 4,9) olarak tespit<br />
edilmiştir. Bu oranlar Ülkemizin diğer bölgelerinde yapılan araştırmalar ile paralellik<br />
göstermektedir (24, 15, 28). Araştırma sonuçlarının Konya (22) bölgesinde yapılan<br />
araştırma ile paralellik göstermemesi ise Konya’daki iklim koşullarının özellikle P.<br />
multocida için Aydın ve İzmir illerindeki iklim koşullarına nazaran daha uygun<br />
olmasından kaynaklanabileceği düşünülmektedir.<br />
Batu ve Elverdi (6) yaptıkları araştırmada, Sakarya, Samsun, Çarşamba, Bafra ve<br />
Terme mezbahalarında kesilen sığır mandaların nasopharangeal boşluklarından aldıkları<br />
1106 swap örneğinde Pasteurella multocida serotiplerini incelemişlerdir. Araştırma<br />
sonuçlarına göre 1106 örnekten 28 (% 2,53) adet P. multocida identifikasyonu yapılmış ve<br />
bunlardan 24’ü yapılan AGID testi sonucunda serogrup B olarak tespit edilmiştir.<br />
Prudy ve ark (37) tarafından ABD’de yapılan bir araştırmada 50 adet P. multocida<br />
identifikasyonu yapılmış ve bunların 42 adedi serotip A olarak belirlenmiş, 8 adedi ise<br />
tiplendirilememiştir. Al-Humam ve ark (3) Suudi Arabisatan’da yaptıkları bir çalışmada<br />
400 adet örnek sığır akciğer swap örneğinden 10 adet P. multocida identifiye etmişler ve<br />
bununda 4 adedini tip A, 2 adedini tip C, 2 adedini tip E olarak tiplendirmişler diğer 2<br />
adedini ise tiplendirememişlerdir. De Rosa ve ark (14) ise sığır solunum yollarından 4 adet<br />
P. multocida identifiye etmişler ve bunların 3 adedini serotip A olarak tespit etmişler, bir<br />
adedini ise tiplendirememişlerdir.<br />
Aydın ve İzmir illerinde yapılan araştırmamızda toplam 28 adet P. multocida izolatı<br />
kullanılmış olup, bunlardan 15 (% 53,6) adedi serotip B, 10 (% 35,7) adedi serotip A ve bir<br />
(% 3,5) adedi de serotip D olarak tiplendirilmiştir. Suşlardan 2 (% 7,2)’si ise<br />
tiplendirilememiştir.<br />
De Rosa ve ark., (14) ABD’de yaptıkları bir çalışmada P. multocida izolatlarının 7<br />
çeşit antibiyotiğe (Ampicilline, Ceftiofur, Erythromiycine, Spectinomycine, Trimethoprimsulfamethoxazole<br />
ve Flourphenicol) karşı MIC değerlerini tespit etmişler ve<br />
spectinomycine haricindeki diğer antibiyotiklerde düşük MIC değerleri ile<br />
karşılaşmışlardır P. multocida izolatlarının Ceftiofur’a duyarlı olduğu bildirilmektedir.<br />
Biswas ve ark (7), Hemorajik septisemi ile ilgili Hindistan’da yaptıkları bir<br />
çalışmada sahadan izole ettikleri P. multocida izolatlarını sulphadiazin’e karşı dirençli<br />
bulmuşlardır. Çalışmada kullanılan diğer antibiyotikler ise mikroorganizmaya vermiş<br />
oldukları duyarlılık sırasına göre amikacin, gentamicine, ciprofloxacine, erytromycine,<br />
streptomycine, nitrofurantoin, oxytetracycline ve enrofloxacine olarak sıralanmaktadır.<br />
Wallmann (42), yapmış olduğu araştırmada çeşitli patojen bakterilerin antibiyotik<br />
direçliliklerini MIC değerleri yardımı ile tespit etmiştir. Araştırma sonuçlarına göre<br />
sığırlardan elde edilen P. multocida izolatları Nalidixic acid’e (% 10,6), Enrofloxacin’e (%<br />
1,5), Cefoperazon’a (% 3), Cefotaxim’e (% 6,8) ve Ceftiofur’a (% 1,5) oranında dirençli<br />
bulunmuştur. Wallmann bu araştırma sonucunda Almanya’da yaklaşık olarak 15 yıl kadar<br />
sonra Veteriner alanda Flouroqinolon ve cephalosporon’lara karşı patojen bakterilerin<br />
dirençlilik geliştirebileceği görüşünü savunmaktadır.<br />
Grobbel ve ark., (19) Sığır ve domuzlardan elde edilen P. multocida izolatları ile<br />
Veteriner fluoroquinolone’lar arasında MIC değerlerini hesaplayarak bir karşılaştırmada<br />
207
ulunmuşlar ve sonuç olarak Enrofloxacine ve onun bir metaboliti olan ciprofloxacin’in<br />
yüksek in vitro antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğunu ortaya koymuşlardır.<br />
Araştırmamızda 28 adet P. multocida suşunun % 93,0 oranında Flourphenicol’e,<br />
% 61,0 oranında Enrofloxacine’e, % 54,0 oranında oxytetracycline’e duyarlı olduğu<br />
bulundu. P. multocida suşlarının tümünün Erytromycine ve Sulphamethaxazole –<br />
trimethoprim’e % 82,0 oranlarında, gentamycine’e % 64,0 oranında ve amoxycilline<br />
clavulanic acid’e ise % 61,0 oranında dirençli olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen bu<br />
sonuçlar doğrultusunda P. multocida suşlarının Enrofloxacine ve Oxytetracycline’e direnç<br />
kazanmaya başladığı ve hatta yaklaşık % 45 – 50 arasında dirençli olduğu görülmektedir.<br />
Sonuç olarak Aydın ve İzmir illerinden toplanan 570 örneğin 28 (%4,9)’inden P.<br />
multocida izole ve identifiye edilmiştir. Bu 28 P. multocida suşunun 15’i serotip B, 10’u<br />
serotip A ve 1’i serotip D olarak tiplendirilmiştir. Elde edilen bu sonuçlar doğrultusunda<br />
sığır pnömonilerinde P. multocida suşlarının da önemli bir rol oynadığı bir kez daha<br />
doğrulanmıştır. Tespit edilen P. multocida serotip B’nin, diğer serotiplere göre daha<br />
yüksek oranda rastlanılmış olması diğer serotiplere göre daha yüksek patojenite kriterlerine<br />
sahip olabileceğini ispatlamaktadır. Ayrıca bu serotipin belirlenmesi halen uygulanmakta<br />
olan veya ileride hazırlanacak aşılara ciddi oranda katkı sağlayacaktır. Yapılan<br />
antibiyogramlar sonucunda ise P. multocida suşlarının fluoroquinolone grubunda bulunan<br />
antibiyotiklere (eritromycin, siprofloxacin vb.) karşı yoğun bir şekilde direnç kazandığı<br />
görülmektedir. Yeni bir etken madde olan flourphenicole ise veteriner sahada tedavide<br />
kullanılabilecek bir antibiyotik olarak karşımıza çıkmaktadır. Ancak bu antibiyotiğin de<br />
bilinçsiz bir şekilde kullanılması sonucunda P. multocida izolatlarının direnç geliştirmesi<br />
kaçınılmaz bir sonuç olacaktır. Bundan dolayı, sığır pnömonilerini tedavi etmeye<br />
çalışmaktansa bu hastalıktan korunmak için aşı <strong>araştırmaları</strong>na ağırlık verilmesi ve yeni<br />
kombine aşıların üretilip uygulanmasının ülkemiz ekonomisi açısından faydalı olacağı<br />
düşünülmektedir.<br />
ÖZET<br />
Aydın ve İzmir Bölgesindeki Sığırlardan Pasteurella multocida’nın İzolasyonu,<br />
Tiplendirilmesi ve Antibiyotiklere Duyarlılıkları<br />
Bu çalışmada, Pasteurella multocida izolasyonu amacıyla kullanılan toplam 570<br />
adet sığır intratracheal svabının 350 adedi İzmir ilinde, 220 adedi ise Aydın ilinde bulunan<br />
mezbahalardan temin edildi.<br />
Araştırmada kullanılan 570 adet örneğin 28 (%4,9)’inden P. multocida izolasyon ve<br />
identifikasyonu yapıldı. İzmir ilinden alınan 350 örnekten 18 adet (% 5,14) ve Aydın<br />
ilinden alınan 220 örnekten 10 adet (% 4,54) P. multocida izolasyon ve identifikasyonu<br />
yapılmıştır.<br />
Yapılan çalışmada 28 adet saha suşunun 15 (% 53,6) adedi tip B, 10 (% 35,7) adedi<br />
tip A ve 1 (% 3,5) adedi de tip D olarak tespit edildi. İzolatlardan 2 (% 7,2) adedi ise<br />
tiplendirilememiştir.<br />
P. multocida suşlarının % 93,0 flourphenicole’e, % 61,0 enrofloxacine’e, % 54,0<br />
oxytetracycline’e duyarlı olduğu bulundu. P. multocida suşlarının tümünün erytromycine<br />
ve sulphamethaxsazole – trimethoprim’e % 82,0, gentamycine’e % 64,0 ve amoxycilline<br />
clavulanic acid’e ise % 61,0 oranlarında dirençli olduğu tespit edilmiştir.<br />
Summary: The Isolatıon, Serotyping and Antimicrobial Susceptibility of Pasteurella<br />
multocida strains in cattle in the region of Aydın and İzmir<br />
208
In this study, a total of 570 intratracheal swabs were examined for the Pasteurella<br />
multocida isolation that were taken 350 of from İzmir region slaughterhouse and were<br />
taken 220 of from Aydın region slaughterhouse.<br />
P. multocida was identified from 28 (4,9%) of 570 intratracheal swabs that were<br />
examined in this study. Pasteurella multocida was identified from 18 (5,14%) of 350 in<br />
İzmir region and 10 (4,54) of 220 in Aydın region.<br />
In the study, a total of 28 field Pasteurella multocida strains were serotyped as ; 15<br />
(53,6 %) type B, 10 (35,7%) type A and 1 (3,5%) type D, respectively. Of 2 Pasteurella<br />
multocida strains were untypeable.<br />
The Pasteurella multocida strains were found to be susceptible to Flourphenicol<br />
(93,0 %), Enrofloxacine (61,0 %), Oxytetracycline (54,0 %) and were found to be resistant<br />
to Erythromycine (82,0 %), Sulphamethaxsazole-Trimethoprim (82,0 %), Gentamycine<br />
(64,0 %) and Amoxycilline-Clavulanic acid (61,0 %).<br />
LİTERATÜR LİSTESİ<br />
1. Akgül Y., Tanrıtanır P., İçen H. (1995); Bronkopnömonili buzağıların sağaltımında<br />
farklı Tilmicosin dozlarının etkisi. Y.Y.Ü. Sağ. Bil. Derg., 1, 12-20<br />
2. Alexander B.H., Mac Vean D.W., Rutter J.M. (1989); Risk factors for lower respiratory<br />
tract disease in a cohort of feedlot cattle. JAVMA. 195(2): 207-211<br />
3. Al-Humam N.A., Al-Dughaym A.M., Mohammed G.E., Housawi F.M., Gameel A.A.<br />
(2004); Study on the isolation and Pathogenicity of Pasteurella multocida Type A in calves<br />
in Suudi Arabia. Pakistan Journal of Biomedical Science 7(4): 460-463<br />
4. Allan E.M., Wiseman A., Gibbs H.A., Selman I.E. (1985); Pasteurella species isolated<br />
from the bovine respiratory tract and their antimicrobial sensitivity patterns. Vet Rec<br />
117:629 – 631<br />
5. Aslan V., Maden M., Hadimli H.H. (1998); Dana enzootik pnömonilerinin etiyolojisi ve<br />
Penisilin + Streptomisin kombinasyonu ile tedavisi. Bültendif, Sayı: 11, 4-7<br />
6. Batu A., Elverdi R. (1970); Türkiye’de sığır ve mandalardan izole edilen Pasteurella<br />
serotiplerinin tayini. Pendik Vet. Kont. ve Araşt. Enst. Derg. I, II: 50-60<br />
7. Biswas A., Shivachandra S.B., Saxena M.K., Kumar A.A., Singh V.P., Srivastava S.K.<br />
(2004); Moleculer variability among strains of Pasteurella multocida isolats from an<br />
outbreak of hemorraghic septicaemia in India. Vet Res Comm., 28(2004): 287 – 298<br />
8. Bowland S.L., Shewen P.E. (2000); Bovine respiratory disease: commercial vaccines<br />
currently available in Canada. Can Vet J. 41: 33-48<br />
9. Boyce J.D., Adler B. (2000); The Capsule is a virulence determinant in the pathogenesis<br />
of Pasteurella multocida M1404 (B:2) Infect and Immun. 68(6): 3463-3468<br />
10. Caldow G.L., Edwards S., Nixon P., Peters A.R. (1988); Assaciations between viral<br />
infection and respiratory disease in young beef bulls. Vet Record 122: 529-531<br />
11. Carter GR, De Alwis MCL (1989); Haemorrhagic septicaemia In “Pasteurella and<br />
Pasteurellosis”. Ed. by Adlam and JM Rutter, 131-160, Academic Press Inc. NewYork<br />
12. Catry B., Laevens H., Devriese L.A., Opsomer G., Kruif A. (2003); Antimicrobial<br />
resistance in livestock. J Vet Pharmacol Therap. 26, 81–93<br />
13. Chanter N., Rutter J.M. (1989); Pasteurellosis in pigs and the determinants of virulence<br />
of toxigenic P. multocida. In “Pasteurella and Pasteurellosis”. Ed. by Adlam and JM<br />
Rutter, 161-169, Academic Press Inc. NewYork<br />
14. De Rosa D.C., Mechor G.D., Staats J.J., Chengappa M.M., Shryock T.R. (2000);<br />
Comparison of Pasteurella spp. Simultaneously Isolated from Nasal and<br />
Transtracheal Swabs from Cattle with Clinical Signs of Bovine Respiratory Disease,<br />
Journal of Clinical Microbiology, January, p. 327-332, Vol. 38, No. 1<br />
15. Dinler U. (1998); Pnömonili sığır akciğerlerinden Pasteurella multocida’nın izolasyonu ve<br />
identifikasyonu. (Uzmanlık Tezi), Ankara.<br />
16. Dyer R.M. (1982); The bovine respiratory disease complex. A complex ineraction of host,<br />
environment and infectious factors. Compend Contain Educ. 4: S296-S304<br />
209
17. Frank G.H. (1986); The role of Pasteurella haemolytica in the bovine respiratory disease<br />
complex. Vet Med. 12: 841-846<br />
18. Gilmour N.J.L., Gilmour J.S. (1989); Pasteurellosis of sheep. In “Pasteurella and<br />
Pasteurellosis”. Ed. by Adlam and JM Rutter, 223-262, Academic Press Inc. NewYork<br />
19. Grobbel M., Lübke-Becker A., Wieler L.H., Froyman R., Friederichs S., Filios S.<br />
(2007); Comparative quantification of the in vitro activity of veterinary fluoroquinolones.<br />
Vet. Microb. xxx(2007): xxx-xxx, in press.<br />
20. Gruenau H. (1992); Experiences with Tilmicosin in treatment of enzootic<br />
broncopneumonia in farms with beef cattle. Pract. Tieraerztle, 10, 1-2<br />
21. Gül Y., Dabak M., Kalander H., Kızıl Ö., Issi M. (1999); Enzootik pnömonili dana ve<br />
kuzularda Amoksisilin ile tedavi denemeleri. Bültendif, Sayı: 12, 12-15<br />
22. Gündüz K., Erganiş O. (1998); Pnömonili sığır akciğerlerinden izole edilen Pasteurella<br />
haemolytica suşlarının biyotiplendirilmesi ve serotiplendirilmesi. Veterinarium 9(1): 11-19<br />
23. Haritani M., Nakazawa M., Hashimoto K., Narita M., Tagawa I., Nakagawa M.<br />
(1990); İmmunoperoxidase evaluation of the relationship between necrotic lesions and<br />
causative bacteria in lungs of calves with naturally acquired pneumonia. Am J Vet Res<br />
51(12): 1975-1979<br />
24. Hazıroğlu R., Erdeğer J., Gülbahar M.Y., Kul O. (1997); Association of Pasteurella<br />
haemolytica, Pasteurella multocida and Haemophilus somnus with pneumonia in calves.<br />
Dtsch Tierarztl Wschr. 104:125-164<br />
25. Highlander S.K. (2001) Molecular genetic analysis of virulence in Mannheima<br />
(Psteurella) haemolytica. Frontiers in Bioscience. 6: 1128-1150<br />
26. Houghton S.B., Gourlay R.N. (1984); Bacteria associated with calf pneumonia and their<br />
effect on gnobiotic calves. Res Vet Sci. 37:194-198<br />
27. Howard JL (1986); Current Veterinary Therapy 2. Food Animal Practice. W.B. Saunders<br />
Company, Philadelphia<br />
28. Kılıç A. (2003); Sığır akciğerlerinden bakeri izolasyonları ve izole Pasteurella’ların<br />
Polimeraz Zincir Reaksiyonu(PZR) ile Saptanması (Doktora Tezi) Elazığ.<br />
29. Maity B., Deb P. (1991); Seasonal variation in incidence of pnomonia in cattle. Indian J.<br />
of Animal Sci. 61(3): 261-262<br />
30. Mannıng P.J., Digiacoma R.F., Delong D. (1989); Pasteurellosis in laboratory animals.<br />
In “Pasteurella and Pasteurellosis”. Ed. by Adlam and JM Rutter, 263-302, Academic Press<br />
Inc. NewYork<br />
31. Mutter R., Mannheim W., Bisgaard M. (1989); Taxonomy of the group In “Pasteurella<br />
and Pasteurellosis” Ed by C Adlam and JM Rutter, 3 – 34, Academic Press Inc New York<br />
32. National Committee for Clinical Laboratory Standards (2003); Methods for dilution<br />
antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically - Sixth Edition:<br />
Approved Standard M7-A6. NCCLS PA, SA.2003<br />
33. Office International Des Epizooties (OIE) (2000); Haemorrhagic Septicemia Chapter<br />
Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. 4th Ed. OIE, Paris<br />
34. Özer H. (1985); Besi danalarında exudative pnömonilerin yayılışı. Elazığ bölg. Vet. Hek.<br />
Odası Dergisi 1(3): 63-70<br />
35. Özer H. (1987); Besi sığırlarında atipik interstitiel pnömonilerin yayılışı. Fırat Üniv. Sağl.<br />
Bil. Derg. 1(1-A):27-34<br />
36. Picavet T, Muylie E, Devriese L.A, Gerly J. (1991); Efficacy of Tilmicosin in treatment<br />
of pulmonary infections in calves. Vet. Rec., 125, 400-403<br />
37. Prudy W.C., Raleigh H.R., Collins K.J., Watts D.J., Straus C.D. (1996); Serotyping<br />
and enzyme characterization of Pasteurella haemolytica and Pasteurella multocida isolats<br />
recovered from pneumonic lungs of stressed feeder calves. Current Microb. Vol. 34 (1997),<br />
pp: 224-249<br />
38. Radostis O.M., Blood D.C., Gay C.C. (1994); Veterinary Medicine. A Textbook of<br />
Disease of Cattle, Sheep, Pigs, Goats and Horses. Bailliere, Tindall, London 590-603<br />
39. Rosequist R.B., Dobson A.W. (1974); Multiple viral infection in calves with acute bovine<br />
respiratory tract disease. Am J Vet Res 35(3): 363-365<br />
210
40. Seleim R.S. (2005); Review: Major Pathogenic Components of Pasteurella Multocida And<br />
Mannheimıa (Pasteurella) Haemolytica Isolated From Animal Origin.<br />
http://www.priory.com/vet/pasteurella.htm Erişim tarihi: 18.10.2006<br />
41. Thomas L.H, Swann R.G. (1973); Influence of colostrum on the incidence of calf<br />
pneumonia. Vet Record 92: 454-455<br />
42. Wallmann J. (2006); Monitoring of antimicrobial resistance in pathogenic bacteria from<br />
livestock animals. Int J of Medicinal Microb. 296(2006) S2: 81-86<br />
43. Whiteley L.O, Maheswaran S.K, Weiss D.J, Ames T.R, Kannan M.S. (1992);<br />
Pasteurella haemolytica A1 and bovine respiratory disease pathogenesis. J Vet. internal<br />
Med . 6(1): 11-12<br />
44. Yates W.D.G. (1982); A rewiev of infectious ovine rhinotracheitis, shipping fever<br />
pneumonia and viral-bacterial synergism in respiratory disease of cattle. Can J<br />
Comp Med. 46: 225-263<br />
ÖZGEÇMİŞ<br />
1973 yılında Aydın’da doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimlerini Aydın’da tamamladı.<br />
1990 yılında İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi’ni kazandı ve 1997 yılında mezun<br />
oldu. 1 yıl İstanbul’da küçük <strong>hayvan</strong> kliniğinde çalıştıktan sonra 1998 yılında Askerlik<br />
görevini tamamladı. 1999 yılında Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü<br />
Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans yapmaya hak<br />
kazandı ve Aynı yıl araştırma görevlisi olarak atandı. Araştırma görevlisi kadrosunda<br />
çalışmakta iken 1 yıl Amerika Birleşik Devletleri’nde dil eğitimine katıldı. Yüksek Lisans<br />
Programı sırasında Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’ne atandı ve 2002<br />
yılında Yüksek Lisansını tamamladı. Aynı yıl Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık<br />
Bilimleri Enstitüsü Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’nda Doktora yapmaya hak kazandı. Halen<br />
Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Veteriner Biyolojik Ürünler kontrol<br />
laboratuarında çalışmaktadır.<br />
Evli ve İngilizce bilmektedir.<br />
211
ÇUKUROVA YÖRESİNDE SUBKLİNİK MASTİTİSE NEDEN OLAN<br />
MİKROORGANİZMALARIN VE ANTİBİYOTİKLERE DUYARLILIKLARININ<br />
SAPTANMASI<br />
Nevin TURUT , Atilla YOLDAŞ,<br />
Yrd. Doç. Dr. Yaşar ERGÜN, Yrd. Doç. Dr. Gökhan DOĞRUER<br />
Adana Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
GİRİŞ<br />
Mastitislerden çok çeşitli bakteriyel etkenler izole ve identifiye edilmesine rağmen<br />
subklinik inek mastitislerinden sıklıkla; Staphylococ’lar, Streptococ’lar ve Coliform’lar<br />
izole ve identifiye edilmektedir. Yapılan çalışmalarda, süt ineklerinde mastitis olgularının<br />
% 7-65 oranında görüldüğü ve bu olguların da % 93-98’ini subklinik mastitislerin<br />
oluşturduğu bildirilmektedir. Sürüde anlık her bir klinik mastitis olayına karşılık 15-40<br />
subklinik mastitis olduğu bildirilmektedir. Subklinik mastitis memede % 10-15 oranında<br />
süt kaybına neden olur. Bu kayıp meme alveollerindeki kalıcı hasardan dolayı geri<br />
dönüşümsüzdür. Subklinik mastitisli <strong>hayvan</strong>lardan elde edilen sütlerdeki Somatik Hücre<br />
Sayısı (SHS) yüksek olduğundan tank sütünün SHS’sını da yükselterek çiftlikten elde<br />
edilen sütün kalitesini düşürmektedir. Subklinik mastitisli inekler sağım sistemi yoluyla<br />
diğer sağlıklı <strong>hayvan</strong>ları da enfekte ederek bir süre sonra sürü problemi oluşturmaktadır.<br />
Türkiye’de değişik yörelerde yapılan çalışmalarda farklı subklinik mastitis oranları<br />
bildirilmiş (%14.11-71.8) olmasına rağmen, Çukurova yöresinde süt ineklerinde subklinik<br />
mastitis yayılımını belirlemeye yönelik bir çalışma bulunmamaktadır.<br />
Bu araştırma projesinde;<br />
1-Çukurova yöresinde kooperatifleşmiş ve kooperatifleşmemiş işletmelerde subklinik inek<br />
mastitislerinin prevalansının belirlenmesi,<br />
2-Subklinik inek mastitislerine neden olan mikroorganizmaların saptanması,<br />
3-İzole ve identifiye edilecek olan mikroorganizmaların antibiyotiklere duyarlılıklarının<br />
belirlenmesi amaçlanmıştır.<br />
MATERYAL<br />
Süt Örnekleri: Çukurova Yöresi’nde 119’u Tarımsal Kalkınma Kooperatifleri bünyesinde<br />
yetiştirilen, 181’i de yörede güncel teknolojiyi kullanarak süt üretimi yapan işletmelerden<br />
olmak üzere toplam 300 sağmal inekten aseptik koşullarda alınan süt örnekleri çalışmanın<br />
materyalini oluşturmuştur.<br />
Örneklerin alımı sırasında ırk, yaş ve laktasyon sayısı gibi <strong>hayvan</strong>lara ait bilgiler ile<br />
yetiştiriciye ya da işletme sahibine ait farklı parametreler de kayıt edilmiştir. CMT sahada<br />
örnek alımından önce yapılmış fakat, CMT sonuçlarına bakılmaksızın tüm memelerden<br />
mikrobiyolojik örnekleme yapılmıştır.<br />
Alınan süt örnekleri buz kalıplarının bulunduğu termos içinde laboratuvara getirilmiş ve<br />
süt örneklerinin somatik hücre sayısı belirlendikten sonra 300.000 ve üzeri SHS’ye sahip<br />
süt örneklerinden ekimler yapılmıştır.<br />
METOT<br />
İzolasyon ve İdentifikasyon<br />
SHS 300.000 ve üzeri olan süt örneklerinden 0,1 ml Kanlı Agara (%7 oranında defibrine<br />
koyun kanı katılmış), MacConkey agar, Edwards Medium ve Saboraud Dextrose Agara<br />
ekimleri yapılmıştır.<br />
Edwards Medium, MacConkey Agar ve Kanlı Agara ekilen platelerden birisi 37 o C’de 1-4<br />
gün aerobik olarak,<br />
212
Kanlı Agara ekilen diğer süt örnekleri ise mikroaerofilik koşullarda 37 o C’de 1-4 gün<br />
inkübe edilmiştir. Saboraud Dextrose Agara ekilen süt örnekleri ise maya ve küf<br />
izolasyonu için 25 o C’de 5-7 gün inkübe edilmiştir.<br />
Saboraud Dextrose Agar dışında üreme görülen platelerden Gram boyama, oksidaz ve<br />
katalaz testi yapıldıktan sonra VITEK cihazı ile identifikasyon yapılmıştır.<br />
İzolasyon ve identifikasyonu yapılan bakterilerin 10 farklı antibiyotik ya da antibiyotik<br />
kombinasyonuna olan duyarlılıkları değerlendirilmiştir.<br />
SONUÇLAR<br />
Tablo. 1. SUBKLİNİK MASTİTİS PREVALANSI<br />
Örnekleme<br />
yapılan<br />
inek sayısı<br />
CMT+<br />
inek<br />
sayısı<br />
İŞLETMELER 181 153<br />
%84.5<br />
KOOPERATİFLER 119 85<br />
%71.4<br />
GENEL<br />
ORTALAMA<br />
300 238<br />
%79.3<br />
Subklinik<br />
enfekte<br />
inek<br />
sayısı<br />
101<br />
%55.8<br />
73<br />
%61.3<br />
174<br />
%58<br />
Örnekleme<br />
yapılan<br />
meme lobu<br />
sayısı<br />
CMT+<br />
meme<br />
lobu<br />
sayısı<br />
724 445<br />
%61,5<br />
476 229<br />
%48,1<br />
1200 674<br />
%56,2<br />
SHS<br />
300000’den<br />
fazla olan<br />
meme lobu<br />
sayısı<br />
506<br />
%69,9<br />
305<br />
%64,1<br />
811<br />
%67,6<br />
Tablo 2. İZOLE EDİLEN MİKROORGANİZMALAR<br />
Staphylococcus aureus 5<br />
Koagulaz + staphylococcuslar 3<br />
KNS’ler 120<br />
Streptococlar 18<br />
Mayalar 67<br />
Mantarlar 53<br />
Subklinik<br />
enfekte<br />
meme<br />
lobu<br />
sayısı<br />
176<br />
%24,3<br />
127<br />
%26,7<br />
303<br />
%25,3<br />
Diğer 48<br />
Çalışmada en fazla sayıda izole ve identifiye edilen mikroorganizmalar sırayla<br />
Candida lambica (55), Aspergillus spp. (53), Staphylococcus auricularis (33),<br />
Staphylococcus epidermidis (29), Staphylococcus scuiri (16), Staphylococcus simulans<br />
(14), Candida rugosa (10) ve Staphylococcus haemolyticus (10) olmuştur.<br />
TARTIŞMA ve ÖNERİLER<br />
Süt inekçiliği işletmelerinde subklinik mastitis önemli bir ekonomik kayıp<br />
nedenidir. Mastitis görülme sıklığı Türkiyede yapılan çalışmalarda farklı oranlarda<br />
belirlenmiştir. Şahin ve ark (1997), Kars yöresinde Simental ineklerde %15.78,<br />
Kuyucuoğlu ve Uçar (2001) Afyon ilinde %43.7, Bozkır (1985) Konya yöresinde %23,<br />
Ergün ve ark (2004) Hatay ilinde %71.8 ve Ergün ve ark (2000) Hatay ilinde % 48.6<br />
oranında subklinik mastitis bulduklarını bildirmektedirler. Araştırmada Çukurovada bu oranın %<br />
58 olduğu tespit edilmiştir. Ancak çalışmada bu oranın kooperatifler bünyesindeki işletmeler ve<br />
kooperatifler bünyesinde olmayan işletmeler arasında farklılık belirlenmiştir. Kooperatifler<br />
bünyesindeki işletmelerde daha fazla inek (%61.3) ve meme lobunun (%26.7) enfekte olduğu<br />
belirlenmiş, kooperatifler bünyesinde olmayan ve kooperatiflere göre sağım sistemleri daha iyi<br />
213
durumda olan işletmelerde ise bu oranın (enfekte inek :%55.8 ve enfekte meme lobu: %24.4) biraz<br />
daha aşağılarda olduğu belirlenmiştir. Özetle söylemek gerekirse çalışmanın yürütüldüğü Adana,<br />
Mersin, Hatay ve Osmaniye illerindeki her on inekten altısı ve her 4 meme lobundan birisi<br />
mikroorganizmalarla subklinik olarak enfekte edilmiş durumdadır. Yine çalışmanın yürütüldüğü<br />
illerdeki ineklerin her 4 meme lobundan 3 tanesinden elde edilen sütteki SHS 300.000 ve üzeri<br />
sayılardadır. Bunun tank sütüne ve tank sütünün hijyenik kalitesine etkisi başka bir çalışma ile<br />
ortaya konulmalıdır.<br />
Türkiyede yapılan çalışmalarda başta Stafilokok ve Streptokoklar olmak üzere subklinik<br />
mastitislerden çok çeşitli mikroorganizmalar izole ve identifiye edilmiştir (Tekeli ve ark 1985,<br />
Alaçam v ark. 1986, Şahin ve ark. 1997, Ergün ve ark 2000, Ergün ve ark 2004). Sunulan projede<br />
örneklenen 1200 meme lobundan SHS 300.000’den fazla olanlardan yapılan ekimlerden izole ve<br />
identifiye edilen mikroorganizmalar Tablo 2’de özet olarak sunulmuştur. Çalışmada maya ve<br />
mantarlar dikkat çekici sayıda izole edilmiştir. Bu durum işletmelerdeki sağım hijyeni eksikliği,<br />
bölgenin sıcak ve nemli oluşu ve çalışmada uygulanan çok yönlü izolasyon ve identifikasyon<br />
tekniklerine bağlanabilir. Araştırma sürecinde izole edilen 50 farklı türe ait mikroorganizma,<br />
mastitis etkeni olduğu bildirilen literatür verileri ile uyumludur. Ancak aspergillus türlerinden<br />
kaynaklanan inek mastitislerinin bu kadar yoğun olduğu bir çalışmaya rastlanmamış ve bu konunun<br />
ayrıca tartışılması ve değerlendirilmesi gereken bir konu olduğuna karar verilmiştir.<br />
Yaklaşık iki yıl boyunca yılın tüm mevsimlerine dağılan ve 4 ilde sürdürülen bu çalışmada gidilen<br />
tüm işletme ve kooperatiflerde sadece araştırma amaçlı örnekleme yapılmamış, ek olarak bir anket<br />
düzenlenmiş ve sağım sistemleri, sağım esnasında uygulanan prosedür, süt sağım sistemlerinin<br />
hijyenik ve teknik kalitesi ve yapılacak kontroller ile bunların temizliğinde kullanılacak solusyonlar<br />
hakkında da teknik bilgi aktarımı yapılmıştır. Gerek kooperatif yönetici ve üyeleri, gerekse işletme<br />
sahibi, çalışanları ve Veteriner Hekim ya da Veteriner Teknikerleri ile yapılan görüşmeler<br />
neticesinde aşağıda 8 madde halinde sıralanan önerilerin hem bölge hem de ülke süt sığırcılığının<br />
gelişmesine katkısı olacağı kanaatine varılmıştır.<br />
1. Öncelikle subklinik mastitisler hakkında klinisyen Veteriner Hekim’lerin Tarım Bakanlığının<br />
düzenleyeceği konu hakkında en az doktora derecesine sahip Veteriner Hekimlerce verilecek<br />
hizmet içi eğitim kursları ile ayrıntılı olarak bilgilendirilmesi gerekmektedir.<br />
2. Veteriner Hekimler Odası’nın özellikle avrupa birliğine uyum çerçevesinde düzenlediği<br />
sertifika <strong>program</strong>ları örneğinde olduğu gibi “Mastitis kontrol <strong>program</strong>ları sertifika <strong>program</strong>ı”<br />
düzenlemelidir.<br />
3. Yetiştirici ve kooperatiflerin yöneticileri sağım hijyeni ve mastitis kontrol <strong>program</strong>ları<br />
hakkında eğitime tabi tutulmalıdır.<br />
4. Acilen, Tarım Bakanlığının koordinasyonu ile hazırlanacak bir eğitim paketi ile “sağımcı<br />
eğitimi sertifika <strong>program</strong>ı” düzenlenerek kooperatif üyeleri ve çiftliklerde çalışan sağımcıların<br />
sertifika <strong>program</strong>ına katılmış ve başarılı olmuş kişilerden oluşması zorunluluk haline getirilmelidir.<br />
5. Tarım Bakanlığınca kooperatiflere kredi karşılığı verilen süt sığırcılığını geliştirmeye yönelik<br />
projeden düve alan kooperatif üyelerinin sağım hijyeni konusunda bir günlük bir seminer almaları<br />
zorunlu hale getirilmelidir.<br />
6. Kooperatif üyeleri ile süt sığırcılığı işletmesi çalışanlarının gıda üretim yerlerinde çalışanlar<br />
gibi periyodik portör muayenelerinden geçirilmesi konusu ilgili bilim insanlarınca tartışılmalıdır.<br />
7. Kooperatif ya da birlik üyesi olmayan işletmelerin işlemek üzere süt toplayan firmalara süt<br />
vermesi engellenmeli ve desteklemelerden muaf tutulmalıdır.<br />
8. Kooperatif ve işletme yöneticileri eğitim <strong>program</strong>ına inek yataklıkları ve bunun subklinik<br />
mastitislere etkisi konusu ayrıca eklenmelidir.<br />
214
ÖNSÖZ<br />
TAVUKLARDA KRONİK SOLUNUM SİSTEMİ HASTALIĞININ (CRD)<br />
TEŞHİSİNDE PCR TEKNİĞİNİN KULLANILMASI<br />
Kamile KESLER,<br />
Doç. Dr. Leyla GÜLER,<br />
Dr. Gülşen ORHAN<br />
Konya Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
Mycoplasma gallisepticum (MG ) un neden olduğu kanatlıların Kronik Solunum<br />
Sistemi Hastalığı (CRD ) genel olarak solunum sistemi bozuklukları ile seyreden vücut<br />
ağırlığında düşme, gelişme geriliği, yumurta veriminde düşme ve yumurta kalitesinde<br />
bozulmalara neden olan bir hastalıktır. Her yaştaki kanatlılar hastalığa duyarlı olmakla<br />
beraber özellikle büyüme çağındaki <strong>hayvan</strong>lar enfeksiyona daha çok yakalanmaktadırlar.<br />
Mycoplasma gallisepticumun izolasyon ve identifikasyonunda kullanılan yöntemler<br />
genellikle yavaş ve zahmetlidir. Etkeni izole etmek birkaç hafta sürebilir.<br />
Mycoplasmaların saha mataryallerinden izolasyonu zordur. Çünkü izolasyonda normal<br />
florada bulunan non-patojenik Mycoplasmalarda izolasyonu güçleştiren faktörden biridir.<br />
MG nun izolasyon ve identifikasyonundaki güçlükler nedeni ile enfeksiyonun teşhisinde<br />
serolojik testler rutin olarak daha fazla kullanılmaktadır. Ancak bu test çeşitli nedenlerden<br />
dolayı hatalı pozitif sonuçlar vermektedir.<br />
Hastalığın teşhisinde son yıllarda geliştirilen PCR (Polimerase Chain Reaction)<br />
tekniği spesifik, duyarlı ve hızlı bir teknik olarak kullanılmaktadır. PCR tekniği,<br />
özellikle Mycoplasma gibi izolasyonu güç ve zaman alan mikroorganizmaların tesbitinde<br />
kolaylık sağlamaktadır. Mycoplasmaların izolasyonunda diğer bakterilerle kontaminasyon<br />
önemli bir problem olup çabuk üreyen bu bakteriler izolasyonu engellemektedir. PCR,<br />
oldukça yoğun kontamine örneklerde bile Mycoplasmaların tesbitini sağlamaktadır.<br />
Bu çalışmada Mycoplasma enfeksiyonlarının teşhis yöntemlerinden etken<br />
izolasyonu, çabuk lam aglutinasyon testi ve PCR testleri karşılaştırıldı.<br />
1-GİRİŞ<br />
MG enfeksiyonu ve enfeksiyonun kontrolü kanatlı endüstrisinde ekonomik etkileri<br />
bakımından önemli olup enfeksiyonun çabuk teşhisinin endüstriye büyük katkısı olacaktır.<br />
Ülkemiz kanatlı yetiştiriciliği için problem olan bu hastalıkla mücadele çalışmaları<br />
sürdürülmektedir. Kuluçkahanelerde kabukaltı ölümler, damızlık işletmelerde ise yumurta<br />
yolu ile civcivlere bulaşması sonucu oluşan hastalığın meydana getirdiği ekonomik<br />
kayıplar hastalığın önemini daha da artırmaktadır. Yapılan çalışmalarda MG<br />
enfeksiyonlarına bağlı yumurta verim düşüklüğü % 10-20, embriyo ve civciv mortalitesi %<br />
5-10, canlı ağırlık ve yem dönüşüm oranındaki kayıp ise %10-20 dir.<br />
Tarım ve Köyişleri Bakanlığı tarafından çıkarılan damızlık işletmeler ve<br />
kuluçkahanelerin sağlık yönetmeliğinde bu hastalıktan ari olmaları gerekmektedir.Bu<br />
nedenle hastalığın doğru teşhisi önem arzetmektedir. Bu yönetmelikte PCR testi de<br />
bakteriyoloji gibi teyit testi olarak kabul edilmiştir.<br />
Çiftliklerde rutin kontrol proğramlarında PCR kullanılması , antibiyotiklerle sürekli<br />
koruma yerine bulaşma anında hastalığa müdahale edilip oluşacak ekonomik kayıplar<br />
önlenmiş olacaktır.<br />
Tavuklarda önemli solunum yolu enfeksiyonu olan CRD nin teşhisinde kullanılan<br />
etken izolasyonu uzun sürmekte, izolasyon çeşitli nedenlerden dolayı güç olmakta ve<br />
215
serolojik testlerde pek çok sebepten dolayı hatalı sonuçlar vermektedir. Ayrıca aşılı<br />
sürülerde serolojik teşhisin mümkün olmamaktadır. Bu çalışmada hastalığın teşhisinde<br />
kullanılan etken izolasyonu, çabuk lam aglutinasyon testi yerine rutinde PCR tekniğinin<br />
kullanabilirliğinin sağlanması amaçlanmıştır.<br />
2-ÖZET<br />
Tavuklarda kronik solunum yolu hastalığına (CRD) neden olan Mycoplasma<br />
gallisepticum (MG) yumurta ile bulaşması nedeniyle özellikle damızlık işletmeler için<br />
büyük önem taşımakta ve ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bu çalışmada M.<br />
gallisepticum enfeksiyonunun teşhisinde bakteri izolasyonu, çabuk serum aglutinasyon<br />
testi (RSA) ve PCR metotlarının kullanımı karşılaştırıldı.<br />
Çalışmada 15 işletmeden alınan 375 kan serumu örneği RSA testi ile MG<br />
antikorları yönünden test edildi ve 13 (%86.6) işletmeden alınan serumu örneklerinde<br />
%12-100 arasında pozitiflik tespit edilirken 2 işletmeden alınan kan serumları ise negatif<br />
bulundu. Aynı işletmelerden alınan 292 svab örneği MG izolasyonu için test edildi ve 3<br />
işletmeye ait 3 (%1.0) svab örneğinden bakteri izole edildi; 292 svabın kültür<br />
buyyonlarından yapılan PCR testinde ise 7 işletmeye ait 9 (%3.08) örnekte MG spesifik<br />
DNA tespit edildi<br />
Canlı tavuklardan alınan 73 tracheal svab örneğinden doğrudan yapılan PCR<br />
testinde 2 işletmeye ait 2 örnekte MG DNA’sı pozitif bulundu. Bunlardan birinde seroloji<br />
ve bakteri isolasyonu negatif olmasına rağmen PCR pozitif bulundu.<br />
İşletmelerin çoğu serolojik olarak pozitif bulunurken izolasyon ve PCR ile etken<br />
tespit oranının düşük olması bu işletmelerde geçirilen bir enfeksiyona işaret etmektedir.<br />
Sonuç olarak CRD enfeksiyonunun kesin teşhisi için serolojik testlerin tek başına yeterli<br />
olmadığı etken tespitinin gerekli olduğu, ancak bunun uzun zaman alması ve yaygın<br />
kontaminasyonlar nedeniyle güç olması nedeniyle daha kolay, çabuk ve spesifik sonuç<br />
veren PCR testinin rutin teşhislerde uygun bir alternatif olarak kullanılabileceği kanaatine<br />
varıldı.<br />
Anahtar kelimeler: Tavuk, Mycoplasma gallisepticum, İzolasyon, RSA, PCR<br />
3-Summary: The Use of Polymerase Chain Reaction (PCR) for the Diagnosis of<br />
Chronic Respiratory Disease (CRD) in Chickens<br />
Mycoplasma gallisepticum (MG), the etiyological agent of chronic respiratory<br />
disease of chickens, is of real concern to breeders due to vertical transmission and causes<br />
significant economic losses to poultry industry. In this study fort he diagnosis of<br />
Mycoplasma gallisepticum infection culture, serology (RSA) and PCR methods were<br />
compared.<br />
The serum samples from 375 chickens taken in 15 flocks were tested for the<br />
detection of MG antibodies by rapid serum agglutination (RSA) test and in 13 (86.6%) of<br />
flocks between 12 to 100 % positivity were detected in serum samples. In 2 flocks RSA<br />
test was negative in all serum samples. Two hundred ninety-two swab samples from 15<br />
flocks were tested for M. gallisepticum isolation. M. gallisepticum was isolated from 3<br />
(1.0%) of 292 swab samples belong to 3 flocks. In 292 culture broths tested by PCR and 9<br />
(3.0%) samples taken from 7 flocks was found positive for MG specific DNA.<br />
Among 73 tracheal swabs of live chickens tested by PCR directly 2 samples belong<br />
to two flocks of were found positive. In one of these flocks both serology and isolation was<br />
negative.<br />
Because serology was positive in most of flocks while the rate of isolation and PCR<br />
was low, the results indicate that active infection is over (chronic infection) in these flocks.<br />
216
As a result, it was concluded that for the definite diagnosis of CRD, serological tests are<br />
not sufficient alone and detection of microorganism is necessary. Because isolation and<br />
identification procedures of MG are time consuming and difficult due to common<br />
contaminations, PCR assay which is easy, rapid and specific can be useful alternative for<br />
the routine diagnoses.<br />
Key words: Chicken, Mycoplasma gallisepticum, Isolation, RSA, PCR<br />
4-LİTERATÜR ÖZETİ<br />
Kronik solunum sistemi hastalığı (CRD) ülkemizde kanatlı hastalıkları arasında<br />
önemli bir yere sahiptir. Büyük kapasiteli işletmelerin ve parent stok yetiştiren modern<br />
damızlık işletmelerin sayısının giderek artması üzerine hastalığın kanatlı yetiştiriciliğinde<br />
neden olduğu ekonomik kayıplar daha da artmaktadır (1,32).<br />
Hastalık etkeni Mycoplasma gallicepticum, gram negatif, hareketsiz, sporsuz,<br />
kapsülsüzdür. Hücre duvarından yoksun olan bu mikroorganizma fakültatif anaerobtur.<br />
MG’u üretmek için kompleks zenginleştirilmiş besiyerine gerek vardır. Jordan (12), kanatlı<br />
mikoplazmalarının üremesi ve izolasyonunun temelde 2 unsura dayandığını bildirmiştir.<br />
Bunlar; konakçının organ ve dokularındaki belirtileri, mikoplazma üremesi için gerekli<br />
olan besin maddelerinin varlığı. Tüm vasatlar temel olarak %10-15 at, domuz veya kanatlı<br />
serumu ile zenginleştirilip, maya faktörleri, glukoz, arginin ve bakteriyel inhibitörler katılır<br />
(11,14,19). Türkaslan ve ark. (29) MG izolasyonu için Muhammed agar ve broth, Modifiye<br />
Hayflick, Adler broth, FM4 agar ve broth , PPLO agar ve broth besiyerlerinin ilk<br />
izolasyon için uygun olduğunu bildirmişlerdir.<br />
Kanatlılarda mikoplazmanın bulaşmasında infekte tavuk ve hindilerle olan direk<br />
temas sonucunda oluşan horizantal bulaşma, damızlıklardan geçen vertikal bulaşma<br />
önemlidir (15). Buna rağmen çevrede M. gallisepticum bulunan yerlerdeki insanların ve<br />
ekipmanların vasıtasıyla oluşan indirekt bulaşma da olabilmektedir (3,21)). Mikoplazma<br />
kanatlılar arasında çok hızlı bir şekilde yayılabilir. Sürünün hastalık belirtilerini<br />
göstermesinden bir ya da iki hafta sonra sürünün tamamı pozitif olur. MG enfeksiyonunun<br />
şiddeti ve yoğunluğu değişkendir. Soğuk aylarda hastalık şiddetli ve uzun olur ve genç<br />
<strong>hayvan</strong>ları daha fazla etkiler (3).<br />
Mycoplasma gallisepticum ile doğal enfeksiyonda en karakteristik bulgular;<br />
tracheal sesler, burun akıntısı ve öksürüktür (4). MG bulguları sürüde yavaş gelişebilir.<br />
Solunum sistemi bulguları haftalarca kalabilir. İlk bulgu burun akıntısıdır, bunu gözlerin<br />
akıntısı takip eder. Hayvanlarda, öksürük, tıksırık ve traheal sesler tespit edilir..<br />
Broylerlerde bulguların ortaya çıkışı şiddetlidir, fazla oranda canlı ağırlık kaybı ve yem<br />
tüketiminde azalma ile kendini gösterir. Yumurtacı tavuklarda yem tüketiminde azalma ve<br />
yumurta veriminde düşüş görülür. Hindilerde ilk lezyonlar hava keseleri ve<br />
akciğerlerdedir. Broylerlerde, çevresel şartlar ve kümes koşulları iyi değil, stres ve<br />
sekonder enfeksiyonlar devreye girmişse ölüm oranları yüksek olur. Yumurtacı tavuklarda<br />
ölüm oranları genelde düşüktür, <strong>hayvan</strong>larda halsizlik vardır. Hindilerde yüksek ölüm<br />
oranları görülebilir (3).<br />
Mikoplazma enfeksiyonlarında oluşan kronik bağışıklığı sebebi henüz yeteri kadar<br />
anlaşılamamıştır. M. gallisepticum ‘a karşı oluşan humoral ve hücresel antikor cevabı<br />
incelendiğinde hücreye bağımlı bağışıklık önemli bulunmuştur. M. gallisepticum’ dan tam<br />
anlamıyla kurtulmak için hem hücresel hem de humoral bağışıklığa ihtiyaç olduğu tespit<br />
edilmiştir (9). CRD’nin doğal şartlarda çoğunlukla diğer enfeksiyonlarla komplike olduğu<br />
bildirilmektedir (19).<br />
MG enfeksiyonunun teşhisinde bakteriyolojik izolasyon ve identifikasyon, serolojik<br />
testler(RSA, HI, ELISA) kullanılmaktadır. Mikoplazma enfeksiyonlarında; kesin teşhis<br />
217
için kültür metodu kullanılmasına rağmen çok uzun zaman gerektirmesi kültür sırasında<br />
diğer mikroorganizmalar tarafından kontamine olması, antibiyotik kullanımı ve kültürün<br />
tam oluşabilmesi için mikroorganizmaların canlı olması gerekliliği bu metodun<br />
dezavantajları olarak görülmüştür. Pozitif sonuçlar genelde 4–7 gün arasında alınmasına<br />
rağmen kesin negatif sonuçlar için 30 günlük bir sürenin geçmesi gerekmektedir (<br />
26,29,30).<br />
Mycoplasmaların teşhisinde izolasyon ve identifikasyon zor olduğu için serolojik<br />
testler (RSA, HI, ELISA) daha çok kullanılmaktadır (22,25). Bunlardan en çok kullanılan<br />
çabuk serum aglutinasyon testi (RSA) özellikle inaktif aşılarla aşılama sonucu nonspesifik<br />
reaksiyonlar vermektedir (22). Çabuk lam aglutinasyon testi Ig M antikorlarını tespit<br />
etmekte, fakat IgM’ ler 7. günden sonra oluşmaktadır. Bu test hızlı.kolay ve ekonomiktir,<br />
fakat antijene bağlı olumsuzluklar sıktır. MS ile ortak epitopları bulunmaktadır ve donmuş<br />
serumlarda istenmeyen pozitiflikler oluşmaktadır. HI testiyle Ig G antikorları tespit edilir.<br />
Ancak 2-4 hafta sonra bu testle bakılabilir. Bu test SPA testine göre daha spesifik fakat<br />
daha az hassastır. Tüm bu testlerin yanında ticari olarak kullanılabilen ELISA kitleri<br />
vardır. ELISA testi ile de Ig G ‘ler tespit edilmekte ve çabuk sonuç verdiği için tercih<br />
edilmektedir. Bu test kitleri enfeksiyon sonrası oluşan pozitif serumları HI testinin tespit<br />
ettiği sürede tespit eder. Ticari kitlerin kalitesi iyi olmasına rağmen bazen yanlış<br />
pozitiflikler görülebilir Suşlar çabuk şekil değiştirdiği ve diğer enfeksiyonlarla işbirliği<br />
geliştirebildiği için ELISA testinde de hatalar oluşmaktadır (15).<br />
Bütün bunların sonucunda bazı veteriner diagnostik laboratuarları mycoplasmaların<br />
karekterizasyonu için moleküler metotları (PCR) kullanmaktadırlar (14,22,28). Polimeraz<br />
zincir reaksiyonu (PCR) tekniği hem genetik materyalin çoğaltılması, hem de ortaya<br />
konması amaçlanmaktadır. PCR’nin temelini hedef DNA’nın spesifik deoksinükleotid<br />
primerleri ve ısıya dayanıklı DNA polimeraz enzimi yardımıyla invitro koşullarda<br />
çoğaltılması oluşturmaktadır. Sonrada işaretli problar yardımıyla 1-2 gün içinde teşhis<br />
etmek mümkün olmaktadır. (2,24,27.28). Diğer teslere göre daha hızlı (30 dak.–5 saat )<br />
güvenilir, ekonomok ve çabuk örnek işleyebilecek variasyonlara (PCR-ELISA, Real Time-<br />
PCR) sahiptir (15).<br />
Son yıllarda hem bakteriyel hem de viral patojenlerin ve genlerin tespit edildiği<br />
multiplex PCR amplifikasyon teknikleri kullanılmaya başlanmıştır (31).<br />
Canlı Mycoplasma gallisepticum F-suşu ticari yumurtacılarda yumurta<br />
randımanındaki düşüşle oluşan ekonomik kaybı engellemek için şu anda aşı olarak<br />
kullanılmaktadır. Aşı olarak kullanılmasına rağmen bu suş tamamıyla apatojen değildir ve<br />
MG ‘den ari olan hindi ve tavuk sürülerine yayılabilir. Aşı suşundan ya da saha suşundan<br />
oluşan hastalık konvasiyonel serolojik veya izolasyon ve identifikasyon metodlarıyla tespit<br />
edilemez. Bunu tespit etmenin en spesifik ve hassas yolarından biri PCR’dır (24).<br />
Sensivitesi yüksek olan Sodyum dodecyl sulfate-polyacrylamide gel<br />
electrophoresis (SDS-PAGE) veya restriction fragment lenght polymorphism (RFLP )<br />
metotlarıyla örneklerin DNA’sının protein bantlarının direk karşılaştırmasıyla M<br />
gallisepticum suşları birbirinden ayırt edilebilmektedir. Bu metotlar özellikle M<br />
gallisepticum aşı suşlarının identifikasyonunda ve epidemiyolojik araştırmalarda<br />
kullanılmaktadır (13). Fan ve ark (8), AP-PCR (arbitrarily primed polymerase chain<br />
reaction) metoduyla M. gallisepticum saha izolatları ile suşlar arasındaki antijenik farklılığı<br />
tesbit etmişler. Bu metodun populasyonların gen haritasının çıkarılmasında, filojenik<br />
çalışmalarda genotip identifikasyonlarında kullanılabileceğini bildirmişlerdir.<br />
MG enfeksiyonu ve kontrolü kanatlı endüstrisinde ekonomik etkileri bakımından<br />
önemli olup enfeksiyonun çabuk teşhisinin endüstriye büyük yararı olacaktır. İlaç<br />
masraflarının arttığı günümüzde hastalığın kesin teşhisi yapılmadan gereksiz yere ilaç<br />
kullanılmasına sık olarak rastlanmaktadır. Bu çalışmada Mycoplasma enfeksiyonlarının<br />
218
teşhisinde PCR metodu kullanılarak hastalığın kısa sürede teşhisi ve enfeksiyon sonucu<br />
oluşan yumurta veriminde azalma ve et kalitesinde düşme gibi ekonomik kayıpların<br />
önlenmesi, kuluçka ve damızlık kontrollerinde kullanılması, hastalık vakalarında kısa<br />
sürede tanı konularak gereksiz ilaç kullanımının önlenmesi ve PCR tekniğini rutine<br />
yerleştirmek amaçlanmıştır.<br />
5-MATERYAL ve METOT:<br />
5.1. Materyal:<br />
5.1.1. Organ örnekleri: Toplam 15 işletmeden alınan 73 adet canlı tavukların trachea,<br />
hava kesesi ve akciğerlerinden alınan 292 adet svab örnekleri izolasyon ve PCR için<br />
kullanıldı.<br />
5.1.2. Kan serumu: Aynı işletmelerden toplam 375 kan serumu örneği RSA testi için<br />
alındı.<br />
5.1.3. RSA test antijeni: İntervet firmasından sağlanan MG boyalı test antijeni kullanıldı.<br />
5.1.4. PCR test: Direkt svab örnekleri ve kültür buyyonları DNA analizi için kullanıldı.<br />
5.1.5. Besiyeri: Etkenin izolasyonu amacıyla Modified Hayflick Medium katı ve sıvı<br />
besiyerleri kullanıldı (5).<br />
5.1.6. Standart MG suşu: MG S6 suşu Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü’nden temin edildi.<br />
5.2. METOT<br />
5.2.1. İzolasyon Çalışmaları: Hayvanların organlarından (trachea, hava kesesi,<br />
akciğer) steril svablarla alınan materyaller selektif sıvı ve katı besiyerine ekimleri<br />
yapıldı. Katı besiyerleri nemli ve %5-10 CO2 bulunan ortama konularak 37 o C’de inkube<br />
edildi. Katı besiyerinde mycoplasma kolonilerinin görünümü, sıvı besiyerinde de renk<br />
değişimi bakımından hergün kontrol edilerek renk değişimi görülen sıvı besiyerinden katı<br />
besiyerine pasaj yapıldı. Bu şekilde 3 kez pasaj yapıldıktan sonra üreme görülmeyen<br />
materyaller negatif olarak değerlendirildi.<br />
Kısa sürede renk değişimi görülen aşırı bulanık tüpler dilusyon yöntemine rağmen<br />
saflaştırılamadığı için kontamine kabul edilerek atıldı. L-formlarını ayırmak için<br />
penisilinsiz katı besiyerinde 3 pasaj yapıldıktan sonra ortası düğmeli koloni görünümünün<br />
değişmemesi sonucu mycoplasma kolonisi olarak kabul edildi ( 5 ).<br />
5.2.2. İdentifikasyon Çalışmaları: Üreyen koloniler digitonin’e duyarlılık testi,<br />
glikoz fermentasyonu, arginin hidrolizi, tetrazolium redüksiyonu, film ve spot oluşumu,<br />
üreme inhibisyon testleri ile identifiye edildiler (29).<br />
5.2.3. Çabuk Serum Aglutinasyon (RSA) Testi: Temiz bir fayans üzerinde bir<br />
damla şüpheli serum ile MG RSA test antijeni karıştırılarak yaklaşık 2cm çapında yayıp<br />
ve rotasyon hareketi yaptırılarak 2 dk içerisinde oluşan reaksiyon izlendi (7).<br />
5.2.4. DNA İzolasyonu: DNA izolasyonu amacıyla svab örnekleri içerisinde 1 ml<br />
PCR-grade PBS bulunan tüplere alındı, çalkalayıcıda iyice karıştırıldıktan sonra svablar<br />
atıldı. Svab sıvıları ve sıvı kültür besiyerleri 1.5 ml Eppendorf tüpler içerisine alındı.<br />
Süspansiyon 14 000 g de 4 o C de 30 dak. santrifüj edildi. Üst sıvı dikkatlice alınarak atıldı<br />
ve pellet 25 μl ultra saf su ile süspanse edildi. Tüpler 10 dak. kaynatıldıktan sonra 10 dak.<br />
buz üzerinde bekletildi. Daha sonra 14 000 g de 5 dak. santrifüj edilerek, DNA’nın<br />
bulunduğu üst sıvı alındı (17).<br />
5.2.5. PCR Testi: Test 50 μl final konsantrasyonda gerçekleştirildi. Reaksiyon<br />
karışımı 10хBuffer (Promega), 2 mM MgCl2, her bir deoxynucleoside triphosphate<br />
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)’tan 200 μM, her bir primerden 0.2 μM, 1.25 U Taq<br />
219
polymerase (Promega) ve 5 μl template içermektedir. MJ Research Thermal Cycler da<br />
94 o C’ de 30 san., 55 o C’ de 30 san. ve 72 o C’ de 60 san. den oluşan 25 devir uygulandı.<br />
Örneklerin analizi için 7 μl PCR ürünü % 1.5 agarose jel içinde elektroforeze tabi tutularak<br />
ethidium bromide (Sigma) ile boyandı, UV transilluminatörde incelendi ve fotoğrafları<br />
çekildi. Oluşan bandların büyüklükleri standart 100 bp DNA marker (Promega) ile<br />
karşılaştırılarak değerlendirildi (17). Pozitif kontrol olarak Pendik Veteriner Kontrol ve<br />
Araştırma Enstitüsünden sağlanan M. gallisepticum S6 suşu kullanıldı. Pozitif kontrol<br />
olarak kullanılan S6 suşu 185 bp bant oluşturdu. Çalışılan örnekler buna göre<br />
değerlendirildi.<br />
Primerler:<br />
MG-14F: 5’-GAG-CTA-ATC-TGT-AAA-GTT-GGT-C-3’<br />
MG-13R: 5’-GCT-TCC-TTG-CGG-TTA-GCA-AC-3’<br />
6-BULGULAR<br />
Bu araştırmada bakteri izolasyon ve identifikasyonu, PCR ve serolojik çalışmalar<br />
için 15 işletmeden örnekler alındı. Bu işletmelerden toplam 73 adet canlı tavuklardan<br />
bakteri izolasyonu için 292 svab, aynı işletmelerden serolojik çalışma içinde 375 adet kan<br />
serumu örneği alındı. PCR testi için direkt tracheal svab (73 svab ) örnekleri alınarak saf<br />
su içinde saklandı. Bakteri kültürü için canlı tracheal svab, nekropsiden sonrada trachea<br />
açılarak trachea mukozasından, hava kesesi ve akciğerlerden 292 svab örnekleri alınarak<br />
Modifiye Hayflick Mycoplasma sıvı ve katı besiyerlerine ekimler yapıldı. Besiyerinde<br />
üreyen düğme tarzındaki koloniler biyokimyasal testler sonucu M.gallisepticum olarak<br />
identifiye edildiler. 15 işletmenin bakteri identifikasyon çalışmaları tamamlanarak<br />
işletmelerin 3 (%20) ünde M.gallisepticum tespit edildi. Diğer işletmelerden alınan<br />
örneklerden 12 işletmede (% 80) bakteri izolasyonu yapılamadı. Alınan svab örneklerine<br />
göre değerlendirildiğinde %1.03 (3/292) ünde identifikasyon yapıldı.<br />
Aynı işletmelerden alınan 375 kan serumu örneğinin çabuk lam aglutinasyon testi<br />
sonucu işletmelerden 2’ sinde incelenen serumların tümü negatif, 2 işletmede tümü pozitif,<br />
diğer 11 işletmelerde ise % 12- 80 oranlarında pozitiflik tespit edildi. Test sonucunda<br />
toplam serumların 153’ü ( % 40.8 ) serolojik olarak pozitif, 222 ( %59.2 ) si ise negatif<br />
bulundu.<br />
PCR için canlı tavukların tracheasından alınan 73 adet svab örnekleri ve sıvı kültür<br />
besiyerleri (292) kullanıldı. Direkt tracheadan alınan svab örneklerinin 2 ( %2.33 ) sinde<br />
PCR ile MG tespit edildi. Sıvı besiyerinden yapılan PCR testi sonunda ise 7 (%46.66)<br />
işletmede ve 9 (%3.08) tavukta MG spesifik DNA tespit edilmiştir.Bu işletmelerin birinde<br />
(6 nolu ) seroloji ve bakteri izolasyonu negatif olmasına rağmen PCR pozitif bulundu.<br />
Sıvı kültürlerinden yapılan PCR sonucunda tespit edilen pozitif örneklerin 1 (%<br />
0.34)’i akciğer svabı, 1 (% 0.34)’i hava kesesinden alınan svab, diğer 5 (% 2.39 )’i ise<br />
nekropsiden sonra alınan trachea örnekleridir.<br />
220
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
Resim 1. PCR sonuçlarının agaroz jelde görüntülenmesi: M- 100 bp DNA ladder<br />
1-Pozitif kontrol MG S6 suşu (185 bp bant)<br />
2- Negatif kontrol<br />
3-4-5-6-7-8- negatif örnekler. 9-MG pozitif örnek<br />
Tablo 1. M.gallisepticum’un organlardan tespit edilme oranları<br />
Örnek alınan Bakteri<br />
PCR<br />
PCR<br />
organlar identifikasyonu<br />
direkt svab<br />
kültür buyyon<br />
Örnek Pozitif oranı Örnek Pozitif oranı Örnek Pozitif oranı<br />
sayısı<br />
sayısı<br />
sayısı<br />
Canlı trachea 73 1 73 2 (% 2.73) 73 2 ( % 2.73 )<br />
Ölü trachea 73 1 - - 73 5 (% 6.84 )<br />
Akciğer 73 - - - 73 1 ( % 1.36 )<br />
Hava kesesi 73 1 - - 73 1 ( % 1.36 )<br />
Tablo 2. İşletmelerden alınan tavukların serolojik, kültür ve PCR sonuçlarının genel görünüşü<br />
İşletme no Kan serumu<br />
örnek sayısı<br />
500 bp<br />
200 bp<br />
185 bp<br />
Kan serumu<br />
RSA testi<br />
Bakteri identifikasyonu<br />
( 292 svab)<br />
Pozitif Negatif Toplam incelenen<br />
tavuk sayısı<br />
Tespit<br />
edlilen<br />
PCR<br />
(73 direkt<br />
svab)<br />
PCR<br />
(292 kültür<br />
buyyonu)<br />
1 25 8 17 5<br />
2 25 7 18 5<br />
3 25 3 22 3 + + (Tr) + (HK)<br />
4 25 4 21 5<br />
5 25 - 25 5<br />
6 25 - 25 5 + (Tr)<br />
7 25 5 20 5<br />
8 25 7 18 5<br />
9 25 4 21 5<br />
10 25 10 15 5 + (Akc)<br />
11 25 25 - 5 + + + (Tr)<br />
12 25 25 - 5 + + (Tr)<br />
13 25 15 10 5 + + (Tr)<br />
14 25 7 18 5<br />
15 25 20 5 5 + + (Tr)<br />
Toplam 375 153 222 73 3 2 9<br />
7-TARTIŞMA VE SONUÇ<br />
M. gallisepticum (MG)’ un neden olduğu kanatlıların Kronik Solunum Sistemi<br />
Hastalığı (CRD) genel olarak solunum sistemi bozuklukları ile seyreder. Ülkemizde büyük<br />
kapasiteli işletmelerin ve parent stok yetiştiren damızlık işletmelerinin sayısının giderek<br />
221
artması hastalığın kanatlı yetiştiriciliğinde neden olduğu ekonomik kayıplar işletmeler için<br />
daha da önem kazanmıştır. Hastalıktan ölümler nadir olmasına rağmen broylerlerde karkas<br />
ağırlığında düşme, yumurtacılarda yumurta verim düşüklüğü ile ekonomik kayıplara<br />
neden olan bir hastalıktır (1,32). CRD indikatör bir hastalıktır. Tek başına önemli bir klinik<br />
ve patolojik belirti oluşturmazken , sters faktörleri, ND ve IB virularıyla doğal enfeksiyon<br />
veya bunların canlı aşıları , E. Coli kompleks olaylarda klinik belirtilerin ortaya çıkışı ve<br />
hastalığın şiddeti artmaktadır (32).<br />
Bu çalışmada CRD şüpheli kanatlılardan bakteri izolasyonu ve identifikasyonu,<br />
PCR ve kan serumlarından MG’e özgül antikorların tespiti için RSA testi yapıldı. Bakteri<br />
izolasyonu için Modifiye Hayflick mycoplasma katı ve sıvı besiyerleri kullanıldı.<br />
Türkaslan ve ark. (29) MG izolasyonu için Muhammed agar ve broth, Modifiye Hayflick,<br />
Adler broth, FM4 agar ve broth , PPLO agar ve broth besiyerlerinin ilk izolasyon için<br />
uygun olduğunu bildirmişlerdir.<br />
Güler (10) Konya bölgesinde yaptığı çalışmada CRD şüpheli 40 işletmenin 22<br />
sinde başta E. coli olmak üzere diğer enfeksiyonlarında mevcut olduğunu tesbit etmiştir.<br />
40 işletmenin 12 (%30) sinde değişik organlardan alınan svab örneklerinden MG izole<br />
etmiştir.<br />
Çalışmada bir işletmede MG yönünden serolojik olarak negatif olmasına rağmen<br />
traceal svab örneğinden PCR ile MG spesifik DNA’ sı tespit edildi. Levisohn ve ark. (18)<br />
da serolojik olarak negatif olmasına rağmen tracheal svablarda MG’un varlığını DNA<br />
probe ve kültür yöntemleriyle göstermişlerdir.<br />
Ülgen (30), MG’un tracheadan %8.3, akciğerden %0.7, hava keselerinden %3<br />
oranlarında izole edildiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada 3 <strong>hayvan</strong>dan izole edilen MG<br />
suşları 2 tracheadan, 1 tanesi hava kesesinden, PCR ile MG 1 hava kesesi, 1 akciğer ve 7<br />
tracheadan tespit edilmiştir.<br />
PCR tekniğinin, kültür ve serolojik testlere göre spesifite ve sensivitesinin daha<br />
yüksek olduğu, serolojik testlerde olduğu gibi kros reaksiyonlara rastlanmadığı birçok<br />
çalışma ile tesbit edilmiştir (6,20,23 ). Lutrell ve ark. (20) konjunktivisli 31 housefinch ve<br />
5 goldfinch sürülerinde MG tesbit etmek için yaptığı çalışmada RSA testiyle %91, PCR<br />
metoduyla %95 ‘inde pozitif bulurken, kültür metodu ile de %24’ünde bakteriyi izole<br />
etmişlerdir.<br />
Bu çalışmada örnek alınan işletmelerin RSA testiyle (13 işletme) %86.66 , PCR<br />
metoduyla (7 işletme) %53.33 ‘ünde pozitif bulunurken, kültür metodu ile (3 işletme) %<br />
20’sinde bakteri izole edilmiştir. Serolojik metodun bakteriyolojik metotdan daha sensitif<br />
ama PCR metodunun her ikisinden daha spesifite ve sensivitesinin yüksek olduğu<br />
görülmüştür.<br />
Salisch ve arkadaşlarının (2) yaptığı; MG ve MS ‘nın kültürünü ve DNA probe<br />
tabanlı PCR ile teşhisini kapsayan çalışmada; MG şüpheli 10 kümeste yaptıkları<br />
incelemelerde sürülerin 2 si hariç hepsinde serolojik olarak seropozitif sonuç elde<br />
etmişlerdir. Yine bu sürülerden alınan toplam 294 svab örneğinden 41 tanesi MG<br />
yönünden yapılan kültürlerde pozitif, 45 tanesi ise MGAV8/31 prob testinde MG<br />
yönünden pozitif sonuç vermiştir.<br />
PCR metodunda kullanılan tracheal svab örneklerinin alınma şekillerinin de önemli<br />
olduğu , direk canlı tavuklardan alınan svablardan M.gallisepticum tesbit edilemezken,<br />
otopsi yapılarak tracheası açılıp , trachea mukazasına sürülerek alınan svabların<br />
hepsinden M. gallisepticum izole edildiği bildirilmiştir (6). Bu çalışmada da PCR da tespit<br />
edilen MG’ların çoğunluğu nekropsiden sonra tracheadan alınan svab örneklerinden tespit<br />
edilmiştir. İşletmelerden alınan serum örneklerinde RSA pozitif olmasına rağmen hem<br />
kültür hem de PCR ile negatif bulundu. Bunun serolojik olarak yanlış pozitif olabileceği<br />
veya bu işletmelerde antibiyotik kullanılmış olabileceğini düşündürmektedir.<br />
222
M. gallisepticum enfeksiyonlarını MG-F suşu ile aşılı sürülerden ayırt etmek<br />
amacıyla MGF-PCR geliştirilmiş ve basit numune alma metotları ile çok az bir<br />
mikroorganizma ile ayırt edici teşhis yapılabilmektedir (24). PCR tekniği ile ağır bakteriyel<br />
kontaminasyonların olduğu sürülerde bile etken tesbit edilebilmekte ve ayrıca<br />
enfeksiyonun en erken zamanda teşhisi (1 gün) mümkün olmaktadır (22).<br />
Ülkemizde kanatlı yetiştiriciliği için problem olan bu hastalıkla mücadele çalışması<br />
sürdürülmektedir. Bakanlığımızın ‘’Damızlık ve Kuluçkahane Sağlık Yönetmeliği’’nde<br />
(16) damızlıklardan bu hastalığın tümüyle eradike edilmesi amaçlanmıştır. Son yıllarda<br />
damızlık kontrollerinde hızlı ve kesin sonuç verdiği için PCR metodunun teyit testi olarak<br />
kullanılabileceği belirtilmiştir.<br />
Kanatlı endüstrisinde ekonomik önemi bakımından hastalığın çabuk teşhisinin<br />
endüstriye katkısı büyük olacaktır. Bu nedenle kanatlı hastalıklarının çabuk ve hızlı bir<br />
şekilde tespit edilmesi, serolojik olarak hatalı pozitifler sonucu gereksiz yere ilaç<br />
kullanımının önlenmesi amacıyla moleküler teşhis metotlarının rutinde kullanılması sektör<br />
için büyük kazanç olacaktır. MG için aşı kullanılmaya başlanması ile serolojik olarakta<br />
hastalığın tespit edilmesi zorlaşacak, tespit edilen seropozitifliğin aşıdan mı yoksa<br />
enfeksiyondan mı kaynaklandığının tespiti için moleküler metotların kullanılması zorunlu<br />
hale gelecektir. Bu çalışma ile kanatlıların MG enfeksiyonunun teşhisinde PCR yöntemi<br />
laboratuara yerleştirilmiş ve rutin olarak uygulanır hale gelmiştir.<br />
8-LİTERATÜR LİSTESİ<br />
1- Arda, M.,Mimbay, A.,Aydın, N., Akay, Ö, İzgür, M. (1990) Kanatlı Hayvan Hastalıkları Pfizer.<br />
2-Arda, M. Biyoteknoloji. Kükem Derneği Bilimsel Yayınları.<br />
3- Bokhari S. A. Mycoplasma gallisepticum. University of California www.ag.state.co.us<br />
4-Branton, S. L., Lott, B. D., Austin, F. W., Pharr, G. T. (1997) Effect of drinking water containing<br />
ammonium chloride or sodium bicarbonate on Mycoplasma gallisepticum isolation in<br />
experimentally infected broiler chickens. Avian Dis., 41:930-934.<br />
5- Carter G.R. (1990) Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology.<br />
6- Çarlı, K.T. and Eyigor,A. (2003) Real Time PCR for detection of Mycoplasma gallisepticum.<br />
Avian Dis. 47:712-717.<br />
7- Erdağ, O., Türkaslan, J. (1988) Kanatlı mycoplasmalarının laboratuvar teşhis yöntemleri. Pendik<br />
Hay. Hast. Mer. Arş. Ens. Derg.19, 85-97.<br />
8- Fan, H.H., Kleven, S.H. and Jackwood, N.W. ( 1995) Application of polimerase chain reaction<br />
with arbitrary primers to strains identification of Mycoplasma gallisepticum.Avian Dis., 39:729-<br />
735.<br />
9- Gaunson J. E., Philip C J., Whithear K. G., Browning G. F. (2000) Lymphocytic infiltration in<br />
the chicken trachea in response to Mycoplasma gallisepticum infection. Microbiology, 146, 1223-<br />
1229.<br />
10- Güler L.(1992) Konya bölgesindeki kümes <strong>hayvan</strong>larında serolojik yoklamalarla müsbet<br />
bulunan CRD vakalarından etken izolasyon çalışmaları. Uzmanlık tezi Tarım ve Köyişleri<br />
Bakanlığı Konya.<br />
11- İzgür, M. (1983) Kanatlılarda mycoplasma enfeksiyonları. Kanatlı <strong>hayvan</strong>ların infeksiyon<br />
hastalıkları ve laboratuvar teşhis yöntemleri. Pendik Vet. Kont. Arş.Enst.Yayın No:7, 65-71.<br />
12- Jordan, F.T.W. (1983) Recovery and identification of avian mycoplasmas.In ‘’ Metods in<br />
Mycoplasmology’’ Ed, Tully,J.G., Razin S. Vol II, Diagnostic Mycoplasmology, , Academic Pres,<br />
69-79.<br />
13- Khan, M.I., B.C. Kirkpatrick and R. Yamamoto.(1987) Mycoplasma gallisepticum strain<br />
variations detected by sodyum dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.Avian<br />
Dis.,31:315-320.<br />
14- Kleven, S:H. (2000) Avian Mycoplasmosis (M. gallisepticum) In: OIE manual of standarts for<br />
diagnostic tests and vaccine. Forth Ed. 666-678.<br />
223
15- Kleven, S.H.Mycoplasmosis (1998) In: A laboratory manual fort the isolatıon and<br />
identification of avian pathogens. Fourth Ed. , Ed:Swayne, D:E: American Association of Avian<br />
Pathologists Pennsylvanian, USA, 74-80.<br />
16- Kuluçkahane ve Damızlık İşletmelerin Sağlık Kontrol Yönetmenliği (2007) Tarım ve<br />
Köyişleri Bakanlığı Ankara.<br />
17- Lauerman L.H. (1998). Nucleic acid amplification assays for diagnosis of animal diseases.<br />
American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 39–66.<br />
18- Levisohn,S., Hyman, H., Perelman,D., and Razin, S. (1989) The use of a specific DNA probe<br />
for detection of Mycoplasma gallisepticum in field outbreaks. Avian Pathol. 535-541.<br />
19-Ley,D.H.and Yoder, H.W.( 1997) Mycoplasma gallisepticum iinfection In:Diseases of Poultry<br />
Ed: Calnek B.W. Iowa State Univercity press Ames, Iowa, USA 19-208.<br />
20- Lutrell MP, Fischer JR, Stallknecht DE, Kleven SH.( 1996) Field investigation of Mycoplasma<br />
gallisepticum in house finches (Carpodacus mexicanus) from Maryland and Georgia. Avian Dis.<br />
40:335-341.<br />
21- Marois C, Oufour G. F, Kempf I. (2000) Detection of Mycoplasma synoviae in poultry<br />
envoirment samples by culture and polymerase chain reaction. Veterinary microbiology 73 , 311-<br />
22- Moalic.P.Y. (2002) İmproving mycoplasmosisi control using PCR tecnology World poultry 7<br />
(18 ) 38-39.<br />
23-Moscoso,H. Thayer, S.G. and Kleven SH. Optimization and Application of PCR for The<br />
Detection Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae. Department of Avian Medicine,<br />
College of Veterinary Medicine.<br />
24- Nascimento,E.R,Yamamoto.R and Khan .M.I (1993) Mycoplasma gallicepticum F– vaccine<br />
straine – specific polimerase chain reaction . Avian Dis 37 :203-211.<br />
25- Opitz.HM., Daplessis,JB., Cyr,MJ. (1983) Indirect micro-enzyme-linked immunosorbent assay<br />
for the detection of antibodies to Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae. Avian<br />
Dis.27(3), 776-786.<br />
26- Pang Yaoshan, Wang Han, Girshick Theodore, Xie Zhixun ve Khan Mazhar I. (2002)<br />
Development and Application of a Multiplex Polymerase Chain Reaction for Avian Respiratory<br />
Agents. Avian Diseases 46:691-699.<br />
27-Salisch H., Hinz K-H., Graack H-D. & Ryll M. (1998) A comparison of a commercial PCRbased<br />
test yo culture methods for detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma<br />
synoviae in concurrently infected chickens. Avian Pathology 27, 142-14.<br />
28- Slavik.M.F ., Wang R.F and Cao W.W (1993) Development and evaluation of the polimerase<br />
chain reaction methot for diagnosis of mycoplasma gallicepticum enfection in chickens<br />
Mol.Cel.probes 7:459-463.<br />
29-Türkaslan,J., Salihoğlu,H. (1989) Çeşitli besiyerleri kullanılarak Mycoplasma gallisepticum’un<br />
bakteriyolojik yöntemlerle izolasyon ve identifikasyonu Pendik Hay. Hast. Mer. Araşt. Enst. Derg.<br />
20(2) 53-59.<br />
30-Ülgen,M (1991) Kanatlıların Kronik Solunum Yolu enfeksiyonu üzerinde karşılaştırılmalı<br />
bakteriyolojik ve serolojik araştırmalar doktora tezi U.Ü. Sağlık Bilimleri Enst. Bursa.<br />
31- Wang Han, Fadl A. A., Khan M. I. (1997) Multiplex PCR for avian pathogenic mycoplasmas.<br />
Molecular and cellular probes 11, 211-216.<br />
32-Yoder, H.W.JR.( 1979) Serolgic response of chickens vaccinated with inactivated preparations<br />
of mycoplasma gallisepticum. Avian Dis.23(2), 493,506.<br />
224
TAVUKLARDA ORNİTHOBACTERİUM RHİNOTRACHEALE İLE<br />
OLUŞTURULAN DENEYSEL ENFEKSİYONLARDA ETKENİN KÜLTÜR; PCR<br />
İLE TESPİTİ VE BİYOKİMYASAL PARAMETRELERDEKİ<br />
DEĞİŞİKLİKLERİN SAPTANMASI<br />
Dr. Ayşe KILIÇ, Dr. Fulya BENZER, Doç. Dr. Necati TİMURKAAN<br />
Doç. Dr. Seval YILMAZ, Doç. Dr. Hasan Basri ERTAŞ<br />
Elazığ Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
1. ÖNSÖZ<br />
Solunun sistemi hastalıkları kanatlı endüstrisinde sık karşılaşılan infeksiyonlardan<br />
olup, önemli sorun olmaya devam etmektedir. İklim ve bakım koşulları gibi enfeksiyöz<br />
olmayan faktörler ile birlikte; bakteriyel, mikotik, viral ve paraziter etkenler solunum<br />
sistemi enfeksiyonlarının gelişmesine neden olmaktadırlar.<br />
Ornithobacterium rhinotrachele (ORT) tavuk ve hindilerde solunum sistemi<br />
hastalıklarına, büyümenin yavaşlamasına ve mortaliteye neden olan ve yakın zamanda<br />
isimlendirilen bir bakteridir. Tavuk ve hindilerde ORT enfeksiyonu, ünilateral veya<br />
bilateral pnömoni, plöritis, ve hava kesesi yangısı ile karakterize olur. Hastalığa bağlı<br />
şiddetli lezyonlar öncelikle yaşlı <strong>hayvan</strong>larda, özellikle de damızlıklarda görülür. Damızlık<br />
<strong>hayvan</strong>ların hastalığa yakalanması ile ekonomik kayıplar önemli boyutlara çıkabilir.<br />
Bu projede tavuklarda ORT ile oluşturulan deneysel enfeksiyonda etkenin kültür<br />
ve PZR yöntemleriyle saptanması, infeksiyon sırasında oluşan patolojik değişimlerin<br />
incelenmesi, enfeksiyon sırasında oluşan hasarın lipid peroksidasyonu (LPO), nitrik oksit<br />
(NO) ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ve katalaz (KAT) aktiviteleri üzerine etkisinin<br />
araştırılması amaçlanmıştır.<br />
Projenin finansal desteği Tarım ve Köyişleri bakanlığı tarafından sağlanmış olup,<br />
çalışma Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji, Patoloji, Biyokimya<br />
Anabilim Dalları ile ortak yürütülmüştür.<br />
2. ÖZ<br />
Bu çalışma kanatlıların solunum sisteminde ORT’nin direkt patojen rolünü tespit<br />
etmek ve infeksiyonun teşhisi için yararlı olabilecek teknikleri kullanmak amacıyla yapıldı.<br />
ORT B3263/91 (serotype A) suşu toplam14 günlük 30 tavuğa aerosol olarak verildi, diğer<br />
30 tavuk ise negatif kontrol olarak kullanıldı. ORT inokulumu ile enfekte edilmiş<br />
<strong>hayvan</strong>larda: klinik, makroskobik ve mikroskobik bulgular incelendi.<br />
Makroskobik olarak <strong>hayvan</strong>larda 5 ile 9. günler arasında akciğerlerde genellikle<br />
unilateral olmak üzere pneumonia tablosu, hava keselerinde kalınlaşma ve opak görünüm<br />
nedeniyle belirgin bir görünüm gözlendi. Mikroskobik olarak, akciğerlerde, sekunder ve<br />
tersiyer bronşlar ile hava veziküllerinin epitelinde nekroz ya da hiperplazi, hava<br />
keselerinde epiteliyal dejenerasyon ile yer yer hiperplazi, propriada ödem, konjesyon ve<br />
kanamalar gözlemlendi. İnfeksiyon oluşturulmayan kontrol grubunda makroskobik ve<br />
mikroskobik bulgular gözlenmedi.<br />
Trake, akciğer, hava keseleri, kalp ve perikard bakteriyolojik ve histolojik muayene<br />
için toplanıldı. Deneysel olarak ORT verilen tavuklardan trake ve akciğerden etken<br />
izolasyonu ve identifikasyonu kültür ve PZR metodu ile yapıldı. Gözlenen makroskobik<br />
ve mikroskobik bulgular saha infeksiyonlarında gözlenen bulgularla paralellik göstermiştir.<br />
Serum MDA ve NO düzeyleri kontrol grubuna göre enfeksiyon grubunda artış<br />
gösterirken, eritrosit KAT ve GSH-Px aktiviteleri kontrol grubuna göre düşüş göstermiştir.<br />
225
Trake dokusunda MDA ve NO düzeyleri kontrole göre enfeksiyon grubunda artmış, KAT<br />
ve GSH-Px aktiviteleri ise değişmemiştir. Akciğer dokusunda MDA düzeyi ile, KAT<br />
aktivitesi artmış, NO düzeyi kontrol grubuna göre düşmüş, GSH-Px aktivitesi ise<br />
istatistiksel olarak bir değişim göstermemiştir.<br />
3. ABSTRACT<br />
The aim of study were to determine direct pathogen role of Ornithobacterium<br />
rhinotracheale (ORT) in respiratory tract of birds and to use the technics which can be<br />
useful for infection diagnosis. ORT strain B3263/91 (serotype A) was given to 30 14-daychickens<br />
as aerosol and other 30 chickens were used as negative control. It was<br />
investigated clinical, macroscopic and microscopic sings at animals infected by ORT<br />
inoculation.<br />
It was observed unilateral pneumonia table in lungs between 5 th and 9 th days as<br />
macroscopic, thickening in the air-sacs and opac appereance. It was observed necrose or<br />
hyperplasi at seconder and tertier bronches in lungs and epithelial air of vesicules.<br />
However, it was also observed epithelial degeneration in air-sac, rarely hyperplasie, odema<br />
in propria, kongestion and petechi. It was not observed macroscopic and microscopic signs<br />
at control group.<br />
Trachea, lung, air-sacs, heart and pericard were taken for bacteriological,<br />
histological examination. Bacteria isolation and identifacition in trachea and lung at<br />
chickens with ORT was done by culture and PCR method.<br />
There was a similarity between observed macroscopic and microscopic signs and<br />
observed at natural infection signs.<br />
While serum MDA and NO levels were increasing at control group than infection<br />
group, erytrocyte CAT and GSH-Px activities were decreasing in accordance with control<br />
group. Levels of MDA and NO in trachea tissue increased at infection group more than<br />
control group; but levels of CAT and GSH-Px did not change. MDA level and CAT<br />
activity increased in lung tissue, however level of NO decreased more than the control<br />
group. GSH-Px activity had no change statistically.<br />
Key Words: Ornithobacterium rhinotracheale, chicken, culture, PCR, lipid<br />
peroxidation, antioxidan.<br />
4.GİRİŞ<br />
Solunum sistemi hastalıkları, kanatlı endüstrisinde sık karşılaşılan infeksiyonlardan<br />
olup, önemli sorun olmaya devam etmektedirler. İklim ve bakım koşulları gibi infeksiyöz<br />
olmayanfaktörler ile birlikte; bakteriyel, mikotik, viral ve paraziter etkenler solunum<br />
sistemi infeksiyonlarının gelişmesine neden olmaktadır.<br />
Kanatlı <strong>hayvan</strong>ların ORT infeksiyonu ilk olarak, 1991 yılında Du Preez tarafından<br />
Güney Afrika’da 28 günlük broilerlerde gözlenmiştir. Du Preez, infekte broilerlerde aksırık<br />
ile başlayan, % 1-2’lik mortalite ile seyreden günlük büyümede yavaşlama ve gıda<br />
tüketiminde düşüş gibi klinik belirtilerle devam eden ve tipik nekropsi bulgusu olarak tek<br />
taraflı pnömoni, hava keselerinde özelikle de abdominal hava keselerinde köpüklü,<br />
kazeifiye bir eksudat görülmesi ile karakterize yeni bir solunum sistemi enfeksiyonu tespit<br />
etmiştir. Aynı yıl içinde dünyanın değişik bölgelerinde tavuk ve hindilerde de benzer klinik<br />
belirtilerle seyreden hastalık olgularının saptandığı ve tüm olgularda infekte <strong>hayvan</strong>ların<br />
akciğer ve hava keselerinden pleomorfik gram negatif çomak (Pleomorphic Gram Negative<br />
Rod; PGNR) şekilli bakterilerin izole edildiği bildirilmiştir (Hinz ve ark., 1994; Hafez,<br />
1996).<br />
ORT, infekte tavuk ve hindilerden ilk kez izole edildiği dönemlerde araştırıcılar<br />
tarafından tam olarak identifiye edilememiş ve PGNR, Pasteurella benzeri ya da Kingella<br />
226
enzeri bakteri olarak isimlendirilmiş, daha sonra da Bisgaard tarafından Taxon 28 olarak<br />
tanımlanan grup içerisinde sınıflandırılmıştır. Çeşitli ülkelerden temin edilen izolatların<br />
genetik taksonomik yöntemlerle incelenmesi sonucunda etken Vandamme ve ark. (1994)<br />
tarafından rRNA süperfamilya- 5 içeisinde yer alan ORT olarak isimlendirilmiştir.<br />
ORT başta tavuk ve hindiler olmak üzere keklik, sülün, güvercin, karga, bıldırcın,<br />
ördek, hint sülünü, devekuşu, kaz ve beç tavuğu gibi birçok kanatlı <strong>hayvan</strong> türünde<br />
infeksiyon oluşturabilmekte ve Amerika Birleşik Devletleri, Hollanda, Almanya, Güney<br />
Afrika, Fransa, İtalya, İsrail, Yugoslavya, Macaristan, Kanada, Avustralya ve Türkiye gibi<br />
birçok ülkede infekte <strong>hayvan</strong>lardan izole edilebilmektedir.<br />
ORT genellikle 3- 4 haftalık broylerlerde %2-10’luk ölüm oranı ile görülmektedir.<br />
Broyler damızlıklar ise infeksiyona en duyarlı kanatlılar olup infeksiyon daha çok 24- 52.<br />
haftalarda seyretmektedir. Hindilerde daha çok 4 haftalıktan büyüklerde görülmesine<br />
rağmen 2-8 haftalıklarda da hastalık yapabilmektedir. (Roepke, DC, 1998; Van Empel,<br />
1999; Van Veen L, 2000).<br />
ORT son yıllarda üzerinde sıkça tartışılan ve solunum yolu problemlerine neden<br />
olan bakteriyel bir ajandır. Solunum yolu infeksiyonlarına neden olan etkenleri hiçbir<br />
zaman tek başına düşünmemek lazımdır. Özellikle ticari hindi, ticari broyler sürüleri ve<br />
damızlıklarında primer ve sekonder etken olarak devreye girebilmekte, bu sürülerde<br />
solunum problemlerinin yanı sıra sürülere gelişim geriliği, üniformite bozukluğuna neden<br />
olabilmektedir.<br />
Hastalığın ekonomik olarak yarattığı kayıplar da göz önüne alınacak olursa<br />
hastalığın erken teşhisi ile sürülerde kontrol <strong>program</strong>larına özen gösterilmesi ve tedavi<br />
<strong>program</strong>larının uygulanması gerekmektedir.<br />
5. LİTERATÜR ÖZETİ<br />
Sağlık sorunları her zaman tavukçuluk sektöründe en önemli gündem<br />
maddelerinden birisini oluşturmaktadır. Bu sorunlardan birisi de kanatlılarda sıkça<br />
karşılaşılan solunum sistemi infeksiyonlarıdır.<br />
Solunum sistemi infeksiyonları, kanatlılarda ölüm oranında artış, yumurta<br />
kalitesinde bozulma, yumurtalarda döllülük oranında azalmalara sebep olarak ağır<br />
ekonomik kayıplar oluşturmaktadır.<br />
ORT tüm dünyada solunum sistemi hastalıkları ile ilgili olarak evcil ve yabani<br />
kanatlı <strong>hayvan</strong>larda yaygın olarak bulunmaktadır. ORT başta tavuk ve hindiler olmak<br />
üzere keklik, sülün, güvercin, karga, bıldırcın, ördek, Hint sülünü, devekuşu, kaz ve beç<br />
tavuğu gibi birçok kanatlı <strong>hayvan</strong> türünde infeksiyon oluşturabilmektedir (Back, 1997;<br />
Devrıese, 1995).<br />
ORT, izolasyonu ve identifikasyonu zor bir bakteri olduğu için, kanatlı <strong>hayvan</strong><br />
popülasyonlarında uzun yıllardan beri bulunuyor olmasına karşın sekonder ve oportunistik<br />
bir bakteri olarak değerlendirilerek gözden kaçırılmış ve varlığı ancak 1994 yılında ortaya<br />
konulabilmiştir. ORT infeksiyonları doğal koşullarda tavuk ve hindilerde görülür. Etken<br />
ayrıca keklik, sülün, güvercin, ekin kargası, bıldırcın, ördek, Hint kekliği, deve kuşu, kaz<br />
ve beç tavuğu gibi kanatlı <strong>hayvan</strong>lardan da izole edilmiştir. Broiler piliçlerde subklinik<br />
seyir gösteren ORT enfeksiyonları 3-4 haftalıktan büyük piliçlerde solunum sistemi<br />
hastalığı oluşturabilmesine karşın, tipik olarak hastalık tablosu daha ziyade 24-52 haftalar<br />
arasındaki damızlık broilerlerde, özellikle de yumurta veriminin pik yaptığı dönemde daha<br />
sık görülür (Back., 1996). Enfeksiyon en çok 3-4 haftalık broilerlerde % 2-10’luk mortalite<br />
(Travers, 1996; Van Empel, 1998), 24-52 haftalık broiler damızlıklarda ise % 1-3’lük<br />
mortalite (Travers, 1996; Van Empel., 1996) ile seyretmektedir.<br />
ORT infeksiyonlarında mortalite oldukça değişkenlik göstermektedir. Mortalite<br />
kötü bakım koşulları, yetersiz havalandırma, fazla sayıda <strong>hayvan</strong> barındırma, kümes<br />
227
hijyeninin kötü olması, tekrarlayan enfeksiyonlar ve sekonder enfeksiyonlar gibi pek çok<br />
faktörlerden etkilenmekte ve duruma göre, yüksek veya düşük olarak seyredebilmektedir<br />
(Van empel., 1999).<br />
Amerika Birleşik devletleri, Hollanda, Almanya, Güney Afrika, Fransa, İtalya,<br />
İsrail, Yugoslavya, Macaristan, Kanada ve Avustralya gibi dünyanın birçok bölgesinde<br />
enfekte <strong>hayvan</strong>lardan izole edilmiştir (Back., 1996; Hınz, 1997; Vandamme, 1994).<br />
Travers ve ark. (Travers, 1996), Güney Afrika’da solunum sistemi bozuklukları gösteren<br />
sekiz haftalık yumurtacı bir tavuğun abdominal hava kesesinden ORT izole ettiklerini<br />
bildirmişlerdir. Erganiş ve ark. (Erganiş, 1999) ile Sprenger ve ark. (Sprenger, 2000a)da<br />
hastalık belirtileri gösteren yumurtacı tavuklardan ORT izole edildiğini bildirmişlerdir.<br />
Tavuk ve hindilerde deneysel infeksiyon çalışmalarında, ORT’nin intratrakeal yolla<br />
verilmesinden 48 saat sonra, <strong>hayvan</strong>ların bir kısmının öksürükle birlikte kanlı mukus<br />
çıkardıkları veya yaklaşık olarak 24 saat sonra da öldükleri gözlenmiştir. Etkenin tavuk ve<br />
hindilerde hava keselerine uygulanmasından sonra büyümede yavaşlamaya; aerosol<br />
uygulamasından sonra da hava kesesi yangısı, pnömoni ve büyümede yavaşlamaya neden<br />
olduğu gözlenmiştir (Van Empel, 1998; Van Empel 1999a). ORT kültürünün intravenöz<br />
olarak uygulanması durumunda ise mortalite %20’lere kadar çıkabilmektedir (Van Veen,<br />
2000). Değişik ülkelerde ve farklı <strong>hayvan</strong>lardan izole edilen ORT’nin laboratuar teşhisi<br />
direkt olarak izolasyon, indirekt olarak da serolojik yöntemler ile yapılabilmektedir. ORT<br />
şüpheli bakterilerin identifikasyonu amacı ile kullanılan bazı biyokimyasal test<br />
besiyerlerinde ürememeleri nedeni ile identifikasyonlarının APİ 20 NE kiti ile yapılması<br />
faydalı sonuçlar vermektedir (Travers, 1996; Turan, 2002).<br />
PZR ile ORT’nin identifikasyonu ve tiplendirilmesi yapılabilmekte ve<br />
epidemiyolojik çalışmalarda kullanılabilmektedir (Canal., 2003; Van Empel., 1999).<br />
ORT suşlarının patojeniteleri arasında farklılıklar olmakla birlikte hindi ve<br />
broylerler üzerinde yapılan deneysel çalışmalarda etkenin eprüvasyonu sonucu hastalık<br />
oluşturulabilmiştir (Sommer, 2000; Szalay, 2002). Travers ve ark. (1996), Güney<br />
Afrika’da izole ettikleri üç suşu 28 günlük broylerlerin hava keseleri içerisine inoküle<br />
etmiş ve suşların patojenetilerine göre <strong>hayvan</strong>larda artritis veya hava kesesi yangısı<br />
şekillendiğini bildirmişlerdir (Szalay., 2002). Sprenger ve ark. (1998) intravenöz ve<br />
intratrakeal yolla eprüve ettikleri 22 haftalık hindilerde depresyon, yem tüketiminde<br />
azalma ve ölüm oranında artma ayrıca nekropside hava keselerinde köpüklü yoğurt benzeri<br />
bir eksudatın şekillendiğini ayrıca akciğerlerin kollabe olduğunu gördüklerini<br />
belirtmişlerdir (Sprenger., 1998).<br />
Deneysel çalışmalarda ORT ile Newcastle, Turkey Rhinotracheitis (TRT),<br />
İnfeksiyöz Bronşitis (IB) gibi viral; Escherichia coli, Bordetella avium gibi bakteriyel<br />
etkenlerin birlikte verilmesinin infeksiyonun şiddetini artırdığı görülmüştür (Sprenger,<br />
1998, Travers, 1996; Van Empel, 1999).<br />
Hastalığın kısa bir süre içinde dünya genelinde yayılması araştırıcıların bu konu<br />
üzerinde yoğunlaşmasına neden olmuştur. Charlton 1995- 1997 yılları arasında Kaliforniya<br />
teşhis laboratuarında 589 ORT izolasyonu yapıldığını bildirmiştir (Charlton, 1993). Odor<br />
ve ark. Delmarva Peninsula bölgesinde (A.B.D) solunum bozukluğu görülen 11 sürüden<br />
etkeni izole etmişlerdir (Odor, 1997). Joubert ve ark (Joubert, 1999) Kanada’da, Travers<br />
(Travers, 1996) Güney Afrika’da, Sakai ve ark. (Sakai, 2000) Japonya’ da, Hinz ve ark<br />
(Hinz, 1994) Almanya’da solunum bozuklukları ve ölüm oranında artış görülen broyler ve<br />
hindilerden etken izolasyonu yapmışlardır. Salem A.B.D’nin Delmarwa Bölgesindeki 80<br />
farklı çiftlikten trakeal svaplar almış ve 25 çiftlikten etkeni izole ettiğini bildirmiştir<br />
(Schleifer, 1997). Ülkemizde ise Erganiş ve ark (Erganiş, 2002) Konya çevresinde, Turan<br />
ve Ak (Turan, 2002) Marmara ve Batı Karadeniz Bölgesinde etken izolasyonu yapmış ve<br />
hastalığın varlığını saptamışlardır.<br />
228
Serbest radikaller birçok fizyolojik ve patolojik süreçte üretilebilen, bir ya da daha<br />
fazla eşleşmemiş elektron içeren oldukça aktif atom veya moleküllerdir (Halliwell, 1989;<br />
Lohr, 1991; Halliwell B and Gutteridge, 1996). Biyolojik sistemlerde önemli serbest<br />
radikallerin çoğu oksijene dayanır. Bunlardan süperoksit radikali hem çevresel etkenler,<br />
hem de organizmalardaki enzimatik ve enzimatik olmayan tepkimelerle en çok ve en kolay<br />
oluşan oksijen radikalidir (Halliwell, 1989). Canlılarda diğer radikallerin oluşumu<br />
çoğunlukla süperoksit radikallerinin birikmesine bağlıdır (Halliwell, 1989; Lohr, 1991;<br />
Halliwell B and Gutteridge, 1996).<br />
Serbest radikaller potansiyel olarak toksik oldukları için organizmalar bunları<br />
etkisiz hale getirmek amacıyla savunma sistemleri geliştirmişlerdir. Bunlar kısaca<br />
‘antioksidanlar’ şeklinde adlandırılır. Oksidan-antioksidan denge oksidanların lehine<br />
bozulursa patolojik olaylar ortaya çıkar (Lohr, 1991). Antioksidanlardan süperoksid<br />
dismutaz (SOD) süperoksit radikalinin hidrojen peroksit (H2O2)’ye dönüşümünü; GSH-Px<br />
ve KAT enzimleri ise H2O2’nin su ve oksijene indirgenmesini sağlar (Halliwell, 1989;<br />
Lohr, 1991; Halliwell B and Gutteridge, 1996). KAT ve GSH-Px süperoksid radikali<br />
tarafından inaktive edilmektedir (Kılınç, 1985). KAT enzimi H2O2’nin yüksek<br />
konsantrasyonlarda bozunumunda rol oynarken, GSH-Px enzimi düşük H2O2<br />
konsantrasyonlarda daha etkindir (Miller ve Baehner, 1990; Meister ve Anderson, 1980).<br />
GSH-Px eritrositlerde oksidan strese karşı en etkili antioksidan olup H2O2 ve lipid<br />
peroksitlerin redüksiyonunu katalize eder (Mccay, 1976).<br />
NO, pro-inflamatuar veya antiinflamatuar etkileriyle akut ve kronik yangıda önemli<br />
bir role sahiptir. NO oldukça reaktif bir moleküldür ve doğrudan ya da peroksinitrit<br />
oluşumu yoluyla oksidan özellik gösterir. Bu oksidan özelliği nedeniyle bakterisid ve<br />
tümör hücrelerine karşı sitotoksik etki gösterir ve savunma sisteminin bir parçası olarak<br />
görev yapar (Nathan, 1992; Ozkan,2001). Ancak aynı özellikler astımda görülen yangının<br />
da bir nedeni olabilmektedir (Barnes, 1995; Kharitonov, 1994).<br />
6. MATERYAL VE METOT<br />
6.1. Deneme Hayvanları<br />
Bu çalışmada kontrol ve deney grubu için 30’ar adet olmak üzere toplam 60 adet 1<br />
günlük ticari civciv kullanıldı. Kullanılan civcivler Elazığ’daki özel bir kanatlı civciv<br />
işletmesinden temin edildi. Veteriner hekim kontrolünde yetiştirilen bu civcivlerde<br />
herhangi bir aşılama yapılmadığı ve kümeslerde enfeksiyonun görülmediği ilgililerce<br />
bildirildi. Enstitümüze getirilen bu civcivler, kontrol ve deney grubu olmak üzere daha<br />
önce dezenfekte edilen ayrı odalara alındı. Deney süresince bakım ve beslenmeleri yapıldı.<br />
Civciv büyütme yemi yem fabrikasından temin edildi.<br />
6.2. Etken<br />
ORT B 3263/91 (serotip A) suşu, Dr. Hafez Mohamed Hafez, Instıtute of Poultry<br />
Diseases, Free University Berlin, Almanya’dan temin edildi. ORT B 3263/ 91 (serotip A)<br />
suşundan’dan inokulum hazırlandı. Bakteri %7 kanlı agara ekimi yapıldı % 5- 10 CO2 ’li<br />
ortamda 48 saat inkube edildi. Bakteriyel süspansiyon 3,8X10 8 coloni forming ünitesi<br />
(cfu/ml) olarak civcivleri infekte etmek için kullanıldı.<br />
6.3. Deney Düzeni<br />
Deney ve kontrol grubu ayrı odalara alındı. Birinci grup olan deney grubuna 1 ml<br />
ORT 3263/ 91 suşu (serotip A) mililitre başına 3,8X10 8 CFU içeren inokulum aerosol<br />
olarak verildi. İkinci grup kontol grubu olarak kullanıldı. İnokülasyonu takiben 1., 3., ve 6.<br />
haftalarda I. ve II. Gruptan 10’arlı tavuğun nekropsileri yapıldı.<br />
229
6.4. Bakteriyolojik Analiz<br />
Kültür izolasyonu için, akciğer ve trake örnekleri aseptik olarak 10 µg/ml<br />
gentamicin içeren %7 kanlı agara ekim yapıldı. 48 saat %5- 10 CO2 ‘lik atmosferde<br />
üremeye bırakıldı. Şüpheli kolonilerin kültürleri yapıldı ve saf kültürler %15 gliserollü<br />
nutrient broth’a bırakıldı ve -20°C'de saklanıldı. Bakterinin identifikasyonu; koloni<br />
morfolojisi, Gram boyama ve biyokimyasal testlere göre yapıldı.<br />
6.5. Histopatolojik Analiz<br />
Histopatolojik muayeneler için, akciğerler, hava keseleri, trake, larynks ve sinuslar ile<br />
birlikte diğer iç organlardan alınan doku örnekleri % 10’luk nötral formalin solüsyonunda<br />
tespit edildi. Rutin işlemlerden geçirildikten sonra hazırlanan parafin blokları, 5 mikrona<br />
ayarlanmış mikrotomda kesilerek Hematoxylin-Eosin (HE) ile boyanarak ışık<br />
mikroskobunda incelendi.<br />
6.6. Biyokimyasal Analiz<br />
Plazma malondialdehid (MDA) tayini modifiye edilmiş Yagi, dokularda ise<br />
Ohkawa yöntemiyle spektrofotometrik olarak yapıldı. Bu metot lipid peroksidasyonunun<br />
(LPO) aldehid ürünlerinden biri olan MDA ile tiobarbitürik asit (TBA)’in reaksiyonu<br />
temeline dayanmaktadır. Oluşan MDA, TBA ile pembe renkli bir kompleks oluşturmakta<br />
ve bu çözeltinin absorbansının 532 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçümü ile<br />
LPO derecesi saptanmaktadır.<br />
Eritrosit ve doku KAT aktivitesi Aebi metodu ile ölçüldü. H2O2’nin KAT<br />
tarafından yıkım hızı, H2O2’nin 240 nm dalga boyunda ışığı absorbe etmesinden<br />
yararlanılarak spektrofotometrik olarak ölçüldü.<br />
Eritrosit ve doku GSH-Px enzim aktivitesi Beutler yöntemiyle, NADPH’ın<br />
NADP+’ye yükseltgenmesi sırasındaki absorbans farkının 340 nm’de spektrofotometrik<br />
olarak okunmasıyla tayin edildi. Serum ve dokuda NO ölçümü Griess reaksiyonuna göre,<br />
nitrat redüktaz enzimi ile nitrat nitrite indirgenerek total nitrit ölçümü olarak yapıldı.<br />
Protein miktarları Lowry yöntemine göre, Hemoglobin tayini siyanomethemoglobin<br />
yöntemine göre yapıldı.<br />
6.7. DNA Ekstraksiyonu ve PCR<br />
Kanlı agarda üreyen O. rhinotracheale referans kültüründen (pozitif kontrol olarak<br />
kullanılacak O. rhinotracheale suşları Dr. Hafez Mohamed Hafez, (Instıtute of Poultry<br />
Diseases, Free University Berlin, Almanya)’den temin edildi. Birkaç koloni alınarak 300<br />
µl'lik distile su içeren bir eppendorf tüpte süspanse edildi. Sonra süspanse edilen bakteriler<br />
bir vorteks vasıtasıyla iyice karıştırıldıktan sonra bakteri süspansiyonu 56°C de 30 dakika<br />
süreyle inaktive edildi. Bu aşamayı müteakip süspansiyona 300 μl TNES-tamponu (20<br />
mM Tris pH 8.0,150 mM NaCl, 10 mM EDTA, % 0,2 SDS) ve 200µg/ml Proteinase K<br />
ilave edildi. Daha sonra süspansiyon 37°C'de 2 saat inkube edildi. İnkubasyondan sonra 30<br />
dakika kaynatma işlemini müteakip süspansiyon tekrar vortekslendi. Bu aşamayı müteakip<br />
süspansiyona aynı volümde (300 μl) Tris-HCl ile satüre edilmiş fenol ilave edildi,<br />
süspansiyon elle 5 dakika süreyle iyice çalkalandı ve 13.000 rpm'de 10 dakika santrifüj<br />
edildi. Santrifüj işleminden sonra ependorfun üst kısmındaki solüsyon gözle görülebilen<br />
bir çizgiyle ayrılmış olan alt kısma (fenollü kısım) dokunmaksızın bir mikropipet<br />
yardımıyla dikkatli bir şekilde başka bir ependorfa aktarıldı. Daha sonra DNA'nın<br />
presipitasyonu amacıyla süspansiyona 0,1 volüm 3M Sodyum asetat ve 2,5 volüm saf<br />
etanol ilave edilerek -20°C'de 1-2 saat bekletildi. Daha sonra süspansiyon 13.000 rpm'de<br />
10 dakika santrifüj edildi ve süpernatant uzaklaştırıldı. Elde edilen pelet önce 300 µl<br />
miktarındaki %90'lık ve daha sonra da %70'lik etanol ile muamele edildi. Bu işlemler<br />
230
arasında süspansiyon 13.000 rpm'de 5 dakika santrifüj edildi ve süpernatant uzaklaştırıldı.<br />
Son olarak elde edilen tortu 50 µl distile su ile süspanse edildi. Bu süspansiyondan 5 µl<br />
alınarak PZR’de hedef DNA olarak kullanıldı.<br />
6.8. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)<br />
Toplam 50 µl’lik volümde hazırlanan PZR karışımına 5µl 10xPZR buffer (100 mM<br />
Tris-HCl, pH 9.0, 500mM KCl, 15mM MgCl2, %1 Triton X-100), deoksinükleotid<br />
trifosfatların her birinden 250 µM, 2U Taq DNA polymerase enzimi (Fermentas), 40 pmol<br />
her bir primer OR16S-F1 (5’-GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G-3’) ve OR6S-R1<br />
(5’- TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT-3’) ve 5 µl hedef DNA olmak üzere 50µl'lik<br />
volümde hazırlanan PZR karışımının üzeri 100µl mineral yağ ile kaplandı ve PZR<br />
Reaksiyonu, Touchdown Thermocycler'de (Hybaid Marka, İngiltere) gerçekleştirildi. DNA<br />
amplifikasyonu 94°C'de 5 dakika ön ısıtmayı müteakip 94°C'de 30 saniye denatürasyon,<br />
52°C'de 1 dakika hibridizasyon ve 72°C' de 1 dakika 30 saniye olmak üzere 45 siklus<br />
halinde gerçekleştirildi. Son siklus 72°C'de 7 dakika olarak gerçekleştirildi.<br />
6.9. Elektroforez<br />
PZR'de amplifiye edilen DNA, agaroz jel elektroforez işlemine tabi tutuldu.<br />
Elektroforez tampon solüsyonu olarak Tris-Borik asit-EDTA (TBE) kullanıldı ve bir midi<br />
jel elektroforez tankında 75 voltta 1 saat süreyle elektroforez işlemi gerçekleştirildi.<br />
Elektroforezi müteakip, jel ethidium bromide (0.5 µg/ml) ile 30 dakika süreyle boyandı ve<br />
sonuçlar ultraviyole transilluminatörde değerlendirildi. PZR ürünlerinin jel elektroforezi<br />
neticesinde 784 bp uzunluğundaki bant O. rhinotracheale yönünden pozitif olarak<br />
değerlendirildi.<br />
7. BULGULAR<br />
7.1. Klinik ve Nekropsi Bulguları:<br />
Klinik olarak; elde edilen bulgularda gelişim geriliği, sinuslarda şişme, burun akıntısı ve<br />
tıksırma görüldü. Nekropside; Hava kesesi yangısı (airsacculitis), hava keselerinin<br />
özellikle kalınlaşarak peynirleşmiş bir görünüme dönüşmesi, pnömoni, kalp ve karaciğer<br />
üzerinde pseudomembranların bulunduğu görüldü.<br />
7.2. Kültür Sonuçları<br />
ORT 1.haftada sadece 5 kanatlı örneğinin trakesinden izole edildi ve 3.haftada<br />
sadece 2 akciğer örneğinden izole edildi. 6. haftada trake ve akciğer örneklerinden kültür<br />
de ORT izole edilemedi (Tablo 1).<br />
Tablo 1. İnokülasyondan sonra 1., 3., ve 6. haftalarda etkenin izole edildiği akciğer ve<br />
trake sonuçları.<br />
İnokülasyon sonrası haftalar<br />
Grup 1.Hafta 3.Hafta 6.Hafta<br />
Trake Akciğer Trachea Akciğer Trake Akciğer<br />
Enfeksiyon Grubu 5 - - 2 - -<br />
Kontrol Grubu - - - - - -<br />
231
7.3. PZR Sonuçları<br />
Kanlı agarda üreyen ORT kolonilerinden izole dilen ORT suşlarından ekstrakte<br />
edilen DNA’ların PZR’de amplifiye edilmesi ve agaroz jel elektroforeze tabi tutulması<br />
neticesinde 784 bp uzunluğunda pozitif bantlar elde edildi (Resim 1).<br />
7.4. Patolojik Bulgular<br />
Makroskobik olarak, post inokulasyon 1. ve 3. haftalarda nekropsi edilen<br />
tavuklarda gözlendi. Akciğerlerde genellikle unilateral olmak üzere, pneumonia tablosu<br />
hakim idi. Konjesyon, kanama ve ödem nedeniyle koyu kırmızımtırak renkte olan<br />
akciğerlerde yer yer konsilidasyon alanları dikkati. Başta abdominal olmak üzere, hava<br />
keselerinde kalınlaşma ve opak bir görünüm vardı. Burun boşlukları, larinks ve trake<br />
mukozasında ödem, konjesyon ve kanama alanları, lumenlerinde de sarımtırak renkte,<br />
kıvamlı ve yapışkan bir içerik saptandı.<br />
ORT ile enfekte edilen tavukların postinokulasyon günlerine göre, doku ve<br />
organlardaki histopatolojik bulguların olgulara gore dağılımı Tablo 2’de sunulmuştur.<br />
Mikroskobik olarak akciğerlerde, sekunder ve tersiyer bronşlar ile hava veziküllerinin<br />
epitelinde nekroz ya da hiperplazi, lumende heterofil lökosit, deskuame epitel hücreleri,<br />
eritrosit ve mukusdan oluşan hücresel birikim, intersitisyel alanda ödem, konjesyon,<br />
heterofil ve mononüklear hücre infiltrasyonları ile kimi olgularda ayrıca, oldukça geniş<br />
kanama alanları dikkati çekti. Ayrıca, damarlar ile sekunder ve tersiyer bronşların<br />
çevresinde lenfoid hiperplazi tespit edildi. Hava keselerinde epiteliyal dejenerasyon ile yer<br />
yer hiperplazi, propriada ödem, konjesyon ve kanamalar ile heterofil, lenfosit, makrofaj<br />
infiltrasyonları gözlendi.<br />
Sinuslar, larinks ve trakede genellikle benzer histopatolojik bulgular gözlendi.<br />
Mukozalarda hafif epiteliyal dejenerasyon ve deskuamasyon gözlendi. Propria mukozada<br />
hafif ödem, konjesyon ve değişen derecelerde kanamalar ile yangısal hücre infiltrasyonları<br />
saptandı. Hücresel reaksiyon orta şiddette olup, heterofil, lenfosit, makrofaj ve az sayıda<br />
plazma hücrelerinden oluşmaktaydı. Propria mukozada, ayrıca fokal lenfoid hiperplaziler<br />
dikkati çekti. Lumenlerinde nekrotik epitel hücreler ve eritrositler ile karışık bir eksudat<br />
vardı.<br />
ORT ile deneysel olarak enfekte edilen toplam 15 broiler tavuğun doku ve<br />
organlardaki histopatolojik bulguların olgulara göre dağılımı aşağıda verilmiştir.<br />
Tablo 2: Deneysel olarak infekte edilen tavukların postinokulasyon günlerine göre,<br />
doku ve organlardaki histopatolojik bulguların olgulara gore dağılımı<br />
Post inokulasyon günleri<br />
Dokular 1. hafta 3. hafta 6. hafta<br />
Sinuslar 5 3 -<br />
Larinks 4 2 -<br />
Trake 4 3 -<br />
Akciğerler 4 5 -<br />
Hava keseleri 3 6<br />
7.5. Biyokimyasal Sonuçlar<br />
Serum MDA ve NO düzeyleri kontrol grubuna göre enfeksiyon grubunda artış<br />
gösterirken, eritrosit KAT ve GSH-Px aktiviteleri kontrol grubuna göre düşüş göstermiştir<br />
(Tablo 3). Trake dokusunda MDA ve NO düzeyleri kontrole göre enfeksiyon grubunda<br />
artmış, KAT ve GSH-Px aktiviteleri ise değişmemiştir (Tablo 4). Akciğer dokusunda<br />
232
MDA düzeyi ile, KAT aktivitesi artmış, NO düzeyi kontrol grubuna göre düşmüş, GSH-Px<br />
aktivitesi ise istatistiksel olarak bir değişim göstermemiştir (Tablo 5).<br />
Tablo 3: ORT ile enfekte tavuklarda serum MDA, Nitrit düzeyleri ile eritrosit KAT ve<br />
GSH-Px aktivite düzeyleri<br />
Not: Farklı harfler veriler arasındaki farklılıkları ifade etmektedir.<br />
P >0.05: - p
Bu çalışmlarda airsacculitis ve pnömoni virus verilmediği için gözlenmemiştir<br />
Broilerlerde air sacculitis ve pnömoni Newcastle virus (NDV), infectious bronchitis<br />
virus (IB) ya da tavuk-turkey rhinotracheitis (TRT) virusunun verilmesi ile<br />
enfeksiyonun şiddetlendiği görülmüştür. Bizim yaptığımız bu çalışmada ORT’ye<br />
maruz bırakılan 14 günlük tavuklarda air sacculitis ve pnömoni gözlendiği halde<br />
mortalite gözlenmedi.<br />
Tavuklarda B.avium, NDV’nun, broylerlerde chicken anemia virus (CAV),<br />
Infeksiyöz bronşitis virus (IBV) ve Reovirus (REOV) gibi immunsupreif ajanların<br />
ve hindilerde de turkey rhinotracheitis virusunun (TRT) bulunması durumunda<br />
O.rhinotracheale infeksiyonlarının görülme sıklığında bir artış olduğu ve<br />
infeksiyonun çok daha ağır seyrettiği bildirilmektedir. Viral bir infeksiyonun<br />
bulunmadığı durumlarda tek başına ORT ile infekte tavuk ve hindilerde pnömoni ve<br />
hava kesesi yangısı meydana gelemeyebilirken, viral infeksiyonlar saha koşullarında<br />
ORT infeksiyonlarının seyrini şiddetlendirir (Travers ve ark., 1996; van Empel ve<br />
ark., 1996; Fabris ve ark., 1998; Jones, 1998; Abdul-Aziz ve Weber, 1999; Mante,<br />
1999).<br />
Tavuklarda deneysel infeksiyonu takiben görülen en önemli nekropi bulgusu<br />
trakeal eksudat ile birlikte pnömoni yada hava kesesinin yangısıdır. Deneysel<br />
infeksiyondan sonra şekillenen bu lezyonlar doğal infeksiyonlarda fazla<br />
görülmemektedir (Ryll ve Hinz., 1997; Van empel ve ark., 1999b). Bizim<br />
yaptığımız bu çalışmada herhangi bir viral ajan verilmeksizin etken tek başına<br />
aerosol olarak verilmiş ve bu uygulamadan sonra enfeksiyonun hava kesesi yangısı,<br />
pnömoniye neden olduğu gözlenmiştir<br />
Yapılan bir kısım çalışmalarda herhangi bir primer ajan olmaksızın aerosol,<br />
intra-trakeal, intravenöz ve intra-torasik infeksiyonda airsacculitis, pnömoni ve<br />
mortalitede artışın olduğu gözlemlenmiştir. (Ryll et all, 1997a; Sprenger et al.,<br />
1998). Beyaz specific pathogen free (SPF) leghornların infeksiyona broylerlerden<br />
daha dirençli olduğu, ticari broylerler ile SPF broylerler arasında ise duyarlılık<br />
bakımından fark olmadığı belirtilmiştir (Van Veen., 2000). Bu çalışmada Elazığ’da<br />
bulunan bir tavukçuluk işletmesinden temin edilen civcivler 14 günlükken 3,8X10 8<br />
CFU içeren inokulum aerosol olarak verilmiştir.Verilen bu inokulum dozu tavuklarda 1. ve<br />
3. haftalarda makroskobik ve mikroskobik bulguların rahatlıkla görülmesini sağlamıştır.<br />
Van Empel. spesifik patojen free kanatlı kullanıldığında etkenin aerosol,<br />
intra-trakeal yada intra-thoracic challenge uygulamasında pnömoni ve airsacculitis<br />
tablosunun görülmediğini bildirmiştir (Van empel et al., 1999a). Yapılan diğer bir<br />
çalışmada ise ORT’nin SPF tavuklara intravenöz uygulamasının %20’lik<br />
mortaliteye neden olduğu ancak airsacculitis oluşturmadığı bildirilmiştir (Van<br />
Empel., 1999b). Bizim yapmış olduğumuz bu çalışmada mortalite görülmemiş olup,<br />
orta şiddette pnömonik lezyonlar ve airsacculitis tablosu görülmüştür. Ticari<br />
broilerler ile SPF broilerler araında önemli bir duyarlılık farkı olmamakla birlikte,<br />
SPF leghorn tavuklar ORT infeksiyonlarına broilerlerden daha az duyarlıdırlar (Van<br />
veen ve ark., 2000). Bu çalışmada SPF tavuk yerine ticari alınan tavukların<br />
kullanılmış olması infeksiyonun klinik tablolarının daha iyi görülmesini sağlamıştır.<br />
Bu açıdan araştırmacıların bildirmiş olduğu bulgulara benzerlik gösterdiği ve<br />
tavukların duyarlı olduğu söylenebilir.<br />
ORT’nin hem tavuklarda hemde hindilerde primer bir patojen etken olduğu<br />
gösterilmiştir (Sprenger ve ark., 1998; Van Veen ve ark., 2000). ORT, Koch<br />
postulatlarının özelliklerinin hepsini sağlamktadır. Etken, sağlıklı kanatlılardan<br />
izole edilmemesine karşın, doğal ve deneysel yollarla infekte olmuş hindi ve<br />
234
tavuklardan saf olarak izole edilmiştir (Van Empel ve ark., 1996). Yapmış<br />
olduğumuz bu çalışmada etken 1.haftada infekte tavukların 5 tanesinin trakesinden,<br />
3.haftada ise 2 tanesinin akciğerinden saf olarak izole edilmiştir. ORT<br />
enfeksiyonlarında mortalite oldukça değişkenlik göstermektedir. Mortalite kötü<br />
bakım koşulları, yetersiz havalandırma, fazla sayıda <strong>hayvan</strong> barındırma, kümes<br />
hijyeninin kötü olması, yüksek amonyak düzeyi, tekraralayan infeksiyonlar ve<br />
sekonder infeksiyonlar gibi pek çok faktörlerden etkilenmekte ve duruma gore,<br />
yüksek veya düşük olarak seyredebilmektedir (Van Empel ve Hafez, 1999; Hafez,<br />
2000b). Yaptığımız bu çalışmada solunum sisteminde makroskobik ve<br />
histopatolojik bulgular gözlenirken, mortalite gözlenmedi. Mortalite gözlenmemiş<br />
olması araştırmacıların bulgularıyla benzerdir. ORT, özellikle çevresel strese maruz<br />
kalmış, viral ya da bakteriyel bir patojen ile immun sistemi baskılanan hindi ve<br />
broilerlerde oldukça ciddi düzeyde infeksiyon oluşturabilmektedir (Schleifer, 1997b;<br />
Mante, 1999; Van Empel, 1999)<br />
Hasta tavuk ve hindilerden ORT izolasyonu için en uygun organlar<br />
akciğerler, hava keseleri, sinuslar ve trake’dır. ORT izolasyonu, doğal infeksiyonu<br />
takip eden ilk birkaç gün içinde başarıyla yapılabilmektedir (Back ve ark.,996;<br />
Hafez ve Beyer, 997; Minta ve ark., 1998). Etken izolasyonunun infeksiyonun ilk 10<br />
günü içerisinde daha başarılı olduğu belirtilmiştir (Tahseen, A; Hafez, 1998).<br />
Deneysel infeksiyondan sonra ise etken solunum sistemindeki organların dışında<br />
kalp, beyin, dalak, karaciğer, konjunktiva, yumurta sarısı, kemik ve eklemlerden de<br />
izole edilebilmektedir (Charlton ve ark., 1993; Back ve ark., 1998b; Sprenger ve<br />
ark.,1998; Van empel ve ark.,1999b) Van Empel ve ark. (1999) herhangi bir viral<br />
ajan verilmeksizin ORT’ye maruz bırakılan tavukların infeksiyonun ilk ikinci<br />
gününde hava keseleri ve tracheadan izole edilebildiğini, infeksiyondan sonraki ilk<br />
10 gün içinde ise hava keseleri ve akciğelerde var olduğunu bildirmiştir. Back ve<br />
ark. (1998b) 3. ve 7.günden ziyade 14.günde dokularda lezyonların görüldüğünü<br />
bildirmiştir. Bu çalışmada infekte tavukların trakesinden 1.haftada, akciğerinden<br />
3.haftada etken izole edilmiş olması çalışmalarla uyum göstermektedir.<br />
Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) klinik örneklerde etkenin saptanması ve<br />
epidemiyolojik çalışmalarda kullanılmaktadır (Van Empel, 1999). Yaptığımız bu<br />
çalışmada ORT DNA’sı PZR ile tespit edildi. Bu tespit içinde OR 16S-F1 ve OR<br />
16S-R1 primer kombinasyonu kullanıldı. Bu çalışmada PZR metodu identifikasyon<br />
amacıyla kullanılmıştır. İdentifikasyon amacıyla metod başarıyla kullanılmış ve<br />
PZR denemesinin örneğin yumurta, dışkı, toz ve doku örneklerinde ORT’nin<br />
identifikasyonu için optimize edilerek kullanılabilirliliği ve epidemiyolojik<br />
çalışmalarda kullanılmasının yararlı olacağı sonucuna varılmıştır .<br />
Sprenger ve ark.(1998) hindilere, Van Veen ve ark.(2000) ise tek başına<br />
ORT vererek yaptıkları deneysel çalışmalarla klinik belirtiler ve patolojik bulgular<br />
bakımından saha infekiyonuna benzer infeksiyonu oluşturmuşlar ve ORT’nin tavuk<br />
ve hindilerde primer patojen etken olduğunu kanıtlamışlardır. Bizim yapmış<br />
olduğumuz bu çalışmada da saha infeksiyonuna benzer klinik bulguların görülmüş<br />
olması tavuklarda bu etkenin primer etken olduğunun göstergesi olarak kabul<br />
edilebilir.<br />
Sonuç olarak tavuklarda önemli ekonımik kayıplara neden olan bu hastalığın<br />
Türkiyede ilk olarak tavuklarda herhangi bir viral etkene maruz bırakılmadan<br />
deneysel olarak ORT’nin oluşturulduğu ilk çalışmadır. Mikrobiyolojik, patolojik ve<br />
biyokimyasal sonuçlar öncelik alınarak bu metotların patogenez ve kesin teşhiste<br />
yeri ve önemi incelenmiş olup, ORT infeksiyonuna ilişkin 14 günlük tavuklarda<br />
235
oluşturulan deneysel modelle enfeksiyonun patogenezi ortaya konulmaya<br />
çalışılmıştır.<br />
Akciğerler havadaki mikroorganizmalara maruzdur ve sistemik enfeksiyöz olaylar<br />
için hedeftir. Hemen bütün akciğer hastalıkları, pulmoner enfeksiyonlara karşı artmış<br />
eğilimle karekterizedir. Enfeksiyonlar oksijen radikali üreten ve ekstrasellüler ortama salan<br />
çeşitli fagositik hücreleri ortama çeker ve aktive ederler. Akciğerler bütün kardiyak kan<br />
akımını alırlar ve dolayısıyla kan kaynaklı oksidanlara da maruz kalırlar. Akdoğan ve<br />
ark.’ları (1999) tarafından bronşial astımlı hastalarda antioksidan enzim ve melatonin<br />
düzeyleri araştırıldığı çalışmada, bronşial astımlı hastalarda eritrosit SOD ve GSH-Px<br />
aktiviteleri kontrol grubuna göre anlamlı olarak düşük bulunmuştur. Glutatyon Redüktaz<br />
(GR), KAT ve melatonin düzeylerinin de düştüğü ancak bu düşüşün anlamlı olmadığı<br />
saptanmıştır. Malvy ve ark.’ları (1993) astımlı çocuklarda eritrosit GSH-Px enzim<br />
aktivitesini, Powell ve ark.’ları (1994) astımlı çocuklarda eritrosit GSH-Px aktivitelerini<br />
kontrole göre anlamlı derecede düşük bulmuşlardır. Aksu ve ark.’ları tarafından astımlı<br />
hastalarda yapılan bir başka çalışmada astımlı hastaların serum MDA, NO düzeyleri ile<br />
Ksantin Oksidaz (XO) aktivitesinin artmış olduğu, eritrosit GSH-Px ve SOD enzim<br />
aktivitelerinin ise önemli derecede azaldığı kaydedilmiştir. Kwiatkowska ve ark.<br />
(1999)’ları tarafından akciğer tüberkülozlu hastalarda yapılan çalışmada tüberkülozlu<br />
hastaların serum MDA düzeylerinin artmış olduğu bildirilmiş ve bu artıştan solunum<br />
patlaması sırasında aşırı miktarda üretilen serbest radikallerden kaynaklandığı ileri<br />
sürülmüştür. Akciğer tüberkülozlu bir başka çalışmada tüberkülozlu hastaların serum<br />
MDA ve nitrit düzeylerinin arttığı, antioksidan aktivitelerinin ise düştüğü bildirilmiştir<br />
(Lamsal, 2007).<br />
Çalışmamızda enfekte <strong>hayvan</strong>ların eritrosit KAT ve GSH-Px enzim aktivitelerinin<br />
kontrol grubuna göre düşük, serum MDA ve NO düzeylerinin yüksek olması çalışmalarla<br />
uyum göstermektedir. Ayrıca eritrosit GSH-Px aktivitesindeki düşüşün istatistiksel olarak<br />
daha anlamlı olması, eritrositlerdeki antioksidan savunmada GSH-Px’in daha etkili olduğu<br />
fikrini doğrulamaktadır.<br />
Serbest radikallerin neden olduğu hasarın tipi, büyüklüğü radikallerin oluştuğu<br />
bölgeye ve lokal antioksidan savunma sistemlerine bağlıdır. Normalde solunum yolu<br />
epitelyumi endojen ve eksojen serbest radikal hasarına karşı enzimatik ve nonenzimatik<br />
antioksidanlarla korunur. Reaktif oksijen türlerinin çeşitli akciğer hastalıklarının<br />
patofizyolojisindeki muhtemel rolü birçok çalışma ile gösterilmiştir. NO ve süperoksit<br />
radikali akciğer fonksiyonlarında önemli role sahiptir ve pulmoner sirkülasyondaki etkileri<br />
yapılan derlemelerle bildirilmiştir (Demiryürek 1999, Clini 2002).<br />
NO ile süperoksit hızlı bir reaksiyon sonucu peroksinitrit oluştururlar. Bu reaksiyon<br />
hızı süperoksitin SOD ile reaksiyon hızından yaklaşık 3 kez daha fazladır. İnflamasyon<br />
gibi birçok patolojik olayda hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artarak NO ve süperoksitin<br />
simultane olarak salıverilmesine yol açar. Makrofajlar ve nötrofiller stimüle edildiklerinde<br />
NO ve süperoksiti salıvererek peroksinitrit oluşumuna neden olabildikleri gibi, NO ve<br />
süperoksit farklı hücrelerden salıverilip peroksinitrit oluşturabilirler (Gow, 1998).<br />
Peroksinitritin dekompozisyonu ile nitrojen dioksit ve hidroksil radikali oluşur (Merenyi,<br />
1998). Oluşan bu ürünler potent oksidan özelliğe sahiptir ve LPO’ya yol açarlar.<br />
Myeloperoksidaz ve eozinofil peroksidaz, H2O2 ve nitritin substrat olarak kullanıldığı<br />
reaksiyonları katalizleyerek nitrojen dioksit oluşumuna yol açabilir (Persinger, 2002).<br />
Nitrojen dioksit epitelyum hücre hasarını da içeren akciğerde biyokimyasal ve morfolojik<br />
değişikliklere, astımın alevlenmesine ve solunum enfeksiyonlarının artmasına neden<br />
olabilir. Nitrojen dioksit lipidler, proteinler ve nükleik asitlerle reaksiyona girip LPO’ya<br />
ve aminlerin nitrasyonuna neden olabilir (Davidson,1996).<br />
236
Cadogan ve ark.’ları (1999) tarafından yapılan bir çalışmada ratlara intratrakeal<br />
olarak Pseudomonas aeruginosa verilerek ve 10-15 gün sonra ratlar öldürülmüştür. Kronik<br />
enfekte <strong>hayvan</strong>ların akciğerlerinde iNOS gen ekspresyonu arttığı halde iNOS aktivitesinin<br />
artmadığı görülmüştür. Hopkins ve ark.’ları (2003) tarafından yapılan bir başka<br />
çalışmada Pseudomonas aeruginosa verilerek enfeksiyon oluşturulan ratlarda kronik<br />
enfekte grubun akciğerlerinde etken izole edilmiştir. Akciğerlerde yangısel hücre<br />
infiltrasyonu ve doku hasarı görülmüştür. Enfekte grupta akciğerlerde iNOS ekspresyonu<br />
artmış, fakat nitrit, nitrat, nitrotirosin ve nitrosotiol konsantrasyonlarında artış<br />
görülmemiştir.<br />
Staphylococcus aureus süspansiyonu verilerek unilateral sinüsitis oluşturulan<br />
tavşanlarda mukozal örnekler toplanarak SOD, GSH-Px, KAT aktiviteleri ile MDA<br />
düzeyleri ölçülmüştür. Yangılı sinüs mukozasında SOD aktivitesi oldukça yüksek<br />
bulunmuş, GSH-Px aktivitesi ise düşük bulunmuştur. KAT aktivitesi ve MDA düzeyleri<br />
arasında yangılı doku ile sağlam doku arasında bir fark görülmemiştir. Bu bulgular MDA<br />
düzeyinde değişiklik olmaksızın antioksidan aktivitenin değişebildiğini göstermiştir (Uslu,<br />
Çalışmamızda akciğer parametrelerinin daha fazla etkilenmesi hasarın en fazla<br />
akciğerde olduğunun göstergesi olarak kabul edilebilir. Gerek serum, gerekse akciğer ve<br />
trake olsun hepsinde de MDA artışı solunum yolu enfeksiyonunun oksidan-antioksidan<br />
dengeyi oksidan lehine bozduğunu göstermektedir. Eritrosit KAT ve GSH-Px<br />
aktivitesindeki düşüş bu enzimlerin serbest radikallerle mücadelesinden olabileceği gibi,<br />
fazla miktarda oluşan H2O2’nin enzimleri inaktive etmesinden de kaynaklanmış olabilir.<br />
Akciğer dokusunda MDA artışına karşın KAT ve GSH-Px aktiviteleri artmış ancak<br />
GSH-Px aktivitesindeki artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. KAT enziminin<br />
H2O2’nin yüksek konsantrasyonlarda bozunumunda rol oynadığı dikkate alınacak olursa<br />
bu artış akciğerlerde fazla miktarda H2O2 açığa çıktığı fikrini akla getirebilir. Kronik<br />
akciğer enfeksiyonlarında indüklenebilir NOS ekspresyonunun artmasına karşın, enzim<br />
aktivitesinde bir artış olmadığı sıçanlarda yapılan çalışmada bildirilmiştir (Hopkins, 2003).<br />
Çalışmamızda serum ve trake dokusunda nitrit düzeyinin artması bakteriyel enfeksiyonlara<br />
karşı NO salınımının artması açısından beklenen bir sonuçtur. Ancak akciğer dokusundaki<br />
NO düşüşü ile ilgili yorum yapabilmek için bu konuyla ilgili daha detaylı çalışmalara<br />
ihtiyaç olduğu görülmektedir.<br />
Resim 1. ORT izolatlarından elde edilen DNA’ların PZR’de analizi sonucu oluşan 784 bp<br />
uzunluğundaki bantları gösteren ethidium bromide ile boyanmış %1,5’luk bir agaroz jel. M: DNA<br />
ladder, N: Negatif kontrol, P: Pozitif kontrol, lanes 1,2,3,4,5,6,7,8,9: ORT isolates<br />
237
Resim 2: ORT B 3263 /91 (serotip A) ile infekte edilen bir tavukta, postinokülasyon 1.<br />
haftada akciğerlerde bronşial lymphoid doku (BALT)’de nekroz, yangısal hücre<br />
infiltrasyonu ve hemoraji. HE X 200<br />
Resim 3: ORT B 3263 /91 (serotip A) ile infekte edilen bir tavukta, postinokülasyon<br />
1.haftada, hava kesesinin mukozal yüzeyinde epiteliyal hiperplazi. HE X 200<br />
238
Resim 4: ORT B 3263/9 (serotip A) ile infekte edilen bir tavukta, postinokülasyon<br />
3.haftada, hava kesesinde epiteliyal dejenerasyon ve nekroz ile propriada yangısal hücre<br />
infiltrasyonu. HE X 200.<br />
Resim 5: ORT B 3263/9 (serotip A) ile enfekte edilen bir tavukta, postinokülasyon<br />
1.haftada, tracheanın lamina propriasında yangısal hücre infiltrasyonu (oklar), lamina<br />
epitliyaliste dejenerasyon, nekroz ve deskuamasyon. HE X 100<br />
239
9. LİTERATÜR LİSTESİ<br />
1. Abdul-Azız, T.A., Weber, L.J. (1999). Ornithobacterium rhinotracheale infection in a turkey flock<br />
in Ontonorio. Can. Vet. J., 40: 349-350.<br />
2. Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105: 121-126.<br />
3. Akdoğan, M., Gültekin, F., Kaleli, S., Koyu, A., Gençgönül M. (1999). Bronşial astımlı hastalarda<br />
antioksidan enzim ve melatonin düzeylerinin araştırılması. Van Tıp Dergisi. 6(1): 16-19.<br />
4. Aksu, N., Armutcu, F., Kart, L., Gürel, A., Demircan, N., Ünalacak, M. Yetişkin astımlı hasta<br />
serumlarında lipid peroksidasyonu ve antioksidan enzim aktivitelerinin değerlendirilmesi. Türkiye<br />
solunum Araştırmaları Dergisi. Baskıda.<br />
5. Amonsin, A., Wellehan, X.F., Vandamme, P., Lındeman, C., Edman, M., Robınson, A.R., Back, A.,<br />
Gıreesh, R., Halvorson, D., Nagaraja, K. (1996). Experimental studies of Ornithobacterium<br />
rhinotracheale (ORT) infection. Proceedings of the 46. Western Poultry Diseases Conference, pp: 7-<br />
8, Sacremento.<br />
6. Back, A., Sprenger, S., rajashekara, G., Halvoron, D.A., Nagaraja, K.V.(1997). Antimicrobial<br />
sensitivity of Ornithobacterium rhinotracheale isolatedfrom different geographic locations. The 48 th<br />
North Central Avian Diseases Conference. Des Moines. Iowa. pp: 1- 3, October, 12-14.<br />
7. Back, A., Rajashekara, G., Jermıah, R.B., Halvorson, D.A., Nagaraja, K.V.(1998). Tissue<br />
distrubition of Ornithobacterium rhinotracheale in experimentally infected turkeys. Vet.Rec., 143:<br />
52-53.<br />
8. Barnes, P.J. (1995). Nitric oxide and airway disease. Ann Med. 27; 389-93.<br />
9. Beutler, E. A . (1975). Manual of Biochemical Methods.2 nd Ed. Grunef Strottan. New York.<br />
10. Cadogan, E., Hopkins, N., Giles, S., Bannigan, J.G., Moynihan, J., McLoughlin, P. (1999).<br />
Enhanced expression of inducible nitric oxide synthase without vasodilator effect in chronically<br />
infected lungs. Am J Physiol. 277(3 Pt 1): L616-27.<br />
11. Clini E, Ambrosino N. (2002). Nitric oxide and pulmonary circulation. Med Sci monit. 8:RA178-82.<br />
12. Canal, C.W., S.L.S. Rocha, J. A.Leao, L.C.B. Fallavena, S.D. Oliveira, and N. Beltrao.<br />
(2003).Polymerase chain reaction (PCR) detection of Ornithobacterium rhinotracheale (ORT).<br />
Cienc. Rural. 33: 371-373.<br />
13. Charlton, B.R., Channing –Santiago, S.E., Bickford, A.A., Cardona, C.J., Chin R.P., Cooper, C.L.,<br />
Droual, R., Jeffrey, J.S., Meteyer, C.U., Shivaprasad, H.L., Walker, R.L. (1993). Preliminary<br />
Characterization of a Pleomorphic Gram-Negative Rod Associated with Avian respiratory Disease.<br />
J. Vet .Dıagn. Invest. 5: 47-.51.<br />
14. Davidson, C.A., Kaminski, P.M., Wu, M., Wolins, M.S. (1996). Nitrogen dioxide causes pulmonary<br />
arterial relaxation via thiol nitrosation and NO formation. Am j Physiol. 270; H1038-43.<br />
15. Demiryürek AT, Wadsworth RM. (1999). Superoxide in the pulmonary circulation. Pharmacol Ther.<br />
84:355-65.<br />
16. Denis Malvy, J.M., Lebranchu, Y., Richard, M.J., Arnaund, J., Favier, A. (1993). Oxidative<br />
metabolism and severe asthma in children. Clin Chim Acta. 218: 117-120.<br />
17. Devrıese, L.A., Hommez, J., Vandamme, P., Kestes, K., Haesebrouck. (1995). In vitro antibiotic<br />
sensitivity of Ornithobacterium rhinotracheale strains from poultry and wild birds. Vet. Rec., 137,<br />
435-436.<br />
18. Erganiş, O., Ateş, M., Hadimli, H., Çorlu, M. (2002). Tavuk ve Hindilerde O. rhinotracheale<br />
İzolasyonu. Turk. J. Vet. Anim. Sci., 61, 208-211.<br />
19. Erganiş, O., Ateş, M., Hadimli, H.H., Çorlu, M. (1999). Tavukçuluk İşletemelerinde<br />
Ornithobacterium rhinotracheale’nin araştırılması. S.Ü. Araştırma Fonu. Proje 97/061.<br />
20. Fabris, G., Valentina, D.M., Gavazzi, L., Gozzini, P., Tosi, G. (1998). Up to date on the Most<br />
Frequent Tırkey Diseases of the Current Year and Serology Investigation, 1 st . International<br />
Symposium on Turkey Diseases, Pp: 107- 9, 19- 21 February, Berlin, Germany.<br />
21. Gow, A.J., Thom, S.R., Ischiropoulos H. (1998). Nitric oxide and peroxynitrite-mediated<br />
pulmonary cell death. Am j physiol. 274: L112-8.<br />
22. Hafez, H.M. (1996). Current Status on the Role of Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) in<br />
Respiratory Disease Complexes in Poultry. Arch.Geflügelk., 60: 208-211.<br />
23. Hafez, H.M., Beyer, W. (1997). Preliminary İnvestigation on Ornithobacterium rhinotracheale<br />
“ORT” İsolates Using PCR-fingerprints. 11 th Int. Cong. Wrld.Vet.Assoc., pp: 51, 18-22 August<br />
1997 Budapest, Hungary.<br />
24. Hafez, H.M. (1998). Current Status on the Laboratory Diagnosis of O.rhinotracheale “ORT” in<br />
Poultry. Berl. Münch. Tierarztl. Wschr., 111: 143-145.<br />
25. Hafez, H.M. (2000). Factors of Influencing Turkey Diseases. Wrld. Poult., Elseiver Special. 6- 19.<br />
26. Hafez, H.M. (2002). Diagnosis of Ornithobcterium rhinotracheale. The 5th. National Congress of<br />
Veterinary Microbiology (With İnternational Guest speakers), 24- 26 September, Konya, Turkey.<br />
240
27. Halliwell, B. (1989). Oxidants and the central nervous system: Some fundamental questions. Acto<br />
Neurol Scand. 126:23-33.<br />
28. Halliwell B and Gutteridge J. (1996). free radicals in biology and medicine(2 nd ed). 11-21.<br />
29. Hinz, K.H., Blome, C., Ryll, M. (1994). Acute Exudative Pneumonia and Airsaculitis Associated<br />
with Ornithobacterium rhinotracheale in Turkeys, Vet. Rec. 135: 233- 234.<br />
30. Hinz, K., Hafez, H.M. (1997). The early history of Ornithobacterium rhinotracheale (ORT). A.<br />
Geflugelk., 61: 95-96.<br />
31. Hopkins, N., Cadogan, E., Giles, S., Bannigan, J., McLoughlin, P. (2003). Type 2 nitric oxide<br />
synthase and protein nitration in chronic lung infection. J Pathol. 199(1); 122-9.<br />
32. Jones, R.C. (1998).Respiratory Diseases. 4 th Asia-Passific Poultry Health Conference. pp: 75-84, 22-<br />
26 November, Melbourne, Australia.<br />
33. Joubert, P., Higgins, R., Laperle, A., Mikalien, I., Venne, D., Silim, A.(1999). Isolation of<br />
O.rhinotracheale from Turkeys in Quebec, Canada. Avian Dis. 51- 53.<br />
34. Kharitonov, S.A., Yates, D., Robbins, R.A., Logan-Sinclair, R., Shinebourne, E.A, Barnes, P.J.<br />
(1994). Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Lancet. 343; 133-35.<br />
35. Kılınç K. (1985). Oksijen Radikalleri: Üretilmeleri, fonksiyonları ve toksik etkileri. Biyokimya<br />
Dergisi. 2:59-89.<br />
36. Kwiatkowska, S., Piasecka, G., Zieba, M., Piotrowski, W., Nowak, D. (1999). Increased serum<br />
concentrations of conjugated diens and malondialdehyde in patients with pulmonary tuberculosis.<br />
93(4):272-6.<br />
37. Lamsal, M., Gautam, N., Bhatta, N., Toora, B.D., Bhattacharya, S.K., Baral, N. (2007). –Evaluation<br />
of lipid peroxidation product, nitrite and antioxidant levels in newly diagnosed and two<br />
months follow-up patients with pulmonary tuberculosis. Southeast Asian J Trop Med Public Health.<br />
38(4): 695-703.<br />
38. Lohr JB, MD. (1991). Oxygen radicals and neuropsychiatric ıllness. News and Views. Arch Gen<br />
Psychiatry. 48: 1097-1106.<br />
39. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the folin<br />
phenol reagent. J Biol Chem. 193(1): 265-75.<br />
40. Lyall, F., Young, A., Greer, I.A. (1995). Nitric oxide concentrations are increased in the<br />
fetoplacental circulation in preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 173(3): 714-718.<br />
41. Mante, P.A. (1999). ORT infection. Vet.Sci. Zootecnica International. January. 51- 53.<br />
42. Mccay, P.B., Gibson, D.D., Fong, K.L and Hornbrook, K.R. (1976). Effect of glutathione<br />
peroxidase activity on lipid peroxidation in biological membranes. Biochim Biophys Acta. 431-459.<br />
43. Meister, A., Anderson, M.E. (1980). Glutathione. Ann Rev Biochem 52: 711-760.<br />
44. Merenyi, G., Lind, J., Goldstein, S., Czapski, G. (1988). Peroxynitrous acid homolyzes into *OH<br />
and *NO2 radicals. Chem Res Toxicol. 11; 712-3.<br />
45. Miller D.R., Baehner, R.L. (1990). Blood diseases of infancy and childhood. Sixth ed. The C.V.<br />
Mosby Company. St. Louis. 184:295-304.<br />
46. Minta, Z., Konkcıckı, A., Tomozyk, G., Krasnodebska-Depta, A., Ramza, J. (1998). Current Satatus<br />
of Turkey Diseases in Poland. 1 st . International Symposium on Turkey Diseases. Pp: 120- 127, 19-<br />
21 February Berlin, Germany.<br />
47. Nathan, C.(1992). Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells.FASEB. 6;3051-64.<br />
48. Odor, E.M., Salem, M., Pope, C.R., Sample, B., Prim, M., Vance, K., Murphy, M. (1997). Isolation<br />
and Identification of O.rhinotracheale from Commercial Broiler Flocks on the Delmarwa Peninsula.<br />
Avian Dis. 41: 257- 260.<br />
49. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. (1979). Assay for lipid peroxides in animal tissues by<br />
thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem. 95: 351-358.<br />
50. Ozkan, M., Dweik, R. (2001). Nitric oxide and airway reactivity. Clin Pulm Med.8;199-206.<br />
51. Persinger R.L., Poynter, M.E., Ckless, K., Jansenn-Heininger, Y.M. (2002). Molecular mechanisms<br />
of nitrogen dioxide induced epithelial injury in the lung. Mol Cell Biochem. 234-235; 71-80.<br />
52. Powell, C.V., Nash A.A., Powers, H.J., Primhale, R.A. (1994). Antioxidant status in asthma. Pediat<br />
Pulmonology. 18(1): 34-38.<br />
53. Roepke, D.C., Back, A., Shaw, P., Nagaraja, K.V., Sprenger, S.J., Halvorson, A.D. (1998). Isolation<br />
and İdentification of Ornithobacterium rhinotracheale from Commercial Turkey Flocks in the Upper<br />
Midwest. Avian Dis. 42: 219- 221.<br />
54. Ryll, M., Hınz, K.H. (1997). Pathogenicity of Ornithobacterium rhinotracheale for chicken Under<br />
Experimental Conditions. 11 th Int.Cong., Wrld. Vet. Poult. Assoc. 8- 22 August, 1997 Budapest,<br />
Hungary.<br />
55. Sakai, E., Tokuyama, Y., Nonaka F., Ohishi, S., Ishikawa, Y., Tanaka, M., Taneno, A.(2000). O.<br />
Rhinotracheale İnfection in Japan: Preliminary Investigatişons. Vet Rec. 146: 502-503.<br />
241
56. Schleifer, J. (1997). ORT in turkeys, broilers has more questions than answers. Poultry Digest. July,<br />
14-17.<br />
57. Sommer, F. (2000). Detection of Antibodies Against Ornithobavteium rhinotracheale in Austrian<br />
Turkey Flocks by ELISA, 3 rd . Turky Disease Symposium, 4-7 June, Berlin, Germany.<br />
58. Sprenger, J.S., Back, A., Shaw, P.D., Nagaraja, V.K., Repke, D.C., Halvorson, A.D. (1998).<br />
Ornithobacteium rhinotracheale İnfection in Turkeys: Experimental Reproduction of the Disease.<br />
Avin Dis., 42: 154-61.<br />
59. Sprenger, J.S., Halvarson, A.D., Shaw, P.D., Nagaraja, V.K. (2000). Ornithobacterium<br />
rhinotracheale İnfection in Commercial Laying-Type Chickens. Avian Dis. 44: 549- 555.<br />
60. Szalay, D., Glavitis, R., Nemes, C.S., Kosa, A., Fodor, L. (2002). Clinical Signs and Mortlity<br />
Caused by Ornithobacterium rhinotracheale in Turkey Flocks, Acta Vet. Hung., 50(3): 207-305.<br />
61. Tahseen, A. (1997). O.rhinotracheale Developing into a Serious İnfection. World. Poult. Misset. 3:<br />
47- 48.<br />
62. Tietz, N.W. (1986). Textbook of Clinical Chemistry. WB. Sounders Company Philadelphia, 1532-<br />
1534.<br />
63. Travers, A.F. (1996). Concomitant Ornithobacterium rhinotracheale and Newcastle Disease<br />
İnfection in Broilers in South Africa. Avian Dis. 40: 488- 490.<br />
64. Turan N, Ak S. (2002). Investigation of the Presence of O.rhinotracheale in Chickens in Turkey and<br />
Determination of the Seroprevalance of the İnfection Using Enzym-Linked Immunosorbent Assay.<br />
Avian Dis. 46(2): 442- 446.<br />
65. Uslu, C., Taysi, S., Bakan, N. (2003). Lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in<br />
experimental maxillary sinusitis. Ann Clin Lab Sci. 33(1): 18-22.<br />
66. Van Empel, P., Bosch, H., Goovaerts, D., Storm, P. (1996). Experimental İnfection in Turkeys and<br />
Chickens with Ornithobacterium rhinotracheale. Avian Dis. 40, 858- 864.<br />
67. Van Empel, P., Vrijenhoek, M., Goovaerts, D., Bosch, H. (1999a). Immunohistochemical and<br />
Serological İnvestigation of Experimental Ornithobacterium rhinotracheale İnfection in Chickens.<br />
Avian Pathol. 28: 187- 193.<br />
68. Van Empel, P., Vrijenhoek, M., Goovaerts, D., Bosch, H. (1999b). Molecular characterisation of<br />
Ornithobacterium rhinotracheale.Avian Dis., 42: 567-578.<br />
69. Van Empel P., Hafez, H.M. (1999). Ornithobacterium rhinotracheal: a review. Avian Pathol. 28:<br />
217- 227.<br />
70. Vandamme, P., Segers, P., Vancanneyt, M., Hove, K., Van Mutters, R., Hommez, J., Dewhırst, F.,<br />
Paster, B., Kersters, K., Falsen, E., Devrıese, L.A., Bısgaard, M., Hınz, K.H., Mannheım, W. (1994).<br />
Ornithobacterium rhinotracheale gen. Nov. Sp. Nov. Isolated from the avian respiratory Tract. Int. J.<br />
Syst. Bacteriol. 44: 24-37.<br />
71. Van Veen, L.V., Van Empel, P., Fabrı, T. (2000). ORT, a primary pathogen in broilers. Avian Dis.<br />
44: 896- 900.<br />
72. Yagi, K. (1984). Assay for Blood Plasma or Serum. Methods Enzymol. 105: 328-331.<br />
10. ÖZGEÇMİŞ<br />
1970 Elazığ doğumluyum. İlk, Orta ve Lise tahsilimi Elazığ’da tamamladım.<br />
1989’da girmiş olduğum Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi’nden 1994’de mezun<br />
oldum. F.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü’nün 1996 yılı Eylül ayında açmış<br />
olduğu doktora sınavında, Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’nda doktora<br />
yapmaya hak kazandım. 1997 yılında Araştırma Görevlisi kadrosuna<br />
atandım.17.03.2003’de doktoramı tamamladım. 16.10.2002 tarihinde Elazığ Veteriner<br />
Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü’ne Veteriner Hekim olarak atandım. 5 yıl<br />
Teşhis Laboratuarı Şefi olarak çalıştıktan sonra 4 Aralık 2007 tarihinde naklen olarak<br />
Sivrice Meslek Yüksekokuluna Yardımcı Doçent olarak atandım. Halen aynı görvime<br />
devam etmekteyim. TAGEM ve TÜBİTAK’ın araştırma gruplarında sununlan ve kabul<br />
edilen projelerde yürütücü ve yardımcı araştırmacı olarak görev aldım. Evli ve iki çocuk<br />
annesiyim.<br />
242
TAVUKLARDA DENEYSEL SALMONELLA ENTERİTİDİS<br />
ENFEKSİYONLARINDA ETKENİN SAPTANMASI VE ANTİBİYOTİK<br />
KULLANIMININ BAZI BİYOKİMYASAL PARAMETRELER ÜZERİNE ETKİSİ<br />
Dr. Fulya BENZER, Dr. Ayşe KILIÇ, Doç. Dr. Seval YILMAZ,<br />
Doç. Dr. Hasan Basri ERTAŞ, Doç. Dr. Necati TİMURKAAN<br />
Elazığ Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
1. ÖNSÖZ<br />
Salmonella türleri arasında Salmonella enteritidis (S. enteritidis) önemli bir yere<br />
sahiptir. Tavuklara ağız yoluyla S. enteritidis etkeni verilerek deneysel salmonellosis<br />
oluşturulmuştur. İnokulasyonu takiben 3. günden başlamak üzere örnekler alınarak<br />
bakteriyolojik etken izolasyonu yapılmıştır. Uygulama sonunda kan ve doku örnekleri<br />
alınarak malondialdehid (MDA), nitrik oksit (NO) düzeyleri ile glutatyon peroksidaz<br />
(GSH-Px) ve katalaz (KAT) aktiviteleri ölçülmüştür.<br />
Bu çalışma Elazığ VKAE deneme ünitelerinde yapılmış ve Fırat Üniversitesi<br />
Veteriner Fakültesi Biyokimya, Mikrobiyoloji, Patoloji Ana Bilim Dalları ile ortaklaşa<br />
olarak yürütülmüştür.<br />
2. ÖZ<br />
Salmonella insan ve <strong>hayvan</strong> <strong>sağlığı</strong>nı tehdit eden önemli hastalıklar arasındadır.<br />
Türkiye ve dünyadaki salmonellosisten kaynaklanan gıda zehirlenmelerinin en önemli<br />
kaynağı kanatlı et ve yumurtasıdır.<br />
Bu çalışma, tavuklarda deneysel S. enteritidis enfeksiyonlarında etkenin saptanması<br />
ve antibiyotik kullanımının bazı biyokimyasal parametreler üzerine etkisini araştırmak<br />
amacıyla yapıldı.<br />
Araştırmada kullanılan broiler tavuklar her grupta 15 <strong>hayvan</strong> olacak şekilde 4 gruba<br />
ayrıldı. Birinci grup kontrol grubu olarak ayrılırken, grup 2, 3, 4’teki tavuklara sırasıyla tek<br />
doz ağız yoluyla (peros) S. enteritidis suşu (0.1 ml’sinde 10 9 bakteri ihtiva eden<br />
inokulumlar), tek doz S. enteritidis uygulamasını takiben 15. gününden itibaren 9 gün<br />
süreyle enrofloksasin (10mg/kg/gün), 9 gün süre ile tek başına enrofloksasin<br />
(10mg/kg/gün) içme sularına katıldı. İnokulasyonu takiben 3. günden başlamak üzere<br />
örnekler alınarak bakteriyolojik etken izolasyonu yapıldı. Uygulama sonunda kan ve doku<br />
örnekleri alınarak MDA, NO düzeyleri ile GSH-Px ve KAT aktiviteleri ölçüldü.<br />
Serum MDA düzeyleri kontrole göre bütün gruplarda arttı, en fazla artış tek başına<br />
antibiyotik verilen grupta görüldü. Eritrosit KAT aktivitesi ve serum NO düzeyi hiçbir<br />
grupta değişmezken, eritrosit GSH-Px aktivitesi her üç grupta da kontrole göre düştü.<br />
Karaciğer MDA düzeyi ve GSH-Px aktivitesi hiçbir grupta değişmedi. NO düzeyi<br />
sadece antibiyotik verilen gruplarda (Salmonella+Antibiyotik, Kontrol+Antibiyotik) arttı.<br />
KAT aktivitesi sadece antibiyotik verilen gruplarda (Salmonella+Antibiyotik,<br />
Kontrol+Antibiyotik) düştü.<br />
Bağırsak dokusunda GSH-Px aktivitesi hiçbir grupta değişiklik göstermedi. KAT<br />
aktivitesi ve NO düzeyi kontrole göre bütün gruplarda düşüş gösterdi. MDA düzeyi<br />
Salmonellalı ve antibiyotik verilen kontrol grubunda (Kontrol+Antibiyotik) düştü.<br />
Anahtar kelimeler: Salmonella enteritidis, Enrofloksasin, MDA, NO, GSH-Px,<br />
CAT<br />
243
3. ABSTRACT:<br />
Salmonella is among the important diseases which threaten human and animal<br />
health. It has been reported that cause of food poisoning originated from salmonellosis is<br />
mainly poultry meat and eggs in Turkey as in the world.<br />
This study was conducted to investigate the effect of antibiotic use on some<br />
biochemical parameters and isolation of agent experimentally infected chickens with<br />
Salmonella enteritidis.<br />
Broiler chickens were divided into 4 groups, each consisting of 15 animals. Group<br />
1 was used as control group; Group 2 orally received a single dose of Salmonella<br />
enteritidis strain (109 bacteria in 0.1 ml); Group 3 orally received a single dose of S.<br />
enteritidis strain (109 bacteria in 0.1 ml) and enrofloxacin (10mg/kg/day) in drinking water<br />
for 9 days beginning from 15th day post administration and Group 3 was administered<br />
enrofloxacin (10mg/kg/day) in drinking water for 9 days. Beginnig from 3 day<br />
postinfection, samples were collected and bacterial isolation was done. At the end of the<br />
experiment blood and tissue samples were collected and MDA, NO, GSH-Px and CAT<br />
activities were determined.<br />
Serum MDA levels increased in all study groups compared to controls, being<br />
highest in antibiotic-administered group. Erytrocyte GSH-Px activity and levels of serum<br />
NO decreased in all study groups compared to controls whereas erythrocyte CAT activity<br />
did not change among groups.<br />
There was no change levels of MDA and GSH-Px activity in liver. Levels of NO<br />
increased only groups given antibiotic (Salmonella+Antibiotic and Control+Antibiotic).<br />
Activity of CAT decreased only groups given antibiotic (Salmonella+Antibiotic and<br />
Control+Antibiotic).<br />
Intestinal GSH-Px activity didn’t change in all groups. Activity of CAT and levels<br />
of NO decreased in all groups compared the control group. Levels of MDA increased in<br />
control groups given salmonella and antibiotic.<br />
Key Words: Salmonella enteritidis, Enrofloksasin, MDA, NO, GSH-Px, CAT<br />
4. GİRİŞ<br />
Enterobacteriaceae familyasında yer alan Salmonellalar tarafından oluşturulan<br />
Salmonellozis, tüm dünyada yaygın olarak görülen, kanatlı <strong>hayvan</strong>larda verim<br />
düşüklüğüne ve ölümlere neden olan zoonoz bir enfeksiyondur. Enfeksiyon, başta S.<br />
pullorum, S. gallinarum, S. typhimurium ve S. enteritidis olmak üzere birçok Salmonella<br />
türü tarafından oluşturulmaktadır. Diğer Salmonellaların tüm özelliklerini taşıyan S.<br />
enteritidis’in neden olduğu enfeksiyonların son yıllarda tüm dünyada olduğu gibi özellikle<br />
Türkiye’de insanlarda gastroenteritis olgularıyla artış gösterdiği birçok araştırma ile<br />
saptanmıştır. İnsanlarda enfeksiyon kaynağının özellikle tavuk eti ve yumurta olduğu<br />
bildirilmiştir. Bu nedenle de kanatlılardaki Salmonella enfeksiyonları halk <strong>sağlığı</strong><br />
açısından da potansiyel bir tehlike oluşturmaktadır.<br />
Salmonella enfeksiyonlarında mikroskopik olarak görülen nötrofil infiltrasyonu ise<br />
reaktif oksijen türlerinin (ROT) en önemli kaynaklarıdır. Serbest radikallerin en önemli<br />
göstergesi hücre membranında yıkıma yol açan lipid peroksidasyonudur (LPO). LPO<br />
hücre membranında bulunan poliansature yağ asitlerinin serbest oksijen radikalleri<br />
tarafından peroksitler, alkoller, aldehitler, yağ asitleri, etan ve pentan gibi ürünlere<br />
yıkılması reaksiyonudur. Serbest radikallerin biyolojik etkileri vitamin A, C, E, glutatyon<br />
ve antioksidant enzimler (GSH-Px, GR, SOD, KAT gibi) tarafından kontrol edilir.<br />
Makrofajlar tarafından sentez edilen NO ise bakteriyel enfeksiyonlara verilen ilk cevaptır.<br />
244
Florokinolonlar insan ve <strong>hayvan</strong>larda kullanılan en faydalı antimikrobial ajanlardır.<br />
Enrofloksasin veteriner hekimlikte solunum ve sindirim sistemi hastalıklarının tedavisi için<br />
kullanılmaktadır.<br />
Bu araştırmada, tavuklarda deneysel olarak oluşturulan salmonellosiste serbest<br />
radikal hasarı ve antioksidant enzim sisteminde meydana gelen değişiklikler ile antibiyotik<br />
kullanımının bu parametreler üzerine etkileri araştırılmıştır.<br />
5. LİTERATÜR ÖZETİ<br />
Gram negatif özellikteki salmonella’ların çok sayıda türü mevcuttur (Minor, 1984).<br />
Bu türler içerisinde yer alan ve genellikle enterik enfeksiyonlardan izole edilen S.<br />
enteritidis ve faj tiplerinin (PT) doğal vakalardaki varlığı, şekillenen patolojik lezyonları<br />
(Baskerville, 1992; Casebolt, 1988) ve patojeniteleri ile ilgili bilgiler mevcuttur (Poppe,<br />
1993). Civcivlerde PT 4, PT 13a, PT 7 ve PT 8 ile yapılan çalışmalarda PT4 ve PT 13a’da<br />
sekal kolonizasyonunun PT7 ve PT8’e göre daha fazla olduğu, PT 4’ün özellikle gıda<br />
zehirlenmelerinden izole edildiği ve daha invaziv karekter taşıdığı bildirilmiştir (Poppe,<br />
1993).<br />
Lipopolisakkarit (LPS) gram negatif bakterilerin dış duvarında bulunan, bakterinin<br />
yaşamı için gerekli olan bir maddedir (Amersfoort ve ark., 2003). LPS immun sistemi<br />
uyarır, bunun haricinde hücresel savunma ve bakterinin öldürülmesi için gerekli olan<br />
reaktif oksijen türleriyle NO salınmasını aktive eder (Amersfoort ve ark., 2003; Lin ve<br />
ark., 2006; Victor ve ark., 2005). LPS’nin yüksek konsantrasyonları septik şok ve multiple<br />
organ yetersizliklerine sebep olmaktadır (Victor ve ark., 2005). Endotokseminin zararlı<br />
etkisine rağmen organizmanın düşük dozda LPS’ye maruz kalması hastalık<br />
oluşturmaksızın immun sistemin atakta olmasını sağlar (Mohlen ve ark., 1995).<br />
Antibiyotiklerin serbest radikal hasarı üzerine etkileri çeşitli çalışmalarla<br />
araştırılmış ve bu çalışmalar sonucunda antibiyotiklerin serbest radikal hasarının göstergesi<br />
olan MDA’yı artırdığı ve antioksidant sistemi ise zayıflattığı ortaya koyulmuştur (Gürbay<br />
ve ark., 2001; Parlakpınar ve ark., 2004; Pari ve Gnanasoundari., 2006; Oz ve Ilhan,<br />
2006).<br />
Diareye sebep olan hastalıklar sırasında gastrointestinal bölgedeki mukozal<br />
permeabilite değişir. Bazı gastrointestinal hastalıkların patofizyolojisinde oksijen kaynaklı<br />
radikallerin rolü vurgulanmıştır (Nalini ve ark., 1993; Grisham ve ark.,1990). Süperoksit<br />
radikalleri, hidrojen peroksit, hipoklorus asit gibi reaktif oksijen türleri mukoza ve<br />
lumende yaygın olarak üretilmektedir (Parks, 1989). Yangısel durumlarda damar<br />
endoteliumu oksijen üretir (Oshitani ve ark., 1993). Oluşan bu reaktif oksijen türlerinin<br />
(ROT) kimyasal reaksiyon güçleri oldukça fazladır ve hücredeki DNA, lipit, protein ve<br />
karbonhidrat gibi hücresel komponentlere zarar verebilirler (Gutteridge, 1977).<br />
Gastrointestinal bölgede bulunan SOD, KAT, GSH-Px gibi farklı antioksidanlar bu reaktif<br />
oksijen türlerini inaktive ederler.<br />
Salmonella enfeksiyonlarında serbest radikal hasarı ile antioksidant enzimler<br />
arasındaki ilişkiyi inceleyen çalışmalar mevcuttur. (Mehta 98a,98b, 99a, 99b; Popkova 84).<br />
Bu çalışmada ağız yoluyla Salmonella enteritidis suşu verilen piliçlerde serbest<br />
radikal hasarı ile antioksidan aktivitenin ne şekilde etkilendiği, ayrıca bu hastalığın<br />
tedavisinde en etkili antibiyotik olan enrofloksasinin bu parametreler üzerine ne şekilde<br />
etki ettiğine bakılması amaçlanmıştır.<br />
245
6. MATERYAL VE METOT<br />
6.1. Deneme Grupları<br />
Çalışmada kullanılacak civcivler 1 günlük olarak alındı ve 15 günlük oluncaya<br />
kadar civciv büyütme yemi ile beslendi. Daha sonra aşağıda belirtildiği gibi dört ayrı gruba<br />
ayrılarak deneysel çalışma yürütüldü. Salmonella suşu: S. enteritidis suşu<br />
Dr.A.A.Mohamed Hatha (Department of Biology, The University of the South Pacific,<br />
Private Mail Bg, Suva,FIJI)’dan temin edildi.<br />
1. Kontrol Grubu: 34 günlük oluncaya kadar normal yemle beslenerek kesildi, gerekli<br />
kan ve doku örnekleri alındı.<br />
2. Salmonellalı Grup: 15 günlük piliçlere S. enteritidis suşu ağız yoluyla (0.1 ml’sinde<br />
10 9 bakteri ihtiva eden inokulumlar) verildi, verildikten sonraki 18. günde yani <strong>hayvan</strong>lar<br />
34 günlük iken kesilerek gerekli kan ve doku örnekleri alındı.<br />
3. Salmonella + Antibiyotik Grubu: Kontrol grubu <strong>hayvan</strong>lara 9 gün boyunca<br />
enrofloksasin (10mg/kg/gün) verildi, 38 günlük iken kesilerek gerekli kan ve doku<br />
örnekleri alındı.<br />
4. Kontrol + Antibiyotik Grubu: Enfeksiyon etkeni verildikten 15 gün sonra<br />
enrofloksasin (10mg/kg/gün) uygulamasına başlandı ve 9 günlük antibiyotik<br />
uygulamasının sonucunda <strong>hayvan</strong>lar 38 günlük iken kesilerek gerekli kan ve doku<br />
örnekleri alındı.<br />
6.2. Laboratuar Analizleri<br />
6.2.1. Bakteriyolojik Muayeneler<br />
Etken izolasyonu için tavukların karaciğer ve dalaklarından Mac Conkey Agara<br />
ekim yapıldı ve besi yerleri aerobik şartlarda 37 ºC’de 24-48 saat inkube edildi. Bağırsak<br />
içeriğinden ise Rappaport Vassiliadis Soya Pepton Broth’a ekim yapılarak 43ºC’de 18-24<br />
saat inkübasyona bırakıldı. Bu süre sonunda bu besi yerinden Brillant Gren Agara geçildi<br />
ve 37 ºC’de 24-48 saat aerobik ortamda inkube edildi (Bilgehan, 1992; Barrow, 1995;<br />
Bekar, 1995). Salmonella şüpheli kolonilerden hazırlanan preparatlar Gram boyama ile<br />
boyandı. Gram negatif, çomak şeklinde görülen bakterilerin biyokimyasal ve antijenik<br />
özellikleri kontrol edildi (Bilgehan, 1992; Lassen, 1975).<br />
6.2.2. Histopatolojik Muayeneler<br />
Histopatolojik muayene için, iç organlardan (karaciğer, dalak, bağırsaklar, kalp,<br />
böbrekler olmak üzere) alınan doku örnekleri % 10’luk nötral formalin solüsyonunda tespit<br />
edildi. Hazırlanan parafin blokları, 5 mikrona ayarlanmış mikrotomda kesilerek<br />
Hematoxylin-Eosin (HE) ile boyanarak ışık mikroskobunda incelendi.<br />
6.2.3. Biyokimyasal Analizler<br />
Plazma MDA tayini modifiye edilmiş Yagi, dokularda ise Ohkawa yöntemiyle<br />
spektrofotometrik olarak yapıldı. Bu metot lipid peroksidasyonunun aldehid ürünlerinden<br />
biri olan MDA ile tiobarbitürik asit (TBA)’in reaksiyonu temeline dayanmaktadır. Oluşan<br />
MDA, TBA ile pembe renkli bir kompleks oluşturmakta ve bu çözeltinin absorbansının<br />
532 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçümü ile lipid peroksidasyonunu<br />
derecesi saptanmaktadır.<br />
Eritrosit ve doku KAT aktivitesi Aebi metodu ile ölçüldü. H2O2’nin KAT<br />
tarafından yıkım hızı, H2O2’nin 240 nm dalga boyunda ışığı absorbe etmesinden<br />
yararlanılarak spektrofotometrik olarak ölçüldü.<br />
Eritrosit ve doku GSH-Px enzim aktivitesi Beutler yöntemiyle, NADPH’ın<br />
NADP+’ye yükseltgenmesi sırasındaki absorbans farkının 340 nm’de spektrofotometrik<br />
246
olarak okunmasıyla tayin edildi. Serum ve dokuda NO ölçümü Griess reaksiyonuna göre,<br />
nitrat redüktaz enzimi ile nitrat nitrite indirgenerek total nitrit ölçümü olarak yapıldı.<br />
Protein miktarları Lowry yöntemine göre, Hemoglobin tayini siyanomethemoglobin<br />
yöntemine göre yapıldı.<br />
6.2.4. İstatistiksel Analizler<br />
Gruplar arası farklılığın önemi SPSS 11.5 paket <strong>program</strong>ı kullanılarak varyans<br />
analiz ile, gruplar içindeki farkın derecesi de Duncan testi ile yapıldı.<br />
7. BULGULAR VE TARTIŞMA<br />
Makroskobik olarak, kalp kesesinde sarımtrak boz renkte sıvı birikimi gözlendi.<br />
Karaciğerde hafif ile orta şiddette büyüme, koyu renk değişimi ile toplu iğne başı<br />
büyüklüğünde boz renkte odaklar dikkati çekti. Bağırsaklarda, özellikle sekumda<br />
kalınlaşma ve duvarında sertleşme, mukozada hiperemik bir görünüm ile lumende<br />
kahvemsi renkte yapışkan bir içerik vardı. Dalak ve böbrekler hafif konjesyone bir<br />
görünüm almıştı.<br />
Histopatolojik olarak, deneme grubu tavuklarda olgulara göre lezyonların şiddeti<br />
değişmekle birlikte genellikle benzer histopatolojik bulgular gözlendi. Karaciğerde fokal<br />
nekroz ve mononüklear hücre infitrasyonları dikkati çeken en önemli bulgu idi (Resim 1).<br />
Ayrıca, karaciğerde konjesyon ve kanama odakları, perisentral bölgede vakuoler<br />
dejenerasyon ile Kupffer hücre aktivasyonu gözlendi. Kalp kasında, bazı olgularda nekroz<br />
ve mononüklear hücre infiltrasyonları (Resim 2), konjesyon ve kanama odakları ile kimi<br />
olgularda da perikardda yangısal hücre infiltrasyonlarının oluşturduğu kalınlaşmalar<br />
görüldü. Bağırsaklarda hafif şiddette bir enteritis tablosu görüldü. Lamina epiteliyaliste yer<br />
yer dejenerasyon ve deskuamasyon, villöz atrofi, propriyada mononüklear ve heterofil<br />
hücre infiltrasyonu (Resim 3), konjesyon ve kanama ile birlikte Libernkühn kript epitel<br />
hücrelerinde belirgin hiperplazi gözlendi. Dalakta parankimde kanama ve konjesyon ile<br />
birlikte retiküler hücre hiperplazisi dikkati çekti. Böbreklerde kanama, konjesyon,<br />
tubuluslarda dejenerasyon ile intersitisyel alanda mononüklear ve heterofil hücre<br />
infiltrasyonları gözlendi (Resim 4). Diğer organlarda histopatolojik olarak dikkati çekecek<br />
herhangi bir bulguya rastlanmadı.<br />
Bu çalışmada S. enteritidis verilen civcivlerde etken izolasyonunun karaciğer, dalak<br />
ve bağırsak içeriğinden yapılabildiği ortaya konulmuştur. Salmonella enfeksiyonlarında<br />
enterokolitis ve septisemi tablosunun görüldüğü, başlıca etkilenen organların etkenin<br />
alınış yoluna göre değişmekle beraber karaciğer, dalak, bağırsaklar, akciğer ve böbrekler<br />
olduğu bildirilmektedir (Baskerville, 1992; Casebolt, 1988; Öztürk, 1998; Turnbull, 1973;<br />
Humphrey., 1991).Günlük civcivlerin S. enteritidis ile oral enfeksiyonunda, etkenlerin<br />
ileosekal bölgede görüldüğü saptanmıştır (Turnbull, 1973). Yine aynı çalışmada 2 haftalık<br />
civcivlerde ise sekumun propria mukoza, submukoza ve muskularis mukozasında diffuz<br />
heterofil infiltrasyonları ve ödem görüldüğü kaydedilmiştir.<br />
Yapmış olduğumuz çalışmayla ortaya konulan mikroskobik ve makroskobik<br />
bulguların araştırmacıların bildirmiş olduğu bulgulara benzerlik gösterdiği görülmektedir.<br />
Salmonella enfeksiyonlarında genel olarak karaciğerde fokal nekroz odakları, paratifoid<br />
nodüller, histiosit ve makrofaj infiltrasyonu, dalakta retiküloendotelial hiperplazi ve nekroz<br />
odaklarını varlığı bildirilmektedir (Bakerville, 1992; Turnbull, 1973).<br />
Biyokimyasal analizler sonucu serum MDA düzeyleri kontrolle kıyaslandığı<br />
zaman her üç grupta da artmış, ancak en fazla artış antibiyotik verilen gruplarda<br />
gözlenmiştir. Eritrosit KAT aktivitesi gruplar arasında bir değişiklik göstermezken,<br />
eritrosit GSH-Px aktivitesi her üç grupta da kontrole oranla düşmüş,<br />
247
Salmonella+Antibiyotik verilen gruptaki düşüşün daha fazla olduğu gözlenmiştir. Serum<br />
nitrit düzeylerin de de herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir (Tablo.1).<br />
Karaciğer dokusunda MDA düzeyi ile GSH-Px aktivitesinde herhangi bir değişiklik<br />
gözlenmemiştir. Karaciğer KAT aktivitesi kontrolle kıyaslandığı zaman her üç grupta da<br />
düşmüştür. Nitrit düzeyleri Salmonellalı grupta kontrole oranla istatistiksel olarak anlamlı<br />
olmayan bir artış gösterirken, Salmonella+Antibiyotik ve Kontrol+Antibiyotik verilen<br />
gruplarda anlamlı artışa sebep olmuştur (Tablo.2).<br />
Barsak dokusundaki MDA düzeyleri kontrolle kıyaslandığı zaman Salmonellalı ve<br />
Kontrol+Antibiyotik verilen gruplarda anlamlı bir artış göstermiştir. Antibiyotik<br />
uygulanması Salmonellalı gruptaki MDA artışını normale getirirken, kontrol grubuna<br />
verilen antibiyotik Salmonellalı gruptaki kadar MDA düzeyinde artışa neden olmuştur.<br />
Barsak KAT değerlerine bakıldığı zaman kontrole göre her üç grupta da KAT aktivitesi<br />
düşmüştür. GSH-Px aktivitelerinde hafif bir düşme gözlense de bu istatistiksel olarak<br />
anlamlı düzeyde olmamıştır. Barsak nitrit düzeylerine bakıldığı zaman ise kontrole oranla<br />
bütün gruplarda bir düşme olduğu gözlenmiştir (Tablo.3).<br />
Gram-negatif bakterilerin pek çoğu patojendir, yani, hastalık yapma yetisine<br />
sahiplerdir. Bu hastalık yapma yetisi, gram-negatif hücre duvarının bazı özelliklerinden,<br />
isim vermek gerekirse LPS içeriğinden kaynaklanmaktadır. LPS'ler endotoksinlerdir<br />
(Amersfoort ve ark., 2003). Gram negatif bakteriler arasında yer alan Salmonella türleri<br />
insanlarda tifo dahil olmak üzere şiddetli sistemik enfeksiyonlara neden olabilmektedir<br />
(Blaser ve Newman, 1982). Mikroorganizmaların yayılmalarına karşı makrofajlar<br />
savunmada hayati öneme sahiptirler, ve bunların en önemli bakterisidal etkileri ROT<br />
üretmektir. Üretilen ROT patojenin yayılmasına engel olurlar (Johnston ve ark., 1975).<br />
Makrofajlar tarafından bu yangısel mediatörlerin fazla üretilmesi doku hasarına yol açabilir<br />
(Klimpel ve ark., 1995). Doku hasarının gelişmesi toksik radikallerin üretimi ile dokudaki<br />
antioksidan arasındaki dengeye bağlıdır (Winrow ve ark., 1993).<br />
Oksijenden tek elektron indirgenmesi sonucu oluşan serbest radikaller değişik<br />
birçok reaksiyonla hücre ve dokularda oluşur. Bu radikaller proteinler, lipitler,<br />
karbohidratlar ve nükleik asitleri yıkıma uğratabilir. Poliansature yağ asitlerinin oksidatif<br />
yıkımı olan LPO serbest radikallerin uyardığı hücre yıkımında önemli bir mekanizmadır.<br />
Birçok hastalıkta doku yıkımı serbest radikaller ve LPO sonucu oluşur. Organizmada<br />
serbest radikal reaksiyonları birçok antioksidan sistemi ile kontrol edilir. Antioksidanlar<br />
serbest radikal oluşumunu önleyen veya zincir kıran yapılar olarak işlev görürler.( Şimşek,<br />
1999; Fantone ve Ward, 1982).<br />
Farelere intraperitoneal E.coli LPS injeksiyonu yapılarak oluşturulan endotoksemi<br />
sırasında karaciğer KAT, GSH-Px ve SOD aktiviteleri düşüş, plazma nitrit düzeyleri ise<br />
artış gözlenmiştir (Payabvash ve ark., 2006). Benzer bir başka çalışmada E.coli verilmesi<br />
doku hasarına dolayısıyla LPO’da artışa, antioksidan aktivitede ise düşüşe neden olmuştur<br />
(Kaur ve ark., 1988). Ben-Shaul ve ark.’ları (2001) tarafından yapılan benzer bir çalışmada<br />
ratlara E.coli LPS’i verilmesi sonucu MDA düzeyinde ciddi bir artış, KAT akivitesinde ise<br />
hafif bir yükselme kaydedilmiştir. GSH-Px aktivitesi ise herhangi bir değişiklik<br />
kaydedilmemiştir.<br />
Tavşanlarda deneysel olarak oluşturulan salmonellosiste kan serumunda ve<br />
enterositlerde LPO’da artış gözlenmiş ve bu artışa antioksidan kapasitedeki azalma eşlik<br />
etmiştir (Martynenko ve ark. 1990).<br />
İntraperiotoneal olarak S. enteritidis verilen farelerde, enfeksiyonun verilmesinden<br />
sonraki 5. günden itibaren karaciğer MDA seviyesi ile GSH seviyesi artmış, SOD ve KAT<br />
aktiviteleri ise düşmüştür. Ayrıca aç bırakılarak oluşturulan enfeksiyonda MDA<br />
düzeyindeki artışın ve antioksidan enzim aktivitelerindeki düşüşün daha fazla olması<br />
hastalığın şiddetinde beslenmenin dolayısıyla vücut direncinin etkili olduğunu göstermiştir<br />
248
(Rishi ve ark., 2006). Gram negatif bakterilerden olan Vibrio cholera ile ilgili tavşan<br />
barsağında yapılan bir çalışmada enterositlerdeki antioksidan enzim aktivitelerinde (SOD,<br />
KAT, GSH-Px gibi) önemli derecede bir düşme gözlenmiş ve bu düşüşün oksidanantioksidan<br />
dengenin oksidan lehine bozulmasından kaynaklandığı kanaatine varılmıştır<br />
(Gorowara ve ark., 1998).<br />
Helicobacter pylori gastritli hastaların serum ve plazma oksidan ve antioksidan<br />
konsantrasyonları ile bunların gastrik kanserle olan ilişkisinin araştırıldığı çalışmada,<br />
gastritisli ve gastrit kanserli hastaların serum MDA ve SOD aktiviteleri kontrole oranla<br />
artmış, plazma askorbik asit düzeyinde ise bir düşüş gözlenmiştir. Serum MDA ve SOD<br />
aktivitesindeki artış ve plazma askorbik asit seviyesindeki düşüş gastrit kanserli hastalarda<br />
daha belirgin olarak gözlenmiştir. Serumdaki MDA artışı hücre hasarının göstergesi, SOD<br />
aktivitesindeki artış ise MDA’daki bu artışı telafi etmek amacıyla hücrenin verdiği cevap<br />
olarak yorumlanmıştır. (Khanzode ve ark. 2003).<br />
Mehta ve ark.ları tarafından S. typhimurium enterotoksininin rat enterositleri<br />
üzerine etkilerinin araştırıldığı çalışmada LPO’da artış ve hücre canlılığında bir azalma<br />
olduğu gözlenmiştir. Yapmış olduğumuz çalışmada gram negatif bakterilerden olan<br />
Salmonella enteritidis’in tavuklarda serum MDA düzeyinde artışa, GSH-Px aktivitesinde<br />
ise düşüşe sebep olması yukarıdaki çalışmalarla uyum göstermektedir.<br />
Antibiyotikler antibakteriyel tedavide kullanılmaktadır. Florokinolonlar insan ve<br />
<strong>hayvan</strong>larda kullanılan en faydalı antimikrobial ajanlardır. Enrofloksasin veteriner<br />
hekimlikte solunum ve sindirim bölgesini ilgilendiren hastalıkların tedavisi için<br />
kullanılmaktadır (Brown, 1996). Enrofloksasin gibi florokinolonlar karaciğerde bulunan<br />
Sitokrom P450 gibi mikrosomal enzimler tarafından okside edildiklerinden serbest radikal<br />
üretimine sebep olmaları sonucu LPO’ya sebep olabilirler (Gürbay ve ark., 2001).<br />
Antibiyotiklerin yararlı etkilerine rağmen nefrotoksik ve ototoksik yan etkileri mevcuttur.<br />
Aminoglikozid antibiyotiklerin sebep olduğu nefrotoksitede oksijen radikallerinin rolü<br />
olduğu bilinmektedir. Bu amaçla yapılan bir çalışmada amikasin ilavesi böbrek MDA<br />
seviyesini artırması ve GSH seviyesini düşürmesi bu görüşü desteklemektedir (Parlakpınar<br />
ve ark., 2004).<br />
Enrofloksasinin diete ilavesinin broyler dokularındaki oksidatif stabilitesi üzerine<br />
etkisinin araştırıldığı çalışmada 5 gün boyunca 50 mg/l enrofloksasin basal dietle birlikte<br />
uygulanarak göğüs, bacak ve karaciğerde GSH-Px, SOD ve KAT enzim aktivitelerine<br />
bakılmıştır. Enrofloksasin uygulanmasının karaciğer, kas ve bacakta GSH-Px, SOD ve<br />
KAT aktivitesini etkilememiştir (Carreras ve ark., 2004).<br />
Rat karaciğerindeki oksitetrasiklin kaynaklı oksidatif hasar üzerine naringeninin<br />
etkisinin araştırıldığı çalışmada intraperitoneal oksitetrasiklin 200 mg/kg dozunda 15 gün<br />
süreyle uygulanmış, bunun sonucunda karaciğerde MDA artışı, bunun yanı sıra SOD, CAT<br />
ve GSH-Px gibi antioksidan aktivitede azalma gözlenmiştir. Çalışmamızda antibiyotik<br />
uygulama karaciğer GSH-Px aktivitesini değiştirmezken, KAT aktivitesinde düşüşe sebep<br />
olmuştur. KAT aktivitesindeki düşüş çalışmayla uyum göstermektedir (Pari ve<br />
Gnanasoundari., 2006). Rat böbreğinde oksitetrasiklin kaynaklı oksidatif hasar üzerine<br />
naringen’in etkisinin araştırıldığı bir başka çalışmada, oksitetrasiklin nefrotoksisiteye<br />
sebep olarak serum MDA düzeyinde artışa, SOD, KAT ve GSH-Px aktivitesinde ise<br />
düşüşe neden olmuştur (Gnanasoundari, 2006).<br />
Ratlarda doxorubicin uyarımlı kardiak toksisite üzerine naringenin etkisinin<br />
araştırıldığı bir başka çalışmada, Doxorubucin uygulaması kalpte MDA ve NO düzeyini<br />
artırmış, GSH, SOD ve KAT aktivitesini ise düşürmüştür. Antrasiklin grubu antibiyotikler<br />
de kalp NO seviyesini artırmaktadır. Polat A ve ark.’ları tarafından gentamisin verilerek<br />
ratlarda akut böbrek yetersizliği oluşturulmuş ve antioksidant özelliğe sahip<br />
aminoguanidinin koruyucu etkisi araştırılmıştır. Kontrolle karşılaştırıldığı zaman<br />
249
Gentamisin verilen gruplarda MDA ve nitrit düzeyinde artış, GSH-Px ve KAT<br />
aktivitesinde ise düşüş olduğu gözlenmiştir. Çalışmamızda antibiyotik uygulamasının<br />
serum ve barsak dokusunda MDA düzeylerinde artışa, GSH-Px ve KAT aktivitelerinde ise<br />
düşüşe sebep olması çalışmalarla uyum göstermektedir.<br />
Otokrin ve parakrin bir hücresel ajan olan NO, normal fizyolojik koşullar ile birçok<br />
patofizyolojik durumda homeostazın sürdürülmesinde önemli bir etkendir. NO’nun beyin<br />
ve daha birçok hücre ve organ sistemlerinde üretilerek fizyolojik ve patofizyolojik<br />
olaylarda etkili olduğu ileri sürülmüştür (Davies MG ve ark., 1995). NO pankreasın asiner<br />
hücrelerinde guanozin 3.5-siklik monofosfat (cGMP) sentezini düzenler (Gukovskaya ve<br />
Pandol, 1994). cGMP böbrekler ile beyinde atrial natriüretik faktör, düz kasların<br />
gevşemesi, retinada fototransdüksiyon ve enteroksinlerle ilişkili olarak ince barsağa sıvı<br />
salınımını etkiler (Davies ve ark., 1995). Hastalık ve sonuçlarına bağlı olarak NO zararlı<br />
veya yararlı etkiler gösterebilir (Eiserich, 1998).<br />
NO’nun serbest oksijen radikalleriyle etkileşimi ve antioksidan özellikleri ile ilgili<br />
araştırmalardan elde edilen sonuçlar çelişkilidir. Süperoksidi bağladığı için, NO’nun<br />
serbest radikalleri temizleyen koruyucu bir faktör olduğu düşünülmektedir. Süperoksit ile<br />
NO reaksiyonunun ürünü olan peroksinitrit güçlü ve yarılanma ömrü uzun olan bir<br />
oksidandır. Peroksinitritin parçalanmasıyla yüksek konsantrasyonlarda NO2 oluşur (Kalff,<br />
1999). Oluşan bu reaktif nitrojen bileşikleri lipidler, DNA, tioller, amino asitler ve<br />
metallerle reaksiyona girerek enzim fonksiyonlarını bozar, membran bütünlüğüne zarar<br />
verir ve DNA mutasyonuna neden olabilir (Eiserich, 1998). Bunun sonucunda lipid<br />
peroksidasyon başlar (Kuo, 1995).<br />
Birçok gastrointestinal patolojide NO sentezinde değişiklikler olmaktadır.<br />
Bağırsaktaki nöromüsküler bozuklukların patofizyolojisinde, nöronlarda sentezlenen NO<br />
miktarının ve düz kas hücrelerinin endojen NO’ya hassasiyetlerinin değişmesinin rol<br />
oynayabileceği düşünülmektedir (Davies ve ark., 1995). Bağırsak enflamasyonunda<br />
NO’nun etkileri üzerine çok sayıda çalışma yapılmıştır. Bu <strong>araştırmaları</strong>n bazılarında NO<br />
inhibisyonu dokularda fonksiyon bozukluğu ve hasara neden olurken, bir kısmında da<br />
yararlı etkiler göstermiştir. Elde edilen farklı sonuçlar NO’nun süperoksiti inaktive eden<br />
bir antioksidan olmasının yanı sıra peroksinitrit gibi radikaller üretmesinden<br />
kaynaklanmaktadır (Kuo, 1995).<br />
Sacco ve ark.(2006)’ları tarafından iki farklı koyun türü üzerine yapılan çalışmada<br />
Mannheimia haemolytica LPS’i verilerek yangısel cevap olarak oluşacak NO miktarı<br />
ölçülmüştür. Koyun türlerinden birinde önemli miktarda NO salınırken diğer türde<br />
herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir. Bu durum türler arasındaki doğmasal immun<br />
mekanizmanın farklılığına bağlanmıştır.<br />
Çalışmamızda serum nitrit düzeyi değişiklik göstermezken, karaciğer nitrit seviyesi<br />
artmış, barsak nitrit seviyesi ise düşmüştür. Yapılan çalışmada en fazla barsak<br />
dokusundaki biyokimyasal parametrelerin değişime uğraması hastalıktan en fazla barsağın<br />
etkilendiğinin göstergesidir. Barsakta nitrit seviyesinin düşük olması solunum patlaması<br />
sırasında açığa çıkan H2O2’lerin nitritle reksiyona girerek peroksinitrit oluşumuna<br />
katılmasından kaynaklanmış olabilir. Oluşan peroksinitrit te LPO’da artışa neden olmuş<br />
olabilir. Aynı şekilde bakteriyel enfeksiyona bağlı olarak MDA düzeyinin artması<br />
bakterilerin fagositozu esnasında salınan reaktif oksijen türlerinin aşırı üretimi şeklinde<br />
yorumlanabilir. Barsak ve karaciğer dokusunda GSH-Px aktivitesi değişmezken KAT<br />
aktivitesi azalmıştır. Bilindiği gibi H2O2 KAT ve GSH-Px enzimleri tarafından<br />
uzaklaştırılır. KAT enzimi H2O2’nin yüksek konsantrasyonlarda bozunumunda rol<br />
oynarken, GSH-Px enzimi H2O2’nin düşük konsantrasyonlarında daha etkilidir (Fantone<br />
ve Ward, 1982). KAT enziminin dokularda etkilenmesi H2O2’nin fazla miktarda<br />
250
salınmasından kaynaklanabilir. Kanda GSH-Px’in etkilenmesi ise H2O2’nin dokulara<br />
oranla daha düşük konsantrasyonlarda salınmış olabileceği fikrini akla getirmektedir.<br />
Sonuç olarak antibiyotik kullanımının bakteriyel enfeksiyona benzer sonuçlar<br />
göstermesi antibiyotiklerin yıkıcı etkilerini tekrar göz önüne sermektedir. Bu nedenle<br />
salmonella enfeksiyonlarında antibiyotik kullanımından doğabilecek zararları en aza<br />
indirmek için antibiyotiklerle birlikte antioksidan vitaminlerin verilmesinin uygun<br />
olabileceği kanaatine varılmıştır.<br />
Tablo 1 : Salmonella enfeksiyonunun ve antibiyotik kullanımının serum MDA, nitrit<br />
düzeyleri ile eritrosit KAT ve GSH-Px aktiviteleri üzerine etkisi<br />
Serum MDA Eritrosit KAT Eritrosit GSH- Serum<br />
(nmol/ml) (k/gr Hb) Px<br />
Nitrit<br />
(U/gr Hb) (µmol/L)<br />
Kontrol Grubu 3,04±0,58 c 0,045±0,01 3,43±0,72 a 36,85±0,93<br />
Salmonella Grubu 5,31±2,69 b 0,041±0,01 2,15±0,34 b 37,98±1,37<br />
Salmonella+Antibiyotik<br />
Grubu<br />
6,34±1,83 ab 0,038±0,02 1,61±0,20 c 38,80±0,85<br />
Kontrol + Antibiyotik<br />
Grubu<br />
7,99±2,93 a 0,045±0,01 2,16±0,46 b 37,51±1,20<br />
p 0.05 0.05<br />
Tablo 2: Salmonella enfeksiyonunun ve antibiyotik kullanımının karaciğer MDA, nitrit<br />
düzeyleri ile KAT ve GSH-Px aktiviteleri üzerine etkisi<br />
MDA<br />
KAT GSH-Px Nitrit<br />
(nmol/gr doku) (k/gr protein) (U/gr protein) (µmol/gr<br />
doku)<br />
Kontrol Grubu 2,76±0,19 57,00±4,00 a 252,54±16,61 30,69±1,59 b<br />
Salmonella Grubu 2,10±0,20 47,10±5,33 b 262,31±9,17 34,74±2,44 b<br />
Salmonella<br />
+Antibiyotik<br />
Grubu<br />
2,68±0,26 42,70±4,95 b 267,34±16,90 42,85±1,74 a<br />
Kontrol + Antibiyotik<br />
Grubu<br />
2,58±0,24 39,30±2,82 b 260,50±14,95 42,18±2,00 a<br />
p >0.05 0.05
Tablo 4. S.enteritidis verilen tavukların iç organlarından etken izolasyon durumu<br />
İnokülasyon<br />
sonrası günler<br />
KC D B<br />
3 - - +<br />
7 - + +<br />
11 - - +<br />
15 + + +<br />
19 - - +<br />
23 - - +<br />
27 - - -<br />
29 - - -<br />
KC: Karaciğer, D: Dalak, B: Bağırsak, +: üreme oldu, -: üreme olmadı<br />
Resim 1: Salmonella inoküle edilen bir tavukta, karaciğerde fokal nekroz ve<br />
mononüklear hücre infiltrasyonu. HE. X 200.<br />
Resim 2: Salmonella inoküle edilen bir tavukta, miyokardda yangısal hücre<br />
infiltrasyonu.<br />
252
HE . X 230.<br />
Resim3: Salmonella inoküle edilen bir tavukta, bağırsakta epiteliyal nekroz, villöz atrofi<br />
ve propria mukozada şiddetli yangısal hücre infiltrasyonları. HE X 200.<br />
Resim 4: Salmonella inoküle edilen bir tavukta, böbreklerde intersitisyel nefritis. HE X<br />
200.<br />
8. LİTERATÜR LİSTESİ<br />
1-Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105: 121-126.<br />
2-Arafa, H.M., Abd-Ellah, M.F., Hafez, H.F. (2005). Abatement by naringenin of doxorubicin-induced<br />
cardiac toxicity in rats. J Egypt Natl Canc Inst. 17(4): 291-300.<br />
3-Barrow, P.A. (1995). Recent Progress in the Diagnosis and Control of Salmonella infections in Poultry.<br />
World Organization for Animal Health, 63 rd. General Session. Paris.<br />
4-Baskerville, A., Humphrey, T.J., Fitzgeorge, R.B., Cook, R.W., Chart, H., Rowe, B., Whitehead, A. (1992).<br />
Airborne infection of laying hens with salmonella enteritidis phage type 4. Vet Rec. 130: 395-398.<br />
5-Bekar, M. (1995). Enterobacteriaceae familyası mikroorganizmaların genel karakterleri ve tanı yöntemleri.<br />
Etlik Vet Kont Arşt Enst. Ankara.<br />
6-Ben-Shaul, V., Lomnitski, L., Nyska, A., Zurovsky, Y., Bergman, M., Grossman, S. (2001). The effect of<br />
natural antioxidants, NAO and apocynin on oxidative stress in the rat heart following LPS challenge.<br />
Toxicol Lett. 123(1): 1-10.<br />
253
7-Beutler, E. A . (1975). Manual of Biochemical Methods.2 nd Ed. Grunef Strottan. New York.<br />
8-Bilgehan, H. (1992). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Barış Yayınları. İzmir. 121-135, 387-411.<br />
9-Blaser, M.J., Newman, L.S. (1982). A review of human salmonellosis. I. Infective dose. Rev Infect Dis.<br />
4(6): 1096-106.<br />
10-Brown, S.A. (1996). Fluoroquinolones in animal health. J Vet Pharmacol Ther. 19(1): 1-<br />
11-Carreras, I., Castellari, M., Garcia, Requeiro., J.A, Guerrero L, Esteve-Garcia E, Sarraga C. (2004).<br />
Influence of enrofloxacin administration and alpha-tocopheryl acetate supplemented diets on oxidative<br />
stability of broiler tissues. Poult Sci. 83(5): 796-802.<br />
12-Casebolt, D.B., Schoeb, T.R. (1988). An Outbreak in Mice of Salmonellosis Caused by Salmonella<br />
enteritidis serotype enteritidis. Lab Anim Sci. 38(2): 190-192.<br />
13-Fantone, J.C., Ward, P.A. (1982). Role of oxygen derived free radicals and metabolites in leukocytedependent<br />
ınflamatory reactions. Am J pathol. 107: 397-418.<br />
14-Gnanasoundari M, Pari L. (2006). Impact of naringenin on oxytetracycline-mediated oxidative damage in<br />
kidney of rats. Ren Fail. 28(7): 599-605.<br />
15-Gorowara S, Sapru S, Ganguly N.K. (1998). Role of intracellular second messengers and reactive oxygen<br />
species in the pathophysiology of V. cholera O139 treated rabbit ileum. Biochim Biophys Acta. 1407(1):<br />
21-30.<br />
16-Grisham, M.B., Gaginella, T.S., von Ritter, C., Tamai, H., Be R.M., Granger, D.N. (1990). Effects of<br />
neutrophil-derived oxidants on intestinal permeability, electrolyte transport, and epithelial cell viability.<br />
Inflammation. 14(5): 531-42.<br />
17-Gutteridge, J.M. (1977). The effect of calcium on phospholipid peroxidation. Biochem Biophys Res<br />
Commun. 74(2): 529-37.<br />
18-Gürbay, A., Gonthier, B., Daveloose, D., Favier, A., Hincal, F. (2001). Microsomal metabolism of<br />
ciprofloxacin generates free radicals. Free Radic Biol Med. 30(10): 1118-21.<br />
19-Humphrey, T.J., Chart, H., Baskerville, A., Rowe, B. (1991). The ınfluence of age on the response of spf<br />
hens to ınfecton with salmonella enteritidis pt4. Epidemiol Infect. 106: 33- 43.<br />
20-Johnston, R.B., Kele, B.B., Misra, H.P., Lehmeyer, J.E., Webb, L.S., Baehner, R.L., Rajagopalan, K.V.<br />
(1975). The role of superoxide anion generation in phagocytic bactericidal activity. Studies with normal<br />
and chronic granulomatous disease leukocytes. J Clin Invest. 55(6): 1357-72.<br />
21-Kaur, A., Garg, U.C., Sethi, A.K., Gorowara, S., Sharma, S., Ganguly, N.K. (1988). Effect of various<br />
oxygen free radical scavengers in preventing tissue injury caused by Escherichia coli in pyelonephritic<br />
mice. Biochem Int. 16(6): 1083-93.<br />
22-Khanzode, S.S., Khanzode, S.D., Dakhale, G.N. (2003). Serum and plasma concentration of oxidant and<br />
antioxidants in patients of helicobacter pylori gasritis and its correlation with gastric cancer. Cancer Lett.<br />
195(1): 27-31.<br />
23-Klimpel, G.R., Asuncion, M., Haithcoat, J., Niesel, D.W. (1995). Cholera toxin and salmonella<br />
typhimurium induce different cytokine profiles in the gastrointestinal tract. Infect Immun. 63(3): 1134-7.<br />
24-Lassen, J. (1975). Rapid identification of gram negative rods using a three-tube method combined with a<br />
dichotomic key. Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 83(6). 525-533.<br />
25-Le Minor, L. (1984). Salmonella, bergey’s manuel of systematic bacteriology. Baltimore. 427.<br />
26-Lin, N.T., Yang, F.L., Lee, R.P., et al. (2006). Inducible nitric oxide synthase mediates cytokine release:<br />
the time course in conscious and septic rats. Life Sci. 78(10): 1038-1043.<br />
27-Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the folin<br />
phenol reagent. J Biol Chem. 193(1): 265-75.<br />
28-Lyall, F., Young, A., Greer, I.A. (1995). Nitric oxide concentrations are increased in the fetoplacental<br />
circulation in preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 173(3): 714-718.<br />
29-Martynenko, L.D., Shepeleva, A.P., Simovan’ian, E.N., Zemliankina, L.P., Aleshukina, A.V., Symkova,<br />
G.I., Savis’ko, A.A., Dmitrieva, N.A. (1990). Lipid peroxidation in experimental salmonella infection.<br />
Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. (4): 7-11.<br />
30-Mehta, A., Singh, S., Dhawan, V., Ganguly, N.K. (1998a). Intestinal mucosal lipid peroxidation and<br />
absorptive function in salmonella typhimurium mediated ıntestinal ınfection. Mol Cell Biochem. 178(1-<br />
2): 345-352.<br />
31-Mehta, A., Singh, S., Ganguly, N.K. (1998b). Impairment of ıntestinal mucosal antioxidant defense<br />
system during salmonella typhimurium ınfection. Dig Dis Sci. 43(3): 646-651.<br />
32-Mehta, A., Singh, S., Ganguly, N.K. (1999a). Effect of salmonella typhimurium enterotoxin (s-lt) on lipid<br />
peroxidation and cell viability levels of isolated rat enterocytes. Mol Cell Biochem.196(1-2): 175-81.<br />
33-Mehta, A., Singh, S., Ganguly, NK. (1999b). Role of reactive oxygen species in salmonella typhimuriumınduced<br />
enterocyte damage. Mol Cell Biochem. 196(1-2): 178-81.<br />
34-Nalini, S., Balasubramanian, K.A. (1993). Effect of luminal exposure of oxidants on intestinal mucosal<br />
lipid peroxidation and absorptive function. Scand J Gastroenterol. 28(3): 281-4.<br />
254
35-Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. (1979). Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric<br />
acid reaction. Anal Biochem. 95: 351-358.<br />
36-Oshitani, N., Kitano, A., Okabe, H., Nakamura, S., Matsumoto, T., Kobayashi, K. (1993). Location of<br />
superoxide anion generation in human colonic mucosa obtained by biopsy. Gut. 34(7): 936-8.<br />
37-Oz, E., Ilhan, M.N. (2006). Effects of melatonin in reducing the toxic effects of doxorubicin. Mol Cell<br />
Biochem. 286(1-2): 11-5.<br />
38-Öztürk, G., Özer, H., Kalender, H. (1998). Salmonella enteritidis faj tipleri ile farelerde oluşturulan<br />
deneysel salmonellosis. Tr J Vet Anim Sci. 22: 371-377.<br />
39-Pari, L., Gnanasoundari, M. (2006). Influence of naringenin on oxytetracycline mediated oxidative<br />
damage in rat liver. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 98(5): 456-61.<br />
40-Parks, D.A. (1989). Oxygen radicals: mediators of gastrointestinal pathophysiology. Gut. 30(3): 293-8.<br />
41-Parlakpinar, H., Tasdemir, S., Polat, A., Bay-Karabulut, A., Vardi, N., Ucar, M., Acet, A. (2005).<br />
Protective role of caffeic acid phenethyl ester (cape) on gentamicin-induced acute renal toxicty in rats.<br />
Toxicology. 207(2): 169-77.<br />
42-Payabvash, S., Ghahremani, M.H., Goliaei, A., Mandegary, A., Shafaroodi, H., Amanlou, M., Dehpour,<br />
A.R. (2006). Nitric oxide modulates glutathione synthesis during endotoxemia. Free Radic Biol Med.<br />
41(12): 1817-28.<br />
43-Polat, A., Parlakpinar, H., Taşdemir, S., Colak, C., Vardi, N., Ucar, M., Emre, M.H., Acet, A. (2006).<br />
Protective role of aminoguanidine on gentamicin-induced acute renal failure in rats. Acta Histochem.<br />
108(5): 365-71.<br />
44-Popkova, N.I., Kernitskii, B.S., Sorochinskaia, E.P., Iurkov, V.A., Kucherenko, N.E. (1984). Early<br />
manifestations of the effect of salmonella endotoxin on the antioxidizing enzyme systems of the liver<br />
and intestines in the rat. Biull Eksp Biol Med. 98(11): 525-7.<br />
45-Poppe, C., Demczuk, W., mcFadden, K., Johnson, R.P. (1993). Virulence of salmonella enteritidis<br />
phagetypes 4,8 and 13 and other salmonella spp. For day-old chicks, hens and mice. Can j Vet Res.<br />
57(4). 281-287.<br />
46-Rishi, P., Kaur, H., Tirkey, N., Chopra, K., Bharrhan, S., Chanana, V., Koul, A. (2006). Are the increases<br />
in local tumour necrosis factor and lipid peroxidation observed in pre-starved mice infected with<br />
salmonella typhimurium markers of increased liver damage? Microbes Infect. 8(7): 1695-701.<br />
47-Sacco, R.E., Waters, W.R., Rudolph, K.M., Drew, M.L. (2006). Comparative nitric oxide production by<br />
LPS-stimulated monocyte-derived macrophages from ovis canadensis and ovis aries. Comp Immunol<br />
Microbiol Infect Dis. 29(1):1-11.<br />
48-Şimşek, F. (1999). Serbest oksijen radikalleri, antioksidanlar ve lipit peroksidasyonu. Turkiye Klinikleri J<br />
Pediatr. 8: 42-47.<br />
49-Tietz, N.W. (1986). Textbook of Clinical Chemistry. WB. Sounders Company Philadelphia, 1532-1534.<br />
50-Turnbull, P.C.B., Snoeyenbos, G.H. (1973). Experimental salmonellosis in the chicken. 1. fate and host<br />
response in alimentary canal, liver, and spleen. Avian Dis. 18(2): 153-177.<br />
51-Van Amersfoort, E.S., Van Berkel, T.J., Kuiper, J. (2003). Receptors, mediators and mechanisms<br />
involved in bacterial sepsis and septic shock. Clin Microbiol Rev.16(3): 379-414.<br />
52-Victor, V.M., Rocha, M., Esplugues, J.V., Fuente, M. (2005). Role of free radicals in sepsis: antioxidant<br />
therapy. Curr Pharm Des. 11(24): 3141-3158.<br />
53-Von der Möhlen, M.A, Kimmings, A.N., Wedel, N.I., Mevissen, M.L., Jansen, J., Friedmann, N., Lorenz,<br />
T.J., Nelson, B.J., White, M.L., Bauer, R., et al. (1995). Inhibition of endotoxin-induced cytokine release<br />
and neutrophil activation in humans by use of recombinant bactericidal/permeability increasing protein. J<br />
Infec Dis. 172(1): 144-151.<br />
54-Winrow, V.R., Winyard, P.G., Morris, C.J., Blake, D.R. (1993). Free radicals in inflammation. Second<br />
messengers and mediators of tissue destruction. Br Med Bull. 49(3): 506-22.<br />
55-Yagi, K. (1984). Assay for Blood Plasma or Serum. Methods Enzymol. 105: 328-331.<br />
9. ÖZGEÇMİŞ<br />
1966 Elazığ doğumluyum. İlk, orta ve lise tahsilimi Elazığ’da tamamladım. 1985 yılında<br />
Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi’ni kazandım, 1990 yılında başarı ile mezun oldum. F.Ü.<br />
Sağlık Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü’nün açmış olduğu 1994 Eylül doktora sınavında, Veteriner<br />
Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı’nda doktora yapmaya hak kazandım. 2002 Şubat ayında<br />
doktora eğitimimi tamamlayarak, Tarım ve Köyişleri Bakanlığına geçiş yaptım. Kısa bir süre<br />
Adana Tarım İl Müdürlüğü’nde Veteriner Hekim olarak çalıştıktan sonra tayinle Elazığ Veteriner<br />
Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’ne geçtim. Halen aynı yerde çalışmaktayım. Evli ve iki çocuk<br />
annesiyim.<br />
255
YEME SOYA İSOFLAVON İLAVESİNİN<br />
BILDIRCINLARDA YUMUŞAK DOKU TÜMÖRLERİ ÜZERİNE ETKİLERİ<br />
Doç. Dr. Nurhan Şahin, Dr. Muhittin Önderci, Prof. Dr. Kazim Şahin,<br />
Prof. Dr. Reşat Özercan, Prof. Dr. M. Ferit Gürsu, Prof. Dr. Ömer Küçük,<br />
Elazığ Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
ÖNSÖZ:<br />
Bu çalışmada rasyona ilave edilen soya izoflavonlarının bıldırcınların<br />
oviduktlarında leiomyomların gelişmesi üzerine etkilerine bakılmış olup soya<br />
izoflavonların doza bağlı olarak leiomyomların görülme sıklığında ve boyutlarında önemli<br />
gerilemelere neden olduğu bulunmuştur. Bu araştırmanın deneme aşaması Elazığ<br />
VKAE’nde yürütülmüş olup analizler aynı enstitü, Fırat Üniversitesi ve Wayne State<br />
Üniversitesinde yapılmıştır.<br />
ÖZ: Bıldırcın rasyonlarına 400 ve 800 μg/kg miktarda soya izoflavonu ilavesi ile<br />
bıldırcınların oviduktlarında kendiliğinden oluşan leiomyomların insidansı ve boyutlarında<br />
düşüşler gözlendi.<br />
Anahtar Kelimeler: Soya izoflavonları, leiomyoma, bıldırcın<br />
ABSTRACT: Spontaneous leiomyomas of the oviduct are common tumors of the Japanese<br />
quail (Coturnix coturnix japonica), which makes it a good animal model for investigating<br />
potential agents for the prevention and treatment of human myoma uteri. Since dietary<br />
intake of soy isoflavones has been associated with reduced risk of some human cancers, we<br />
investigated the effects of soy isoflavone supplementation on the development of<br />
leiomyomas in the oviduct of Japanese quail. We also measured serum levels of oxidative<br />
stress markers [malondialdehyde (MDA), homocysteine, 8-isoprostane], soy isoflavones<br />
and expression of tissue biomarkers bcl-2 and bax. One hundred and fifty quails (5<br />
months-old) were assigned to 3 experimental groups consisting of 5 replicates of 10 birds<br />
in each group. Birds were fed either a basal diet (group C) or a basal diet supplemented<br />
with 400 mg (group ISO-I) or 800 mg (group ISO-II) of soy isoflavones / kg of diet. The<br />
experiment lasted for 305 days. Isoflavone supplementation significantly decreased the<br />
number of leiomyomas as compared to control diet (p = 0.001). Tumor diameter in<br />
isoflavone fed birds were smaller than those found in control birds (p = 0.01). There were<br />
no significant differences in the expression of tissue bcl-2 and bax between the study<br />
groups. Serum isoflavones increased (p = 0.001), whereas MDA (p=0.01), homocysteine (p<br />
= 0.01) and 8-isoprostane (p = 0.001) concentrations decreased with soy isoflavone<br />
supplementation. The results indicate that dietary supplementation of soy isoflavones<br />
reduces the incidence and size of spontaneously occurring leiomyoma of the oviduct in the<br />
Japanese quail.<br />
Key words: Soy isoflavones, leiomyoma, quail<br />
GİRİŞ: Düz kas tümörleri (leiomyoma ve leiomyosarcoma) tavukların genital<br />
organlarında yaygın olarak görülen neoplasmlardır. Genital sistemi organları içerisinde<br />
ovidukta daha yaygın olarak bulunmaktadırlar. Bu tümörler kanatlılarda kısırlığa<br />
dolayısıyla önemli verim düşüklerine yol açarlar. Oviductun ventral ligamentinde ilk<br />
yumurtlama periyodunda % 60’a ulaşan oranlarda görülmektedir (Anjum et al, 1989).<br />
Anderson ve ark. (1985) 7 haftalık piliçlerde leiomyosarcoma bulduklarını bildirmişlerdir.<br />
Düşük canlı ağırlığa sahip bıldırcınlarda hiç tümör görülmezken, canlı ağırlığı yüksek<br />
256
<strong>hayvan</strong>larda dorsal ve ventral oviduct ligamentlerde leiomyomalar ve leiomyosarcoma<br />
insidensi yüksektir (Foster et al.,1989). Yumurta tavuklarında yumurtlamanın ilk<br />
periyodunda oviduct ve magnum leiomyomaları bulunan <strong>hayvan</strong>larda, tümör bulunmayan<br />
<strong>hayvan</strong>lara göre, plasma 17 beta-oestradiol düzeyi daha yüksek bulunmuştur.<br />
Fitoöstrojenler bitkisel kaynaklı, difenolik moleküller olup yapı ve fonksiyon olarak<br />
östradiole benzerlik göstermektedir. İsoflavonların aktif maddeleri genistein ve daidzein<br />
olup bu ajanların hem östrojenik hem de antiöstrojenik özellikleri olduğu gösterilmiştir.<br />
Östrojenik aktivitelerinin varlığı östrojen reseptörlerine bağlanmaları ile ilişkilidir. Yapılan<br />
çalışmalarda soya tüketiminin tümör sayısını, insidansını ve metastazını azalttığı tespit<br />
edilmiştir (Barnes, 1995; Hawrylewicz et al, 1995). Soy isoflavonlar antiproliferatif<br />
etkisini 1) DNA mutasyonunun önleyerek, 2) kanser hücrelerinin çoğalmasını azaltarak, 3)<br />
angiogenesisi inhibe ederek göstermektedir (Okura et al, 1988; Knight and Eden, 1996).<br />
Bu çalışmada rasyona katılan soya izoflavonlarının leiomyom gelişimi üzerine<br />
etkilerine bakılmış bu bağlamda tümörlerin insidansı ve boyutu, serum MDA, homosistein,<br />
8-izoprostan, genistein ve daidzein yoğunluğu, bcl-2 ve bax proteinlerinin dokulardaki<br />
ekspresyon düzeylerine bakılmıştır.<br />
LİTERATÜR ÖZETİ<br />
Düz kas tümörleri (leiomyoma ve leiomyosarcoma), tavuklarda oviduct duvarının<br />
kas ve bağ dokusundan kaynaklanan ve genital organlarında yaygın olarak bulunan<br />
neoplasmlardır. Bazı tümörler oviduktun iç tabakasına yakın yerleşimli olabilirken bazıları<br />
ovarium, infundibulum, magnum, isthmus ve uterusta görülebilmektedir. Ovariumda<br />
görüldüğünde yumurta sarısının şekillenmesine, diğer bölümlerde ise yumurtanın tam<br />
olarak oluşmasına engel olurlar. Diğer bir ifade ile kısırlığa dolayısıyla önemli verim<br />
düşüklüklerine yol açarlar. Tek bir tane olabileceği gibi sayılamayacak kadar çok da<br />
olabilir. Tavuklarda leiomyoma ve leimyosarcoma ile ilgili ilk çalışmalar 1957 yılında<br />
Feldman ve Olson tarafından yapılmış ve daha sonra pek çok çalışmada ergin tavuklarda<br />
leiomyomalar tespit edilmiştir (Anderson, 1985). Oviductun ventral ligamentinde olusan<br />
leiomyoma kanatlılarda ilk yumurtlama periyodunda % 60’a kadar yükselen bir sıklıkla<br />
görülen bir tümördür (Anjum et al, 1988). Anderson ve ark.(1985) 7 haftalık piliçlerde de<br />
leiomyosarcoma bulduklarını bildirmişlerdir. Düşük canlı ağırlığa sahip bıldırcınlarda hiç<br />
tümör görülmezken, gelişmiş türlerde, dorsal ve ventral oviduct ligamentlerde leiomyoma<br />
ve leiomyosarcoma insidensi yüksektir Nitekim, Foster ve ark (1989) üç generasyon<br />
boyunca hafif ve ağır ırk bıldırcınlarda yaptıkları araştırmada, ilk generasyonda hafif<br />
ırklarda tümör tespit etmezlerken (%0), ağır ırklarda 11 tümör (%16), ikinci generasyonda<br />
hafif ırkta 12 tümör (% 38), ağır ırklarda ise 28 (%80) tümör, üçüncü generasyonda hafif<br />
ırklarda 7 tümör (% 21), ağır ırklarda 20 tümör (% 64) tespit etmişler ve tümörlerin çapının<br />
8-18mm arasında olduğunu bildirmişlerdir. Aynı araştırmacılar tümör görülme oranının<br />
ırklara göre %12.1- 16.9 arasında değiştiğini belirtmişlerdir. Yine, iri yapılı bıldırcınlarda<br />
neoplasm görülme sıklığının belirgin derecede yüksek olduğunu, buna karşılık küçük<br />
yapılıların hiç birinde neoplasm görülmediğini, bütün tümörlerin oviductun magnum,<br />
isthmus ve uterus bölgelerinde lokalize olduğunu bildirmişlerdir. Anjum ve ark (1989)<br />
yumurtlamanın ilk periyodunda tümör tespit edilen yumurta tavuklarında plasma 17 betaöstradiol<br />
düzeyinin daha yüksek olduğunu, ancak progesteron düzeyi arasında kontrol<br />
grubuna göre fark bulunmadığını bildirmişlerdir. Steroid sex hormonlarının leimyomaların<br />
oluşumu üzerine etkilerinin araştırıldığı bir diğer çalışmada (Anjum et al) yumurtlamadan<br />
8 hafta sonra diethylstilbestrol ve progesteronun ayrı ayrı veya kombine 3 hafta aralıkla<br />
verilmesinin leiomyoma oluşumu üzerine önemli derecede etkili olduğu, 32 haftadan<br />
sonraki uygulamalarda ise bu oranın kontrol grubuna göre çok yüksek olduğu ( % 75)<br />
tespit edilmiştir.<br />
257
Fitoöstrojenler bitkisel kaynaklı, difenolik moleküller olup yapı ve fonksiyon olarak<br />
östradiole benzerlik göstermektedir. Fitoöstrojenler ailesinin başlıca elemanları<br />
isoflavonlar, lignanlar ve kumestanlardır. Bunlar içerisinde isoflavonlar en sık bulunan ve<br />
üzerinde en çok çalışılan fitoöstrojenlerdir. İsoflavonların aktif maddeleri genistein ve<br />
daidzein olup bu ajanların selektif östrojenik özellikleri olduğu gösterilmiştir. Östrojenik<br />
aktivitelerinin varlığı östrojen reseptörlerine bağlanmaları ile ilişkilidir. Bu bağlanmayı<br />
sağlayan molekülün yapısında bulunan aromatik halka üzerindeki hidroksil grubudur<br />
(Martucci and Fishman, 1993).<br />
Epidemiyolojik çalışmalar kanser oranının azalması ve soya tüketimi arasında bir<br />
ilişki olduğunu ortaya koymuştur (Branca, 2005). Batılı ülkelere göre, bazı Asya<br />
ülkelerinde soya tüketiminin fazla olmasından dolayı, bazı kanser türlerinde azalmalar<br />
olduğu ve kanser doku hacminin daha düşük olduğu bildirilmiştir (Adlercreutz, 1995).<br />
Soya ürünlerinde bulunan isoflavonların antikanserojenik olduğu ve bu ürünlerden<br />
genistein ve daidzeinin insan plasma, idrar, dışkı, tükrük, meme salgısı veya kist ile<br />
prostat sıvılarında bulunduğu tespit edilmiştir (Adlercreutz, 1995). Hussain ve ark (2003)<br />
tarafından daha önce yapılan çalışmalarda LNCaP hücreleri tarafından PSA üretimi veya<br />
sekresyonunun soy isoflavon olan genistein tarafından inhibe edildiği tespit edilmiştir.<br />
Yapılan çalışmalarda soya tüketiminin tümör sayısını, insidansını ve metastazını azalttığı<br />
tespit edilmiştir (Barnes, 1995; Hawrylewicz et al, 1995). Fitoöstrojenlerin<br />
antikanserojenik etkilerinin anjiyogenezin ve/veya tirozin kinaz aktivitesinin inhibisyonu<br />
ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (Fotsis et al. 1993). İsoflavon içeren diyetleri tüketen<br />
insanların kanlarında lipid peroksidasyon biomarkerlarından F2-isoprostane seviyelerinin<br />
düşük olduğu görülmüştür (Wiseman et al, 2000). Isoflavonlar içerisinde genisteinin en<br />
güçlü oksidatif DNA yıkımı inhibitörü olduğu saptanmış olup, bu durum TPA ve FeCl2 ile<br />
indüklenen HL-60 hücrelerinde 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) oluşumuyla tesbit<br />
edilmiştir (Giles and Wei, 1997).<br />
MATERYAL VE METOT<br />
8.1. Deneme Grupları<br />
Beş ay yaşında 150 bıldırcın kullanıldı. Hayvanlar 3 gruba ayrıldı ve % 17 ham<br />
protein ve 12.4 MJ/kg metabolize edilebilen enerji içeren bazal rasyon (kontrol; K), 400<br />
mg (ISO-I) ve 800 mg (ISO-II) soya izoflavonu /kg rasyon miktarlarında izoflavon ilave<br />
edilen rasyonlar verildi. Soya izoflavonları Solgar Ltd. (İstanbul) firmasından temin edildi.<br />
Araştırma 305 gün sürdürüldü ve bu süre sonunda <strong>hayvan</strong>lar kesildi, makroskopik<br />
olarak tumor varlığı ve boyutuna bakıldı. Analizler için gerekli material toplandı.<br />
8.2. Laboratuar analizleri<br />
Çalışma sonunda her gruptan 12 <strong>hayvan</strong>dan kan örnekleri ktoplandı. Serum<br />
malondialdehyde (MDA), genistein and daidzein yoğunlukları HPLC (Shimadzu, Tokyo,<br />
Japan) ile MDA için Shimadzu UV- vis SPD-10 AVP detector ve izoflavonlar için<br />
fluorescence RF-10 AxL detector ve C18- ODS-3, 5μm, 4,6 x 250 mm kolonlar kullanıldı.<br />
8-isoprostan ve homosistein düzeyleri ELİZA kitleri (Oxis International, Inc. USA)<br />
kullanılarak yapıldı. Rasyon kimyasal analizleri AOAC (1990)’de belirtilen metotlara göre<br />
yapıldı.<br />
8.3. İmmunhistokimya<br />
Doku bcl-2, bax ve Cx43 ekspresyon düzeylerine streptavidin-biyotin metodu<br />
uygulanarak immunoboyama ile bakıldı. Primer antikorlar anti-mouse Bcl-2 (1: 200 in<br />
PBS) (Dako, Glostrup, Denmark) ve anti-rabbit Bax (1:1000 in PBS), (Santa Cruz<br />
Biotechnology, Santa Cruz, CA) ve sekonder antikorlar, biyotin bağlı goat anti-mouse IgG<br />
and anti-rabbit IgG (Dako, Glostrup, Denmark) firmalarından satın alındı. Kromojen<br />
olarak AEC (Dako, Glostrup, Denmark) kullanıldı.<br />
258
Boyama oluşumu ve yoğunluğu değerlendirildi. Boyanma olmaması ‘0’, zayıf<br />
boyanma ‘1’, orta şiddette boyanma ‘2’, ve yoğun boyanma ‘3’ olarak değerlendirildi.<br />
Değerlendirmeler ikiden fazla kişi tarafından yapıldı.<br />
8.4. Western blot<br />
Her gruptan alınan doku örnekleri homojenize edilerek protein içerikleri protein<br />
assay kiti (Sigma, St. Louis, MO, ABD) kullanılarak tespit edildi. Eşit miktarlardaki<br />
protein (10 μg/örnek) sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jelde yürütüldü ve nitroselüloz<br />
membrana transfer edildi. Membranlar phosphate-buffered saline (PBS) ile yıkanıp % 1’lik<br />
bovine serum albumini ile bloke edildikten sonra 15 saat boyunca primer antikorlarla<br />
inkube edildi (anti rabbit-bax polyclonal (ab7977), anti rabbit polyclonal-bcl-2 (ab7973),<br />
Abcam Ltd, Cambridge, UK). Yıkamadan sonra 1 saatliğine peroksidaz bağlı sekonder<br />
antikor ile inkube edildi (anti-mouse veya anti-rat; Sigma, Dorset, UK). Substrat olarak<br />
diaminobenzidine ve H2O2 kullanılarak bağlanma olup olmadığı tespit edildi.<br />
İmmunreaktivite bantlardaki yoğunluğun derecesi bilgisayara uyarlanmış <strong>program</strong> yardımı<br />
ile bulundu (LabWorks 4.0; UVP, Inc. Cambridge, UK).<br />
8.5. İstatistiksel Analizler<br />
Gruplarda tümör insidansı ve sayılarındaki farklar için X 2 testi kullanıldı.<br />
İzoflavonun tümör boyutu, boynma yoğunlukları ve serum parametreleri üzerine etkilerini<br />
belirlemek için veriler varyans analizi ile analiz edildi (General Linear Model procedure of<br />
SAS;1999).<br />
BULGULAR VE TARTIŞMA<br />
İzoflavonların tümör görülme sıklığı üzerine etkileri Çizelge 1’de gösterilmiştir.<br />
Kontrol grubundaki <strong>hayvan</strong>lardaki insidans %42 iken 400 mg/kg izoflavon verilen grupta<br />
% 16 ve 800 mg/kg izoflavon verilen grupta % 22 olarak bulundu (P < 0.001). Tümör<br />
boyutları izoflavon verilen gruplarda kontrole göre önemli derecede düşük bulundu (P <<br />
0.01). Bu bulgular izoflavonların tümör insidansı üzerine etkisinin doza bağımlı<br />
olmadığını fakat tümörlerin boyutu üzerine doza bağlı bir etki görüldüğünü<br />
göstermektedir.<br />
Çizelge 2’ de tümöral dokulardaki bax ve bcl-2 proteinlerinin immunhistokimya<br />
sonuçları verilmektedir. Gruplar arasında önemli bir fark bulunmadı.<br />
Çizelge 3’te serum genistein, daidzein, 8-izoprostan, homosistein ile serum ve<br />
karaciğer MDA düzeyleri gösterilmekte olup izoflavon verilen gruplarda serum izoflavon<br />
yoğunluklarında artış (p = 0.001), 8- isoprostan (p = 0.001), serum ve karaciğer MDA<br />
düzeylerinde düşüş (p = 0.01) görüldü. Serum homosistein düzeylerinde önemli bir<br />
değişiklik görülmedi (p>0.05).<br />
Bu çalışmada elde edilen bulgular soya izoflavonlarının bıldırcınlarda leiomyom<br />
insidansı ve oluşan tümörlerin boyutu üzerinde geriletici etkileri olduğunu göstermektedir.<br />
Ayrıca izoflavonlar serum MDA, 8-isoprostan ve homosistein düzeylerinde düşüşe ve<br />
serumdaki genistein ve daidzein düzeylerinde artışa neden olmuştur.<br />
ÖZET<br />
Düz kas tümörleri (leiomyoma ve leiomyosarcoma) bıldırcınların oviduktlarında<br />
yaygın olarak görülen neoplasmlardır. Bu çalışmada yeme 400mg ve 800 mg/kg dozlarında<br />
katılan izoflavonların tümör insidansı ve boyutu, serum MDA, homosistein, 8-isoprostane,<br />
genistein, daidzein düzeyleri, bcl-2 ve bax proteinlerinin ekspresyonu üzerine etkileri<br />
araştırılmıştır. Beş ay yaşında 150 bıldırcın kullanıldı. Yüz elli baş 5 aylık yaşta bıldırcın 3<br />
gruba ayrıldı ve bazal rasyon (kontrol; K), 400 mg (ISO-I) ve 800 mg (ISO-II) soya<br />
izoflavonu /kg rasyon miktarlarında izoflavon ilave edilen rasyonlar verildi. Araştırma 305<br />
gün sürdürüldü. İzoflavon verilen gruplarda tümör insidansı ve boyutu kontrol grubuna<br />
259
göre önemli derecede düşük bulundu(p = 0.001). Gruplar arasında bcl-2 ve bax düzeyleri<br />
açısından bir fark görülmedi. İzoflavon verilen gruplarda serum izoflavon yoğunluklarında<br />
artış (p = 0.001), 8- isoprostan (p = 0.001), serum ve karaciğer MDA düzeylerinde düşüş (p<br />
= 0.01) görüldü. Serum homosistein düzeylerinde önemli bir değişiklik görülmedi<br />
(p>0.05).Bulgular, izoflavonların tümör insidansı ve boyutunda azalmalara, antioksidan<br />
sistem üzerine olumlu etkileri olduğunu göstermektedir.<br />
Çizelge 1. Rasyona katılan soya izoflavonlarının bıldırcınlarda leiomyom insidansı ve<br />
tümör boyutu üzerine etkisi.<br />
Rasyona ilave edilen izoflavon miktarı, mg /kg<br />
0 400 800 P değeri<br />
n 50 50 50 -<br />
Tümör görülen bıldırcın 21 8 11 0.009<br />
Tümör insidansı, % 42 16 22 0.001<br />
Tümör çapı, mm 6.0 (< 8.4) a 3.9 (< 5.1) b 2.2 (< 3.0) c 0.010<br />
a-c: Aynı satırda farklı harflerle gösterilen değerler arasındak fark önemlidir ( p < 0.05).<br />
Çizelge 2. Rasyona katılan soya izoflavonlarının bıldırcınlarda leiomyom dokusu bax<br />
ve bcl-2 proteinlerinin immunhistokimya ile boyama yoğunlukları üzerine etkisi.<br />
Rasyona ilave edilen izoflavon miktarı, mg /kg P değeri<br />
0 400 800<br />
Bax için boyama Tespit edilemedi 0.6 (0-1) + 0.15 0.5 (0-1) + 0.20 0.65<br />
yoğunluğu<br />
Bcl-2 için boyama<br />
yoğunluğu<br />
0.7 (0-1) +<br />
0.15<br />
0.6 (0-1) + 0.20 0.6 (0-2) + 0.22 0.48<br />
Çizelge 3. Rasyona katılan soya izoflavonlarının bıldırcınlarda serum homosistein,<br />
MDA, 8-isoprostan, genistein, daidzeinve karaciğer MDA düzeylerine etkisi<br />
Rasyona ilave edilen izoflavon<br />
Contrast P değerleri<br />
miktarı, mg /kg<br />
0 400 800 SEM Linear Quadratic<br />
Homosistein μmol/L 25 a 21 b 19 b 2.1 0.01 0.41<br />
Serum MDA μmol/L 2.8 a 1.7 b 1.3 c 0.09 0.01 0.50<br />
Kc. MDA , μmol/g 5.1 a 3.5 b 3.0 c 0.5 0.01 0.73<br />
8-isoprostan, pg/ml 158 a 117 b 105 c 6.4 0.001 0.35<br />
Daidzein, nmol/L 81 c 195 b 279 a 20 0.001 0.71<br />
Genistein, nmol/L 126 c 350 b 518 a 35 0.001 0.90<br />
Veriler ortalama + Standart hata ortalaması olarak verilmiştir (n = 10) .<br />
a-c: Aynı satırda farklı harflerle gösterilen değerler arasındak fark önemlidir ( p <<br />
0.05).<br />
LİTERATÜR LİSTESİ<br />
Adlercreutz, H.(1995). Phytoestrogens: Epidemiology and a possible role in cancer<br />
prevention. Environ. Health Perspect. 103(Suppl 7):103-112.<br />
Anderson WI and McCaskey PC(1985). Langheinrich, K.A. & A.E. Dreesen. Case Report.<br />
Neurofibrosarcoma and leiomyosarcoma in slaughterhouse broilers. Avian Dis. 29, 521-<br />
527.<br />
Anjum AD, Payne LN and Appleby EC(1989). Oestrogen and progesterone receptors and<br />
their relationship to histological grades of epithelial tumours of the magnum region of the<br />
oviduct of the domestic fowl. J Comp Pathol 100, :275-286.<br />
260
Anjum AD, Payne LN, and Appleby EC (1988). Spontaneous occurrence and experimental<br />
induction of leiomyoma of the ventral ligament of the oviduct of the hen. Res Vet Sci ; 45.<br />
341-348.<br />
AOAC(1990). Official Methods of Analysis 15 th Ed. Assoc. of Official Analytical<br />
Chemists. Arlington VA.<br />
Barnes S., Grubbs C., Setchell K.D.R., Carlson J.(1990). Soybeans inhibit mammary<br />
tumors in models of breast cancer. Pariza M. eds. Mutagens and Carcinogens in the Diet<br />
239-253 Wiley-Liss New York, NY.<br />
Branca F, Lorenzetti S(2005). Health effects of phytoestrogens. Forum Nutr.<br />
2005;(57):100-11.<br />
Feldman WH and Olson C Jr (1959). Neoplastic diseases of the chicken. Pages: 642-700.<br />
In: Diseases of Poultry. H.E. Biester and Schwarte, L.H., ed. Iowa State Univ. Pres, Ames,<br />
Foster DN, Nestor KE, Saif YM, Bcon WL and Moorhead PD (1989). İnfluence of<br />
selection for increased body weight on the incidence of leiomyomas and leiomyosarcomas<br />
in Japanese Quails. Poultry Science, 68, 1447-1453.<br />
Fotsis T, Pepper M, Adlercreutz H, Fleischmann G, Hase T, Montesano R, Schweigerer L<br />
(1993). Genistein, a dietary-derived inhibitor of in vitro angiogenesis. Proc Natl Acad Sci<br />
USA 90:2690-2694.<br />
Giles D, Wei H. (1997).Effect of structurally related flavones/isoflavones on hydrogen<br />
peroxide production and oxidative DNA damage in phorbol ester-stimulated HL-60 cells.<br />
Nutrition Cancer, 29: 77-82.<br />
Hawrylewicz,E.J., Zapata,J.J. and Blair,W. (1995) Soy and experimental cancer: animal<br />
studies. J. Nutr., 125, 698S–708S).<br />
Hussain M, Banerjee M, Sarkar FH, Djuric Z, Pollak MN, Doerge D, Fontana J, Chinni S,<br />
Davis J, Forman J, Wood DP, Kucuk O (2003). Soy isoflavones in the treatment of<br />
prostate cancer. Nutr Cancer. 2003;47(2):111-7.<br />
Knight DC, Eden JA. (1996). A review of the clinical effects of phytoestrogens. Obstet<br />
Gynecol, 87(5):897-904.<br />
Martucci CP, Fishman J. (1993). P450 enzymes of estrogen metabolism. Pharmacol Ther.<br />
57(2-3):237-57<br />
Okura A, Arakawa H, Oka H, Yoshinari T, Monden Y(1998). Effect of genistein on<br />
topoisomerase activity and on the growth of [val 12] Ha-ras transformed NIH 3T3 cells.<br />
Biochem Biophys Res Comm,157:183-89.<br />
SAS(1999). SAS Institute, SAS® User’s Guide: Statistics. SAS Institute Inc., Cary, NC.<br />
1999.<br />
Wiseman, H. , J.D. O'Reilly, H. Aldercreutz, A.I. Mallet, E.A. Bowey, I.R. Rowland and<br />
T.A.B. Sanders (2000). Isoflavone phytoestrogens consumed in soy decrease F2isoprostane<br />
concentrations and increase resistance of low-density lipoprotein to oxidation<br />
in humans. Am. J. Clin. Nutr. 72 (2000), pp. 395–400.<br />
1966 yılında Doğanşehir’ de doğdu. İlk, orta ve lise tahsilini Elazığ’da tamamladı. 1988<br />
yılında Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi’nden mezun oldu. Muş ve Elazığ illerinde<br />
Hükümet Veterineri olarak görev yaptıktan sonra 1992 yılında Elazığ Veteriner Kontrol ve<br />
Araştırma Enstitüsü’ne atandı. 1994 yılında F.Ü. Veteriner Fakültesi Hayvan Besleme ve<br />
Beslenme hastalıkları Anabilim dalında doktora eğitimini tamamladı. 2005 yılında Doçent<br />
ünvanı aldı ve aynı yıl F.Ü. Veteriner Fakültesi’ne naklen atandı. Halen aynı görevine<br />
devam etmektedir. TAGEM’in ve TÜBİTAK’ın araştırma gruplarında sunulan ve kabul<br />
edilen projelerde proje lideri ve aktif araştırmacı olarak görev almıştır. Uluslararası<br />
hakemli dergilerde yayınlanan 40’tan fazla bilimsel yayını bulunmaktadır. İyi derecede<br />
İngilizce bilmektedir.<br />
261
VERO HÜCRE KÜLTÜRÜNDE ÜRETİLEN KOYUN-KEÇİ ÇİÇEK AŞISININ<br />
BAĞIŞIKLIK SÜRESİNİN SAPTANMASI<br />
Dr. Veli GÜLYAZ<br />
Züleyha PESTİL APUHAN<br />
Selma ÖZDEMİR<br />
Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
ÖNSÖZ<br />
Koyun çiçeği hastalığı koyunlar arasında görülen salgın ve öldürücü viral bir<br />
enfeksiyondur. Damızlık koyunlarda abort ve mastitise, kuzularda ise yüksek oranda<br />
ölümlere sebep olmaktadır.<br />
Koyun çiçeği hastalığı ülkemiz koyun yetiştiriciliğinde önemini halen<br />
sürdürmektedir. Kuzularda % 50 – 80 arasında ölümlere sebep olur. Koyunlarda ise ölüm<br />
oranı düşük olmakla birlikte önemli ekonomik kayıplara sebep olmaktadır.<br />
Bu hastalıkla mücadelede ülkemizde üretilen canlı attenue koyun çiçek aşısı<br />
kullanılmaktadır. Koyun çiçek aşı suşu İstanbul ili Bakırköy ilçesinde koyunlarda meydana<br />
gelen çiçek salgınında hasta koyundan primer kuzu böbrek hücre kültüründe üretilerek<br />
izole edilmiştir. İzole edilen suş dana böbrek – kuzu böbrek hücre kültürlerinde 65 kez<br />
pasajlanarak attenue edilmiş ve SP ( Bk ) LK65 olarak isimlendirilmiştir. Koyun çiçek aşısı<br />
hazırlanması için yaklaşık 1-3 aylık kuzular kesilmekte, steril şartlarda alınan böbreklerden<br />
primer hücre kültürü hazırlanmakta ve tam bir monolayer oluşunca aşı suşu ekilerek aşı<br />
hazırlanmaktadır. Ancak kuzulardan elde edilen böbrek hücreleri aracılığı ile aşı hazırlama<br />
esnasında özellikle pesti virus, mavi dil, koyun vebası, parainfluenza-3, ektima, akabana<br />
viruslarının aşı vasıtasıyla aşılanan <strong>hayvan</strong>lara bulaşma riskinin olması, her seri aşı<br />
üretiminde yeni kuzuların kesilmesi , elde edilen primer kuzu böbrek hücre kültürlerinin 6<br />
kez pasaj yapılabilmesi ve kolay dejenere olmaları sağlıklı aşı üretiminde zorluklar<br />
meydana getirmektedir. Bütün bu nedenlerden dolayı viral kontaminantlardan ari hücre<br />
kültürlerinde aşı hazırlanması aşılamalarda ve hastalıklar ile mücadelede büyük önem arz<br />
etmektedir.<br />
Vero hücre kültürü devamlı hücre kültürlerinden olup sürekli pasajlanabilir olması,<br />
azot tanklarında senelerce canlılığını muhafaza edebilmesi, kolay ve çok miktarda<br />
üreyebilir olmasına karşın primer kuzu böbrek hücre kültürü en fazla 1-6 arası pasaj<br />
yapılabilmesi, kolay dejenere olması, azot tankında uzun süre saklanamaması ve en<br />
önemlisi viral ve bakteriyel kontaminantlar yönünden tehlike arz etmesi virolojik teşhis ve<br />
aşı üretim çalışmalarında sakıncalar oluşturmaktadır.<br />
Aşı üretiminde Önem arz eden kontaminasyon risklerini ortadan kaldırmak için<br />
OIE'nin önerdiği sürekli hücre kültürlerinin (Vero, BHK, MDBK) kullanılması amacıyla<br />
Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Viroloji Bölüm Başkanlığı tarafından aşı<br />
üretiminde kullanılan SP (BK) LK 65 aşı suşunun Vero hücre kültürüne adaptasyonu ve aşı<br />
suşu olarak kullanılması için 2 proje hazırlanmış ve 2003 yılında her iki proje'de<br />
tamamlanarak SP (BK)LK65 koyun çiçek aşı suşu Vero hücre kültürüne adapte edilerek,<br />
üreme özellikleri, zararsızlık, bağışıklık ve doz tayini saptanarak Vero hücre kültürüne<br />
adapte edilen SP(BK)LK 52 - V12 koyun çiçek aşı suşunun aşı üretimi için uygun olduğu<br />
bildirilmiştir. Aşı üretimine hazır hale getirilen suşunun (SP(BK)LK 52 - V12) koyunlarda<br />
bağışıklık süresinin saptanması ile aşı üretimine geçilecektir.<br />
262
ÖZ: Bu çalışmanın amacı Vero hücre kültüründe üretilen koyun çiçek aşısının koyunlarda<br />
bağışıklık süresinin saptamasıdır. Çalışmada kullanılacak koyun çiçek aşısı vero hücre<br />
kültüründe üretildi. Üretilen aşının liyofilizasyon öncesi titresi DKID50 10 6.5 /ml olduğu<br />
saptandı. Virus süspansiyonun liyofilizasyon öncesi titresi DKID50 10 5.5 /ml olacak şekilde<br />
sulandırıldı. Liyofilize edilen aşının bakteriyel,fungal ve viral kontaminantlar yönünden<br />
steril ve liyofilizasyon sonrası ortalama titresinin DKID50 10 5.25. /ml olduğu saptandı.<br />
SP(BK) LK-V12 koyun çiçek aşısı ile aşılanan koyunların (DKID50 10 3.25 /ml-doz)<br />
aşılamadan sonraki birinci ayda 4 adet koyunda antikor titrelerinin ortalama SN İndex<br />
10 1.68 , üçüncü ayda 10 1.37 , altıncı ayda 10 1.22 , dokuzuncu ayda 10 0.9 olarak tespit<br />
edilirken 12. ayda kan serumlarında koyun çiçeğine karşı antikor titreleri saptanamadı.<br />
Aşılanan koyunlardaki bağışıklığın eprüvasyon metodu ile saptanması amacıyla 1.,<br />
3., 6., 9. aylarda yapılan eprüvasyon çalışmalarında tüm aşılı koyunların, 12. ayda ise 4<br />
aşılı koyundan 1 adetinin patojen virusa karşı korunduğu ve dolayısıyla aşının koyun<br />
çiçeğine karşı 9. aya kadar tam koruma sağladığı saptanmıştır.<br />
ABSTRACT<br />
Aim of this study was determine of duration of immunity in vaccinated sheep with<br />
sheep pox vaccine that was propagate on vero cell culture.<br />
İnitially the vaccine of sheep pox was propagated. The titre of propagated virus<br />
suspansion was obtained as DKID50 10 6.5 /ml before liyofilisation.<br />
The titre of virus suspansion was diluated as DKID 50 10 5.5 /ml before liyofilisation<br />
The titre of virus suspansion was detected to be sterile for bacterial, fungal and viral<br />
contaminants and after liyofilisation the average titres was obtained DKID 50 10 5.25 /ml.<br />
The Antibody titres of the sheep vaccinated with sheep pox vaccine (SP (Bk) LK-<br />
V 12 were detected as 10 1.68 , 10 1.37 , 10 1.22 and 10 0.9 at 1., 3., 6. and 9. months in turn in<br />
order.<br />
The titres of Antibody levels against sheep pox viruses were not detected, in the<br />
serum samples at 12 month.<br />
In order to be determined of the immunity levels of vaccinated şheep , the<br />
epruvation metod was used.<br />
All vaccinated animals were found to be immune 100 % in the 1, 3, 6 and 9 months.<br />
In the 12. month , the one of 4 vaccinated sheep was immune. As a result, the şheep pox<br />
vaccine that was propogated on vero cell culture gave good levels of immunity beetween<br />
one and nine months.<br />
GİRİŞ<br />
Ülkemizde Koyun ve Keçi çiçek hastalığı ile mücadelede Pendik Veteriner Kontrol<br />
ve Araştırma Enstitüsü tarafından Kuzu böbrek hücre kültüründe hazırlanan attenüe,<br />
koyun-keçi çiçek aşısı kullanılmaktadır. Aşı suşu İstanbul İli Bakırköy İlçesinde<br />
koyunlarda ortaya çıkan koyun çiçek hastalığına yakalanan koyundan izole edilmiştir.<br />
İzole edilen suş dana böbrek kuzu böbrek hücre kültürlerinde seri pasajlar yapılarak 65.<br />
pasajda aşı suşu olarak kullanılması uygun bulunmuştur. Koyun-Keçi çiçek aşının<br />
üretiminde kullanılan Kuzu böbrek hücresi 1-3 aylık kuzuların böbreklerinden elde<br />
edilmektedir. Ancak kullanılan primer kuzu böbrek hücre kültürünün aşı hazırlanmasında<br />
bazı sakıncalı yönleri vardır. Bunlar;<br />
1- Her bir seri aşı hazırlanmasında 1-3 aylık sağlıklı kuzu gerekmektedir.<br />
2- Kuzulardan hazırlanan primer hücre kültürleri 1-6 kez pasajlanabilmekte ve aşı üretimi<br />
için yeteri kadar kuzu böbrek hücresi üretilememektedir.<br />
3. Hazırlanan primer kuzu böbrek hücre kültürleri kuzudan kaynaklanan özellikte<br />
Pestivirus, Parainfluenza 3, Herpes virus, Mavidil, koyun- keçi vebası gibi viral etkenler<br />
263
içermekte ve böyle enfekte hücre kültürleri ile hazırlanan koyun keçi çicek aşıları ile<br />
aşılanan koyun ve keçilere söz konusu viral hastalıklar aşı ile bulaştırılmaktadır.<br />
Viral kontaminantların saptanması aşı üretiminde büyük önem arz etmektedir.<br />
Aşı üretiminde Önem arz eden kontaminasyon risklerini ortadan kaldırmak için<br />
OIE'nin Önerdiği sürekli hücre kültürlerinin (Vero, BHK, MDBK) kullanılması amacıyla<br />
Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Viroloji Bölüm Başkanlığı tarafından aşa<br />
üretiminde kullanılan SP (BK) LK65 aşı suşunun Vero hücre kültürüne adaptasyonu ve aşı<br />
suşu olarak kullanılması için 2 proje hazırlanmış ve 2003 yılında her iki proje'de<br />
tamamlanarak SP (BK)LK65 koyun çiçek aşı suşu Vero hücre kültürüne adapte edilerek,<br />
üreme özellikleri, zararsızlık, bağışıklık ve doz tayini saptanarak Vero hücre kültürüne<br />
adapte edilen SP(BK)LK65 koyun çiçek aşı suşunun aşı üretimi için uygun olduğu<br />
bildirilmiştir.<br />
LİTERATÜR ÖZETİ:<br />
Koyun çiçeğinin doğal bulaşması ilk kez 1763 yılında Bourgelat tarafından<br />
tanımlanmıştır. Koyun çiçeğinin etiyolojisi ve patogenezi üzerine ilk çalışmaların<br />
Chauveau (1868), Bollinger (1878) ve Borrel (1902) tarafından yapıldığı bildirilmiştir (4).<br />
Koyun çiçeği infeksiyonu Afrikada Ekvatorun kuzeyinde , Orta Doğuda, Türkiye,<br />
İran, Afganistan, Pakistan, Hindistan, Nepal, Çin ve Bangladeş’de endemik olarak<br />
görülmektedir (4).<br />
Koyun çiçeği virusu Poxviridae familyası içinde yer alıp, 290 x 270 nanometre<br />
büyüklüğündedir.Keçi çiçeği, ektima ve sığırların yumrulu deri hastalığı ( LSD ) ile ortak<br />
antijenik yapıya sahip olup serolojik olarak birbirleri ile ortak reaksiyon verirler. LSD<br />
virusunun sığırlarda hastalık oluşturmakla birlikte orijinini Capripox viruslardan aldığı<br />
bildirilmiştir(15). Ancak gerek doğal ortamlarda ve gerekse deneysel çalışmalarda LSD<br />
virusunun koyun ve keçilerde hastalık oluşturmadığı belirtilmiştir. DNA içeren, zarflı ve<br />
kubik yapıya sahip olan virion en az 30 yapı proteinine ve bir enzime sahiptir (15).<br />
Poxviridae familyası Chordopoxvirinae ve Entamopoxvirinae olmak üzere iki alt<br />
familyaya ayrılır(4). Entamopoxvirinae alt familyasındaki viruslar sadece insektlerde<br />
görülür. Chordopoxvirinae alt familyasında 8 tür bulunur. Capripox viruslar<br />
Chordopoxvirinae familyasında yer alıp koyun çiçeği, keçi çiçeği ve LSD viruslarını<br />
kapsar (4).<br />
Araştırıcılar, koyun çiçeği virusunun embriyolu tavuk yumurtasında ve kuzu testis,<br />
böbrek, fötal kuzu böbrek, tiroid, embriyonik akciğer, karaciğer, kalp ve deri hücre<br />
kültürlerinde; sığır testis, böbrek, embriyonik deri hücre kültürlerinde sitoliz ve<br />
intrasitoplazmik inkluzyon cisimcikleri ile karakterize sitopatik etki (CPE) oluşturarak<br />
ürediğini bildirmişlerdir (5,6,13,23,28,33).<br />
Koyun çiçek hastalığında inkubasyon süresi, doğal infeksiyonlarda 6 - 8 gün iken<br />
deneysel enfeksiyonlarda 2-3 gündür. Doğal infeksiyonlarda hastalık akut seyreder, ateş<br />
yükselir, nabız ve solunum sayısı artar, gözler şişer. Hayvanın burnundan mukoz bir akıntı<br />
gelir. Konstipasyon ve idrar zorluğu gözlenir. Hastalığın tipik şeklinde, hastalığın birinci<br />
gününden itibaren derinin yapağısız bölgelerinde, burun ,dudaklar, göğüs, bacaklar<br />
arasında, memede ve karında sırası ile papül, vezikül ve kabuk sonra bu kabuklar dökülür<br />
ve yerlerinde izler kalır. Bu papüller 0.5 - 2 cm çapında olup yuvarlak ve elips şeklindedir.<br />
Daha sonra papüller irinleşirler. Bazen atipik koyun çiçeğine rastlanır. Bu formda sadece<br />
papül oluştuğu görülür ve <strong>hayvan</strong> iyileşir. Koyun çiçeği hastalığı 3-4 hafta kadar sürer, kış<br />
aylarında biraz daha fazla uzayabilir. Hastalığın şiddetli devrelerinde virusun virulansı<br />
yüksek olduğunda kuzularda pnömoni ve bronko pnömoni meydana gelir. 1-2 haftada<br />
ölüm başlar. Ayrıca mastitis ve abort olguları görülür. Hastalığın seyrinde bakım, beslenme<br />
ve hijyen koşullarının etkisi büyüktür. Hayvanların hastalığa yakalanmasında konstitüsyon<br />
264
ve dispozisyonun büyük rolü vardır. Koyunlarda morbidite oranı % 70-80, mortalite oranı<br />
ise %5-50 arasında değişir. Kuzularda mortalite oranı % 80’ e çıkabilir (5,6,12,19,30).<br />
Dermoepiteliotrop olan virus en iyi şekilde epidermis ve mukoza epitellerinde ürer.<br />
Mezoderme ve iskelet kasına karşı da affinitesi vardır. Virus organizmada ilk önce<br />
retikülo-endotelial sisteme yerleşir. Buradan vücuda yayılarak deri ve organlarda çiçekle<br />
ilgili bozukluklara sebeb olur. Virus etkisini en fazla deride ve az olarak ta lenfoid,<br />
retikulo-endotelial, hemopoetik, solunum ve sindirim sisteminde gösterir. Deneysel olarak<br />
meydana getirilen koyun çiçeği hastalığında koyunlarda tipik çiçek lezyonları oluşmaz.<br />
Yalnız vucut ısıları biraz yükselir ve sonradan normale döner. Bazı koyunlarda deri içi<br />
inokulasyonun 3. gününden itibaren ödemli eritematöz nödül şekillenir. Bu odak 6-7 güne<br />
kadar yavaş yavaş büyür ve 3-5 cm çapına ulaşır. Oluşan papüllerin bir kısmı nekroza<br />
uğrar ve nekrotik bir membran oluşur (5,6).<br />
Capripox virusunun çabuk teşhisi elektron mikroskopi ve klinik bulguların<br />
birleştirilmesi ile yapılır (4).<br />
Etkenin izolasyonu için, nötralizan antikorlar gelişmeden önce klinik belirtilerin<br />
görüldüğü ilk hafta içinde ölen <strong>hayvan</strong>lardan alınan lenf yumrusu, akciğerin lezyonlu<br />
parçaları, deri papülleri uygun materyallerdir. Ateşli dönemde generalizasyon oluşmadan<br />
viremi safhasında heparin veya EDTA’ lı tüplere alınan kan örnekleri de izolasyonda<br />
kullanılabilir. Koyun çiçeği virusu, koyun ve sığır orijinli primer hücre kültürlerinde<br />
üretilir. Primer kuzu testis (LT) veya kuzu böbrek (LK) hücre kültürleri, sığır böbrek hücre<br />
kültürlerinden daha duyarlıdır. Ayrıca BHK ve Vero hücre kültürleri de izolasyon amacıyla<br />
kullanılabilir (4).<br />
Serolojik testler arasında en spesifik olanı serum nötralizasyon (SNT)<br />
testidir. Bu testlere ilave olarak agar jel immunodiffuzyon, ELİSA, İndirekt<br />
İmmunofloresans antikor testleri kullanılmaktadır. Virusun identifikasyonunda S.N.T.,<br />
DNA yapılarının saptanması ve western blot analizinden yararlanılmaktadır (2,9,11,14,).<br />
Hayvanları koyun çiçeğine karşı korumada canlı ve inaktif aşılardan<br />
yararlanılmaktadır(21,22).<br />
Bir çok capripoxvirus suşu canlı aşı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır.<br />
Özellikle Bakırköy koyun çiçek suşu, 0240 Kenya koyun-keçi çiçek suşu, Romanya ve RM<br />
65 koyun çiçek suşları ile Mysore ve Gorgan suşları en yaygın kullanılan suşlardır (21).<br />
Yeni generasyon capripox aşıları geliştirme çalışmaları devam etmektedir.<br />
Bunlarda vektör olarak capripox virus genomu kullanılarak ruminantların sığır vebası,<br />
koyun vebası gibi diğer patojenlerine karşı tek aşılama ile koruma sağlanabilecektir (21).<br />
Capripox virusların 2 antijenik formu vardır. İntact virion kısa tubuler elementler<br />
ile çevrilir ve sonra virion konakçı hücre kaynaklı membran ile kaplanır. İntact form<br />
enfekte hücre kültürünün dondurulup çözdürülmesi ile elde edilen süspansiyonda görülür.<br />
Hücre kaynaklı membranla çevrili virionlar infekte <strong>hayvan</strong>lar tarafından üretilir. Hücre<br />
kültürlerinden elde edilen ölü aşılar naked viriondur ve aşı olarak kullanıldığı zaman<br />
membranla çevrili virionlar kadar bağışıklığı sitimule edemezler. Bu da inaktif aşıların<br />
başarısız zayıflığını açıklar. Ayrıca inaktif aşıların canlı aşılardan daha az etkili olmasının<br />
bir nedeni, canlı aşıların, aşılanan <strong>hayvan</strong>da üremesi nedeniyle hücresel immun yanıtın<br />
uyarılmasıdır ki poxvirus infeksiyonlarında koruyucu yanıt yüksek oranda hücresel immun<br />
yanıta aittir (4, 22).<br />
Aşı üretiminde kullanılan hücreler, primer hücre kültürleri ise scrapie’ den ari genç<br />
kuzuların testis ya da böbreklerinden hazırlanmalıdır. Hücrelerin kültürü esnasında<br />
hücrelerin normal morfojilerinde olması ( özellikle fibroblastik ) ve hiç bir CPE bulgusu<br />
göstermemesi gereklidir (1,). Bu hücreler en fazla altı kere pasaj yapılabilir. Hücreler<br />
özellikle CPE negetif bovine virus diare ve border disease infeksiyonlarını oluşturan<br />
pestivirus suşları bakımından immunofloresans ya da immunoperoksidaz teknikler ile<br />
265
kontrol edilmelidir. Hücreler steril DMSO içinde (1ml DMSO + 9 ml Calf serum) 1-2 ml<br />
miktarlarda 10 6-7 /ml olacak şekilde likit nitrojende saklanabilir. Üretim esnasında<br />
kullanılan serumlar capripox virusa karşı antikor taşımamalı ve pesti viruslardan ari<br />
olmalıdır (4).<br />
Kurtul ve Gürel (24), gebeliklerinin değişik dönemlerinde koyun çiçek aşısı ile<br />
aşılanan koyunlarda çiçek hastalığına karşı meydana gelen bağışıklığı kolostrum ve<br />
sütleriyle kuzulara aktardığını ve böylece kuzuların bu pasif bağışıklık ile koyun çiçeği<br />
hastalığına karşı korunduklarını bildirmişlerdir. Martin ve ark. (27), koyun çiçeği aşısı<br />
uygulamasından sonra oluşan antikor düzeylerinin S.N.T. ile log.10 -0.80 - 10 -3.0 arasındaki<br />
değerlerde saptandığında <strong>hayvan</strong>ların bağışık olduğunu, log. 10 -0.50 – 10 -0.79 arasındaki<br />
değerlerde saptanan antikor titrelerinin şüpheli değerler olduğunu, log.10 -0.49’ den düşük<br />
değerlerde saptanan titrelerde koyunların bağışık olmadığını bildirmişlerdir. Erhan ve ark.<br />
(14), attenue Bakırköy koyun çiçek aşısı ile aşılanmış koyunlarda meydana gelen<br />
bağışıklığı S.N.T ile kontrol etmişler ve 10 -0.00-0.50 log. negatif, 10 -0.51-0.80 log. şüpheli ve<br />
10 -0.81 log. dan yukarı değerleri pozitif olarak değerlendirmişlerdir. Ergin ve ark.(13), keçi<br />
çiçeğine karşı Borrel metodu ile koyunlarda hazırlanan aşı yerine primer kuzu böbrek<br />
hücre kültüründe hazırladıkları aşının koruyucu dozunun (PD50) 10 -5.2 /ml olduğunu,<br />
sulandırılan liyofilize aşının 0.5 mililitresi ( bir doz aşının virus titresi 10 -2.9 /0.5 ml ) ile<br />
aşılanan keçilerin 3. ve 6. aylarda %100, 9.ayda %75 bağışık olduklarını bildirmişlerdir.<br />
Arık ve ark. (6), Romanya koyun çiçek virusunun embriyolu tavuk yumurtasının<br />
korioallantoyik membranında seri pasajları yapılarak yirmibeşinci pasaja kadar ürediğini,<br />
koyunlarda yapılan canlılık muayenelerinde virusun canlı olduğunu ve enjeksiyon<br />
yerlerinde tipik koyun çiçek püstüllerinin meydana geldiğini saptadıklarını, yumurtanın<br />
korioallantoyik membranlarının aşı üretimi açısından virus miktarının koyunlarda elde<br />
edilen miktardan daha az olduğundan ekonomik ve pratik olmadığını<br />
bildirmişlerdir.Kitching ve ark. (20), Capripox virusları birbirinden ayırt etme konusunda<br />
Nijerya koyun çiçek, Kenya koyun-keçi çiçek ve LSD virus suşları üzerinde yaptıkları<br />
çalışmalar sonucu, 100 Nijerya koyun çiçeği virus partikülünün ortalama 293 x 262 µm, 58<br />
Kenya koyun-keçi çiçeği virus partikülünün ortalama 299 x 273 µm , 58 LSD virus<br />
partikülünün ortalama 294 x 262 µm çaplarında olduklarını, saptanan bu bilgiler<br />
neticesinde capripox virusların büyüklüklerine göre birbirlerinden ayırt edilemediğini<br />
bildirmişlerdir. Davies ve Mbugwa (12), Kenya koyun-keçi çiçek virusunun bovine fötal<br />
kas hücre kültüründe üretilmesi ve aşı olarak hazırlanması üzerinde yaptıkları çalışmada,<br />
çiçek suşunu bovine fötal kas hücre kültüründe elli kez pasaj yaptıklarını, virusun<br />
inokulasyonundan sonraki 5-6. günlerde hücre kültüründeki CPE’ leri saptadıklarını ve bu<br />
sürenin 10-12. pasajdan itibaren 2-3 güne indiğini bildirmişlerdir. Virusun patojenitesinin<br />
saptanmasında, yapılan 10 ila 50 arası her pasajdan koyunlara deri altı 50.000 - 100.000<br />
DKID50 dilusyonlarında inokulasyonlar yapmışlar ve virusun patojenitesini onbeşinci<br />
pasajdan itibaren kaybettiğini saptamışlar, onsekizinci pasajdan hazırladıkları aşının<br />
koyunlarda çok yüksek titrede bağışıklık oluşturduğunu bildirmişlerdir.<br />
Koyun çiçeği hastalığı ile mücadelede kullanılan attenue koyun çiçeği aşılarında<br />
mililitredeki virus miktarının 10 -5.2 den yukarı ve her <strong>hayvan</strong> için verilmesi gereken saha<br />
dozunun 10 -2 ila 10 -3.5 olması gerektiği ve bu limitlerin <strong>hayvan</strong>larda koyun çiçeğine karşı<br />
bağışıklık sağlamada yeterli olacağı bildirilmiştir (4).<br />
Koyun çiçeği aşısı ile aşılanan koyunlarda bağışıklığın saptanması amacıyla<br />
titrasyon metoduyla yapılan eprüvasyon çalışmalarında, aşılı koyunların vucut ısılarında<br />
artış ve inokulasyon noktalarında lezyonlar oluşmaması gerektiği, lezyonların meydana<br />
gelmesi durumlarında aşılı koyunlar ile kontrol koyunların lezyonları arasındaki logaritmik<br />
farkın 10 -2.5 den yukarı olması gerektiği belirtilmiştir (4).<br />
266
MATERYAL VE METOT:<br />
MATERYAL<br />
Vero hücre kültüründe hazırlanan Koyun-Keçi çiçek aşısı; Vero hücre kültüründe<br />
hazırlanan SP(BK) LK-V12 aşısı l ml. liyofilize şişelerde 100 ml. sulandırma sıvısı ile<br />
Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Koyun-Keçi Çiçek aşısı üretim<br />
laboratuvarında temin edildi.<br />
Vero Hücre Kültürü; Bağışıklık çalışmalarında Serum nötralizasyon testinde kullanıldı(<br />
33). Eprüvasyon Suşu; Koyunların Eprüvasyonunda kullanılacak SP (İ) LK5 patojen saha<br />
suşu Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Koyun-keçi çiçek aşısı üretim<br />
laboratuvarından temin edildi.<br />
Bağışıklık çalışmasında kullanılacak koyunlar; Bağışık süresinin saptanması için<br />
kullanılacak 6-12 aylık 54 adet kuzular Lalahan <strong>hayvan</strong>cılık Araştırma Enstitüsünden satın<br />
alındı.<br />
Pozitif Koyun çiçek İmmunu Serumu; Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
aşı üretim laboratuvarından temin edildi.<br />
Besiyerleri;<br />
Virus Üretme Vasatı; G-MEM vasatı (Glasgow-MEM) kullanıldı.<br />
Hücre Üretme Vasatı; Serum nötralizasyon testleri için kullanılacak olan Vero hücre<br />
kültürünün hazırlanmasında kullanıldı.<br />
Fötal Buzağı Serumu; Hücre kültürü hazırlanmasında Hücre üretme vasatına katıldı.<br />
METOT;<br />
Satın alınan 54 adet kuzunun koyun çiçek hastalığına karşı antikor taşıyıp<br />
taşımadıklarının kontrolü.<br />
Kuzuların Aşılanması; Vero hücre kültüründe hazırlanan l m. Liyofilize koyun-keçi çicek<br />
aşı peledi 100 ml. sulandırma sıvısı ile sulandırıldı ve 36 adet kuzunun derisi altına l ml.<br />
olarak enjekte edildi.<br />
Aşılanan koyunlarda bağışıklık kontrolleri; SP(BK) LK-V12 aşısı ile aşılanan<br />
koyunların aşılamayı takiben l., 3., 6., 9, l2. aylarında her bir dönem için 4 aşılı ve 2 aşısız<br />
(kontrol) kuzunun serumları S.N Testi ile koyun çiçeği antikorları yönünden kontrol edildi<br />
ve eprüvasyon çalışması yapıldı.<br />
Serum Nözralizasyon testi; Mikroserum nötralizasyon testi ile koyun çiçeği virusuna ait<br />
antikor titre düzeyleri saptandı. Bu amaçla 96 kuyucuklu plakanın bütün kuyucuklarına<br />
50’şer µl G-MEM vasatı konuldu. Her bir toklunun kan serumundan 50’şer µl plakanın ilk<br />
dört kuyucuğuna konuldu ve ilk kuyucuklardan 50 µl alınarak alt kuyucuklara aktarılarak<br />
serumun iki katlı diluyonları yapıldı. Kuyucuklarda iki katlı dilusyonu yapılan serum<br />
örneklerinin üzerlerine 50’şer µl 100 DKID50 titrede SP(Bk)LK65 suşu eklendi ve 37 o C’de<br />
bir saat nöralizasyona bırakıldı. İnkubasyon süresi sonunda bütün kuyucuklara 50’şer µl<br />
vero hücre kültürü eklendi ve 37 o C’de %5 CO2’li ortamda 10 gün inkube edildi. Her gün<br />
hücreler CPE oluşumları yönünden kontrol edildi (2,7,8,).<br />
Eprüvasyon çalışması; Bu amaçla altı toklunun sağlı ve sollu göğüs bölgeleri traş<br />
edilerek alkolle iyice silindi. SP(İ)LK5 patojen saha suşunun PBS ile 10 -1 - 10 -5 arası 10<br />
katlı dilusyonları yapılarak her bir virus dilüsyonu koyunların göğüs bölgelerinin her iki<br />
tarafından seçilen ve aralarında en az 5’er cm aralık bırakılan dört noktaya 0.2 ml<br />
intradermal yolla inokule edildi. Eprüvasyondan sonra 15 gün süreyle <strong>hayvan</strong>ların her gün<br />
vucut ısıları alındı ve inokulasyon noktalarındaki değişimler izlendi(10,16,).<br />
267
BULGULAR VE TARTIŞMA<br />
Çalışmada kullanılmak amacıyla satın alınan 54 adet koyunun koyun çiçek<br />
hastalığına karşı antikor taşımadığı saptandı.<br />
• Vero hücre kültüründe üretilen koyun çiçek aşısının liyofilizasyon öncesi titresinin<br />
DKID50 10 6.5 /ml olduğu saptandı. Virus süspansiyonu liyofilizasyon öncesi titresi<br />
DKID50 10 5.5 /ml olacak şekilde sulandırıldı. Liyofilize edilen aşının liyofilizasyon<br />
sonrası ortalama titrenin DKID50 10 5.25 /ml olarak saptandı.<br />
• Liyofilize aşının yapılan bakteriyel,fungal ve viral kontaminantlar yönünden<br />
sterilite testleri yapıldı ve bakteriyel, fungal ve viral kontaminantlar yönünden ari<br />
olduğu saptandı.<br />
Aşılanan koyunlarda bağışıklık kontrolleri; aşılanan koyunların aşılamayı<br />
takiben koyun çiçeğine karşı antikor titreleri ;<br />
• SP(BK) LK-V12 koyun çiçek aşısı ile aşılanan koyunların (DKID50 10 3.25 /ml-doz)<br />
aşılamadan sonraki birinci ayda 4 adet kuzuda antikor titrelerinin ortalama SN İndex<br />
10 1.68 , üçüncü ayda 10 1.37 , altıncı ayda 10 1.22 , dokuzuncu ayda 10 0.9 olarak tespit<br />
edilirken 12. ayda kan serumlarında koyun çiçeğine karşı antikor titreleri saptanamadı<br />
(Tablo 1).<br />
• Eprüvasyon çalışması; Bu amaçla aşılama sonrası 1., 3., 6., 9. ve 12. aylarda aşılı<br />
ve kontrol koyunlarda bağışıklık seyiyeleri koyunların SP(İ)LK5 patojen saha suşu<br />
kullanılarak araştırıldı. Aşılama sonrası 1., 3., 6., 9. aylarda yapılan eprüvasyon testlerinde<br />
aşılı koyunların patojen virusa karşı korunduğu ve dolatısıyla koyun çiçeğine karşı yeterli<br />
bağışıklığa sahip olduğu saptanırken 12. ayda yapılan eprüvasyon çalışmalarında eprüve<br />
edilen aşılı 4 koyundan 1 adeti dişında 3 adetinde inokulasyon yapılan deri bölgelerinde<br />
koyun çiçeğine ait lezyonların oluştuğu ve dolayısıyla koyunların koyun çiçeğine karşı<br />
yeterli bağışıklığa sahip olmadığı saptanmıştır.<br />
Tablo 1. Koyun – keçi çiçek aşı ile aşılanan koyunlarda aylar itibariyle ortalama antikor titreleri<br />
Antikor<br />
titresi *<br />
1. ay<br />
Antikor<br />
titresi *<br />
3. ay<br />
Antikor<br />
titresi *<br />
6. ay<br />
Antikor<br />
titresi *<br />
9. ay<br />
Antikor<br />
titresi *<br />
12. ay<br />
Aşının cinci<br />
SP(Bk)LK-V12 10 1.68<br />
10 1.37 10 1.22 10 0.9 10 00<br />
• (log10 DKID50) SN İndex<br />
Ülkemizde koyun- keçi çiçeği hastalığı ile mücadelede attenue, liyofilize, Bakırköy<br />
koyun çiçek aşısı kullanılmaktadır. Aşı suşu İstanbul ilinin Bakırköy ilçesinde meydana<br />
gelen koyun çiçeği salgınında infekte bir koyundan izole edilmiştir. Etken İzolasyonunda<br />
ve aşı üretiminde primer hücre kültürleri kullanılmaktadır. Halen aşı üretiminde seri<br />
pasajlar ile dana böbrek ve kuzu böbrek hücre kültürlerinde attenue edilen suşun kuzu<br />
böbrek hücre kültüründeki 65. pasajı kullanılmaktadır.<br />
Koyun çiçeği aşısı üretiminde elde edilecek olan virus titreleri aşı hazırlanmasında<br />
önemli bir noktayı oluşturmaktadır. Koyun çiçeği hastalığı ile mücadelede kullanılan<br />
attenue aşının mililitresindeki virus miktarının 10 -4.5 den yukarı ve her <strong>hayvan</strong> için<br />
verilmesi gereken aşı suşunun sulandırma sonrası 10 -2.0 ile 10 -3.5 titreleri arasında<br />
olmasının gerekli olduğu bildirilmektedir (4). Bu çalışmada vero hücre kültüründe üretilen<br />
ve Liyofilize edilen aşının liyofilizasyon sonrası ortalama titresinin DKID50 10 5.3 /ml<br />
olduğu saptandı. Tespit edilen titrenin aşı sulandırılma sıvısı ile sulandırıldığında koyun<br />
başına 10 2.5 -10 -3.5 arasında olduğu ve koyun çiçeği aşısı üretiminde istenen miktarda<br />
mililitrede virus içerdiği saptanmıştır. Bu değerlerin uluslararası koyun çiçeği aşı üretim<br />
standartlarında olduğu görülmektedir (4).<br />
268
Martin ve ark. (27), koyun çiçeği aşısı uygulamasından sonra oluşan antikor<br />
düzeylerinin log.10 -0.80 - 10 -3.0 arasındaki değerlerde saptandığında <strong>hayvan</strong>ların bağışık<br />
olduğunu, log. 10 -0.50 – 10 -0.79 arasındaki değerlerde saptanan antikor titrelerinin şüpheli<br />
değerler olduğunu, log.10 -0.49’ den düşük değerlerde saptanan titrelerde koyunların bağışık<br />
olmadığını bildirmişlerdir. Erhan ve ark. (14), attenue Bakırköy koyun çiçek aşısı ile<br />
aşılanmış koyunlarda bağışıklığın saptanmasında elde edilen antikor titrelerinin log.10 -0.00-<br />
0.50 arası değerleri negatif, log.10 -0.51-0.80 değerleri arası şüpheli ve log.10 -0.81 dan yukarı<br />
değerleri pozitif olarak değerlendirmişlerdir. Bu çalışmada SP(BK)LK-V12 orijinli aşı ile<br />
aşılanan <strong>hayvan</strong>ların aşılamadan 9 ay sonra kan serumlarındaki antikor titreleri 10 0.9<br />
arasında bulunmuştur. Bu sonuçlar araştırıcıların öne sürdüğü titre seviyesi olan 10 -0.8 den<br />
daha yüksektir. Bu da <strong>hayvan</strong>larda 9. ayda koruyucu düzeyde antikor varlığını<br />
göstermektedir.<br />
Gürel (16), deneysel olarak oluşturulmuş koyun çiçeği hastalığında patojen saha<br />
suşunun 0.5 ml. intradermal verilmesini takiben koyunların vücut ısılarının ilk iki gün 39-<br />
40 o C iken üçüncü, dördüncü ve beşinci günlerde 41-41,5 o C ‘ ve altıncı günde 42 o C ye<br />
kadar yükseldiğini, altı ve 10. günler arasında iniş çıkışlar gösterdiğini, vücut ısılarındaki<br />
artışlarla birlikte <strong>hayvan</strong>larda genel hastalık bulgularının saptandığını, virusun<br />
verilmesinden 48 saat sonra deride inokulasyon yerinde hafif kızarma ve ödemle başlayan<br />
deri lezyonlarının yedi ve sekizinci günlerde çaplarının genişleyerek 6 cm’.yi aştığını<br />
bildirmiştir. Bu çalışmada SP(BK)LK-V12 orijinli aşı ile aşılanan <strong>hayvan</strong>lara aşılamadan<br />
sonra 1.,3.,6.,9. ve 12. aylarda patojen SP(İ)LK5 suşu ile eprüvasyon yapılmıştır. 1.,3.,6.,9.<br />
aylarda aşılı <strong>hayvan</strong>ların vucut ısılarında artış olmadığı, inokulasyon bölgelerinde herhangi<br />
bir lezyon oluşmadığı gözlenmiştir. Aşısız <strong>hayvan</strong>larda saptanan klinik bulgular<br />
araştırıcının verileri ile paralellik gösterdiği belirlenmiştir.<br />
Koyun çiçeği aşısı ile aşılanan koyunlarda bağışıklığın saptanması amacıyla yapılan<br />
eprüvasyon çalışmalarında aşılı koyunlardaki vucut ısılarındaki artış ve inokulasyon<br />
noktalarındaki lezyonların oluşmaması, lezyonların meydana gelmesi durumlarında aşılı<br />
koyunlar ile kontrol koyunların lezyonları arasındaki logaritmik farkın 10 -2.5 ’den yukarı<br />
olması gerektiği bildirilmiştir (1,4). Bu çalışmada ise aşılı koyunlarda vücut ısılarında<br />
artışın olmaması patojen virüs inokule edilen noktalarda çiçek lezyonları oluşmaması<br />
<strong>hayvan</strong>larda bağışıklığın oluştuğunun bir göstergesidir.<br />
Erhan ve ark.( 14) tarafından yapılan çalışmada kuzu böbrek hücre kültüründe<br />
üretilen SP(BK)LK65 aşısının koyunlarda 8 ay süreyle bağışıklık sağladığı bildirilmiştir.<br />
Bu çalışmada ise aynı suşun vero hücre kültüründe üretilmesi bağışıklık süresinin 1 ay<br />
daha fazla olduğu saptanmıştır.<br />
Sonuç olarak, vero hücre kültüründe üretilen Bakırköy koyun çiçek virusunun<br />
(SP(BK)LK-V12 ) koyunlarda koyun çiçek virusuna karşı 9 ay süreyle bağışıklık sağladığı<br />
tespit edilmiştir.<br />
LİTERATÜR LİSTESİ<br />
1 – Altınel C. Monolayer kuzu böbrek hücre kültürünün sabit sistem yerine döner sisteme<br />
adaptasyonu ve bu sistemde koyun-keçi çiçek aşısının üretilmesi. Pendik Vet. Kont.ve<br />
Araşt.Enst.Derg. 1992 ; 23 : 59-64.<br />
2 - Anon. Koyun – keçi çiçek aşısı üretim ve kontrol protokolü. Pendik Veteriner Kontrol ve<br />
Araştırma Enstitüsü.İstanbul.1979.<br />
3 - Anon. Şap aşısı üretim protokolü. Şap enstitüsü.Ankara.1980.<br />
4 - Anon. Office international des epizooties. Manuelof standards for diagnostic tests and<br />
vaccines. OIE press.Paris.1996 ; 119 – 127.<br />
5 - Anon. Koyun ve keçi çiçeği aşısı üretim protokolü. Pendik Vet. Kont. ve Araşt. enst.1978.<br />
6 - Arık F. Koyun çiçeği. Pendik Vet. Kont. ve Araş. Enst. yayınları. Hilal matbaacılık koll. Şti. ,<br />
İstanbul. 1971 ; 24 – 30.<br />
269
5 -Aygün S. T. The propagation of variola ovina virus sheep embrionic tissue cultures and its<br />
usefulness as a vaccine against this disease. Arch. Exp. Vet. Med. 1955 ; 9: 415 – 441.<br />
6 - Binepal Y. S ., Ongadi F . A and Chepkwony J . C . Alternative cell lines for the propagation<br />
of lumpy skin disase virus. J. Vet. Res. 2001 ; 68 : 151- 153<br />
7- Burleson F.G., Chambers T.M. and Wıedbrauk D.L. Virologia Laboratory Manuel. 1. ed.<br />
Academic Press. California. 1992 ; 20 – 61.<br />
8- Busby D.W.G. and House W. and Macdonald J.R. Virological Technique. 1.ed. Churchill<br />
Ltd. London, 1964 ; 95 – 136.<br />
9 - Carn V . M . Control of capripoxvirus infections. Vaccine. 1993 ; 11 : 1275- 1279.<br />
10 - Chifney S.T.E, Martin W.B. , Ergin H. And Köylü A. Factors associated with the<br />
production of attenated sheeppox vaccines. Res. Vet. Sci. 1973 : 14 ; 62-68.<br />
11 - Davies G. Capripox virus vaccine production and quality control. Pendik. İstanbul. 1996.<br />
12 - Davies F. G. And Mbugwa G. The alterations in pathogenicity and immunogenicity of a<br />
kenya sheep and goat pox virus on serial passage in bovine foetal muscle cell cultures. J. Comp.<br />
Path. 1985 ; 95 : 565 – 557.<br />
13- Ergin H. Köklü A. Ve Onar B. Keçi çiçeğine karşı kuzu böbrek hücre kültüründe aşı<br />
hazırlanması ve aşının keçilerde bağışıklık denemeleri. Pendik Vet. Kont. ve Araş. Enst. Derg.<br />
1986 ; 19 : 60 – 65.<br />
14-Erhan M. , Ergin H. Ve Onar B. Sahada liyofilize koyun çiçek aşısı ile aşılanan koyunlarda<br />
meydana gelen bağışıklığın değerlendirilmesi. Türkiye Bilimsel ve Teknik Araştırma Kurumu<br />
Projesi. 1979. Proje No: VHAG 6-327.<br />
15- Gershon P. D. And black D. N. A comparison of the genomes of capripox virus isolates of<br />
sheep, goats and cattle. Virology. 1988 ; 164 : 341 – 349.<br />
16-Güler A. Deneysel koyun çiçeği hastalığının patogenezisinin FAT ve histopatolojik<br />
yoklamalarla incelenmesi. Türkiye Bilimsel ve Teknik Araştırma Kurumu Projesi. Proje No.<br />
VHAG – 223. 1978 ; 54 – 67.<br />
17-Güler E. , Baykal O. Ve Tunçoku Ö. Liyofilize koyun – keçi çiçek aşısının farklı<br />
sıcaklıklarda raf ömrünün saptanması. Bornova Vet. Kont. ve Araş. Enst. Derg. 1979 ; 18 : 32<br />
18-Hoskins J. M. Virological Procedures. 1. Ed. Butterworth & co. Ltd. London. 1967 ; 201<br />
19-Krishnan R. Pathogenesis of sheep pox. Indian Vet. J. 1968 ; 45 : 297-302.<br />
20-Kitching R . P. Progress towards sheep and goat pox vaccines. Vaccine. 1983 ; 1: 4 - 9.<br />
21-Kitching R.P. The control of sheep and goatpox. Rev. Sci.tech.off.int.epiz. 1986 ; 5 : 501<br />
22 -Kitching R.P. and Carin V.M.Sheeppox and goatpox. OIE Manuel. OIE Press. Paris, 1994 ;<br />
2 : 1 – 11.<br />
23- Köylü A. ve Nada S.M. Koyun embrio deri kültürlerinde koyun çiçek virusunun üretilmesi.<br />
Pendik. Vet. Kont. ve Araşt. Enst. Derg. 1970 ; 3 : 3 : 88-89.<br />
24- Kurtul Y. Gebelik devresinde koyun çiçek aşısı ile aşılanmış koyunlardan doğan kuzularda<br />
immunite durumu. Pendik Vet. Kont. ve Araş. Enst. Derg. 1973 ; 6 : 77 – 92.<br />
25- Kurtul Y. ve Gürel A. Gebeliğin değişik dönemlerinde koyun çiçek aşısı ile aşılanmış<br />
koyunların kolostrum ve sütlerindeki nötralizan antikor seviyeleri. Pendik Vet. Kont. ve Araş. Enst.<br />
Derg. 1975 ; 23 : 57 – 60.<br />
26- Luria S. E. , Darnell J. R. and James E. General virology. 2. Ed. Medical Books Ltd.<br />
Newyork , 1967 ; 21 – 51.<br />
27- Martin W. B., Erhan M. Ve Onar B. Koyun çiçeği aşısı üzerinde çalışmalar ve serum<br />
nötralizasyon testleri. Pendik Vet. Kont. ve Araş. Enst. Derg. 1975 ; 8 : 26 – 47.<br />
28- Onar B. Koyun çiçeği virusunun koyun tiroid hücre kültüründe üreme safhalarının<br />
incelenmesi. Pendik Vet. Kont. ve Araş. Enst. Derg. 1973 ; 6 : 91 – 96.<br />
29 - Paul J. Cell and tissue culture. 4. Ed. E & S. Livingstone Ltd. London , 1965 ; 167 –<br />
30- Precausta P. , Kato F. And Vellut G. A new freeze – dried living virus vaccine against<br />
sheep pox . Comp. İmmun. Microbiol. Infect.Dıs. 1979 ; 1 : 305 – 319.<br />
31- Ross A. C. , Bell E. J. And Statt E. J. Diagnostic metods in clinical virology. 1. Ed.<br />
Blackwell scientific publications. Oxford , 1966 ; 28 – 54.<br />
32- Sıngh I. P. , Pande R. And Srivastava R. N. Sheep pox. The Vet Bull. 1979 ; 49 : 145<br />
33- Singh I. P. Rai. Adaptation and growth of sheeppox viris in Vero cell culture. İndian Vet.<br />
Med.J. 1991 ; 15 ; 4 : 245-250.<br />
270
KÜLTÜRÜ YAPILAN GÖKKUŞAĞI ALABALIKLARDA (S. Gairdneri)<br />
BAKTERİYEL BÖBREK HASTALIĞI (BKD)’NIN TEŞHİSİ<br />
ÖNSÖZ<br />
Dr. Sibel ÖZKÖK<br />
Uzm. Vet. Hek. Selahattin ŞEN,<br />
Dr. Hikmet ÜN<br />
Etlik Veteriner Merkez Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
Ülkemizde balık yetiştiriciliğine 1960’ların sonunda tatlı su balıklarında, deniz<br />
balıklarında ise 1986 yılında başlanmıştır. Halen ülkemizde 2001 yılı itibariyle 1769 adet<br />
onaylı balık çiftliği bulunmakta ve bunların 1423’ü iç sularda, 346’sı denizlerimizde<br />
faaliyet göstermektedir. Bu çiftliklerin yanı sıra çiftliklerin yavru ihtiyacını temin için 20<br />
adet kuluçkahane bulunmaktadır. Tatlı sularımızda gökkuşağı alabalığı üretimi oldukça<br />
yaygın olarak devam etmektedir. Türkiye’de alabalık üretimi 1990 yılında 3 212 ton iken<br />
1999 yılında 38 570 ton ve 2000 yılında ise 44 533 tona çıkmıştır. Bu rakamlardan da<br />
anlaşılacağı üzere ülkemizde su ürünleri yetiştiriciliği giderek hızla artmakta ve buna<br />
paralel olarak da olumsuz çevre şartları, kalitesiz yem ve hastalıklardan ileri gelen bir<br />
takım problemler de artış göstermektedir. Hastalıklar balıklarda ölüme neden olmaları,<br />
ihracatı olumsuz yönde etkilemeleri, tedavi masrafları, uygun kullanılmayan ilaçların<br />
rezidü sorunu yaratmaları, çevre kirliliği oluşturmaları, bakteriyel dirence neden olmaları<br />
ve iş ve zaman kaybına yol açmaları nedeniyle ülke ekonomisine büyük zararlar<br />
vermektedir.<br />
Balık yetiştiricilerimizin büyük çoğunluğu ihtiyaç duydukları yavru balıkları ya kendi<br />
kuluçkahanelerinde yetiştirmekte ya da mevcut olan kuluçkahanelerden temin<br />
etmektedirler. Kuluçkahanelerde var olan enfeksiyonlar birçok balık işletmesinden<br />
taşınmakta ve oradan doğal kaynaklara yayılma ihtimali de her zaman mevcut olmaktadır.<br />
OIE standartlarına ve AB’nin 91/67/EEC ve 93/53/EEC sayılı direktifleri<br />
çerçevesinde hastalıklı ve hastalıktan ari zonların, işletmelerin ve kuluçkahanelerin<br />
belirlenmesi, haritalanması, onaylanması, duyurulması, takibi, iyileştirilmesine yönelik<br />
tedbirlerin alınması, sertifikalanması, gerek iç piyasaya gerekse ihracata yönelik ürünlerin<br />
yetiştirildiği sular ve taşınmasına yönelik tedbirlerin alınması gerekmektedir. Kuluçkahane<br />
ve işletmelerin periyodik aralıklarla kontrollerinin yapılması ve bu kontroller sonucunda<br />
hastalık riski taşıyan kuluçkahanelerin gözlem altına alınması sağlanmalıdır.<br />
Bu bilgiler ışığında 3285 sayılı Hayvan Sağlığı ve Zabıtası Kanunu’nun 4. maddesine<br />
göre İhbarı Mecburi Hastalıklar Hakkındaki No: 2004/14 ve 01.04.2004 tarih ve 25420<br />
sayılı Resmi Gazete’de yayımlanan ve Kuluçkahane Sağlık Sertifikalarında Diğer Önemli<br />
Hastalıklar grubunda yer alan Bakterial Kidney Disease (Bakteriyel Böbrek Hastalığı,<br />
BKD) üzerine bir çalışma yapılması amaçlanmış ve bu doğrultuda hastalığın alabalık<br />
işletmeleri ve kuluçkahanelerinde yaygınlığı araştırılmıştır. Bu çalışmada kültürü yapılan<br />
alabalıklardan izolasyon ve identifikasyonu, FAT ve PCR testleri ile tespiti ve<br />
antibiyogramı amaçlanmıştır. Renibacterium salmoninarum ile ilgili olarak daha evvel<br />
Türkiye’de FAT ve PCR testleri ile yapılan bir çalışma bulunmamaktadır. Bu araştırmada<br />
OIE’nin önerdiği R. salmoninarum’un konvansiyonel yöntemlerle izolasyon ve<br />
identifikasyonu ile birlikte hızlı ve etkili teşhis yöntemleri olan DFAT ve nested-PCR<br />
testleri de kullanılmıştır.<br />
271
Bu proje Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü tarafından<br />
yürütülmüş ve alabalıkların ve ovaryum sıvılarının temini konusunda özel alabalık üretme<br />
işletmelerinden destek alınmıştır<br />
ÖZ: İhbarı Mecburi Hastalıklar grubunda yer alan Bakterial Kidney Disease (Bakteriyel<br />
Böbrek Hastalığı, BKD) üzerine bir çalışma yapılması amaçlanmış ve bu doğrultuda<br />
hastalığın alabalık işletmeleri ve kuluçkahanelerinde yaygınlığı araştırılmıştır. Bu<br />
çalışmada kültürü yapılan alabalıklardan izolasyon ve identifikasyonu, DFAT ve nested-<br />
PCR testleri ile tespiti ve antibiyogramı amaçlanmıştır. R. salmoninarum ile ilgili olarak<br />
daha evvel Türkiye’de DFAT ve nested-PCR testleri ile yapılan bir çalışma<br />
bulunmamaktadır. Bu araştırmada OIE’nin önerdiği R. salmoninarum’un konvansiyonel<br />
yöntemlerle izolasyon ve identifikasyonu ile birlikte hızlı ve etkili teşhis yöntemleri olan<br />
DFAT ve nested-PCR testleri de kullanılmıştır.<br />
R. salmoninarum izolasyon ve identifikasyonu için, Kesikköprü Baraj Göleti’nde yer<br />
alan 5 adet alabalık işletmesinden toplam 360 adet; Safranbolu’da yer alan 1 adet alabalık<br />
işletmesinden 120 adet 6-12 aylık alabalıklardan böbrek örnekleri aseptik koşullarda alındı.<br />
Safranbolu’da yer alan 1 adet alabalık işletmesinde 120 adet olgun dişi balıklardan<br />
ovaryum sıvısı uygun koşullarda alındı. Toplanan örneklerden R. salmoninarum<br />
izolasyonu için KDM-2 medium kullanıldı. Toplam 600 adet örnekten hiç R.<br />
salmoninarum izolasyonu olmadı. Aynı örneklerden FAT ve PCR testleri yapıldı.<br />
Örneklerin hiçbirinde etkene rastlanılamadı.<br />
Sonuç olarak Ankara ve civarında Bakteriyel Böbrek Hastalığı saptanamamıştır. Bu<br />
hastalık yönünden laboratuarımız alt yapısı uygun hale getirilmiş; konvansiyonel izolasyon<br />
ve identifikasyon yanında DFAT ve nested-PCR gibi testlerle alabalıklarda Bakteriyel<br />
Böbrek Hastalığı kısa sürede teşhis edilebilir hale gelmiştir.<br />
GİRİŞ<br />
Türkiye’de bu konu üzerinde 1977 yılında G. Halıcı, E. İstanbulluoğlu ve M. Arda<br />
tarafından bir araştırma yapılmıştır. Bayındır Barajı alabalık yetiştirme istasyonunda<br />
görülen R. salmoninarum’un izolasyonu ve sağaltımı üzerinde çalışılmıştır. M.<br />
Sarıeyyüpoğlu, A. Muz ve Y. Özdemir tarafından 1985 yılında yapılan diğer bir çalışmada<br />
Ovacık-Tunceli alabalık yetiştirme istasyonunda 10 adet alabalıkda R. salmoninarum tespit<br />
edilmiş ve sağaltımı yapılmıştır. Aynı etkenin DFAT ve PCR testleri ile ilgili bir çalışma<br />
bulunmamaktadır. Bu projede OIE’nin öngördüğü metodlar kullanarak kültürü yapılan<br />
alabalıklarda Bakteriyel Böbrek Hastalığı’na neden olan R.salmoninarum’un izolasyonu,<br />
DFAT ve nested-PCR testi ile kısa sürede teşhisi hedeflenmiştir.<br />
Bu projenin amacı Ankara ve civarında hastalığın alabalık işletmeleri ve<br />
kuluçkahanelerinde yaygınlığı araştırmak; yetiştiricilerle direk temasa geçilerek hastalık<br />
hakkında bilgi vermek; aynı zamanda ileride yapılması gerekli olan tarama çalışması için<br />
pilot bir çalışma yapmak; ileriki zamanlarda doğabilecek herhangi bir Bakteriyel Böbrek<br />
Hastalığı salgınında laboratuarımızı bu materyal ve metodu uygulayabilecek hale<br />
getirmektir.<br />
Aynı zaman DFAT ve nested-PCR testleri ile oldukça kısa sürede hastalık teşhisi<br />
yapıp, vertikal ve horizantel bulaşabilen bu etkenin neden olduğu salgınlara kısa sürede<br />
müdahele edilebilir hale gelmektir.<br />
272
LİTERATÜR ÖZETİ<br />
Bakteriyel Böbrek Hastalığı (BKD) salmonidlerde yüksek mortalite ile seyreden<br />
sistemik bir enfeksiyondur. Hastalık genellikle kronik olarak seyreder, ancak özellikle<br />
düşük ısılarda (13-18ºC) akut hale geçip salgınlar halinde görülebilir. Salgınlar ilk defa<br />
İskoçya’da Atlantik salmonlarda bildirilmiştir. Daha sonra Amerika’da 1935 yılında<br />
hastalık bildirimi yapılmıştır (Bullock ve Herman, 1980)<br />
Etken küçük, hareketsiz, gram pozitif, diplokoklardır. İlk defa Ordal ve Earp (1956)<br />
izole etmeyi başarmışlar ve Corynebacterium olarak klasifiye etmişlerdir. Sanders ve Fryer<br />
(1980), etkenin biyokimyasal özelliklerini dikkate olarak Renibacterium salmoninarum<br />
olarak isimlendirmişlerdir (Bullock ve Herman, 1980)Bullock ve Stuckey (1975; Bullock<br />
ve ark. (1980) oldukça hızlı olan direkt ve indirek FAT ile subklinik ve klinik enfekte<br />
<strong>hayvan</strong>ları saptayabilmişlerdir (Bullock ve Herman, 1980)<br />
R. salmoninarum’un 1990 ve 2002 yıllları arasında yapılan izleme <strong>program</strong>ında<br />
İskoçya sularında Atlantik salmon ve gökkuşağı alabalıklarında birçok salgınlar yaptığı<br />
tespit edilmiştir. Teşhis için kültür, bakteriyoskopi ve ELISA kullanılmıştır. (Bruno, 2004).<br />
Bakteri yabani stoklardan yumurta yolu ile hatcherilere taşınmaktadır. Rutin olarak<br />
balık ürünleri pastörizasyona tabi olduğu halde stoklardan BKD elemine edilememiştir.<br />
Hayli yüksek patojen olan bu etkenin kontrolü için hızlı ve duyarlı test metotları<br />
kullanılması oldukça avantaj sağlamaktadır. Bunlara rağmen BKD halen doğal ve kültür<br />
alabalıkçılığında ciddi bir problem olarak karşımıza çıkmaktadır. (Fryer ve Lannan, 1993)<br />
Bakteriyel Böbrek hastalığı ilk olarak 1930 yılında İngiltere’de Atlantik Salmonlarda<br />
tanımlanmış. 1935 yılında ABD’de alabalık yavrularında ortaya çıkmıştır. Ancak etken<br />
izolasyonu 1950’li yıllarda yapılmıştır. 1995 yılında ABD’de yapılan bir çalışmada yavru<br />
alabalıklarda tespit edilen Bakteriyel Böbrek Hastalığı için kullanılan teşhis yöntemleri<br />
karşılaştırılmıştır. Yine 1995 yılında Finlandiya’da balıklarda BKD üzerinde çalışılmıştır.<br />
Kanada’da 1995 yılında Atlantic salmon ve Salmo salar kuluçkahanelerindeki yavru<br />
balıklarda R. salmoninarum IFAT testi ile araştırılmış, 424 adet balığın % 13.7’sinde<br />
hastalık tespit edilmiştir. 1992 yılında İspanya’da ilk R. salmoninarum izolasyonu<br />
bildirilmiştir. 1994 yılında ise Polonya’da, 1993 yılında’da İngiltere’de alabalıklarda bu<br />
hastalık araştırılmıştır. 1987 yılında Norveç’te yapılan bir çalışmada 11 işletmede BKD<br />
tespit edilmiştir.<br />
Chase ve Pascho (1998), yaptıkları bir çalışmada Salmonidlerin vücut sıvılarından ve<br />
dokularında nükleik asid bazlı testlerle R. salmoninarum teşhis etmişlerdir. Nested-PCR<br />
yöntemini kullanmışlar, böbreklerden konvansiyonel PCR yönteminden daha çok etken<br />
saptamışlardır. Nested-PCR’ın yanlış pozitif reaksiyonlar veren ELISA ve FAT<br />
tekniklerinden daha hassas olduğunu saptamışlardır. 74 adet doğal enfekte chinook<br />
salmonda yaptıkları çalışmada nested-PCR, ELISA ve FAT oranlarını %61, 47 ve 43<br />
olarak bulmuşlardır.<br />
Pascho ve ark. (1998) yaptıkları çalışmada doğal enfekte 103 adet chinook salmon<br />
ovaryum sıvıları üzerinde çalışmışlar; ELISA ile % 39’unu , nested-PCR ile de hasta<br />
olanların % 100’ünü saptamışlardır.<br />
Miriam ve ark. (1997), yaptıkları bir çalışma sonucunda enfekte ovaryum sıvısında<br />
çok düşük orandaki R. salmoninarum’un da saptanabildiğini ve kültürü yapılamayan veya<br />
ölen bakterilerin saptanmasında bu yöntemin güvenle kullanılabileceğini belirtmişlerdir.<br />
White ve ark. (1995), çalışmalarında kültür, ELISA ve FAT karşılaştırmışlar; yüksek<br />
dozla enfekte dokularda ELISA ve FAT daha hassas olduğu halde düşük dozla enfekte<br />
dokularda bakteriyolojik kültürden daha düşük hassasiyette olduğunu saptamışlardır.<br />
Magnusson ve ark (1994) yaptıkları bir diğer çalışmada doğal enfekte balıklardan<br />
alınan özellikle ovaryum sıvılarında reverse transcription ve nested-PCR bazlı yöntemlerde<br />
273
1-10 bakteriye kadar etkenin saptanabildiğini ve 1-2 gün içinde sonuç alınabildiğini<br />
bildirmişlerdir.<br />
Jansson (2002), Sueciae’de yaptığı tez çalışmasında 400 adet salmonid balık<br />
böbrekleri üzerine ELİSA ve kültür yöntemlerini kullanarak R. salmoninarum tespit<br />
etmeye çalışmış, ancak BKD yönünden hepsini negatif bulmuştur.<br />
Türkiye’de ilk olarak 1977 yılında G. Halıcı, E. İstanbulluoğlu ve M. Arda tarafından<br />
Bayındır Barajı alabalık yetiştirme istasyonunda görülen bakteriyel böbrek hastalığı ve<br />
sağaltımı üzerinde çalışılmıştır.<br />
M. Sarıeyyüpoğlu, A. Muz ve Y. Özdemir tarafından 1985 yılında yapılan bir<br />
çalışmada Ovacık-Tunceli alabalık yetiştirme istasyonunda 10 adet alabalıkda R.<br />
salmoninarum tespit edilmiştir.<br />
MATERYAL VE METOT<br />
Örneklerin Toplanması:<br />
Bu projede R. salmoninarum izolasyon ve identifikasyonu için, Kesikköprü Baraj<br />
Göleti’nde yer alan 5 adet alabalık işletmesinden toplam 480 adet; Safranbolu’da yer alan<br />
1 adet alabalık işletmesinden 120 adet 6-12 aylık alabalıklardan böbrek örnekleri aseptik<br />
koşullarda alındı. Safranbolu’da yer alan 1 adet alabalık işletmesinde 120 adet olgun dişi<br />
balıklardan ovaryum sıvısı uygun koşullarda alındı.<br />
Besi Yeri:<br />
İzolasyon için OIE’nin öngördüğü besi yerlerinden % 5-10 fötal sığır serumu bulunan<br />
KDM-2 medium kullanıldı (OIE. Manual 2006).<br />
KDM-2 Medium:<br />
0.1 g l-cystein (chlorhydrate),<br />
1 g tryptone,<br />
0.05 g yeast extract,<br />
1.5 g agar,<br />
100 ml Distile su.<br />
pH 6.5-6.8’e ayarlanır, 20 dakika 120˚C’de otoklava tabi tutulur. 56˚C’de<br />
soğutulduktan sonra % 5-10 calf serum ilave edilerek petrilere dökülür. +4˚C’de bir<br />
ay saklanabilir (OIE. Manual 2006).<br />
Strip:<br />
İdentifikasyonu için OIE’nin önerdiği API-Zym kullanıldı (OIE. Manual 2006).<br />
Konjugate<br />
İşaretli antikor olarak “fluorescein labeled Affinity purified antibody to<br />
Renibacterium salmoninarum, Maryland, 20879 USA” kullanıldı (OIE. Manual<br />
2006).<br />
Primerler:<br />
• İlk etapta 75-93 (5’-AGC-TTC-GCA-TGA-G-3’;P3) ve reverse 438-458 (5’-GCA-<br />
ACA-GGT-TTA-TTT-GCC-GGG-3;M21) primerleri,<br />
• İkincisinde 95-119 (5’-ATT-CTT-CCA-CTT-CAA-CAG-TAC-AAG-G-3’;P4) ve<br />
reverse 394-415 (5’-CAT-TAT-CGT-TAC-ACC-CGA-AAC-C-3’; M38) primerleri<br />
kullanıldı (OIE. Manual 2006).<br />
İzolasyon:<br />
İzolasyon için OIE’nin öngördüğü besi yerlerinden % 5-10 fötal sığır serumu bulunan<br />
KDM-2 medium kullanıldı (Daly J.G. ve Stevenson R.M.W., 1987; Evelyn T.P.T., 1977).<br />
Ortalama 3 hafta (8-16 hafta) 15 ˚C’de inkübe edildi. R. salmoninarum küçük, (0.3-1.5 x<br />
0.1-1 μm) Gram pozitif, PAS pozitif, hareketsiz, sıklıkla çift, kısa çomak veya pleomorfik,<br />
“Çin yazısına” benzer formdadır. Katalaz pozitif, oksidaz negatiftir (OIE. Manual 2006).<br />
İdentifikasyon:<br />
274
İzole edilen bakteriler oksidaz ve katalaz testlerine tabii tutulur. Katalaz pozitif ve<br />
oksidaz negatif olan identifikasyonu için OIE’nin önerdiği API-Zym kullanıldı (OIE.<br />
Manual 2006; Austin ve Austin, 1999). R. salmoninarum’um API Zym’deki profili şu<br />
şekildedir.: -+-+-+--+-++---+--+/-- (Austin ve Austin, 1999).<br />
DFAT:<br />
Enfekte dokularda R.salmoninarum’un tespiti için direkt immunofluoresans testi<br />
(DFAT) kullanıldı. DFAT testi R. salmoninarum’un tespitinde kullanılan oldukça yaygın<br />
bir testtir. Bu testte 3 bölüm yer almaktadır. Böbrek ve ovaryum sıvıları lama fikze edildi,<br />
işaretli antikorla (fluorescein labeled Affinity purified antibody to Renibacterium<br />
salmoninarum, Maryland, 20879 USA) boyandı, değerlendirildi. DFAT testi sonuçları OIE<br />
Manual’de belirtilen standart kriterler baz alınarak yapıldı. DFAT testi OIE Manuel’de<br />
belirtilen Fish Pathology Section Laboratory Manual, Meyers, ed. Special Publication 11,<br />
Alaska Dept. Fish and Game, P.O. Box 25526, Juneau, AK 99802 USA’den baz alınarak<br />
uygulandı (OIE. Manual 2006).<br />
a)Böbrek örnekleri ve ovaryum sıvıları: Böbrek dokularından ve ovaryum sıvılarından<br />
frotiler hazırlandı, kurutuldu ve methanol ile yaklaşık 5-10 dakika tespit edildi.<br />
b) Pozitif ve negatif kontrol: DFAT’inde pozitif kontrol olarak Renibacterium<br />
salmoninarum (ATCC 33209) suşu kullanıldı.<br />
c)Preparatlar karanlık ve nemli ortamda muhafaza edildi. Her preparata bir damla<br />
(100µL) spesifik FITC-konjugate ilave edildi.<br />
d) Oda ısısında 60 dakika inkübe edildi.<br />
e) Preparatlar PBS (pH=7.1) ile yıkandı.<br />
f) Havada kurutulup ve bir damla mounting medium ilave edilip, lamel ile kapatıldı.<br />
g) Okuma ve yorum: Preparatlar floresan mikraskopta x1000 büyütmede okundu. Önce<br />
pozitif ve negatif kontrole bakıldı (OIE. Manual 2006).<br />
PCR testi:<br />
Doku örneklerinden ve ovaryum sıvılarından nested-PCR yapıldı. Nested-PCR’da<br />
Chase D.M. ve Pascho R.J. (1998), Pascho R.J., Chase D. ve McKibben C.L. (1998)’de<br />
belirtilen metod baz alındı (OIE. Manual 2006).<br />
a)PCR testi için önemli olan genel kurallar:<br />
• DNA ekstraksiyonu kontaminasyonu önlemek için PCR ürünü ile temas etmeyecek<br />
başka temiz bir bölümde yapılmalı,<br />
• Yanlış pozitif reaksiyonları önlemek için DNA ekstraksiyon işlemleri ayrı, temiz<br />
bir bölümde veya steril kabin içinde yapılmalı, işlemden sonra UV ile steril edilmelidir.<br />
• Her işlem (reagentlar, ilaveler ve pipetasyonlar) bu iş için ayrılmış bölümlerde<br />
yapılmalıdır,<br />
b) Primer dizaynı: Bu metoda göre testte iki adet oligonükleotid primer kullanıldı.<br />
Primerler R. salmoninaru’un p57 protein sekansına göre dizayn ettirilmiştir.<br />
• İlk aşama PCR’da forward 75-93 (5’-AGC-TTC-GCA-TGA-G-3’;P3) ve reverse<br />
438-458 (5’-GCA-ACA-GGT-TTA-TTT-GCC-GGG-3;M21) primerleri kullanıldı.<br />
• İkinci aşama PCR’da (nested) forward 95-119 (5’-ATT-CTT-CCA-CTT-CAA-<br />
CAG-TAC-AAG-G-3’;P4) ve reverse 394-415 (5’-CAT-TAT-CGT-TAC-ACC-CGA-<br />
AAC-C-3’; M38) primerleri kullanıldı.<br />
c) DNA ektraksiyonu ve purifikasyonu için DNA ektraksiyon Kit’i kullanıldı<br />
(DNeasy Tissue Kit, Qiagen). Elde edilen DNA’lar spektrofotometrede ölçüldü (Nanodrop,<br />
ND-1000).<br />
• Böbrek Dokusu: Böbreklerden yaklaşık 25-50 mg doku örnekleri 1.5 ml’lik<br />
mikrosantrifüj tüplerine alındı.<br />
• Ovaryum sıvıları: 25 ml ovaryum sıvısı 1.5 ml’lik santrifüj tüplerine alındı.<br />
• R. salmoninarum:<br />
275
d) Nükleik asit örneklerinin saflık kontrolü: DNA örnekleri 260 ve 280 nm<br />
absorbance hacimde, moleküler biyolojik kalite su konsantrasyonu 0.01 ve 0.1 ng/µl<br />
olacak şekilde ayarlandı. Saf DNA oranı A260/A280’de 1.8-2.0 oranında olmasına dikkat<br />
edildi..<br />
e) Birinci basamak PCR protokolü:<br />
• PCR reaksiyon mixinin hazırlanması:<br />
Toplam hacim 50 µl olmalı: 10 µl nükleik asit ve 40 µl reaksiyon mixi olmalı.<br />
Reaksiyon mixi içerisinde 0.2 mM her bir nükleotid, 50 mM KCL, 10 mM Tris/HCl, pH<br />
8.3, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM her bir primer (P3 ve M21) ve Taq polymerase.<br />
• Template DNA hariç tüm reagentlar “Master Mix” tüpüne yerleştirilir.<br />
• PCR tüplerine 10 µl DNA ekstraksiyonları ilave edilir.<br />
• PCR tüpleri termal cyclera yerleştirilir.<br />
• Termal cycler <strong>program</strong>ı şu şekilde olur: 30 kez denaturasyon 94ºC 30 saniye;<br />
anneling 60 ºC 30 saniye; extending 72 ºC 1 dakika.<br />
f) İkinci basamak PCR protokolü:<br />
Toplam hacim 50 µl olmalı: 1 µl ilk basamakta elde edilen amplifiye DNA ve 49 µl<br />
reaksiyon mixi olmalı. Master mix içerisinde 0.2 mM her bir nükleotid, 50 mM KCL, 10<br />
mM Tris/HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM her bir primer (P4 ve M38) ve Taq<br />
polymerase.<br />
• Amplifiye DNA hariç tüm reagentlar “Master Mix” tüpüne yerleştirilir.<br />
• PCR tüplerine 1 µl ilk basamak PCR ürünü ilave edilir.<br />
• PCR tüpleri termal cyclera yerleştirilir.<br />
• Termal cycler <strong>program</strong>ı şu şekilde olur: 30 kez denaturasyon 94ºC 30 saniye;<br />
anneling 60 ºC 30 saniye; extending 72 ºC 1 dakika.<br />
g) Amplifiye DNA’nın görünür hale getirilmesi:<br />
• Yaklaşık 10 µl PCR ürünü jel elektroforezde (% 2 agaroz jel) yürütülür. Her<br />
elektroforezde 1 kb DNA ladder (marker)’da olmalıdır.<br />
• Jel boyanması için 5 mg/ml ethidium bromide kullanılır.<br />
• Jel UV transillumination altında değerlendirilir. R. salmoninarum 320 baz çifti<br />
olarak tespit edilir (OIE. Manual 2006).<br />
Antibiyogram:<br />
İzole edilen suşların antibiyogram duyarlılık testi ATB-Vet ile yapıldı (OIE. Manual<br />
2006).<br />
BULGULAR VE TARTIŞMA<br />
Bu projede R. salmoninarum izolasyon ve identifikasyonu için, Kesikköprü Baraj<br />
Göleti’nde yer alan 5 adet alabalık işletmesinden toplam 480 adet; Safranbolu’da yer alan<br />
1 adet alabalık işletmesinden 120 adet 6-12 aylık alabalıklardan böbrek örnekleri aseptik<br />
koşullarda alındı. Safranbolu’da yer alan 1 adet alabalık işletmesinde 120 adet olgun dişi<br />
balıklardan ovaryum sıvısı uygun koşullarda alındı. Toplam 600 adet numune toplandı.<br />
Proje planlanırken her bir işletmeden 2 yıl süresince 2 kez 30’ar adet numune<br />
toplanılmasına karar verildi. Ancak global su sorunu nedeni ile Büyük Kızılırmak<br />
Projesinden dolayı Kesikköprü Baraj Göleti’nden Ankara’ya su temin edilmesi çalışmaları<br />
sonucu alabalık işletmelerinin bir kısmı kapandı, bir kısmı da üretimi durdurdu. Bu nedenle<br />
hedeflenen sayıya ulaşılamadı. Ancak Kesikköprüde kapanan işletmelere ilaveten<br />
Safranbolu’dan bir adet alabalık işletmesi ve bir adet de damızlık işletmesi projeye dahil<br />
edildi. Aşağı verilen çizelgede hangi işletmelerden ne kadar numune toplandığı<br />
belirtilmiştir (Çizelge 1).<br />
276
Kesikköprü Baraj Göleti’nde Yer Alan İşletmelerden Alınan Numune Sayısı<br />
1.yıl 2.yıl Toplam<br />
1. 2. 3. 4.<br />
Dönem Dönem Dönem Dönem<br />
1.İşletme (böbrek) 30 30 30 30 120<br />
2. İşletme (böbrek) 30 30 30 - 90<br />
3. İşletme (böbrek) 30 30 - - 60<br />
4. İşletme (böbrek) 30 30 - - 60<br />
5. İşletme (böbrek) 30 - - - 30<br />
Safranboluda Yer Alan İşletmeler<br />
1.İşletme (böbrek) 30 30 30 30 120<br />
Damızlık<br />
(Ovaryum sıvısı)<br />
30 30 30 30 120<br />
Toplam 210 180 120 90 600<br />
Çizelge 1. Alabalık işletmelerinden alınan numune sayısı.<br />
Toplanan örneklerden R. salmoninarum izolasyonu için KDM-2 medium kullanıldı.<br />
Toplam 600 adet numuneden KDM-2 mediuma aseptik koşullarda ekimler yapıldı ve 15<br />
ºC’de 4-6 hafta inkübe edildi. Kontrol için standart R. salmoninarum’da aynı koşullarda<br />
inkübe edildi. Toplam 600 adet böbrek ve ovaryum sıvılarından yapılan hiçbir ekimde R.<br />
salmoninarum izolasyonu olmadı. R. Salmoninarum standart suşu ise 48 saat sonra<br />
üremeye başladı. API Zym ile yapılan identifikasyonda OIE. Manual. 2006’da belirtilen<br />
profilin aynısı saptandı (Resim 1).<br />
Resim 1. R. salmoninarum küçük, (0.3-1.5 x 0.1-1 μm) Gram pozitif, sıklıkla çift,<br />
kısa çomak veya pleomorfik, “Çin yazısına” benzer formda mikroskopik görüntüsü.<br />
Bu projede toplanan 600 adet numune işaretli antikorla (fluorescein labeled Affinity<br />
purified antibody to Renibacterium salmoninarum, Maryland, 20879 USA) DFAT yapıldı.<br />
Numunelerin hiçbirinde etkene rastlanılamadı. Pozitif kontrolde ise oldukça kuvvetli<br />
fluoresans veren R. salmoninarum oldukça yoğun görüldü (Resim 2).<br />
277
Resim 2. R. salmoninarum standart suşun DFAT ile boyanmış, fluoresans<br />
mikroskoptaki görüntüsü.<br />
Nükleik asit örneklerinin saflık kontrolü: DNA örnekleri 260 ve 280 nm absorbance<br />
hacimde, moleküler biyolojik kalite su konsantrasyonu 0.01 ve 0.1 ng/µl olacak şekilde<br />
ayarlandı. Elde edilen DNA’lar spektrofotometrede ölçüldü (Nanodrop, ND-1000). Saf<br />
DNA oranı A260/A280’de 1.9 oranında bulundu.<br />
Böbreklerden ve ovaryum sıvılarından nested-PCR yapıldı. Nested PCR’da Chase<br />
D.M. ve Pascho R.J. (1998), Pascho R.J., Chase D. ve McKibben C.L. (1998)’de belirtilen<br />
metod baz alındı) (OIE. Manual 2006). DNA ektraksiyonu ve purifikasyonu için DNA<br />
ektraksiyon Kit’i kullanıldı (DNeasy Tissue Kit, Qiagen) (OIE. Manual 2006).<br />
PCR ürünlerinin 10 μl’si % 2,’lik agaroz jelde yürütülerek ethidium bromide ile<br />
boyanıp, UV transsilliminatörde spesifik bantların varlığı izlendi.<br />
PCR testinin sensitivite ölçümü için içerisinde 1.5X10 2 bakteri/ml bulunan pozitif<br />
kontrolün -1’den -7’ye kadar 10 katlı dilusyonları hazırlandı ve hepsi ayrı ayrı PCR<br />
işlemine tabii tutuldu. Son dilüsyon basamağında (-7) dahi pozitifliğin saptandığı tespit<br />
edildi. Testin sonucunda 150 bakteri/ml’den 15 bakteri/µl’ye kadar etken PCR ile<br />
saptanabilmiştir (Res. 3).<br />
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
278
M:Marker, 1:10 -1 , 2:10 -2 , 3:10 -3 , 4:10 -4 , 5:10 -5 , 6:10 -6 , 7:10 -7 (15 bakteri/µl), 8: Saf pozitif kontrol<br />
(0.5 Mac Farland: 1.5x10 2 bakteri/ml), 9: Negatif kontrol<br />
Resim 3. PCR testinin sensitivitesini ölçmek için yapılan Pozitif kültür ve 10 katlı dilusyonların PCR<br />
sonuçları.<br />
Toplam 600 adet numune nested-PCR’a tabii tutuldu. Örneklerin hiçbirinde 320 baz çifti saptanamadı (Resim<br />
4).<br />
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12<br />
M:Marker, 10 adet alabalık böbrek örneği, 11: Pozitif kontrol, 12: Negatif kontrol.<br />
Resim 4. Nested-PCR yapılan bazı numunelerin ve pozitif kontrolün oluşturduğu<br />
bantlar.<br />
Toplam 600 adet numunenin tabi tutulduğu izolasyon, DFAT ve nested-PCR<br />
sonuçları çizelge halinde verilmiştir (Çizelge 2).<br />
Konvansiyonel<br />
izolasyon<br />
DFAT Nested-PCR<br />
Toplam (n) - - -<br />
Böbrek (480) - - -<br />
Ovaryum sıvısı (120) - - -<br />
Çizelge 2. Konvansiyonel izolasyon, DFAT ve nested-PCR sonuçları.<br />
Sonuç olarak bu projede Ankara ve civarından toplanan toplam 480 adet böbrek ve<br />
120 adet ovaryum sıvısında konvansiyonel izolasyon, DFAT ve nested-PCR testleri ile R.<br />
salmoninarum tespit edilememiştir. Bu bölgede Bakteriyel Böbrek Hastalığı’nın olmadığı<br />
görülmüştür. İzolasyon ve identifikasyonu oldukça güç olan bu bakterinin hem<br />
konvansiyonel izolasyon metotu hem de DFAT ve nested-PCR gibi kısa sürede netice<br />
alınabilen testleri çalışılmış oldu. Şu anda ülkemizde ihbari mecburi olan bu hastalık<br />
yönünden işletmelerin taranması istendiğinde hastalığın teşhisi için laboratuarımız alt<br />
yapısı uygun bulunmaktadır.<br />
Bu etkenin teşhisi için DFAT ve Nested-PCR konvansiyonel izolasyon ve<br />
identifikasyona göre daha uygun testlerdir. Konvansiyonel izolasyon yönteminde<br />
inkübasyon süresi çok uzundur; bu uzun inkübasyon süresi boyunca kontaminasyon riski<br />
oldukça artmaktadır. Ayrıca R. salmoninarum besi yerinde diğer bilindik bakterilerden<br />
farklı tarzda üremektedir. DFAT ve PCR testi oldukça kısa sürede sonuç verebilmekte ve<br />
konvansiyonel yönteme göre daha güvenilirdir.<br />
Magnusson ve ark. (1994) yaptıkları bir diğer çalışmada, doğal enfekte balıklardan<br />
alınan özellikle ovaryum sıvılarında reverse transcription ve nested-PCR bazlı yöntemlerde<br />
1-10 bakteriye kadar etkenin saptanabildiğini ve 1-2 gün içinde sonuç alınabildiğini<br />
279
ildirmişlerdir. Bu projede PCR testinin spesivitesini ölçmek için yapılan diluslardan elde<br />
edilen PCR sonucunda 15 bakteri/µl’de saptayabildiği görülmüştür. Bu da oldukça düşük<br />
bir orandır. Nested-PCR, R. salmoninarum’un tespitinde oldukça duyarlı bir metotdur.<br />
Chase ve Pascho (1998), yaptıkları bir çalışmada Salmonidlerin vücut sıvılarından ve<br />
dokularında nükleik asid bazlı testlerle R. salmoninarum teşhis etmişlerdir. Nested-PCR<br />
yöntemini kullanmışlar, böbreklerden konvansiyonel PCR yönteminden daha çok etken<br />
saptamışlardır. Nested-PCR’ın yanlış pozitif reaksiyonlar veren ELISA ve FAT<br />
tekniklerinden daha hassas olduğunu saptamışlardır. 74 adet doğal enfekte chinook<br />
salmonda yaptıkları çalışmada nested-PCR, ELISA ve FAT oranlarını %61, 47 ve 43<br />
olarak bulmuşlardır. Bu projede herhangi bir izolasyon olmadığı için testler arasında bir<br />
karşılaştırılma yapılamamıştır.<br />
Pascho ve ark. (1998) yaptıkları çalışmada doğal enfekte 103 adet chinook salmon<br />
ovaryum sıvıları üzerinde çalışmışlar; ELISA ile % 39’unu , nested-PCR ile de hasta<br />
olanların % 100’ünü saptamışlardır.<br />
Miriam ve ark. (1997),yaptıkları bir çalışma sonucunda enfekte ovaryum sıvısında<br />
çok düşük orandaki R. salmoninarum’un da saptanabildiğini ve kültürü yapılamayan veya<br />
ölen bakterilerin saptanmasında bu yöntemin güvenle kullanılabileceğini belirtmişlerdir.<br />
White ve ark. (1995), çalışmalarında kültür, ELISA ve FAT karşılaştırmışlar. Yüksek<br />
dozla enfekte dokularda ELISA ve FAT daha hassas olduğu halde düşük dozla enfekte<br />
dokularda bakteriyolojik kültürden daha düşük hassasiyette olduğunu saptamışlardır.<br />
Jansson (2002), Sueciae’de yaptığı tez çalışmasında 400 adet salmonid balık<br />
böbrekleri üzerine ELİSA ve kültür yöntemlerini kullanarak R. salmoninarum tespit<br />
etmeye çalışmış, ancak BKD yönünden hepsini negatif bulmuştur.<br />
Sonuç olarak bu projede Ankara ve civarında Bakteriyel Böbrek Hastalığı<br />
saptanamamıştır. Bu vertikal ve horizantel bulaşan R. salmoninarum’un neden olduğu bu<br />
hastalığın teşhisi yönünden laboratuarımız alt yapısı uygun hale getirilmiş; konvansiyonel<br />
izolasyon ve identifikasyon yanında DFAT ve nested-PCR gibi testlerle alabalıklarda<br />
Bakteriyel Böbrek Hastalığı kısa sürede teşhis edilebilir hale gelmiştir. İhbari mecburi<br />
hastalıklar arasında yer alan bu hastalık yönünden alabalık işletmelerinin 6 ay aralıklarla<br />
yılda iki kez taramaları yapılması gerekmektedir. Bu proje ileride yapılabilecek çalışmalara<br />
da bu anlamda ışık tutmaktadır.<br />
ÖZET<br />
Kültürü yapılan gökkuşağı alabalıklarında (S. Gairdneri) Bakteriyel Böbrek<br />
Hastalığı (BKD)’nın Teşhisi<br />
Bu projede R. salmoninarum izolasyon ve identifikasyonu için, 2005-2007 yılları<br />
arasında, Kesikköprü Baraj Göleti’nde yer alan 5 adet alabalık işletmesinden toplam 360<br />
adet; Safranbolu’da yer alan 1 adet alabalık işletmesinden 120 adet 6-12 aylık<br />
alabalıklardan böbrek örnekleri aseptik koşullarda alındı. Safranbolu’da yer alan 1 adet<br />
alabalık işletmesinde 120 adet olgun dişi balıklardan ovaryum sıvısı uygun koşullarda<br />
alındı. Toplanan örneklerden izolasyon için KDM-2 medium kullanıldı. Toplam 600 adet<br />
örnekten hiç R. salmoninarum izolasyonu olmadı. Aynı örneklerden DFAT ve nested-PCR<br />
testleri yapıldı. Örneklerin hiçbirinde etkene rastlanılamadı.<br />
Sonuç olarak Ankara ve civarında Bakteriyel Böbrek Hastalığı saptanamamıştır. Bu<br />
hastalık yönünden laboratuarımız alt yapısı uygun hale getirilmiş; konvansiyonel izolasyon<br />
ve identifikasyon yanında DFAT ve nested-PCR gibi testlerle alabalıklarda Bakteriyel<br />
Böbrek Hastalığı kısa sürede teşhis edilebilir hale gelmiştir.<br />
Anahtar Kelimeler: Gökkuşağı alabalığı, bakteri, Renibacterium salmoninarum,<br />
Bakteriyel Böbrek Hastalığı, DFAT, nested-PCR.<br />
280
SUMMARY<br />
The diagnosis of Bakterial Kidney Disease (BKD) from kultured rainbow trout (S.<br />
Gairdneri)<br />
In this project ,totally 360 samples for isolation and identification of R.<br />
salmoninarum were collected from 5 rainbow trout farms on Kesikköprü barrage lake;<br />
were collected aseptically 120 kidney tissues about 6-12 months rainbow trout from 1<br />
rainbow trout farms from 2005 to 2007. Ovarian (coelemic) fluids were collected from 120<br />
mature females of fish farming on Safranbolu. KDM-2 medium were used for isolation<br />
from samples. On totally 600 samples were not isolated R. salmoninarum. DFAT and<br />
nested-PCR were negative from same samples.<br />
The reason Bacterial Kindey Disease were not found around Ankara. Our<br />
laboratories were appropriated for diagnosis of Bacterial Kidney Diasease; On this disease<br />
are more rapid commonly used for diagnosis convansionel isolation with DFAT and<br />
nested-PCR in our laboratories.<br />
Key Words: Rainbow trout, bacteria, Renibacterium salmoninarum, Bacterial Kidney<br />
Disease, DFAT, Nested-PCR.<br />
281
LİTERATÜR LİSTESİ<br />
Austin, B., Austin, D.A. (1999). Bacterial Fish Pathogens: Disease in Farmed and Wild Fish,<br />
Third Edition. Springer-Praxis, Chishester, UK.<br />
Bruno, DW. (2004): Prevalance and diagnosis of bacterial kidney disease (BKD) in Scotland<br />
between 1990 and 2002. Dis. Aquat. Organ. 59(2): 125-30.<br />
Bullock, GL. ve Herman, RL. (1980): Bacterial Kidney Disease of Salmonid fishes caused<br />
by Renibacterium salmoninarum. Fish Disease Leaflet 78, U.S. Fish and Wildlife Service, National<br />
Fisheries Research Center-Leetown, National Fish Research Laboratory, Box 700, Kearneysville,<br />
West Virginia.<br />
Bullock, GL. ve Stuckey, HM. (1975): Fluorescent antibody identification and detection of<br />
the Corynebacterium causing kidney disease in salmonids. J. Fisheries Res. Board. Can.32: 2224-<br />
2227.<br />
Chase, D.M., Pascho, R.J. (1998): Development of a nested polymerase chain reaction for<br />
amplification of a sequence of the p57 gene of Renibacterium salmoninarum that provides a higly<br />
sensitive method for detection of the bacterium in Salmonid kidney. Dis. Aquat. Org. 34: 223-229.<br />
Fryer, J.L. ve Lannan, C.N. (1993): The history and current status of Renibacterium<br />
salmoninarum causitive agent of bacterial kidney disease in Pacific salmon. Fisheries Resarch. 17,<br />
15-33.<br />
Halıcı, G., İstanbulluoğlu, E., Arda, M. (1977): Bayındır Barajı alabalık yetiştirme<br />
istasyonunda görülen bakteriyel böbrek hastalığı ve sağaltımı. İstanbul Üni. Vet. Fak. Derg. 3: 1-2,<br />
22-27.<br />
Jonsson, E. (2002): Bacterial Kidney Disease in salmonid fish. Doktora tezi. Acta<br />
Universitatis agriculturae Sueciae. Veterinaria vol. 116.<br />
Magnusson, H.B., Fridjonsson O.H., Andresson, O.S., Benediktsdottir, E.,<br />
Gudmundsdottir, S., Anderstottir, V. (1994): Renibacterium salmoninarum, the causitive agent of<br />
bacterial kidney disease in salmonid fish, detected by nested reverse transcription-PCR of 16S<br />
rRNA sequences. Appl. Environ. Microbiol. 60(12): 4580-3.<br />
Manual of Diagnostik Tests for Aquatic animals 2006, Bacterial Kidney Disease<br />
(Renibacterium salmoninarum) Part 2. Section 2.1, Chapter 2.1.11 p:1-19<br />
Miriam, A.,Griffiths, S.G., Lovely, J.E., Lynch, W.H.(1997): PCR and probe-PCR assays to<br />
monitor broodstock Atlantic salmon (Salmo salar L.) ovarian fluid and kidney tissue for presence<br />
of DNA of the fish pathogen Renibacterium salmoninarum. J. Clin. Microbiol. 35(6): 1322-6.<br />
Ordal, EJ ve Earp, BJ. (1956): Cultivation and transmission of etiological agent of kidney<br />
disease in salmonid fishes. Proceedings of the Society of Experimental Biology and Medicine. 92,<br />
85-88.<br />
Pascho J.R., Chase, D., McKibben, C.L. (1998): Comparison of the membrane-filtration<br />
fluorescent antibody test, the enzyme-linked immunosorbent assay and the polymerase chain<br />
reaction to detect Renibacterium salmoninarum in salmonid ovarian fluid. J Vet. Diag. İnvest.<br />
10:60-66.<br />
Sarıeyyüpoğlu, M, Muz, A., ve Özdemir, Y. (1985): Ovacık-Tunceli alabalık yetiştirme<br />
istasyonunda oluşan bakteriyel böbrek hastalığı. Ege Üni. Su Ürün. Derg. 2 (5-6):71-78.<br />
White, M.R., Wu, C.C. , Albregts, S.R., Wu, C.C. (1995): Comparison of diagnostic tests for<br />
bacterial kidney disease in juvenile steelhead trout (Oncorhynchus mykiss). J. Vet. Diag. Invest.<br />
7:4, 494-499.<br />
TEŞEKKÜR<br />
Bu çalışmanın yürütülmesinde Enstitü imkanlarını esirgemeyen Enstitü Müdürü<br />
Sayın Dr. Nahit YAZICIOĞLU’na, Müdür Yardımcıları Sayın Dr. Rauf AKKAYA’ya ve<br />
Sayın Uzm. Vet. Hek. Kadir KAYA’ya, çalışmalarım sırasında katkılarını esirgemeyen<br />
Sayın Uzm. Vet. Hek. Selahattin ŞEN’e, Sayın Dr. Hikmet ÜN’e, Laborant Sayın Mübeccel<br />
ZAFER’e ve işçi Sayın Kazım ALTUNYALDIZ’a, şoför Sayın Nedim YILMAZ’a, ve<br />
sevgileriyle destek olan eşim R. Sinan ÖZKÖK’e, oğlum S.Kaan ÖZKÖK’e ve kızım Elif<br />
Su ÖZKÖK’e ve Z. Gökhan ÖZKÖK’e teşekkür ederim.<br />
282
DEVAM EDEN<br />
PROJELER<br />
283
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: Türkiye’de Sığırlarda B. bovis ve B. bigemina’nin<br />
Epidemiyolojisi<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/05/01/02/98<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından):<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: Büyükbaş Hayvan Hastalıkları/Orta<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: ...01./.04./2007.. ile ...05./.02./2008...... arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: Babesia bovis IFA IgG antibody kit<br />
ve B. Bigemina IFA IgG antibidy kitleri bütün Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüleri<br />
gönderilmiştir. Projenin çalışma takvimine uygun olarak 7 veteriner kontrol ve Araştırma<br />
Enstitüsü tarafından örnekler toplanmıştır. Toplanan serumlardan IFAT testi ile B. bovis ve<br />
B. bigemina bakılmıştır. Frotilerden Babesia spp etkenleri aranmıştır. Toplanan kenelerin<br />
teşhisi yapılmıştır.<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları:<br />
Doğu Anadolu Bölgesine bağlı 13 ilden (Elazığ, Malatya, Diyarbakır, Tunceli, Mardin,<br />
Siirt, Batman, Hakkâri, Van, Bingöl, Bitlis, Muş, Şırnak) ve 37 köyden olmak üzere<br />
toplam 493 sığırdan kan alınmıştır. Şimdiye kadar bakısı yapılan 493 serumdan 186 B.<br />
bovis ve 50 B. bigemina yönünden pozitif bulunmuştur. 13 Serum hem B. bovis hemde B.<br />
bigemina yönünden pozitif bulunmuştur. Bakısı yapılan 493 frotilerin 62 âdeti Babesia<br />
spp. etkenleri yönünden pozitif bulunmuştur . Bu bölgede 72 adet Kene toplanmıştır. En<br />
çok Hyalomma türüne rastlanmıştır.<br />
Konya Bölgesine bağlı 8 ilden (Afyonkarahisar, Aksaray, Antalya, Burdur, Isparta,<br />
Karaman, Konya, Niğde) ve 23 köyden olmak üzere toplam 315 sığırdan kan serumu ve<br />
froti alınmıştır. Şimdiye kadar bakısı yapılan 315 serumdan 75 serum B. bovis (% 23.81)<br />
ve 33 serum B. bigemina (% 10.48) yönünden pozitif bulunmuştur. 11 adet serum hem B.<br />
bovis hem de B. bigemina yönünden pozitif (% 3.49) bulunmuştur. Bakısı yapılan 315<br />
frotilerin 73 adedi Babesia spp. etkenleri yönünden pozitif (% 23.17) bulunmuştur. Bu<br />
bölgede 113 adet Kene toplanmıştır.<br />
Akdeniz Bölgesine bağlı 9 ilden (Kahramanmaraş, Osmaniye, Hatay, Mersin, Şanlıurfa,<br />
Adana,Kilis, Adıyaman, Gaziantep) ve 30 köyden olmak üzere toplam 432 sığırdan kan<br />
alınmıştır. Şimdiye kadar bakısı yapılan 217 serumdan 75 serum B. bovis ve 83 serumdan<br />
28 serum B. bigemina yönünden pozitif bulunmuştur. Adana-Yüreğir 1, Hatay-Dörtyol 1,<br />
Kahramanmaraş-Pazarcık 4, Kahramanmaraş-Andırın 3, Adıyaman-Gölbaşı 2 Serum hem<br />
B. bovis hemde B. bigemina yönünden pozitif bulunmuştur.<br />
Marmara Bölgesine bağlı 12 ilden (Edirne, Sakarya, Balıkesir, Bursa, Kırklareli, İstanbul,<br />
Düzce, Çanakkale, Tekirdağ, Koceli, Bilecik, Yalova) ve 37 köyden olmak üzere toplam<br />
530 sığırdan kan alınmıştır. Bakısı yapılan 530 serumdan 60 serum B. bovis ve 40 serum<br />
B. bigemina yönünden pozitif bulunmuştur. 10 Serum hem B. bovis hemde B. bigemina<br />
yönünden pozitif bulunmuştur. Bakısı yapılan 530 frotilerin 55 âdeti Babesia spp. etkenleri<br />
yönünden pozitif bulunmuştur. Bu bölgede 200 adet Kene toplanmıştır. En çok<br />
Rhipicephalus spp. ve Hyolomma spp. türlerine rastlanmıştır.<br />
Karadeniz Bölgesinde Amasya ilinden ve 3 köyden olmak üzere toplam 42 sığırdan kan<br />
alınmıştır. Şimdiye kadar bakısı yapılan 42 serumdan % 42 B. bovis ve % 54 B. bigemina<br />
yönünden pozitif bulunmuştur. % 23 Serum hem B. bovis hem de B. bigemina yönünden<br />
pozitif bulunmuştur. Bakısı yapılan 42 frotinin 9 adeti Babesia spp. etkenleri yönünden<br />
284
(% 21) pozitif bulunmuştur. Karadeniz Bölgesinde Sinop ilinden ve 4 köyden olmak<br />
üzere toplam 56 sığırdan kan alınmıştır. Şimdiye kadar bakısı yapılan 56 serumdan % 55<br />
B. bovis ve % 50 B. bigemina yönünden pozitif bulunmuştur. % 30 Serum hem B. bovis<br />
hemde B. bigemina yönünden pozitif bulunmuştur. Bakısı yapılan 56 frotinin 13 adeti<br />
Babesia spp. etkenleri yönünden (% 23) pozitif bulunmuştur. Karadeniz Bölgesinde<br />
Amasya ve Sinop illerinden 7 köyden olmak üzere toplam 98 sığırdan kan alınmıştır.<br />
Şimdiye kadar bakısı yapılan 98 serumdan % 50 B. bovis ve % 52 B. bigemina yönünden<br />
pozitif bulunmuştur. % 27 Serum hem B. bovis hemde B. bigemina yönünden pozitif<br />
bulunmuştur. Bakısı yapılan 98 frotinin 22 adeti Babesia spp. etkenleri yönünden (% 22)<br />
pozitif bulunmuştur.<br />
Kuzey Doğu Anadolu Bölgesindeki 9 il (Erzurum, Kars, Ağrı, Artvin,Gümüşhane,<br />
Bayburt, Erzincan, Iğdır, Ardahan) ve 29 köyden olmak üzere toplam 391 sığırdan kan<br />
alınmıştır. Şimdiye kadar bakısı yapılan 391 serumdan 144 B. bovis ve 125 B. bigemina<br />
yönünden pozitif bulunmuştur. 85 Serum hem B. bovis hem de B. bigemina yönünden<br />
pozitif bulunmuştur. Bakısı yapılan 391 frotilerin 3 adeti Babesia spp. etkenleri yönünden<br />
pozitif bulunmuştur. Bu bölgede 141 Kene toplanmıştır. En çok 8 farklı türe rastlanmıştır.<br />
Ege Bölgesinde 7 ilden (İzmir, Aydın, Denizli; Muğla, Manisa, Kütahya ve Uşak) ve 30<br />
köyden olmak üzere toplam 438 sığırdan kan alınmıştır. Şimdiye kadar bakısı yapılan 438<br />
serumdan 98( % 17,81)’ i sadece B. bovis, 78(% 26,26)’ i sadece B. bigemina, 37(%<br />
8,45)’ si ise hem B. bovis hemde B. bigemina yönünden sero-pozitif bulunmuştur. Toplam<br />
bazda ele alınırsa; 135(% 30,82) serum B. Bovis, 115 (% 26,26) serum B. bigemina<br />
anntikorları yönünden pozitif bulunmuştur. Bu enfeksiyonlardan 37(% 8,45)’ si miks<br />
enfeksiyon şeklindedir. Toplam olarak 438 serumden 213(% 48,63)’ ü Babesia spp.<br />
antikorları yönünden pozitif bulunmuştur. Bu bölgede Hyalomma detritum, Hyalomma<br />
anatolicum anatolicum, Hyalomma margintum, Boophilus annulatus, Rhipicephalus<br />
turanicus, Haemapysalis spp. rastlamıştır.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: Pendik. Bornova, Samsun, Adana, Elazığ, Konya,<br />
Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüleri tarafından çalışmalar<br />
gerçekleştirilmiştir.<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: -<br />
7.4.Darboğazlar: -<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
8.1. Materyal ve Metot: Değişiklik yoktur.<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsünde (İç Anadolu<br />
Bölgesinde) proje ile ilgili her hangi bir faaliyet gerçekleştirilmemiştir. Bu bölgenin çalışmalarının<br />
bitirilmesi ve son raporu yazılabilmesi için 6 ay uzatma süresi talep edilmektedir.<br />
8.3. Personel: Dr. Abdulkasım İçyeroğlu, Dr. Kadir Kamburgil, Uzm. Vet. Hekim Hasan<br />
Aytekin, Vet. Hekim Salih Güzeş Projeye katılmaları düşünülmektedir. Projede Dr.<br />
İbrahim Balkan Erzurum bölgesindeki çalışmalarda yer almıştır.<br />
8.4. Bütçe: Değişiklik yok<br />
9. Proje Harcamaları: 20.450 YTL<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: 35 adat Babesia bovis IFA IgG antibody Kit ve 35 adat B.<br />
bigemina IFA IgG antibody kiti alınmıştır.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri : : Dr. Muhammet Aksın<br />
Proje Lideri : Dr. Taraneh Öncel<br />
Tarih : 05.02. 2008<br />
285
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: Aşılı <strong>hayvan</strong>larda ve enfekte <strong>hayvan</strong>larda şap virusu yapısal<br />
olmayan proteinlerine karşı oluşan antikor profilinin incelenmesi<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/01/02/07/118<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Şap Enstitüsü Müdürlüğü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından): Hayvan <strong>sağlığı</strong><br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP:<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 01.01.2007 ile 01.01.2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: (Rapor döneminde, proje hedeflerinin<br />
ne ölçüde gerçekleştiği, kalan sürenin nihai hedeflere ulaşmak için yetip, yetmeyeceği<br />
konusunda yapılacak <strong>değerlendirme</strong> sonunda; 0 ( bu rapor döneminde ulaşılması gereken<br />
hedeflerde hiç gerçekleşme yok) ile, 30 (bu rapor dönemi için planlanan hedeflerde tam<br />
gerçekleşme) arasında bir puan veriniz)<br />
Bu dönemde planlanan şekilde çalışmalara başlandı. PCR ürünlerinin eldesi ve klonlama<br />
vektörüne aktarılması işlemleri tamamlandı. Ancak bu aşamada kimyasallardan birinin<br />
çalışmaması nedeniyle bunun son kullanım tarihinin geçtiği fark edildi. Yurtdışındaki<br />
tedarikçi firmadan yenisi istendi ve teslim alındı. Bu sebeple proje faaliyet aşamalarında<br />
yaklaşık 4 aylık bir gecikme meydana geldi. (20 puan)<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: (Rapor dönemi için planlanan başlıca faaliyetlerden,<br />
tamamlananlar ile elde edilen sonuçları özetleyiniz). Bu dönemde planlandığı şekilde şap<br />
virusuna ait yapısal olmayan proteinleri kodlayan gen bölgeleri PCR yardımıyla çoğaltıldı,<br />
buna göre PCR ile çoğaltılan bölgeler şunlardır:<br />
2C, 3A, 3AB, 3ABC, 3C, 3D (Bkz: Fotograflar)<br />
PCR ile çoğaltılan bölgeler dijital görüntüleme sistemi ile fotograflanıp, doğru büyüklüğe<br />
sahip bantlar UV ışık altında agaroz jelden kesilip alınarak, jelden DNA saflaştırma kiti ile<br />
saflaştırıldı. Saflaştırmanın ardından istenen derişim sağlanacak şekilde sulandırıldı. PCR<br />
ürününün klonlama vektörüne yerleşimi için gerekli olan dNTPA uçları 72 °C’de mevcut<br />
dNTP’ler varlığında 30°C uzatmaya bırakıldı. Hazırlanan taze ürünler, klonlama vektörüne<br />
aktarıldı ve daha sonra bakteriler bu vektörlerle transforme edildi. Ampicillin içeren LB<br />
agarda vektör taşıyan koloniler seçildi ve bunlar üretilmeden önce tekrar istenen gen<br />
bölgelerinin varlığı yönünden koloni PCR’a tabi tutuldu. Sonuçlar fotograflandı. (Bkz:<br />
Fotograflar).<br />
286
Fotograflar<br />
3A PCR<br />
2C Koloni PCR<br />
3A, 3C, 3ABC PCR<br />
3D Koloni PCR<br />
3D PCR<br />
3A ve 3C Koloni PCR<br />
287
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: (40 Puan)<br />
Önemli araştırma faaliyetleri/aşamaları ve ne zaman gerçekleştirilecekleri<br />
1. Rekombinant NSP ların üretilmesi<br />
a. Primer dizaynı ve sentezlettirilmesi. (0-6 ay) TAMAMLANDI.<br />
b. Diğer kimyasal ve biyolojiklerin temin edilmesi (0-6 ay) TAMAMLANDI.<br />
c. PCR ürünlerinin eldesi ve klonlama vektörlerine aktarılması (6-12 ay)<br />
TAMAMLANDI.<br />
d. NSP ların ekspresyonu, saflaştırılması ve identifikasyonu (6-12 ay) (DEVAM<br />
EDİYOR)<br />
2. EITB testinin standardizasyon ve optimizasyonunda kullanılacak serum panellerinin<br />
oluşturulması (0-12 ay) SIĞIRLARA AİT SERUMLAR AYRILDI.<br />
a. Oluşturulan panellerin bir ticari NSP ELISA kiti ile test edilmesi (12-18)<br />
3. Yüksek duyarlılıklı EITB testi kullanılarak serum panelinde NSP’lere karşı oluşmuş<br />
antikor profillerinin belirlenmesi. (18-24)<br />
4. Sonuçların istatistiksel analizi (18-24)<br />
5. Yayım<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: Herhangi bir ara yayın yapılması<br />
planlanmamıştır.<br />
7.4. Darboğazlar: Herhangi bir darboğaz bulunmamaktadır. Ancak kimyasal ve sarf<br />
malzemelerin Enstitülerce ihale yoluyla alınması projelerin çalışma hızını<br />
yavaşlatmaktadır.<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: (Varsa proje ile ilgili önerilen değişiklikler). Herhangi<br />
bir değişiklik bulunmamaktadır.<br />
8.1. Materyal ve Metot: (Varsa materyal ve metotta tavsiye edilen değişiklikler). Materyal<br />
ve metot’la ilgili bir değişiklik düşünülmemektedir.<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: (Varsa proje faaliyet takviminde önerilen değişiklikler).<br />
Faaliyet takviminde değişiklik düşünülmemektedir. Ancak elde olmayan sebeplerle<br />
meydana gelen gecikme diğer proje dönemlerinde kapatılamazsa belki bir sonraki rapor<br />
döneminde süre uzatımı istenebilecektir.<br />
8.3. Personel: Çalışmada yer alan personelde bir değişiklik olmamıştır.<br />
8.4. Bütçe: (Varsa bütçe ile ilgili değişiklikler). Bütçe ile ilgili bir değişiklik gerekmemektedir.<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Proje başlangıcından beri dönemler üzerinden proje için<br />
harcanılan ödeneklerin ana kalemler bazında dökümü verilecektir. Bu dönemde harcama<br />
yapılmamıştır, önceki dönemde yapılan harcama aşağıda bildirilmiştir:<br />
Sıra Sarf Malzeme (Kimyasal) Birim Fiyat (YTL) Toplam Fiyat (YTL)<br />
No:<br />
1 Prokaryotik gen ekspresyon kiti 2.350 (x1 adet) 2.350<br />
2 Western Blot kemiluminesan reaktifi 292 (x1 adet) 292<br />
3 Nitroseluloz membran 474 (x1 adet) 474<br />
4 Protein molekuler weight marker 139 (x1 adet) 139<br />
5 Protein konsantrasyon tespit kiti 239 (x1 adet) 239<br />
6 Protein saflaştırma kiti 509 (x1 adet) 509<br />
Toplam 4003<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Kuruluş Amiri<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
: Recep ERGÜL<br />
Proje Lideri : Can ÇOKÇALIŞKAN<br />
Tarih : 18/01/2007<br />
288
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: Atık Sığır Fetuslarında Brucella, Leptospira, Listeria, Campylobacter,<br />
ve Klamidia Etkenlerinin İmmunohistokimyasal, Mikrobiyolojik ve Moleküler<br />
Yöntemlerle İncelenmesi<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/ HS /01 /02 /07 /119<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Adana Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından):<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP:A-01.P-02<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 01/01/2007 ile 31/12/2007 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1.Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: -<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: Proje çalışma takviminde ilk 12 ay için planlanan<br />
Materyal toplanması, sarf ve demirbaş malzemenin temini aşamalarından demirbaş alımı<br />
için gerekli şartnamaler hazırlanarak Müdürlük Makamına sunulmuş, Müdürlük<br />
Makamınca proje için gerekli demirbaşların alımı için ihale düzenlenmiştir. Ancak yapılan<br />
ihalenin değişik aşamalarında ortaya çıkan geçikmelerden dolayı demirbaşların büyük<br />
çoğunluğu teslim alınamamıştır. Materyal toplama aşaması devam etmekte olup 24 adet<br />
sığır atık materyali toplanarak histopatolojik ve bakteriyolojik olarak incelenmiştir.20<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar:<br />
7.4. Darboğazlar: -<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
8.1. Materyal ve Metot:<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi:<br />
8.3. Personel: Proje ekibinde bulunan Veteriner Hekim Nezaket Evgin ve Veteriner<br />
Hekim Şerife Vural’ın emekliye ayrılmalarından dolayı bakteriyolojik çalışmaları yapmak<br />
üzere Veteriner Hekim Mehmet Mirioğlu, yine proje ekibinde bulunan Kanatlı Hayvan<br />
Hastalıkları Laboratıvarı Şefi Veteriner hekim Suzan Reyhan Karakoç’un yerine<br />
Moloküler Biyoloji Laboratuvarı Şefi Atilla Yoldaş projeye dahil edilecektir.<br />
8.4. Bütçe: -<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti:<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri : Vet. Hek. Mehmet MİRİOĞLU<br />
Proje Lideri : Vet.Hek. Dr.Mehmet TUZCU<br />
Tarih : 05/02/2008<br />
289
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Proje Adı: Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir<br />
Multipleks Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Geliştirilmesi<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/01/02/08/129<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü/ELAZIĞ<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı ( TAGEM tarafından): HSAD<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: A-01, P-02 (Büyükbaş Hayvan Hastalıkları)<br />
6. Projenin İlgili Olduğu Dönem:01.01.2008-01.08.2009<br />
7. Gelişme Raporu<br />
7.1 Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: --<br />
7.2 Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları:<br />
Proje kapsamında kullanılacak olan kimyasalların ve sarf malzemelerinin fiyat teklifi için<br />
piyasa araştırması yapılmaktadır. Malzemeler temin edildiğinde proje takviminde belirtilen<br />
plan çerçevesinde projeye başlanacaktır. Bununla birlikte laboratuarımıza getirilen süt<br />
örneklerinden direkt DNA ekstraksiyon işleminin optimizasyonu üzerinde çalışmalara<br />
başlanmıştır. Ayrıca araştırma için gerekli literatür taraması yapılarak projenin<br />
yürütülmesinde gerekli olacak altyapı hazırlıkları tamamlanmıştır.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: --<br />
7.3.Yapılan veya yapılması düşünülen ara yayınlar: Proje bitiminde yayın<br />
düşünülmektedir<br />
8.Darboğazlar: Projede şu an herhangi bir darboğaz bulunmamaktadır.<br />
9.Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
9.1. Materyal ve Metot: Herhangi bir değişiklik yapılmayacaktır.<br />
9.2. Proje Faaliyet Takvimi: Herhangi bir değişiklik yapılmayacaktır.<br />
9.3. Personel: Herhangi bir değişiklik yapılmayacaktır.<br />
9.4. Bütçe: . Herhangi bir değişiklik yapılmayacaktır.<br />
9.4.1.Proje Harcamaları: Projeye aktarılan bütçe çerçevesinde sarf malzeme<br />
ihtiyaçlarının fiyat teklifleri firmalardan istenmiştir.<br />
9.4.2.Proje Harcamaları Özeti: Şimdiye kadar herhangi bir harcama yapılmamıştır.<br />
10.Proje Sorumluları: Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri: Ünal KILINÇ<br />
Proje Lideri: Dr. Murat KARAHAN<br />
Tarih: 25.01.2008<br />
290
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: Marmara bölgesinde yeni doğan buzağı ishallerinde Bovine<br />
Coronavirusların saptanması ve patojenite çalışması<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/ HS/01/02/08/130<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Pendik veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından):<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP:<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 01/ 04/2007 ile 01/02/2008arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: Bu dönemde çalışmada kullanılacak<br />
Corona virus antijen detection ELISA kiti ve PCR malzemelerinin alımı yapıldı. 15 puan.<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: Bu dönemde İstanbul ilinden ishal belirtileri gösteren 0-1 aylık<br />
buzağıdan 10 adet ve Tekirdağ ilinden 10 adet gaita numunesi olmak üzere toplam 20 adet<br />
numune toplandı. Numuneler 1/10 oranında pankreatinli serumsuz GMEM vasatı ile<br />
sulandırıldı. Her bir numune örneği Corona virus antijen detection ELISA ve PCR testi ile<br />
işlendi. Gaita örneklerinden HRT hücre kültürüne ekimler yapıldı, ekimler sonucu virus<br />
izolasyonu yapılamadı. Yapılan analizler sonucu gaita numunelerinde gerek ELISA , gerek<br />
hücre kültürü, gerekse PCR testi ile Coronavirus varlığı saptanamadı.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: Bu çalışma döneminde yeteri kadar numune toplanarak<br />
işlenmiş ancak pozitif sonuçlar elde edilememiştir.30 puan.<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar:<br />
7.4. Darboğazlar: Proje çalışmalarında gaita numunesi toplanmasına temmuz ayında<br />
başlanıldı. Numunelerin toplanması için bizzat <strong>hayvan</strong> yetiştiricilerini dolaşmak ve hasta<br />
olan buzağıları bularak numunelerin alınması gerektiğinden yeteri kadar numunenin elde<br />
edilmesinde sıkıntı yaşanacağı tahmin edilmektedir. Ayrıca hastalığın buzağılarda kısa<br />
sürmesi ve hasta buzağıların kısa sürede ölmesi hasta <strong>hayvan</strong>ları bulma açısından sıkıntı<br />
yaratmaktadır. Gerekli numunelerin temini açısından bölgemize bağlı il müdürlüklerine<br />
yazılar yazılarak numunelerin gönderilmesi talep edilmiştir.<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: (Varsa proje ile ilgili önerilen değişiklikler).<br />
8.1. Materyal ve Metot: (Varsa materyal ve metotta tavsiye edilen değişiklikler).<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: (Varsa proje faaliyet takviminde önerilen değişiklikler).<br />
8.3. Personel: (Varsa görev alan araştırmacılar, teknisyenler, laboratuar personeli ve<br />
diğerleri ile ilgili değişiklikler).<br />
8.4. Bütçe: (Varsa bütçe ile ilgili değişiklikler).<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Proje çalışmalarında kullanılmak üzere 5.000 YTL<br />
tutarında ELISA kiti ve PCR testinde kullanılan maddeler satın alınmıştır.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri : Dr. Muhammet AKSIN<br />
Proje Lideri : Züleyha PESTİL APUHAN<br />
Tarih : 11.01.2008<br />
291
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1.Projenin Adı: Akdeniz Bölgesinde Mavi dil Hastalığı ve Culicoides Türlerinin Araştırılması<br />
“The Investigation of Bluetongue and Culicoides Species in Mediterrenean Region<br />
2. Proje Numarası: TAGEM / HS /01 /02 /08 /131<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından):<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: AP:A-01.P-02<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: Mayıs/2007 ile Ocak /2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: 30<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları:<br />
Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğünün 23 Ekim 2007 tarih ve 250 13 05 11-111-6-<br />
626-79696 sayılı yazıları ile Hizmet Sözleşmesi imzalanmış ve bu Proje’nin TAGEM tarafından<br />
resmi başlama tarihi 1 Ocak 2008 olarak belirlenmiştir ve bütçesi 89.565 YTL’dir. Hastalığın<br />
Avrupa Ülkelerinde de yaygın şekilde görülmeye başlamasından dolayı Proje Koruma Kontrol<br />
Genel Müdürlüğü ve Enstitü Müdürlüğünün koordinasyonu ile Nisan 2007 yılında başlatılmıştır.<br />
Önceki gelişme raporları KKGM ile TAGEM’e sunulmuştur. Bu çalışma döneminde (Osmaniye<br />
hariç, bekleniyor) toplam 602 adet kan serumu enstitülere ulaşmış, bunun 536 adeti mavidil<br />
antikorları yönünden negatif bulunurken 56 adedi pozitif bulunmuştur, toplam pozitiflik oranı %<br />
8.8’dir.<br />
3. dönem raporunda belirtilen illerden (Osmaniye, Adana ve Hatay) antikor pozitif bulunan<br />
<strong>hayvan</strong>lardan alınarak gönderilen defibrine kan örneklerinden Hatay ve Osmaniye illerine ait<br />
örnekler Antijen pozitif bulunmuştur. Osmaniye iline ait örneklerde RT-PCR ile yapılan<br />
serotiplendirme’de Mavi dil serotip 9 (BT-9) tespit edilmiştir. Bu dönem ile, proje başlangıcından<br />
itibaren antijen pozitif bulunan örneklerin yumurta ekimleri, hücre kültürüne adaptasyonları, RT-<br />
PCR ve serotiplendirme çalışmaları devam etmektedir.<br />
Vektör culicoidesler ile ilgili olarak; Proje kapsamınca illerden Mayıs ayından başlamak<br />
üzere her ay ışık tuzaklarından toplanan 18319 adet culicoidesin tiplendirilmesi yapıldı ve 2792<br />
adetinin Mavi dil taşıyıcısı C. imicola olduğu tespit edildi. Culicoideslerde virus araştırması için<br />
Osmaniye’den PBS içerisinde gönderilen örneklerde mavi dil taşıyıcısı olduğu bilinen C.imicola,<br />
c.schultzei ve obsoletus complex türleri seçilerek yapılan Antijen ELISA da pozitiflik tespit<br />
edilmemiştir. Bu nedenle proje kapsamınca toplanan ve alkolde muhafaza edilen culicoides’lerde<br />
virus araştırması RT-PCR ile de yapılacaktır.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: 60<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar:<br />
7.4. Darboğazlar:<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
8.1. Materyal ve Metot:<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi:<br />
8.3. Personel:<br />
8.4. Bütçe:<br />
9. Proje Harcamaları: KKGM’lüğünün proje için yatırmış olduğu 40.000 YTL’den BT<br />
antijen kiti, serum ve EDTALI kan alma tüpleri ile tüplere uygun iğneleri alınmış bunlara 6.000<br />
YTL ödenmiştir.<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti:.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı Soyadı Tarih İmza<br />
Kuruluş Amiri : Dr. Nahit YAZICIOĞLU<br />
Proje Lideri : Dr. Arife ERTÜRK<br />
292
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: İzmir İli ve Çevresindeki İshalli Kuzu ve Oğlaklarda Rotavirus,<br />
Coronavirus, Enterotoksinojenik Escherichia coli ve Cryptosporidium spp.<br />
Yaygınlığının Araştırılması.<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/ HS /08 /02 /07 /121<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından): Hayvan Sağlığı<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: Küçükbaş Hayvan Hastalıkları P-02<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 02/2007 ile 02/2008 arası – 2. Dönem<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: Rapor döneminde, proje hedeflerinin<br />
%75’i gerçekleşmiştir. Kalan sürede çalışmalar tamamlanarak proje sonuç raporu<br />
yazılacaktır.<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
2. Dönem:<br />
Proje kapsamında, Şubat 2007 ve Şubat 2008 yılları arasındaki dönemde; 61 oğlak<br />
ve 69 kuzu olmak üzere toplam 130 ishalli gaita örneği ve svab toplanmıştır.<br />
Bakteriyolojik olarak izolasyon ve identifikasyon çalışmaları devam etmektedir. Bu<br />
materyallerin 96 adedinde E.coli K99 antiserumu ile yapılan serolojik yoklamalarda 7 adet<br />
E.coli suşunun K99 antijeni tespit edilmiştir. Enterotoksinojenik özellikleri ise daha<br />
sonraki dönemde yapılacaktır. 130 ishalli gaita örneğinin, parazitolojik muayeneleri<br />
sonunda 46’sında Cryptosporidium spp. ookistleri,12’sinde E.coli+Crptosporidium tespit<br />
edilmiştir.<br />
Virolojik muayenelerde ise 67 kuzu ve 42 oğlak gaitası olmak üzere toplam 109 adet<br />
materyalde ELİSA ile rota ve corona virus antijenleri aranmış, örneklerin hiçbirinde bu<br />
antijenler tespit edilmemiştir.<br />
3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: Herhangi bir ara yayın yapılması<br />
düşünülmemektedir.<br />
7.4. Darboğazlar: Bu aşamada dar boğaz bulunmamaktadır.<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: Herhangi bir değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.1. Materyal ve Metot: Herhangi bir değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: Herhangi bir değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.3. Personel: Herhangi bir değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.4. Bütçe: Herhangi bir değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Herhangi bir bütçe aktarımı yapılmadığından herhangi bir<br />
harcamada yapılmamıştır.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri : Necdet AKKOCA<br />
Proje Lideri : Dr. Seza Nerim ESKİİZMİRLİLER<br />
Tarih : 06/02/2008<br />
293
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORU<br />
1. Projenin Adı: Kuzu Pnömonilerinde Parainfluenza 3 Virus (PI3V) ve Respiratory<br />
Syncytial Virus (RSV) Enfeksiyonlarının Teşhisi Üzerine Virolojik ve Patolojik<br />
Çalışmalar<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/08/02/08/132<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Konya Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Başlama ve Bitiş Tarihi: 01.01.2008 - 30.06.2010<br />
5. Proje Yürütücüleri: Dr. Ertan ORUÇ, Dr. Mehmet EKİK<br />
6. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı: Hayvan Sağlığı Daire Başkanlığı<br />
7. Gelişme Rapor No: 1<br />
Projenin Özeti: Kuzu pnömonilerinde Parainfluenza 3 virus (PI3V) ve Respiratorik<br />
sinsisyal virus (RSV) enfeksiyonları problem olmakta ve özellikle sekonder<br />
enfeksiyonlarla birlikte kayıplara yol açmaktadır. Kuzularda pnömonilerin etiyolojisine<br />
yönelik Türkiye’de fazlaca bakteriyolojik çalışma bulunurken viral etiyolojiye yönelik<br />
çalışmalar daha sınırlıdır. Bu amaçla çalışmada kuzularda viral pnömoni sebebi olan PI3V<br />
ve RSV enfeksiyonlarının teşhisine yönelik virolojik (izolasyon, elisa, floresan antikor) ve<br />
patolojik (histopatolojik ve immunohistokimyasal) çalışmalar yapılacaktır. Bu amaçla<br />
Konya mezbahasında kesime alınan 10-12 aylık kuzular ile Konya Veteriner Kontrol ve<br />
Araştırma Enstitüsüne getirilen pnömoni kuzulardan alınacak akciğer örnekleri<br />
kullanılacaktır. Virus izolasyon işlemleri ile floresan çalışmaları viroloji laboratuarında,<br />
histopatolojik ve immunohistokimyasal işlemler patoloji laboratuarında takip edilecektir.<br />
Çalışma sonunda elde edilen bulgular doğrultusunda kuzu pnömonilerinde PI3V ve RSV<br />
enfeksiyonları tanımlanacak ve teşhis yöntemlerinin karşılaştırması yapılarak uygun<br />
yöntemin enstitümüzde rutin teşhis hizmeti vermesi sağlanmaya çalışılacaktır.<br />
Proje hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: 0<br />
Proje 2008 yılı Ocak ayında başlamıştır.<br />
Başlıca Faliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
Dönem Bulguları:<br />
Dönem Başarı Durumu:<br />
Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: Düşünülmemektedir.<br />
Darboğazlar:<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: Düşünülmemektedir.<br />
Materyal ve Metot:<br />
Proje Faaliyet Takvimi: Takvim değişikliği düşünülmemektedir.<br />
Personel: İş hacmi sebebiyle Laboratuar personelinden Veteriner Hekim Oktay ÖCAL,<br />
Veteriner Hekim Emine ÇİFTCİ ve Veteriner Hekim Berat Selim TOKGÖZ’ün Yardımcı<br />
Araştırıcı olarak görevlendirilmesi düşünülmüştür.<br />
Bütçe:<br />
9. Proje Harcamaları: Yapılmadı.<br />
Bütçe Harcamaları Özeti: --<br />
294
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: Marmara Bölgesinde Koyunlarda Abort Vakalarında Pestivirus<br />
İnfeksiyonunun Saptanması<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/ HS/08/02/08/133<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından):<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP:<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 05/ 06/2007 ile 31.01.2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: Bu dönemde koyunların gebelik<br />
dönemlerine bağlı olarak numunelerin toplanmasına Kasım 2007 tarihinde başlanıldı.<br />
Enstitümüze gelen 36 adet yeni doğmuş kuzu iç organ numunesi ve 40 adet atık fötus<br />
çalışmada kullanıldı.<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: Çalışmanın bu döneminde Enstitümüz numune kabul ünitesine<br />
gelen 36 adet kuzu iç organ numunesi ve 40 adet atk fötus örnekleri işlendi. Steril şartlarda<br />
hazırlanan homojenatlar santrifüj edildikten sonra süpernetantlar BVD antijen ELISA<br />
testine tabi tutuldu. Test edilen toplam 36 adet yeni doğan kuzu iç organ numunesinde 6<br />
adet (%16.6) olarak bulunan pozitif örnekler sırasıyla Edirne’den 4 ve İzmit ilinden 2<br />
olarak tespit edildi. 40 adet atık fötus iç organ numunesinden 14 adet pozitif ( % 35 )<br />
sonuç elde edildi. Elde edilen pestivirus pozitif örneklerin 2 adedi Edirne, 1 adet Bolu, 1<br />
adet İzmit, 1 adet İstanbul, 4 adet Çanakkale ve 1 adedinin Kırklareli’nden geldiği<br />
saptandı. Bu dönemde edilen bu sonuçlarda koyunlarda atık vakalarında pestivirusun<br />
önemli rol oynadığı kanaatine varılmıştır. Önümüzdeki dönem numune toplanması ve<br />
işlenmesi çalışmalarına devam edilecektir. Ayrıca ELISA ile pozitif bulunan örneklerden<br />
hücre kültüründe virus izolasyonu çalışmaları yapılacaktır.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: Enstitümüze gelen atık kuzu ve yeni doğmuş kuzu iç<br />
organ numunelerinden tahmin edilenin üzerinde Pestivirus etkeninin varlığı saptandı. 30<br />
puan.<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar:<br />
7.4. Darboğazlar:<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: (Varsa proje ile ilgili önerilen değişiklikler).<br />
8.1. Materyal ve Metot: (Varsa materyal ve metotta tavsiye edilen değişiklikler).<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: (Varsa proje faaliyet takviminde önerilen değişiklikler).<br />
8.3. Personel: (Varsa görev alan araştırmacılar, teknisyenler, laboratuar personeli ve<br />
diğerleri ile ilgili değişiklikler).<br />
8.4. Bütçe: (Varsa bütçe ile ilgili değişiklikler).<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Projede bütçesinde yer alan 5.000 YTL’den 2.000 YTL<br />
BVD antijen ELISA kit alımında kullanıldı.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Kuruluş Amiri : Dr. Muhammet AKSIN<br />
Proje Lideri : Selma ÖZDEMİR<br />
Tarih : 27.02.2007<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
295
ARAŞTIRMA PROJELEİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Proje Adı: Elazığ ve Civar İllerde Atık Yapmış Koyun ve Keçilerde<br />
Chlamydophila abortus (Chlamydia psittaci Serovar 1) Enfeksiyonunun<br />
Mikrobiyolojik, Patolojik ve Moleküler Yöntemlerle Saptanması.<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/08/02/08/134<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş:Elazığ Vet. Merk.Kont. ve Araş. Enstitüsü Müd. ELAZIĞ<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı ( TAGEM tarafından):<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: A-08. P-02 (Küçükbaş Hayvan Hastalıkları)<br />
6. Projenin İlgili Olduğu Dönem: 01/01/2008 - 30/01/2008<br />
7. Gelişme Raporu<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları:<br />
Bu dönemde proje kapsamında kullanılacak olan sarf malzemelerinin siparişleri verilmiş<br />
olup malzemeler temin edildiğinde projenin laboratuar çalışmasına başlanılacaktır.<br />
Projede kullanılmak üzere numune toplanmasına başlanmıştır. Numuneler derin<br />
dondurucuda işlenmek üzere muhafaza edilmektedir.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu:<br />
7.3. Yapılan veya yapılması düşünülen ara yayınlar: yok<br />
7.4. Darboğazlar:<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
8.1. Materyal ve Metot: -<br />
8.2. Proje Faaliyet Takvimi:<br />
8.3. Personel:<br />
Dr. M.Nuri AÇIK’ın projeye katılımı teklif edilmektedir.<br />
8.4 Bütçe: .<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1 . Proje Harcamaları Özeti: -<br />
10 Proje Sorumluları: adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri: Ünal KILINÇ<br />
Proje Lideri: Doç.Dr.Hakan KALENDER<br />
Tarih:<br />
296
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Proje Adı: Pnömonili Koyun ve Kuzuların Akciğerlerinde Mikoplazma<br />
Etkenlerinin Kültür, PCR ve İmmunoperoksidaz Yöntemleri ile Saptanması ve<br />
Moleküler Tiplendirilmesi.<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/08/02/08/135<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş:Elazığ Vet. Merk.Kont. ve Araş. Enstitüsü Müd. ELAZIĞ<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı ( TAGEM tarafından):<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: A-08. P-02 (Küçükbaş Hayvan Hastalıkları)<br />
6. Projenin İlgili Olduğu Dönem: 01/01/2008 - 30/01/2008<br />
7. Gelişme Raporu<br />
7.3 Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.4 Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: Bu dönemde proje kapsamında kullanılacak olan sarf<br />
malzemelerinin siparişleri verilmiş olup malzemeler temin edildiğinde projenin laboratuar<br />
çalışmasına başlanılacaktır. Projede kullanılmak üzere numune toplanmasına başlanmıştır.<br />
Numuneler derin dondurucuda işlenmek üzere muhafaza edilmektedir.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu:<br />
7.5 Yapılan veya yapılması düşünülen ara yayınlar: yok<br />
7.6 Darboğazlar:<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
8.1 Materyal ve Metot: -<br />
8.2 Proje Faaliyet Takvimi:<br />
8.3 Personel:<br />
Dr. Bülent TAŞDEMİR’in projeye katılımı teklif edilmektedir.<br />
8.4 Bütçe: .<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1 . Proje Harcamaları Özeti: -<br />
10 Proje Sorumluları: adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri: Ünal KILINÇ<br />
Proje Lideri: Doç.Dr.Hakan KALENDER<br />
Tarih:<br />
297
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Proje Adı: Hastalıktan Şüpheli Kovanlardan Alınan Bal ve Balmumu<br />
örneklerinde Amerikan Yavru Çürüklüğü Hastalığı Etkeni Paenibacillus<br />
larvae’nin Kültür ve PCR ile Teşhisi<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/13/01/07/122<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü/ELAZIĞ<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı ( TAGEM tarafından):<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: A103, P-03 ( Arıcılık)<br />
6. Projenin İlgili Olduğu Dönem: 01/01/2007-30/01/2008<br />
7. Gelişme Raporu<br />
7.7 Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: 40 puan<br />
7.8 Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları:<br />
Projede bu güne kadar; 25 farklı işletmeden alınan 70 adet bal ve bal mumu<br />
örneklerinden 8 tanesinde Amerikan Yavru Çürüklüğü etkeni Paenibacillus larvae’nin<br />
kültür yöntemi ile teşhisi yapılmıştır. Projede öngörülen 100 örneğin tamamlanmasına<br />
mütakip tüm örneklerde direk PCR metodu ile identifikasyon yapılacaktır. Projede<br />
kullanılacak tüm kimyasal maddeler ve literatürler temin edilmiştir.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: 80 puan<br />
7.9 Yapılan veya yapılması düşünülen ara yayınlar: Yok<br />
7.10 Darboğazlar: Yok<br />
9. Projede Önerilen Değişiklikler: Yok<br />
8.4 Materyal ve Metot: -<br />
8.5 Proje Faaliyet Takvimi:-<br />
8.6 Personel: Veteriner Hekim Ömer ÖZMEN’in emekli olması sebebiyle<br />
projeden çıkartılması talep edilmektedir.<br />
8.4 Bütçe: .<br />
9. Proje Harcamaları:-<br />
9.1 Proje Harcamaları Özeti: -<br />
10. Proje Sorumluları: adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri: Ünal KILINÇ<br />
Proje Lideri: Yrd. Doç. Dr. Ayşe KILIÇ<br />
298
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: İnfeksiyöz Bursal Hastalığı Saha ve Aşı Viruslarının Antijenik<br />
ve Patojenik Özellikleri Yönünden Moleküler Analizi<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/13/01/08/136<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından): Hayvan Sağlığı<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: Kanatlı ve Küçük Evcil Hayvan Hastalıkları<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 01/01/2008 ile 06/02/2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
Proje, 23.10.2007 tarihinde Enstitü Müdürlüğümüz ve TAGEM ile karşılıklı<br />
imzalanan proje sözleşmesine göre 01/01/2008 tarihi itibariyle yürütülmeye başlanmıştır.<br />
Bu kısa dönem içinde çalışma takvimine göre; yeni saha materyali toplanması, eskiden<br />
toplanan materyalin organizasyonu, aşı ve referans virusların sağlanması organizasyonu<br />
çalışmaları başlatılmış, sarf ve kimyasal maddeler satın alınmıştır. 10 puan<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: Proje çalışmalarına henüz başlanmadığı için rapor döneminde<br />
dönem bulgusu bulunmamaktadır. Kısa sürede çalışmalara başlanacaktır.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: 10 puan<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: Ara yayın yapılması<br />
düşünülmemektedir.<br />
7.4. Darboğazlar: Bu aşamada darboğaz bulunmamaktadır.<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.1. Materyal ve Metot: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.3. Personel: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.4. Bütçe: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Sarf malzemeleri alımı için 5767 YTL harcama<br />
yapılmıştır.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri :Necdet AKKOCA<br />
Proje Lideri :Dr.Olcay TÜRE GÖKSU<br />
Tarih :04.02.2008<br />
299
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1.Proje Adı : Solunum sistemi hastalığı olan tavuklardan Mycoplasma synovia ve<br />
Mycoplasma gallisepticum’un kültür, PCR ve immunohistokimyasal yöntemle<br />
saptanması.<br />
2.Proje Numarası : TAGEM/HS/13/01/08/136<br />
3.Proje Yürütücüsü Kuruluş : Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü-ELAZIĞ<br />
4.Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı ( TAGEM tarafından) :<br />
5.Projenin İlgili Olduğu AP : A-13. P-10 (Kanatlı ve Küçük Evcil Hayvan Hastalıkları)<br />
6.Projenin İlgili Olduğu Dönem : 15.11.2007 – 15.02.2008<br />
7. Gelişme Raporu<br />
7.11 Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.12 Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu :<br />
7.2.1. Dönem Bulguları :<br />
Araştırma için laboratuarların alt yapı çalışmaları tamamlanmıştır.<br />
Hiperimmun serum yurtdışından temin edilmiş olup gerekli malzemelerin ve<br />
ekipmanın bir kısmı sağlanmıştır. Bir kısım malzemeler için ise Enstitünün alım<br />
çalışmaları devam etmektedir. İlgili firmalarca gerekli malzemeler temin edildiğinde<br />
numune toplama ve işleme çalışmalarına başlanacaktır<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu :<br />
7.13 Yapılan veya yapılması düşünülen ara yayınlar :<br />
7.14 Darboğazlar :<br />
10. Projede Önerilen Değişiklikler :<br />
8.1 Materyal ve Metot :<br />
8.2 Proje Faaliyet Takvimi :<br />
8.3 Personel :<br />
8.4 Bütçe :<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1 . Proje Harcamaları Özeti :<br />
10 Proje Sorumluları : Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri: Uzm. Vet. Hekim Ünal KILINÇ<br />
Proje Lideri: Doç. Dr. Fethi YILMAZ<br />
Tarih:<br />
300
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1 Projenin Adı: Şap virusu üretimi amacıyla soy bean peptonlu vasatlarda BHK<br />
21 hücre kültürlerinin üretilmesi<br />
2 Proje Numarası: TAGEM/ HS/14/01/05/110<br />
3 Proje Yürütücüsü Kuruluş: Şap Enstitüsü Müdürlüğü<br />
4 Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı(TAGEM tarafından):<br />
5 Projenin İlgili Olduğu AP:<br />
6 Raporun İlgili Olduğu Dönem: 27/02/2007 ile 06/02/2008 arası<br />
7 Gelişme Raporu :<br />
7.1 Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: 70<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: Bu dönem için çalışma proğramında virus hassasiyet, metabolik<br />
aktivite ve sonuçların değerlendirilmesi öngörülmekte olup % 50 si tamamlanmıştır.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: 50<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar : Çalışma tamamlandığında<br />
yayın düşünülmektedir.<br />
7.4. Darboğazlar: Yok<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
8.1. Materyal ve Metot: Yok<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: Bir yıl uzatma talebi<br />
8.3. Personel: Yok<br />
8.4. Bütçe:<br />
9. Proje Harcamaları :<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Proje ihtiyaçlarının bir kısmı 2006 yılı sonunda sınırlı<br />
miktardaki proje bütçesinden karşılanmış olup, harcamaların büyük çoğunluğu enstitü<br />
imkanları ile karşılanmaktadır. Projelere ait bütçelerin enstitüye gönderilirken,<br />
gönderildikleri harcama kaleminden dolayı proje harcamalarında sıkıntılar yaşanmakta ve<br />
buna bağlı olarakta<br />
proje çalışma takviminde aksamalar olmaktadır<br />
10. Proje Sorumluları :<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri : Dr. Recep Ergül<br />
Proje Lideri : Şükran Yılmaz<br />
Tarih : 01 / 02/ 2008<br />
301
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1 Projenin Adı: A/Aydın 98 Şap Virusuna Karşı Monoklonal Antikor Panelleri<br />
Oluşturulması ve Karakterizasyonu<br />
2 Proje Numarası: TAGEM/ TAGEM/ HS /14/01/05/112<br />
3 Proje Yürütücüsü Kuruluş: Şap Enstitüsü<br />
4 Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı : HSAD<br />
5 Projenin İlgili Olduğu AP: Hayvan Aşıları ve Biyolojik Maddeler<br />
6 Raporun İlgili Olduğu Dönem: 15.02.2007 ile 15.02.2008 arası<br />
7 Gelişme Raporu :<br />
7.1 Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: Projemiz 2003 yılında askıya alınan<br />
projelerdendir. Bu rapor dönemi içinde hedeflenen çalışmaların büyük bir kısmı<br />
gerçekleştirilmiş olup halen çalışmalarımız devam etmektedir.(25)<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları<br />
Bu dönem içerisinde yapılan başlıca faaliyetler<br />
a.İmmunizasyon: Proje başlangıcından bu yana farklı orijinden epitellerden hazırlanan<br />
şap virusu aktif ve inaktif A/Aydın 98 146S antijeni ile Balb-c fareler i.p. ve i.v. olmak<br />
üzere prosedürüne uygun olarak immunize edilmiştir.<br />
b.Füzyon: İmmunize <strong>hayvan</strong>ların dalağından elde edilen B-Lenfositler aynı orijinli kanser<br />
hücreleri ile PEG ortamında birleştirilmiştir.<br />
c.Hibridoma hücrelerinin üretilmesi: Füzyonlar sonrası mikroskopta koloni oluşumu<br />
gözlemlenmiştir ve oluşan hibridoma hücre kolonileri seçici besi ortamı ilavesiyle<br />
üretilmiştir.<br />
d.ELISA: Oluşan kolonilerde antikor üreten hibridoma hücrelerinin varlığı indirect SP-<br />
ELISA testi ile tespit edilmiştir.<br />
e.Klonlama: Antikor üreten pozitif hibridoma kolonilerinin tespit edildiği gözler dilüsyon<br />
tekniği ile klonlanmıştır.<br />
f.Rekloning: Dilüsyon sonrası halen pozitifliğini sürdüren kolonilerin bir kısmı stabilite<br />
kontrolü için stoklanmış ve daha sonra yeniden klonlanmıştır. SP-ELISA testinde<br />
pozitifliği tespit edilen klonlarda karakterizasyon aşaması için hacim büyütülmüştür.<br />
g.Karakterizasyon çalışmaları:<br />
1. ELISA : Kolonilerin ilk gözlemlendiği andan itibaren pozitif hibridomaların tespiti için<br />
her aşamada indirect SP-ELISA testi kullanılmıştır.<br />
2. VNT: İndirect SP- ELISA sonucu pozitifliği tespit edilmiş olan klonlar VNT ile test<br />
edilmiştir .Elde edilen antikorların tamamı non-nötralizan olarak tespit edilmiştir..<br />
3. Ig alt sınıflarının belirlenmesi: Pozitif klonlar üzerinde yapılan çalışmalarda Ig G1 ve<br />
IgG2’ler tespit edilmiştir.<br />
4. TTV, DNV, 146S ve 12S Şap Virusu Antijenleri ile Gösterdiği reaksiyonlar: Farklı<br />
şekillerde hazırlanmış Şap virusu partikülleri ile üretilen antikorların ELISA testinde<br />
göstermiş olduğu reaksiyonlar tespit edilmiştir.<br />
5.Western –Blotting: ELISA pozitif klonların tamamında WB negatiflik tespit edilmiştir.<br />
6.Plak Purifikasyon: Nötralizasyondan kaçan mutantların tespiti çalışmaları devam<br />
etmektedir.<br />
7.Kros Bağlanma : Tip içinde ve tipler arası kros reaksiyon çalışmaları devam etmektedir.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu:<br />
Bu rapor döneminde planlanan çalışmaların büyük bir kısmı tamamlanmıştır. (60)<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar : Ara yayın düşünülmemektedir<br />
7.4. Darboğazlar: Herhangi bir darboğaz söz konusu değildir<br />
302
8. Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
8.1. Materyal ve Metot: Metot projede belirtildiği şekilde uygulanmış ve çalışmanın<br />
devamında da aynı metot uygulanacaktır.<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: Proje faaliyet takviminde bir değişiklik önerilmemektedir.<br />
8.3. Personel: Projede çalışan personelde bir değişiklik olmamıştır.<br />
8.4. Bütçe: Bütçe ile ilgili bir değişiklik yapılmamıştır.<br />
9. Proje Harcamaları :<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti:<br />
Dönemi Yatırılan<br />
01.04.2005-15.02.2006<br />
TL<br />
2.500<br />
15.02.2006- 15.02.2007 3.750<br />
TOPLAM 6.250<br />
Kullanılan<br />
TL<br />
10. Proje Sorumluları : Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri : Dr.Recep ERGÜL<br />
Proje Lideri : Berrin M. ALPAY<br />
Tarih : 04.02.2008<br />
303
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1 Projenin Adı: Şap Enstitüsü Müdürlüğü'nde Kullanılan Aşı Suşlarının Koruyucu<br />
Doz50 (PD50 :Protective Dose50) Değerleri ile İmmunite Sürelerinin Belirlenmesi<br />
2 Proje Numarası: TAGEM/HS/14/01/05/113<br />
3 Proje Yürütücüsü Kuruluş: Şap Enstitüsü Müdürlüğü<br />
4 Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı(TAGEM tarafından):<br />
5 Projenin İlgili Olduğu AP:<br />
6 Raporun İlgili Olduğu Dönem: . 01/03/2007 ile 01/02/2008 arası<br />
7 Gelişme Raporu :<br />
7.1 Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: Projeye 2007 yılında Enstitü’nün imkanlarıyla<br />
devam edilmiş olup iki parti halinde tedarik edilen (TİGEM den kontrol edilerek satın alınan)<br />
sığırlarda Koruyucu Doz 50 çalışmaları yapıldı. Halen çalışmalar devam etmekte olup yaklaşık iki<br />
ay içerisinde projenin tamamının bitirilmesi hedeflenmektedir.<br />
Dönem Gerçekleşme Puanı: 25<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu: Projenin deneysel aşı ve saha çalışmaları<br />
önceki yıllarda (2004-2006) tamamlanmıştı.<br />
7.2.1. Dönem Bulguları : 2006 ve 2007 yıllarında TİGEM ile yapılan sözleşme gereği olarak,<br />
annelerinden doğan buzağılar, şap hastalığına ve diğer hastalıklara karşı aşılanmadan ayrı bir yerde<br />
tutularak yetiştirilmekte ve ortalama bir yaş üstü <strong>hayvan</strong>ların kan serumları kontrol edildikten sonra<br />
Enstitü’ye getirildiler. A22 Irak ve O1 Manisa suşlarından hazırlanan monovalan yağ adjuvantlı<br />
aşılar bu <strong>hayvan</strong>larda kullanılarak koruyucu doz 50 değerleri tesbit edildi. Asya-1 Şamir suşunun<br />
çalışmaları devam etmektedir.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu : 65<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar : ---<br />
7.4. Darboğazlar: 2005 yılından itibaren Aluminyum hidroksit-saponin adjuvantlı şap aşıları rutin<br />
üretimden kaldırılmış olup konu ile ilgili şap aşılarının koruyucu doz 50 çalışmalarının yapılmasına<br />
gerek duyulmadığı Enstitü Fen Kurulu tarafından karar verilmiştir. Projede yağ adjuvantlı aşılar<br />
çalışılmıştır.<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler<br />
2-3 ay süre uzatımı.<br />
8.1. Materyal ve Metot:<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi:<br />
8.3. Personel: Projede görev alan aşağıda isimleri bulunan kimselerin projeye eklenmesi:<br />
Dr. Recep Ergül, Dr Musa Alkan, Uzm. Vet. Hekim Mehmet Karakaya, Vet. Hekim Ergun<br />
Uzunlu, Vet. Hekim Yasemin Gültekin.<br />
8.4. Bütçe: ---<br />
9. Proje Harcamaları :<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti:<br />
Araştırma Sarf Malzemeleri<br />
Hayvan alımı-Nakliye dahil (34 adet dana) 76.400 YTL<br />
Total protein test kiti 4.000 YTL --<br />
SNT, ELISA reagent ve malzemeleri 6.000 YTL<br />
Yiyecek ve Yem Alımları 5.000 YTL<br />
Ara Toplam: 91.400 YTL<br />
Cari Giderler<br />
Geçici Görev Yollukları 2.000 YTL --<br />
Ulaştırma ve Haberleşme Giderleri 2.000 YTL<br />
Ara Toplam: 4.000 YTL<br />
GENEL TOPLAM : 95.400 YTL<br />
10. Proje Sorumluları :<br />
Kuruluş Amiri : Dr. Recep ERGÜL<br />
Proje Lideri : Şeref AKYÜZ<br />
Tarih : 05/02/2008<br />
304
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: İnaktif Konsantre Şap Aşısı Antijeni 146 S Partiküllerinin<br />
Stabilite Çalışmaları.<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/ ...HS.14.01.07/25..<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Şap Enstitüsü Müdürlüğü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından): Hayvan <strong>sağlığı</strong><br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP:<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 05/...03..../2007 ile ...30...../.01../2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
Bu araştırmanın amacı konsantre edilen inaktif aşı antijeninin +4 o C ve -20 o C ’lerde<br />
muhafazası esnasında 146 S partiküllerinin zarar görmesini en aza indirgemektir. Bu çalışmada Şap<br />
Enstitüsünde üretilen ve inaktive edildikten sonra Cross Flow teknolojisi ile konsantre edilen şap<br />
aşı antijenleri kullanılmaktadır. Bu antijenlerin içine koruyucu olarak değişik solüsyonlardan<br />
katılmış ve zamana bağlı olarak 146 S ile Total Protein yönünden incelenmektedir.<br />
Bu dönemde proje faaliyetlerinin ikinci aşaması olan “ Hazırlanan antijenlerin teste<br />
tabi tutulmasında” belirtildiği üzere numuneler her ay 146 S miktarı ve total protein<br />
yönünden test edilmektedir. (Değerlendirmeye göre 25 puan)<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: Bu dönemde + 4 0 C ve – 20 0 C’ deki numunelerin 146 S ve total<br />
protein miktarları hesaplanmış kayıtlara geçmiştir.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: (70 PUAN)<br />
Önemli araştırma faaliyetleri/aşamaları ve ne zaman gerçekleştirilecekleri<br />
6. İnaktif Aşı Antijenlerinin hazırlanması.( TAMAMLANDI ).<br />
7. Hazırlanan antijenlerin her ay teste tabi tutulması. ( % 70 tamamlandı )<br />
8. Sonuçları değerlendirilmesi ve final raporu. (14-16 )<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: Herhangi bir ara yayın yapılması<br />
planlanmamıştır.<br />
7.4. Darboğazlar: Herhangi bir darboğaz bulunmamaktadır.<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: Herhangi bir değişiklik bulunmamaktadır.<br />
8.1. Materyal ve Metot: (Varsa materyal ve metotta tavsiye edilen değişiklikler). Materyal<br />
ve metot’la ilgili bir değişiklik düşünülmemektedir.<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: (Varsa proje faaliyet takviminde önerilen değişiklikler).<br />
Faaliyet takviminde değişiklik düşünülmemektedir.<br />
8.3. Personel: Veteriner Hekim Dr. Melahat CENGİZ’in projeden çıkarılması önerilmektedir.<br />
8.4. Bütçe: Bütçe ile ilgili bir değişiklik gerekmemektedir.<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Proje başlangıcından beri dönemler üzerinden proje için<br />
harcanılan ödeneklerin ana kalemler bazında dökümü verilecektir.<br />
Projede şu ana kadar bir harcama yapılmamıştır Enstitü olanaklarından faydalanılmıştır.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri : Recep ERGÜL<br />
Proje Lideri : Dr.Nedret ÇELİK<br />
Tarih : 30/01/2008<br />
305
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: Mevcut Şap Aşısının Etkinliğinin Yeni Adjuvant Sistemi<br />
Oluşturularak İyileştirilmesi<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/ HS /14/01/07/126<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Şap Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından): Hayvan Sağlığı<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP:<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 01/01/2007 ile 31/01/2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: Puan : 25<br />
Sipariş verilen kimyasal madeler alınmıştır. Proje kesin teklifinde belirtilen çalışmanın 1. aşaması<br />
çalışmaları tamamlanmıştır. İkinci aşama devam etmektedir. Proje çalışmalarının öngörülen proje<br />
süresi içinde bitirilmesi planlanmaktadır.<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: Denemelerimize planlandığı gibi biyouyumluluğu, biyobozunabilirliliği<br />
ve bioaktivitesi dolayısı ile çeşitli farmasötik ve tıp alanlarında oldukça cazip bir madde<br />
görünümünde olan kitosan ile devam edilmektedir.<br />
Glukozamin ve N-asetil-glukozamin kopolimerlerinden oluşan kitosan doğal lineer bir<br />
biopoliaminosakkarid’tir. Kitosan nötral ve bazik pH da çözünmez, ancak organik ve inorganik<br />
asitlerle suda çözünebilen tuzlar oluşturur. Asidik ortamda çözünmesi sonucunda polimerdeki<br />
amino gruplar protonlanarak pozitif hale gelirler. Bu durumda katyonik bir biyopolimer olan<br />
kitosanın karşıt iyonlarla (anyonlarla) etkileşerek iyonotropik olarak jel ve koşullara bağlı olarak<br />
değişik boyutlarda jel tanecikleri meydana getirebilmektedir.<br />
Proje faaliyetleri kapsamında aşağıdaki çalışmalar gerçekleştirilmiştir:<br />
• Kitosan’ın iyonotropik jelleşme davranışının incelenmesi: Bu çalışmalar neticesinde kitosanın<br />
jelleştirilmesinde en etkin anyonlar polifosfat, fosfomolibdat ve molibdat ile birlikte tripolifosfat ve<br />
pirofosfat anyonları ile de çalışmalara devam edilmesine karar verilmiştir.<br />
• Kitosan’ın iyonotropik jelleşmesinde kullanılan anyonların etkinlik sırasına çözücü etkisinin<br />
araştırılması: Bu çalışmalar neticesinde çözücünün anyonların etkinliğine etkisi olduğu görülmüş<br />
ve tuzların sudaki çözeltilerinin kullanılmasına karar verilmiştir.<br />
• Kitosanın polielektrolit kompleks oluşturulması ve jelleşme davranışlarının incelenmesi: Bu<br />
kapsamda kitosan’ın düşük vizkoziteli sodyum aljinat, orta vizkoziteli sodyum aljinat, kapakaragenan,<br />
pektin ve agaroz ile polielektrolit kompleks oluşturma çalışmaları gerçekleştirilmiştir.<br />
Elde edilen polielektrolit komplekslere anyon varlığının etkileri incelenmiştir. Bu denemelerden<br />
elde edilen bulgular sonucunda orta vizkoziteli sodyum aljinat ile çalışmalara devam edilmesine<br />
karar verilmiştir.<br />
• Ca 2+ , Ba 2+ , Zn 2+ , Fe 2+ ve Fe 3+ katyonların varlıklarının kitosan ve aljinat polielektrolit<br />
kompleksi oluşumuna etkisinin incelenmesi: Bu katyonların anyonlar ile birlikte varlıklarının<br />
polielektrolit kompleks oluşumuna olumlu katkı yaptığı görülmüştür.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: Birinci aşamada planlanan faaliyetler gerçekleştirilmiştir. İkinci<br />
aşama devam etmektedir. Puan: 65<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: Değişiklik yok<br />
8.1. Materyal ve Metot: Değişiklik yok<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: Değişiklik yok<br />
8.3. Personel: Değişiklik yok<br />
8.4. Bütçe: Değişiklik yok.<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti:<br />
4 300 YTL değerinde kimyasal madde ve malzeme alınmıştır.<br />
10. Proje Sorumluları: Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri : Dr. Recep ERGÜL<br />
Proje Lideri : Tunçer TÜRKOĞLU<br />
Tarih : 04/02/2008<br />
306
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Proje Adı: Vero hücrelerinde ısıya dayanıklı sığır vebası aşı üretimi<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/14/01/07/127<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Etlik Vet. Merk.Kont. ve Araş. Enstitüsü Müdürlüğü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı ( TAGEM tarafından):<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: A-14 , P-01 ( Hayvan Aşıları ve Biyolojik Maddeler )<br />
6. Projenin İlgili Olduğu Dönem: 01/03/2007 - 14/01/2007<br />
7. Gelişme Raporu<br />
7.15 Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: 20 puan<br />
7.16 Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları:<br />
Sığır vebası Kabate O suşunun Vero cell line hücre kültürlerinde 3 pasaj ile<br />
adaptasyonu yapıldı. PDB hücre kültüründe 95 . pasajdaki KABATE O RP ( Pirbright<br />
V19/13/92 BK 95 ) ana tohum virus vero cell line hücre kültürlerinde 3 pasaj<br />
gidilerek 98. pasajda vero hücrelerine adapte ana tohum virus stokları oluşturuldu.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: 60 puan<br />
7.17 Yapılan veya yapılması düşünülen ara yayınlar: yok<br />
7.18 Darboğazlar: Yardımcı araştırıcıların başka kuruma geçmelerinden dolayı<br />
projenin bu dönemindeki hedeflerinin ikinci bölümü gerçekleştirilememiştir.<br />
Gelecek dönemde bu sorun yeni yardımcı araştırıcı katılımı ile<br />
çözümlenebilecektir.<br />
11. Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
8.7 Materyal ve Metot: -<br />
8.8 Proje Faaliyet Takvimi:<br />
8.9 Personel:<br />
Dr. Elvin ÇALIŞKAN ‘ın projeye katılımı teklif edilmektedir.<br />
8.4 Bütçe: .<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1 . Proje Harcamaları Özeti: -<br />
10 Proje Sorumluları: adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri: Dr. Nahit YAZICIOĞLU<br />
Proje Lideri: Uzm.Vet.Hek.Dr. Özden KABAKLI<br />
Tarih:<br />
307
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: Türkiye’de Kullanılan Canlı İnfeksiyöz Bursal Hastalığı<br />
(Gumboro) Aşılarının Patojenite Düzeylerinin Moleküler Marker ile Analizi<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/14/01/08/137<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından): Hayvan Sağlığı<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: Hayvan Aşıları ve Biyolojik Maddeler<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 01/01/2008 ile 06/02/2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
Proje, 23.10.2007 tarihinde Enstitü Müdürlüğümüz ve TAGEM ile karşılıklı<br />
imzalanan proje sözleşmesine göre 01/01/2008 tarihi itibariyle yürütülmeye başlanmıştır.<br />
Bu kısa dönem içinde çalışma takvimine göre; 2006 ve 2007 yılında gelen, 2008<br />
yılında gelmeye başlayan Gumboro Canlı Aşı Örneklerinden birer örnek seçilmiştir.<br />
Projenin sarf ve kimyasal maddeleri satın alınmıştır. 10 puan<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: Proje çalışmalarına henüz başlanmadığı için rapor döneminde<br />
dönem bulgusu bulunmamaktadır. Kısa sürede çalışmalara başlanacaktır.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: 10 puan<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: Ara yayın yapılması<br />
düşünülmemektedir.<br />
7.4. Darboğazlar: Bu aşamada darboğaz bulunmamaktadır.<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.1. Materyal ve Metot: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır<br />
8.3. Personel: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır<br />
8.4. Bütçe: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Sarf malzemeleri alımı için 2883 YTL harcama<br />
yapılmıştır.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri :Necdet AKKOCA<br />
Proje Lideri :Dr.Olcay TÜRE GÖKSU<br />
Tarih :04.02.2008<br />
308
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1 Projenin Adı: Orta ve Doğu Karadeniz Bölgesinde Alabalık Çiftliklerinde Viral<br />
Hemorajik Septisemi (VHS) Virusunun İzolasyon ve İdentifikasyonu<br />
2 Proje Numarası: TAGEM/ HS/03/06/116<br />
3 Proje Yürütücüsü Kuruluş: Samsun Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4 Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından):<br />
5 Projenin İlgili Olduğu AP: Su Ürünleri Hastalıkları<br />
6 Raporun İlgili Olduğu Dönem: 28/02/2007 ile 21/01/2008 arası<br />
7 Gelişme Raporu :<br />
Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu: Projede öngörülen 2. yıl hedeflerine<br />
ulaşılamamıştır. Projenin birinci gelişme döneminde metoda eklenen yeni testler ile hedeflerde<br />
sapma olmuştur. Bölgede su ısısının soğuması geç döneme kadar sürdüğünden 2. dönem<br />
örnekleri toplanmaya yeni başlanmış olup, laboratuar testleri sürmektedir. Bu nedenlerden<br />
dolayı proje için bir yıl ek süre talep edilmektedir. (15)<br />
Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları : Birinci rapor döneminde projenin saha ve laboratuar çalışmaları<br />
sonucunda 4 ilde bulunan toplam 9 alabalık işletmesine gidildi ve toplam 66 adet numune<br />
temin edildi. Tablo 1’de sunulan sonuçlara ek olarak aynı örnekler üzerinde yapılan RT-PCR<br />
sonuçlarıda NEGATİF sonuç vermiştir. İkinci döneme ilişkin örnekler sahadan temin edilmeye<br />
başlanmış olup, laboratuar çalışmaları da sürmektedir. Tablo-1<br />
İşletmenin ait olduğu Test Edilen<br />
VHS Sonuç<br />
İl/İşletme No Numune Sayısı Direk ELISA CPE<br />
1-ORDU-1 3 - -<br />
2-ORDU-2 10 - -<br />
3-ORDU-3 9 - -<br />
4-ORDU-4 8 - -<br />
5-SAMSUN-2 6 - -<br />
6-SAMSUN-3 10 - -<br />
7-SAMSUN-4 10 - -<br />
8-RİZE-1 5 - -<br />
9-TRABZON-1 5 - -<br />
TOPLAM:9 66 0 0<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: Bu rapor döneminde proje takvimine göre projenin 2. yılında<br />
yapılması planlanan saha ve laboratuar çalışmaları sürmekte olup, projenin sonuç ve raporlama<br />
kısmı gelecek döneme sarkacaktır.(30)<br />
7.3. Yapılan ve yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: Yok<br />
7.4. Darboğazlar: Yok<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
8.1. Materyal ve Metot:Yok<br />
8.2. Proje Faaliyet Takvimi: 1 yıl ek süre talep edilmektedir.<br />
8.3. Personel: Yok<br />
8.4. Bütçe: Yok<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti:<br />
2007 yılında projeye ayrılan ödenek aktarılmamış olup, proje enstitünün kendi imkanları<br />
ile yürütülmektedir.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri : İsmail AYDIN<br />
Proje Lideri : Harun ALBAYRAK<br />
Tarih : 20/01/2008<br />
309
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: A Sınıfı Avlanma/Üretim Alanlarından Çıkarılan Çift Kabuklu<br />
Yumuşakçalardan ve Deniz Sularından Listeria monocytogenes İzolasyon ve<br />
İdentifikasyonu<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/HS/09/02/07/123<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından): Hayvan Sağlığı<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: Su Ürünleri Sağlığı, Orta<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 01/01/2007 ile 05/02/2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
Ocak 2007 – Şubat 2008 tarihleri arasında proje için gerekli besiyerleri, supplement ve<br />
identifikasyon kitleri ile Listeria monocytogenes (ATCC 15313) standart referans suş<br />
sağlanmıştır. Projeye materyal sağlamak üzere Çanakkale İl Müdürlüğü, İzmir İl<br />
Müdürlüğü ve Ayvalık İlçe Müdürlüğü ile iletişim sağlanmıştır.<br />
25 puan<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları:<br />
Ayvalık Bölgesinde bulunan 9 istasyondan (19, 20, 21, 63, 64, 65, 66, 68, 81) üçer kez<br />
sağlanan çift kabuklu yumuşakça ve deniz suyu numunelerinde çalışma yapılmıştır.<br />
Çalışmalar sonucu ilk alınan (Ekim Ayı) 64 nolu istasyona ait ürün numunelerinden<br />
Listeria monocytogenes izole edilmiş, diğer istasyonlara ait ürün ve su numunelerinden ve<br />
Listeria monocytogenes izole edilmemiştir. Bu Bölgedeki 9 istasyondan ikinci kez<br />
sağlanan numunelerden 21, 64, 66, 81 nolu istasyonlara ait numunelerden Listeria<br />
monocytogenes izole edilmiş, 63 nolu istasyondan Listeria inocua izole edilmiştir. Diğer<br />
istasyonlara ait ürün ve su numunelerinden ve Listeria monocytogenes izole edilmemiştir.<br />
Bölgedeki 9 istasyondan üçüncü kez sağlanan numunelerden 64 nolu istasyondan Listeria<br />
monocytogenes izole edilmiştir<br />
İzmir Bölgesi’nde bulunan 3 adet istasyondan (84, 85, 86) 2 kez ürün ve deniz suyu<br />
sağlanmış olup Listeria monocytogenes izole edilmemiştir.<br />
Çanakkale Bölgesi’nde yer alan 13 istasyondan 11’inden ikişer kez (24, 59, 62, 75, 76, 77,<br />
82, 83, 87, 88, 89), 2 istasyondan 1 kez (90, 91) ürün ve deniz suyu numunesi sağlanmış<br />
olup örneklerden Listeria monocytogenes izole edilmemiştir.<br />
Şu ana kadar 25 istasyondan 55 adet deniz suyu ve 55 adet ürün numunesi olmak üzere<br />
toplam 110 numune çalışılmıştır. Çalışmalar sonucu 3 istasyondan birer, 1 istasyondan 3<br />
kez olmak üzere toplam 6 L. monocytogenes, 1 adet Listeria innocua izole edilmiştir.<br />
310
Üretim Bölgesi Kodu Üretim Bölgesinin Adı Üretim Alan Numarası<br />
(İstasyon)<br />
Ürün Türü<br />
84 İzmir 84 (Çaltıdere/Aliağa) Akivades<br />
85 İzmir 85 (Dalyanköy/Çeşme) Akivades<br />
86 İzmir 86 (Mersin Koyu/Çeşme) Kara Midye<br />
I Ayvalık 19 Akivades<br />
I Ayvalık 20 Kara Midye<br />
I Ayvalık 21 İstridye<br />
I Ayvalık 63 İstridye<br />
I Ayvalık 64 Kıllı Midye<br />
I Ayvalık 65 Kidonya<br />
I Ayvalık 66 Akivades<br />
I Ayvalık 68 Kara Midye<br />
I Ayvalık 81 Kum Şırlanı<br />
II Çanakkale 24 (Gelibolu/Karakova) İstridye<br />
II Çanakkale 59 (Labseki/Çardak) İstridye<br />
II Çanakkale 62 Akivades<br />
II Çanakkale 75 (Baklaburnu) Kidonya<br />
II Çanakkale 76 (Kabatepe) Akivades<br />
II Çanakkale 77 (Ocaklı) Akivades<br />
II Çanakkale 82 (Fındıklı) Kum Şırlanı<br />
II Çanakkale 83 (Yeniköy) Kum Şırlanı<br />
II Çanakkale 87 (Akbaş) Kara Midye<br />
II Çanakkale 88 (Ilgardere) Kara Midye<br />
II Çanakkale 89 (Karacaören Altı) Kara Midye<br />
II Çanakkale 90 (Adatepe) Cardium edule<br />
II Çanakkale 91 (Umurbey) Cardium edule<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: 65 puan<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: Ara yayın yapılması<br />
düşünülmemektedir.<br />
7.4. Darboğazlar: Bu aşamada darboğaz bulunmamaktadır.<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.1. Materyal ve Metot: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.3. Personel:Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.4. Bütçe: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Sarf malzeme alımları yapılmıştır.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri : Necdet AKKOCA<br />
Proje Lideri : Necla TÜRK<br />
Tarih : 06/02/2008<br />
311
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: İnfeksiyöz Pankreatik Nekrozis Virusunun (IPNV) üç farklı<br />
serotipine karşı tavşanlarda nötralizan antiserum üretimi<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/ HS /09 /02 /07 /124<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş:Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından): Hayvan Sağlığı<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: Su Ürünleri Sağlığı P-02<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 01/03/2007 ile 30/01/2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
Mart 2007-Ocak 2008 tarihleri arasında virusların üretimi, stoklanması, konsantrasyonu<br />
ve konsantre virus kullanılarak tavşanların immunizasyonu çalışmaları hedeflendiği<br />
şekilde tamamlanmıştır. Purifikasyon çalışmalarına başlanmıştır. Nihai hedefe ulaşmak<br />
için kalan süre yeterli bulunmaktadır.<br />
25 puan<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları:<br />
Mart 2007-Ocak 2008 tarihleri arasında immunizasyonda kullanılmak üzere IPNV ‘nun üç<br />
farklı serotipi (Sp, Ab, VR 299 ) BF-2 hücre kültüründe büyük hacimde üretilerek<br />
konsantrasyon ve purifikasyon işlemlerini takiben immunizasyonda kullanılmak üzere<br />
stoklanmıştır. IPNV ‘nun üç farklı serotipine (Sp, Ab, VR 299 ) karşı üretilen viruslar<br />
konsantre edilerek 500μg/tavşan + Freund’s İncomplete Adjuvant ile tavşanların<br />
intramusküler immunizasyonu yapılmış 4 hafta sonra çıplak virus intravenöz olarak verilip<br />
immunizasyon tekrarlanmıştır. 10 gün sonra kanlar alınarak serumları ayrılmış ve testlerde<br />
kullanılmak üzere stoklanmıştır.Purifiye viruslar kullanılarak yapılacak immunizasyon<br />
çalışmaları için tavşanlar temin edilmiş ve virusların purifikasyon çalışmalarına<br />
başlanmıştır.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu:<br />
65 puan<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: Ara yayın yapılması<br />
düşünülmemektedir.<br />
7.4. Darboğazlar: Bu aşamada darboğaz bulunmamaktadır.<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
8.1. Materyal ve Metot: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır<br />
8.3. Personel: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır<br />
8.4. Bütçe: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Proje için gerekli sarf malzemelerinin alımları yapılmıştır.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Kuruluş Amiri<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
:Necdet AKKOCA<br />
Proje Lideri :Dr.Gülnur KALAYCI<br />
Tarih :<br />
312
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
1. Projenin Adı: Kerevit Vebası Etkeni Aphanomyces astaci’nin Varlığının<br />
Konvansiyonel ve Moleküler Yöntemlerle Araştırılması.<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/ ..HS.. /09.../.02.... /08..... /138.....<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından): Hayvan Sağlığı<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP: Su Ürünleri Sağlığı P-02<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 01/01/2008 ile 01/02/2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
Standart A. Astaci suşu (Temin yeri CEFAS-İngiltere) getirtildi.<br />
PCR malzemelerinin alımı gerçekleştirildi.<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
Temmuz, Ağustos, Eylül, Ekim, Kasım ve Aralık aylarında İznik ve Eğirdir göllerine<br />
gidilerek her defasında örnekleme yöntemi ile 30’ar adet olmak üzere toplam 360 adet (180 adet<br />
İznik gölü, 180 adet Eğirdir gölü) canlı kerevit numunesi soğuk zincirde ve ıslaklıkları korunarak<br />
Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Balık Hastalıkları Teşhis Laboratuarına<br />
getirildi.<br />
Her kerevitin melanizasyon görülen noktaları başta olmak üzere ventral abdomen<br />
bölgesinden doku parçaları alınıp steril bisturi ile 1-2 mm lik parçalara ayrıldıktan sonra<br />
I.M agar ortamına plante edildi. 360 örneğin değerlendirilmesinden 56 adet Aphanomyces<br />
astaci şüpheli mantar üremesi gözlendi. Kültürler üzerinde gerekli incelemeler yapıldıktan<br />
sonra PCR ile konfirme edilmek üzere Pepton Glukuoz Mediumda stoklandı.<br />
15.01.2008 tarihinde PCR çalışmalarına başlandı. Moleküler çalışmalar devam<br />
etmektedir. Daha sonra projenin sonuç raporu yazılacaktır.<br />
7.2.1. Dönem Bulguları: Rapor döneminde planlanmış faaliyetlerin her biri<br />
tamamlanmıştır.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu: 1. Dönem : 90<br />
7.3.Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar: Ara yayın yapılması<br />
düşünülmemektedir.<br />
7.4. Darboğazlar: Bu aşamada darboğaz bulunmamaktadır.<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler: Proje planlamasını ya da sonuçlarını etkileyecek bir<br />
değişiklik önerisine gerek duyulmamaktadır.<br />
8.1. Materyal ve Metot:<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi: Proje faaliyet takvimine uygun olarak çalışılmaktadır.<br />
8.3. Personel: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır<br />
8.4. Bütçe: Değişiklik önerisi bulunmamaktadır.<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti: Numune tedariki için İznik ve Eğirdir Göllerine yapılan<br />
görevlendirmeler sırasında yol ve gündelik masraflarını içermekte olup, Enstitü Müdürlüğü<br />
tarafından karşılanmıştır. PCR malzemelerinin ücretleri Adnan Menderes Üniversitesi<br />
Proje Daire Başkanlığı bütçesinden karşılanmıştır. Bu iki kalem dışında 9500 YTL<br />
soğutmalı Etüv alımı için kullanılmıştır.<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri :Necdet AKKOCA<br />
Proje Lideri :Lütfi AVSEVER<br />
Tarih : 06/02/2008<br />
313
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
Projenin Adı: Karadeniz Bölgesinde Kültürü Yapılan ve Doğal Balıklardan Viral Hemorajik<br />
Septisemi Virüs (VHSV) İzolasyon Çalışmaları ve Elde Edilecek İzolatların Patojenitesini<br />
Belirleyen Genetik Yapı Üzerine Çalışmalar.<br />
2. Proje Numarası: TAGEM/ HS /14/01/07/126<br />
3. Proje Yürütücüsü Kuruluş: Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsü – Trabzon<br />
4. Projenin İlgili Olduğu Daire Başkanlığı (TAGEM tarafından):HSAD<br />
5. Projenin İlgili Olduğu AP:<br />
6. Raporun İlgili Olduğu Dönem: 01/01/2007 ile 31/01/2008 arası<br />
7. Gelişme Raporu:<br />
7.1. Proje Hedeflerinin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2. Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu:<br />
7.2.1. Dönem Bulguları:<br />
Başlıca Faaliyetlerin Gerçekleşme Durumu: Proje kapsamında bu güne kadar (15 Ocak 2008<br />
itibariyle) yapılan çalışmalar aşağıda sıralanmıştır;<br />
� Yapılacak örneklemeler için Karadeniz bölgesinde coğrafi farklılıkları ve balık çeşitliliği<br />
bakımından önemli olan sekiz ayrı merkez (doğudan batıya doğru; Hopa, Pazar, Trabzon, Ordu,<br />
Samsun, Sinop, İnebolu ve Ereğli) belirlenmiştir.<br />
� Yukarda belirtilen örnekleme merkezlerinden 28 Kasım 2007 tarihinden itibaren deniz<br />
suyu sıcaklığının da 14,5°C civarına düşmesiyle örneklemelere başlanmış ve bu amaçla 38 adet<br />
tatlı su ve 190 adet deniz balığı olmak üzere toplam 228 adet balık örneklenmiştir. Pazar<br />
Bölgesinden; (25 adet gökkuşağı alabalığı, 13 adet dere alabalığı) Trabzon Bölgesinden; (77 adet<br />
mezgit, 58 adet barbunya, 35 adet kaya balığı, 16 adet tırpana balığı, 11 adet denizatı, 7 adet öküz<br />
balığı, 7 adet vatoz balığı örneği alınmıştır.<br />
� Yukarda belirtilen örneklemelere ilaveten ağustos ayından kasım ayına kadar geçen süre<br />
zarfında, Enstitüde yürütülen “Sürdürülebilir Kalkan Balığı Üretimi Tekniklerinin Geliştirilmesi ve<br />
Larva Dropsi Probleminin Araştırılması” adlı projede toplam 167 adet kalkan larvası virolojik<br />
yönden incelendi. Yine belirtilen dönemde Ordu ve Samsun bölgesinden 7 adet gökkuşağı alabalığı<br />
örneklendi.<br />
� Su sıcaklıklarının da VHSV için kritik seviyelere düşüşüyle birlikte, belirlenen<br />
bölgelerdeki doğal ve kültür balıklarından VHSV izolatları yakalamak amacıyla örneklemelere<br />
devam edilmektedir. Birinci örnek alma dönemi tatlı su balıkları bu dönemde üreme stresi altında<br />
bulunduklarından ocak ayı sonuna kadar sürdürülecektir.<br />
� Yapılmakta olan planlı örnekleme çalışmalarının yanı sıra bu üreme sezonunda dünyaya<br />
gelen genç bireylerde görülmesi muhtemel hastalık vakalarında örnekleme fırsatı<br />
değerlendirilmektedir.<br />
7.2.2. Dönem Başarı Durumu:<br />
7.3. Yapılan ve Yapılması Düşünülen Ara Yayınlar:<br />
7.4. Darboğazlar:<br />
8. Projede Önerilen Değişiklikler:<br />
8.1. Materyal ve Metot: (Varsa materyal ve metotta tavsiye edilen değişiklikler).<br />
8.2.Proje Faaliyet Takvimi:<br />
8.3. Personel:<br />
8.4. Bütçe: 43.000 YTL<br />
9. Proje Harcamaları:<br />
9.1. Bütçe Harcamaları Özeti:<br />
10. Proje Sorumluları:<br />
Adı ve Soyadı İmzası<br />
Kuruluş Amiri :<br />
Proje Lideri :Hakan IŞIDAN<br />
Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsü<br />
Tarih :<br />
314
ARAŞTIRMA PROJELERİ GELİŞME RAPORLARI FORMU<br />
Projenin Adı: Orta ve Doğu Karadeniz Bölgesinde Gökkuşağı Alabalığı<br />
(Oncorhynchus mykiss) Çiftliklerinde Flavobacterium psychrophilum’un<br />
Epidemiyolojisinin Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Belirlenmesi ve Antibiyotik<br />
Dirençliliğinin Ortaya Konulması<br />
Proje no : TAGEM/HS/09/02/08/140<br />
Yürütücü Kuruluş : Samsun Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü<br />
Müdürlüğü<br />
İşbirliği yapılan Kuruluş : 19 Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi<br />
Başlama ve Bitiş tarihi : Ocak 2008 – Aralık 2009<br />
Proje yürütücüleri : Yüksel DURMAZ, : Ertan Emek ONUK, Alper Çiftci,<br />
Kemal Gürkan KÜTÜK, Gökmen Zafer PEKMEZCİ, Yunus GÜR<br />
Proje hedeflerinin gerçekleşme durumu : 0<br />
Proje çalışmalarına planlandığı şekilde 2008 yılı ocak ayında başlanmıştır<br />
Başlıca faaliyetlerin gerçekleşme durumu :<br />
Dönem Bulguları :<br />
Dönem Başarı durumu : 2008 yılı Ocak-Şubat ve Mart ayı içerisinde cihaz ve sarf<br />
malzemelerinin temini yapılacaktır. Sarf malzemelerin bir kısmı ile projede ihtiyaç<br />
duyulan demirbaş malzemeler enstitü imkanları ile temin edilmiştir.<br />
Alımı yapılan cihazlar: 1 Dijital oksijenmetre, 1 adet klas 2 kabin, 1 adet hassas terazi, 1<br />
adet soğutmalı etüv, 1 buzdolabı.<br />
Alınan disk ve kitler: Neomisin, eritromisin, enrofloksasin, amoksisilin, ampisillin,<br />
sulfametoksazol + trimetoprim, oksitetrasiklin, ONPG ve Oksidaz stikleri.<br />
Yapılan ve Yapılması düşünülen ara yayınlar:……<br />
Darboğazlar :……<br />
Projede önerilen değişiklikler :……<br />
Materyal ve Metot :……<br />
Proje Faaliyet takvimi :……<br />
Personel :……<br />
Bütçe :<br />
Proje Harcamaları : Harcama yapılmadı<br />
Bütçe Harcamaları Özeti : 2007 yılı Enstitü bütçesinden sağlanan katkı ile yukarıda<br />
bildirilen malzemelerin alımı yapılmıştır.<br />
315
AB 6. ve 7. ÇERÇEVE PROGRAMI KAPSAMINDA ORTAK OLUNAN PROJELER<br />
Proje adı ve web adresi Proje Ortakları<br />
Network on epizootic disease<br />
diagnosis and control<br />
(Network of Excellence)<br />
Improvement of Foot and Mouth<br />
disease control by ehtically<br />
acceptable methods based on<br />
scientifically validated assays<br />
and new knowledge on FMD<br />
vaccines, including the impact<br />
of vaccination (STREP)<br />
Capacity building for the control<br />
of Avian influenza through<br />
technology transfer and training<br />
(SSA, yeni başladı)<br />
Akdeniz Bölgesi ve Avrupa'da at<br />
vebası, Mavidil ve Reovirusların<br />
İzlenme ağı<br />
Evaluation and improvement of<br />
integrated livestock disease<br />
control measures through<br />
distribution of molecular<br />
diagnostic tools, evaluation of<br />
disease situation, training and<br />
capacity building in Asia (SSA)<br />
Yüksek Patojenik Avıan<br />
Influenza’da Erken Ve Hızlı<br />
Moleküler Teşhis Yöntemleri,<br />
Kontrol Ve Genetik Kuş<br />
Dirençliliği (Taslak proje)<br />
Early And Rapid Moleculer<br />
Diagnostics, Control And Genetic<br />
Bird’s Resistance Of Higly<br />
Pathogenic Avian İnfluenza (HPAI)<br />
Karadeniz Ülkelerin Araştırma<br />
Potansiyeli<br />
Türkiye<br />
(ŞAP Enst),<br />
Hollanda (Koor.),<br />
İtalya, Çin, Almanya,<br />
Belçika, Polonya,<br />
İspanya, Fransa,<br />
İsveç, Danimarka, İng.<br />
(Türkiye)<br />
(ŞAP Enst), İspanya,<br />
Almanya, İtalya,<br />
Danimarka, İsviçre,<br />
Fransa, İngiltere,<br />
Hollanda, Belçika<br />
(Koor.)<br />
Türkiye<br />
(Pendik VKAE),<br />
Irak, İran, İsveç,<br />
İspanya, Romanya,<br />
Turkiye, Ermenistan,<br />
Azerbeycan,<br />
Gürcistan, Suriye,<br />
Etlik VMKAE,<br />
(CIRAD (K)<br />
AFSSA, INMV,<br />
CERVA, IMTA,<br />
MVDRI, DFVF, ULP,<br />
Avia, FLI, IIPD, IZS,<br />
CIDC, FMV, OVI,<br />
UCM, CreSa ,<br />
UIB, IPZ, BVET, IAH<br />
Türkiye<br />
(Pendik VKAE),<br />
Almanya (Koor.)<br />
Irak, Pakistan, Çin,<br />
Portekiz, Hollanda,<br />
İran,<br />
Pendik VKAE<br />
Etlik VMKAE<br />
Projesi, (ICBSS (K),<br />
TUBA, STEPS, AUEB,<br />
Proje<br />
toplam<br />
bütçesi<br />
(€)<br />
Proje<br />
ortağı<br />
kurum<br />
payı (€ )<br />
14.000.000 12.000<br />
Proje<br />
Sorumlusu<br />
Fuat<br />
Özyörük<br />
2.400.000 100.000 Fuat<br />
ÖZYÖRÜK<br />
547.225 16.875<br />
300.000 20.000<br />
229.983 19.000<br />
Dr. Ayşe<br />
Selma<br />
İYİSAN<br />
Dr. Arife<br />
ERTÜRK<br />
Dr.Hatice<br />
ALP<br />
Msc. Esra<br />
SATIR<br />
Dr. Arife<br />
ERTÜRK<br />
316
EPIZONE<br />
Network on epizootic disease diagnosis and control<br />
Action Line: FOOD-2004-T5.4.6.4 Network on epizootic disease diagnosis and control<br />
Coordinator<br />
Contact Person:<br />
Name: BELLINI, Silvia<br />
Organisation:<br />
Instituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e<br />
dell'Emilia Romagna Brescia<br />
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia ed Emilia<br />
Romagna<br />
Via Bianchi 7/9 ITALY<br />
Epizootic diseases in agriculture and aquaculture animals constitute major risks for the<br />
food production. Such diseases spread very fast in high densities of susceptible<br />
animals through animals, vectors or animal products. Outbreaks in Europe showed<br />
enormous social and economic impact, and need to be addressed across the whole<br />
production chain of animal-related food.<br />
The objective of EPIZONE is to improve research on preparedness, prevention,<br />
detection, and control of epizootics by improvement of excellence through<br />
collaboration. EPIZONE will be developed for integration of scientists in health and<br />
production of animals, at the European Level. Benefits of EPIZONE primarily concern<br />
consumers and stakeholders throughout the food supply chain but also the agriculture<br />
administrations and biotechnology companies. EPIZONE includes 14 institutes from 11<br />
countries.<br />
Partners maintain networks worldwide, therewith linked to EPIZONE, and most have<br />
(inter) national ref-lab based tasks for control of epizootics. The management<br />
structure of EPIZONE will generate durable interactions between partners. Initially<br />
+300 key scientists with international reputations, complementary expertises and<br />
skills are identified within the partners. EPIZONE will generate a worldwide network of<br />
institutes contributing to available expertise and spreading of excellence.<br />
EPIZONE includes an SME specialised in dissemination of knowledge via Internet.<br />
Organisational work packages will develop integration activities, including<br />
communications, meetings, and training/continuous professional development.<br />
Scientific work packages will undertake jointly executed research on epizootics<br />
selected on importance in Europe and cover 4 thematic areas: Diagnostics,<br />
Intervention Strategies, Surveillance and Epidemiology, and Risk Assessment. Given<br />
the network structure, the technical resources and the scientific excellence, EPIZONE<br />
will assure strategically driven state-of-art research of world-renown quality.<br />
Project details<br />
Project Reference: 16236 Contract Type: Networks of Excellence<br />
Start Date: 2006-06-01 End Date: 2011-05-31<br />
Duration: 60 months Project Status: Execution<br />
Project Cost: 14 million euro Project Funding: 14 million euro<br />
317
FMD IMPROCON<br />
Improvement of Foot and Mouth disease control by ehtically acceptable<br />
methods based on scientifically validated assays and new knowledge on FMD<br />
vaccines, including the impact of vaccination<br />
Action Line: POLICIES-1.4 New and more environment friendly production methods to<br />
improve animal health<br />
Coordinator<br />
Contact Person:<br />
Name: DE CLERCQ, Kris<br />
Tel: +32-23-790512<br />
Fax: +32-23-790666<br />
Email: Contact<br />
Organisation:<br />
CENTRUM VOOR ONDERZOEK IN<br />
DIERGENEESKUNDE EN AGROCHEMIE<br />
Department of Virology/Section of<br />
Development of Diagnostic Tools for<br />
Epizootic Diseases<br />
Groeselenberg 99<br />
1180 BRUXELLES / BELGIUM<br />
There is a strong desire to reduce reliance on large-scale culling of animals to control<br />
future outbreaks of FMD in Remember States. As an alternative, it is proposed to use<br />
emergency vaccination and then to screen for residual infection using tests for<br />
antibodies to the non-structural proteins of FMD virus. It is intended to amend the<br />
policy on FMD control to enable such an approach to be used in the very near future.<br />
In reality, this means that current contingencies must be based on the use of existing<br />
vaccines. Therefore, this project seeks to address the specific gaps in our knowledge<br />
and technological ability with respect to implementation of a vaccinate-to-live policy.<br />
The availability of adequate discriminatory diagnostic tests is the keystone of the new<br />
EU FMD control policy.<br />
The projects focused on the validation of NSP-based tests to discriminate<br />
unequivocally between infected and vaccinated animals, in order to allow the<br />
implementation of the new policy in the immediate term. Validation of existing and<br />
new NSP tests as confirmatory tests will be a major output of this project. The<br />
experimental design will also provide expected outputs in the field of the impact of<br />
vaccination on the carrier state and on virus dissemination, the onset of vicinal<br />
protection, vaccine potency in relation to emergency use, vaccine strain selection and<br />
new marker vaccines. This project focuses on marker vaccines to induce durable<br />
protection against FMD. Conventional and marker vaccines will be targeted to dendrite<br />
cells with particular attention to promote dendrite cell mussel homing (from parental<br />
immunisation), because mussel immunity can prevent FMD virus establishing local<br />
infection and the carrier status.<br />
Project details<br />
Project Reference: 503603 Contract Type: Specific Targeted<br />
Research Project<br />
Start Date: 2004-01-01 End Date: 2007-12-31<br />
Duration: 48 months Project Status: Execution<br />
Project Cost: 3.42 million euro Project Funding: 2.4 million euro<br />
318
INCOME<br />
Evaluation and improvement of integrated livestock disease control measures<br />
through distribution of molecular diagnostic tools, evaluation of disease<br />
situation, training and capacity building in Asi<br />
Action Line: INCO-A.3 Food security<br />
Coordinator<br />
Contact Person:<br />
Name: AHMED, Jabbar<br />
Tel: +49-04-537188428<br />
Fax: +49-04-537188627<br />
Email: Contact<br />
Organisation:<br />
FORSCHUNGSZENTRUM BORSTEL<br />
Veterinary Infectiology and Immunology<br />
Parkallee 1-40<br />
GERMANY<br />
The livestock sector occupies a significant part of the global economies, particularly in<br />
the developing world. Thus, livestock provides energy, food, raw material and manure<br />
for crops. It is therefore not surprising that the livestock sector, especially the dairy<br />
sector, has emerged as an important economic source for a vast majority of the rural<br />
population. In the last few decades, an enormous progress was achieved towards<br />
trade liberalisation around the world.<br />
However, for the developing countries this liberalisation faced a number of restrictions<br />
in the agricultural sector particularly those concerning dairy products, such as<br />
extensive tariffs and quotas related to dairy trade. In addition, health risks arising<br />
from additives, contaminants, toxins and pathogens contained in food products<br />
constitute another trade restriction. Infectious diseases cause losses in livestock and<br />
their products with socio-economic consequences. The anticipated project will address<br />
the following disease clusters:<br />
1. High epizootic viral diseases such as Rinderpest/PPR.<br />
2. EnzootJc/climate related diseases with a highly significant impact on animal<br />
production and farmer incomes such as ticks and tick borne diseases.<br />
The project will focus particularly on those diseases having a severe transboundary<br />
character which have been characterized by the FAO as having "a significant<br />
economic, trade and/or food security importance for a considerable number of<br />
countries, which can easily spread to other countries and reach epidemic dimension.<br />
Strategic objectives:<br />
1. To establish a platform to evaluate actual and develop improved integrated control<br />
measures for livestock disease in Asia<br />
2. To improve transparency in disease reporting at national, regional and<br />
international levels<br />
3. To distribute and harmonize diagnostic tools required for pathogen detection and<br />
differentiation<br />
4. To build the capacity to ensure the conduction of integrated disease control.<br />
Project details<br />
Project Reference: 515915 Contract Type: Specific Support<br />
Action<br />
Start Date: 2005-07-01 End Date: 2008-06-30<br />
Duration: 36 months Project Status: Execution<br />
Project Cost: 229.983.00 euro Project Funding: 229.983.00 euro<br />
319
Akdeniz Bölgesi ve Avrupa’da Reo virus, Mavidil ve Afrika At Vebasının<br />
İzlenme Ağı Projesi<br />
Bu proje ile; Mavidil, Afrika At Vebası ve Epizootic Haemorhagic Hastalığının<br />
kontrolü ile ilgili bilgileri geliştirme çalışmalarının koordine edilerek<br />
ilerletilmesi, clucoides kaynaklı bu üç hastalığa yönelik surveilans (izleme)<br />
sisteminin güçlendirilmesi, konu ile ilgili <strong>araştırmaları</strong>n koordinasyonun<br />
sağlanması, Akdeniz bölgesinde hastalığın izlenmesini ve risk analizinin<br />
yapılması, teknik konularda ve yapılan çalışmalarla ilgili bilgi değişiminin<br />
gerçekleştirilmesi hedeflenmektedir.<br />
Proje Süresi: 3 Yıl (2007 Şubat ayında başlangıç <strong>toplantısı</strong> yapıldı)<br />
Katılımcılar: Fransa (CIRAD, AFSSA), İtalya (IZSAM), İngiltere (U Liv, IAH),<br />
İsviçre (SFVO), Cezayir, Tunus, Fas, Türkiye (Etlik VMKAE), Bulgaristan,<br />
İspanya, Yunanistan, Portekiz, Güney Afrika, Almanya, Belçika, Hollanda,<br />
Danimarka<br />
Çalışma Paketleri:<br />
1- Virus aktivitesinin izlenmesi,<br />
Laboratuvarlarda kullanılan testlere ilişkin bilgiler toplanacak, SOP’lar ve<br />
validasyon verileri analiz edilecek, sensivite ve spesifiteleri hesaplanacaktır.<br />
Daha sonra mevcut epidemiyolojik bilgiler vaka ve mihrak tanımı, sentinel<br />
sistemin dizaynı ve surveillance sistemi gibi konular üzerinde çalışılacaktır.<br />
Aşılama stratejileri tartışılacak ve tespit edilemeyen enfeksiyonların tespitine<br />
yönelik bir coğrafik proje hazırlanacaktır.<br />
2-Vektörlerin İzlenmesi<br />
3-Moleküler Epidemiyoloji<br />
4-Database, Web design & GIS<br />
5-Risk assesment<br />
Mevcut enfekte alanlardan yayılma yolları konusunda risk temelli bir çalışma<br />
yapılacaktır.<br />
Belirlenmiş bölgelerin enfeksiyon olasılığının değerlendirilmesinde kullanılacak<br />
modeller üzerine bir yeniden bir çalışma yapılacaktır.<br />
Yukarıdaki çalışma-model, seçilen yerlerde uygulanacaktır.<br />
Bu proje kapsamındaki hastalıkların epidemiyolojik çalışmaları için temel<br />
olacak risk temelli izleme modelleri geliştirilecektir.<br />
6-Yönetim<br />
Not: Türkiye 1 ve 5 no’lu Çalışma Paketlerinde görev yapacaktır.<br />
320
Capacity building for the control of Avian influenza through technology<br />
transfer and training<br />
(Start date of contract: 01.02.2007)<br />
Germany (Koordinatör), Sweden, Spain, Romania, Türkiye (Pendik VKAE),<br />
Armenia, Azerbaijan, Georgia, Iran, Iraq, Syria, Jordan, Greece, Bulgaria,<br />
Austria<br />
Project Summary<br />
Avian Influenza (AI) or "Bird Flu" is a highly contagious viral infection which<br />
can affect all species of birds and can manifest itself in different ways<br />
depending mainly on the pathogenicity of the virus involved and on the<br />
species affected. The highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) causes serious<br />
disease with high mortality (up to 100%) – notifiable to the OIE. More<br />
interesting HPAI is shown to infect and cause death in human. Until now, a<br />
total of 103 deaths have been recorded due HPAI infection in a number of<br />
countries like Vietnam, Turkey and Iraq (WHO, 21.3.2006).<br />
Beside the fact that a number of countries were surprised by the outbreaks, an<br />
even greater number of developing countries are missing the adequate tools<br />
to detect and differentiate the HPAI and are lacking experience to manage the<br />
outbreak of the disease. Thus there is an urgent need for technology transfer<br />
and training. To fulfill these gaps, the partners of this consortium will:<br />
� organize technical workshops to facilitate the technology transfer<br />
particularly in the field molecular diagnostic tools for pathogen detection and<br />
differentiation, to reinforce epidemiological analysis for monitoring and<br />
modeling of Avian influenza especially and to respond to outbreaks with<br />
infectious diseases of livestock in general.<br />
� provide training through organization of seminars and short term courses<br />
in well qualified laboratories of a number of member states of European Union.<br />
� organize technical workshops, courses and training in the INCO target<br />
countries to improve the technical experimental level of the staff and<br />
laboratories in charge of livestock infectious diseases.<br />
Project objective and state of art<br />
The overall aim of this proposal is to facilitate the technology transfer and<br />
training to promote capacity building in target INCO countries (see Fig. 1,<br />
page 10) with a particular emphasis to those countries which border the EU<br />
for a better control of Avian influenza and in general outbreaks of infectious<br />
diseases in livestock through the organization of technical workshops and<br />
training courses in the following fields:<br />
� Molecular diagnostic tools for pathogen detection and differentiation<br />
� Standarization and validation of diagnostic tools according to OIE<br />
instruction<br />
� Epidemiological tools for monitoring and modeling Avian influenza<br />
outbreaks<br />
� Management of disease outbreaks<br />
321
PROJE DARBOĞAZLARI:<br />
Proje içerisinde düzenlenen workshoplar ve eğitim çalışmaları zaman<br />
zaman üye ülkelerde gerçekleştirilmektedir. Tüm masrafları projeden<br />
karşılanan ve eğitim alması uygun görülen kişilerin yurtdışı izinleri ise TAGEM<br />
tarafından organize edilmektedir.<br />
Zaman zaman bazı wokshopların duyuruları, düzenleme tarihine yakın<br />
zamanlarda bildirilmektedir. Buda yurtdışı izinlerinin alınması konusunda sıkıntı<br />
yaratmaktadır. Yakın tarihli Yurtdışı izin müracattları, gününde veya geriye<br />
dönük uygulama olmayacağı gerekçesi ile bakanlığımız tarafından geri<br />
çevrilmektedir. Bu durum proje sorumlu kişisinin üzerinde büyük bir strese<br />
sebeb olmaktadır.<br />
Proje koordinatörüne planlanan workshopların kesin tarihlerinin toplantı<br />
öncesi en az 2-3 hafata önceden haber verilmesi gerektiği ve bakanlık<br />
sistemimiz izah edilmesine rağmen, bazen elde olmayan sebebler ile<br />
(workshop uygulanan ülkenin kendi kuralları veya imkansızlıklar veya<br />
bürokrasisi vb. yüzünden) toplantı yakın tarihte haber verilebiliyor. Senelik<br />
izinlerinden alarak yurtdışına gitmek zorunda bırakılan kişilerin maduriyetlerini<br />
gidermek amacıyla, Avrupa Birliği projelerinde; bu konuda bakanlığımız ve<br />
Genel Müdürlüğümüzün yardımları gerekmektedir.<br />
Yüksek Patojenik Avian Influenza’da Erken Ve Hızlı Moleküler Teşhis<br />
Yöntemleri, Kontrol Ve Genetik Kuş Dirençliliği<br />
EARLY AND RAPID MOLECULER DIAGNOSTICS, CONTROL AND GENETIC<br />
BIRD’S RESISTANCE OF HIGLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA (HPAI)<br />
(Uluslararası Atom Enerjisi Ajansı -UAEA)<br />
Projeyi Hazırlayan Ülke:Bulgaristan<br />
Proje başlangıç tarihi: 01.01.2009<br />
Proje bitiş tarihi: 2011<br />
PROJE ÖZETİ:<br />
Bu önerinin kapsamlı amacı; kuş gribini saptamak için erken ve hızlı<br />
moleküler teşhis yöntemleri geliştirmek , kuş gribi virusunu incelemek ve<br />
Avrupa ve Asyadaki UAEA üyesi ülkelerde 15 veya daha fazla türdeki yabani<br />
göçmen ve su kuşlarında H5N1 virusuna karşı dirençliliği araştırmaktır. Proje<br />
kapsamında göç mevsiminde yaban kuşlardan alınan tracheal ve cloacal swab<br />
örnekleri real time PCR ile test edilerek, virus izolasyonuna gidilecektir ve bu<br />
yöntemle yabani kuşlardaki olabilecek H5N1 ve diğer influenza infeksiyonlarıda<br />
izlenebilecektir. Bu projeyle olası pandemilere karşı bölgelerin hazırlanmasına<br />
yardımcı olunacak bölgeler arasında bilgi paylaşımı ve bölgesel haberleşme ağı<br />
daha da güçlenecektir.<br />
Msc. Esra SATIR<br />
Proje Sorumlusu<br />
Karadeniz Ülkelerinin Araştırma Potansiyeli<br />
322
Projenin Amacı:<br />
Bu projeye katılan ülkelerin bilim ve teknoloji potansiyelini belirlemek amacıyla<br />
oluşturulmuştur.<br />
Proje Süresi: 2 yıl (2004-2006)<br />
Katılımcılar:<br />
Karadeniz Ekonomik İşbirliği Teşkilatı üyesi 12 ülke, Arnavutluk, Ermenistan,<br />
Azerbaycan, Bulgaristan, Gürcistan, Yunanistan, Moldova, Romanya, Rusya<br />
Federasyonu, Sırbistan-Karadağ, Türkiye (Etlik VMKAE), Ukrayna katılmıştır.<br />
Söz konusu projenin koordinatör kuruluşu KEİ bünyesinde Atina'da kurulmuş<br />
olan Uluslararası Karadeniz Etütleri Merkezi'dir (ICBSS - International Center<br />
for Black Sea Studies). Türkiye'den Türkiye Bilimler Akademisi (TÜBA),<br />
Ukrayna'dan STEPS Centre (Ukrayna Bilimler Akademisi'ne bağlı Bilimsel ve<br />
Teknolojik Potansiyel ve Bilim Tarihi Çalışmaları Merkezi: Centre for Scientific<br />
and Technological Potential and Science History Studies) ve Avusturya'dan<br />
Joanneum Research Forschungsgesellschaft (JR) proje ortağı kuruluşlardır.<br />
Proje Faaliyetleri: Proje çerçevesinde 12 KEİ üyesi ülkenin bilim ve teknoloji<br />
düzeyini belirlemek amacıyla bu ülkelerdeki temas kuruluşları tarafından 2004 yılı<br />
içinde taslak ülke raporları hazırlanmıştır. Hazırlanan raporda kurumumuzda yer<br />
almaktadır.<br />
323
Gökkuşağı alabalıklarında (Onchorhyncus mykiss) önemli kayıplara neden olan<br />
Lactococcus garvıeae ve Yersinia ruckeri infeksiyonlarına karşı Bivalant aşı<br />
hazırlanması<br />
Dr. Ayşe ATEŞOĞLU, Dr. Sibel ÇOLAK<br />
TUBİTAK PROJE NO: 1070146<br />
Proje Başlama Tarihi: 1 Temmuz 2007<br />
Yersiniozis, kültürü yapılan Gökkuşağı alabalıklarında gözlenen septisemik seyirli<br />
sistemik bir bakteriyel infeksiyondur. Hastalığa en duyarlı türler, gökkuşağı<br />
alabalıklarıdır. Mortalite, tedavi edilmeyen sürülerde % 25-75 arasında seyreder. Hastalığı<br />
geçiren balıklar portör kalırlar. İnfeksiyondan sonra 30-60 günlerde iç organlardan izole<br />
edilebilen etken infeksiyondan sonraki 60-65 günlerde balıkların % 50-75'inin ince<br />
bağırsaklarında lokalize olur. İnfeksiyon sonrası yaklaşık 100 gün kadar 30-40 günlük<br />
periyotlar halinde bağırsaktan saçılır. Bu nedenle alabalık yetiştiricilerinin başlıca<br />
problemi olan infeksiyon Türkiye’de de oldukça yaygındır.<br />
Lactococcus garvieae’nin neden olduğu hemorajik septisemi de kültür<br />
balıkçılığında önemli ekonomik kayıplara neden olan bir diğer önemli infeksiyondur. Aynı<br />
zamanda zoonotik bir patojen olup insan ve sığırlardan da izole edilmiştir. Japonya,<br />
Avustralya, İsrail, ispanya, İtalya ve Fransa’da gökkuşağı alabalıklarında %50’lere varan<br />
oranlarda kayıplara neden olmuştur. İnfeksiyon, Türkiye’de de 2002 yılından beri<br />
görülmekte ve önemli kayıplara neden olmaktadır.<br />
Yetiştiriciliği yapılan diğer <strong>hayvan</strong> türlerinden farklı olarak, balıklarda infeksiyöz<br />
hastalıkların tedavisinde antibiyotik kullanmanın bazı zorlukları vardır. Parenteral yol ile<br />
antibiyotik kullanımı, injeksiyon yapılacak tedavi edilecek balık sayısının fazla olması<br />
nedeni ile uygulaması oldukça zor bir maniplasyondur ve aynı zamanda balıklar için stres<br />
kaynağıdır. Oral yol ile antibiyotik uygulaması kolay ve daha az strese neden olmasına<br />
rağmen, hemen bütün infeksiyöz hastalıklarda gelişen iştahsızlık yeterli tedavi<br />
konsantrasyonuna ulaşılmasını engellemektedir. Diğer taraftan antibiyotiklerle hastalıların<br />
tedavisi pahalı ve maliyet artıran bir faktördür.<br />
Avrupa’da bir çok ülkede Yersiniozis ve Lactococcosis’e karşı hazırlanmış ticari<br />
aşılar mevcuttur. Türkiye‘de ise bu aşılar ile ilgili çalışmalar ancak araştırma düzeyindedir<br />
ve henüz her iki aşının da üretimi yoktur, Türkiye‘ye Avrupa’da üretilen aşılar ithal<br />
edilmektedir.<br />
İnfeksiyöz hastalıklar ile mücadelede en etkili yöntem olmasına rağmen aşı<br />
uygulaması balıklar için oldukça stresli bir işlemdir. Diğer taraftan pahalı ve işgücü<br />
gerektiren bir işlemdir. Aşılamadan kaynaklanan stres faktörünü minimuma indirmek ve<br />
işletme maliyetini düşürmek için polivalan aşılar geliştirilmektedir. Bu çalışmada da<br />
Türkiye’de izole edilen suşlardan hazırlanacak olan inaktif Y. ruckeri ve L. garvieae<br />
aşılarının kombine edilmesi hedeflenmiştir.<br />
Çalışmada öncelikle her iki bakteriden hazırlanacak olan antijenlerin immunojeniteleri<br />
tavşanlarda ve balıklarda saptanacak ve olumlu sonuç alınmasından sonra bu antijenlerin<br />
tek bir aşıda kombinasyonu denenerek bivalent bir aşı geliştirilmeye çalışılacaktır.<br />
324
Brucella canis’in serolojik tanısında kullanılan çabuk lam aglütinasyon test (LAT)<br />
antijeninin fermentörde farklı besiyerlerinde karşılaştırmalı olarak üretimi.<br />
Dr. Sevil Erdenliğ Cener, E. Ayhan Baklan, H. Yavuz Aksoy,<br />
Dr. Muhammet Aksın<br />
TUBİTAK PROJE NO: 1070755<br />
Proje Başlama Tarihi: 1 şubat 2008<br />
Brucella canis tarafından oluşturulan Köpek brusellozu ilk olarak 1966 yılında<br />
Carmicheal tarafından Amerika Birleşik Devletleri’nde bildirilmiştir. Hastalığın<br />
tanımlanmasından sonraki birkaç yıl içinde, Japonyadan Güney Amerika’ya kadar<br />
dünyanın bir çok ülkesinde görülmüş olan hastalık, karnivorların önemli bir abort ve<br />
infertilite nedenidir. Ülkemizde infeksiyon birkaç araştırıcı tarafından serolojik olarak<br />
bildirilmiştir. Yapılan çalışmalarda üç büyük ilimizde % 7 ile % 10 arasında değişen bir<br />
seroprevalans oranı bildirilmektedir. Ancak yapılan çalışmalar son derece az olup<br />
hastalığın ülkemizdeki mevcut durumu hakkında yeterli bilgi bulunmamaktadır.<br />
Hastalığın zoonoz bir karakter göstermektedir. Hastalığın daha ziyade laboratuar<br />
personeli ve <strong>hayvan</strong>lar ile yakın teması olan insanlarda görüldüğü bildirilmektedir.<br />
İnsanlarda infeksiyonun bildirilen vakalardan daha fazla olduğu sanılmaktadır. Bunun en<br />
önemli nedeninin insanlar için B. canis infeksiyonunu serolojik olarak saptayacak yeterli<br />
testlerin olmamasına bağlı olduğu bildirilmektedir. Şu anki bilgimize göre, B.canisin<br />
insanlarda varlığını serolojik olarak gösteren sadece bir çalışma mevcuttur. Bütün bu<br />
faktörler hastalığın köpeklerde ve insanlarda teşhisinin önemini ortaya koymaktadır.<br />
Projenin temel amacı B.canis infeksiyonunun teşhisi için hızlı, ekonomik , kolay<br />
yorumlanabilir ve veteriner kliniklerinde dahi kolayca uygulanabilecek ve son derece<br />
duyarlı bir tarama testi olan çabuk lam aglütinasyon test (LAT) antijeninin üretilmesidir.<br />
Bu antijen henüz ülkemizde ticari olarak üretilmemektedir. Ancak homolog suş ile tanısal<br />
antijen üretimi son derece dikkat gerektirmekte ve bir takım zorlukları bulunmaktadır.<br />
Bunun nedenleri B.canis M+ suşların kolonilerinin daima mukoid olmasıı ve asit pH<br />
değerinde otoaglütinasyon göstermesi ve sıvı kültürlerde yapışkan bir tortu oluşturmasıdır.<br />
Bu zorluklardan dolayı ticari kitlerde B.ovis suşu tercih edilmektedir. Ancak homolog suş<br />
kullanımı antijen üretiminde tercih edilen bir özellik olacağından projede antijen<br />
üretiminde homolog suşlar olarak B. canis RM/66 tip suşu ve laboratuarımızda 10-PBC-<br />
87 kod numaralı bir B. canis suşu antijen üretiminde kullanılmaya çalışılacaktır. B.canis<br />
diğer R brucella suşları ile ciddi bir çapraz reaksiyon gösterdiğinden çalışmada ayrıca<br />
heterolog Rough suşlar olan B. abortus 45/20 ve B.melitensis B115 suşları kullanılacaktır.<br />
Bu suşların LAT antijen üretimindeki potansiyel kullanımı değerlendirilecektir.<br />
Bu amaçla çalışmada kulanılacak tüm suşlar, tripton sıvı besi yeri, Brucella broth<br />
ve brain heart infüzyon broth olmak üzere 3 ayrı besi yerinde optimal üremeyi<br />
<strong>değerlendirme</strong>k üzere karşılaştırmalı olarak üretileceklerdir. Kültürlerin üretilmesi,<br />
sıcaklık, pH, hava ve çalkalama oranları, çözünmüş oksijen gibi ayarlanmış değerlerin<br />
kontrollü olarak izlenebileceği ve geriye yönelik tüm verilerin kaydedilmesine izin verecek<br />
dijital kontrol ünitesi olan bir fermentörde gerçekleştirilecektir. Fermentörden toplanan<br />
kültürlerden bazı modifikasyonlar ile birlikte standart yöntemlere göre LAT antijen<br />
üretimi yapılacaktır.<br />
325
Koyunlarda rekombinant kist hidatik ve standart bivalan enterotoksemi aşısının<br />
kombine halde kullanım olanaklarının araştırılması<br />
Dr. Taraneh Öncel, Doç. Dr. Gülay Vural, Dr. Rüçhan Alp,<br />
Dr. Alper Yalçın, Dr. Muhammet Aksın, Prof. Dr. Marshall W. Lightowlers<br />
TUBİTAK PROJE NO: 107O169<br />
Proje Başlama Tarihi: 1 Temmuz 2007<br />
Echinococcus granulosus çiftlik <strong>hayvan</strong>larında ve insanlarda kist hidatiğe neden<br />
olan parazitik bir helminttir. E. granulosus yaşam döngüsünde iki konak kullanmaktadır.<br />
Olgun formu köpeklerin ve diğer kanidelerin ince bağırsaklarında, larval formu<br />
(metasestod) herbivor ve omnivorların başta akciğer ve karaciğer olmak üzere çok sayıda<br />
organ ve dokularında gelişmektedir. E. granulosus’un patojenik formu kist hidatik olarak<br />
adlandırılmaktadır ve bu nedenden dolayı hastalık hydatidosis olarak da bilinmektedir.<br />
Hastalığın köpeklere naklinde çiftlik <strong>hayvan</strong>ları önemli rol oynamaktadır. Kist hidatik<br />
dünyanın birçok ülkesinde ve Türkiye’de insanlarda hastalığa ve ölüme neden olmaktadır.<br />
Oluşturulan kontrol <strong>program</strong>ları, parazitin yaşam döngüsünü herhangi bir yerde kırmaya<br />
yöneliktir. Bu daha ziyade son konak köpeklerin tedavisine dayanmaktadır. Hastalığın<br />
önlenmesi amacıyla arakonaklarda aşı kullanımı kontrol <strong>program</strong>larında başka bir<br />
yaklaşım olarak düşünülmektedir. Bu noktada rekombinant DNA teknolojisi konağı<br />
koruyan antijenleri içeren aşı hazırlanması ve üretilmesinde yardımcı olmaktadır.<br />
Saflaştırılmış protein içeren tek bir doz aşı bir yılı aşan bir bağışıklık oluşturmaktadır.<br />
Dolayısıyla aşılama ile koyunlarda E. granulosus yaşam halkası kırılmakta, bu <strong>hayvan</strong>larda<br />
E. granulosus kaynaklı kist oranı düşmekte, bu durum insan vakalarına azalma olarak<br />
yansılmaktadır.<br />
Klostridial bir aşı olan enterotoksemi aşısı koyunları enterotoksemi hastalığından<br />
korumakta, büyük bir ekonomik kaybı önlemektedir. Aşı Pendik Veteriner Kontrol ve<br />
Araştırma Enstitüsü, Anaerob Aşılar Üretim laboratuarında rutin olarak üretilmektedir.<br />
Enterotoksemi aşısının uygulama yolu, tekrarlama zamanları kist hidatik aşısı ile bire bir<br />
örtüşmektedir. Bu nedenle bu iki aşıyı kombine halde kullanmak bir hayli mantıklı ve<br />
yararlı görünmektedir. Ayrıca standart enterotoksemi aşısına kist hidatik aşısını eklemekle<br />
ciddi maliyet artışı olmayacaktır. Enterotoksemi aşısı ile kuzularda aşılama yapılacağı<br />
zaman, kombine aşıyı kullanarak aynı zamanda <strong>hayvan</strong>lar kist hidatiğe karşı da korumuş<br />
olacaktır.<br />
Bu çalışmada E. granulosus rekombinant proteinleri bakteri kültüründe üretilerek aşı<br />
hazırlanacak ve enterotoksemi aşısı ile birlikte koyunlarda denenecektir. Oluşan bağışıklık<br />
düzenli aralıklarla alınan serumlarda spesifik antikorların ELISA ile taranması ile<br />
saptanacaktır. Deneme grupları arasındaki sonuçlar Mann Whitney U test ile istatistikel<br />
olarak analiz edilecektir.<br />
326
Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae’nin neden olduğu bulaşıcı keçi ciğer<br />
ağrısı hastalığına (contagious caprine pleuropneumonia) karşı inaktif aşı<br />
geliştirilmesi.<br />
Dr. Ümit ÖZDEMİR, M.Ali TÜRKYILMAZ, Dr. Muhammet AKSIN<br />
TUBİTAK PROJE NO: 1070759;<br />
Proje Başlama Tarihi: 1 şubat 2008<br />
Bulaşıcı keçi ciğer ağrısı hastalığı (contagious caprine pleuropneumonia (CCPP)), Mycoplasma<br />
capricolum subsp. capripneumoniae’nin (M.c.capripneumoniae) neden olduğu, Office International des<br />
Epizooties (OIE) tarafından B listesi hastalıkları arasında sınıflandırılan ve gösterdiği yüksek mortalite ve<br />
morbidite nedeni ile keçi yetiştiriciliğinde çok ciddi ekonomik kayıplar oluşturan önemli infeksiyöz<br />
hastalıklardan biridir. M.c.capripneumoniae’nın in vitro koşullarda çok zor üreyen bir mycoplasma türü<br />
olması ve Mycoplasma mycoides subsp. capri’nin benzer semptomlar gösteren <strong>hayvan</strong>lardan kolayca izole<br />
edilebilmesi nedeni ile hastalığın gerçek etkeninin belirlenmesi ancak 1976 yılında MacOwen ve Minette<br />
tarafından gerçekleşmiştir. Ülkemizde hastalığın varlığı, ilk olarak 1988 yılında Türkiye’den Umman’a ihraç<br />
edilen keçilerde M.c.capripneumoniae’nin izole edilmesi ile ortaya konmuştur. Daha sonra yapılan çeşitli<br />
çalışmalarla, ülkemizde keçi yetiştiriciliği yapılan bölgelerde hastalığın varlığı ve yaygınlığı hastalık<br />
etkeninin izolasyonu ile ve çeşitli serolojik testlerle belirlenmiş, Ülkemizde infeksiyona neden olan suşun 16<br />
S rRNA genlerinin dizi analizi ile IIB2 alt grubunda bulunduğu tespit edilmiştir.<br />
Hastalık fibrinöz pleuropneumonia, tek taraflı akciğer patolojisi ve göğüs boşluğunda çok miktarda<br />
pleural sıvı birikmesi ile karakterizedir. Hastalığın çok bulaşıcı olması, yüksek mortalite ve morbidite<br />
göstermesi nedeni ile keçi yetiştiriciliği yapılan bölgelerde ciddi ekonomik kayıplar oluşturması yönüyle<br />
büyük risk oluşturur.<br />
Hasta <strong>hayvan</strong>lara erken dönemlerde antibiyotik uygulamaları hastalık semptomlarının giderilmesinde<br />
etkili olabilmekle birlikte, çoğunlukla bakteriyolojik olarak steriliteyi sağlayamamaktadır. Bulaşıcı keçi ciğer<br />
ağrısı hastalığında, salgın çıkan sürülerde antibiyotik tedavisi sonucu veya kendiliğinden iyileşen <strong>hayvan</strong>lar<br />
taşıyıcı olarak kalma eğilimindedir. Bu taşıyıcıların yanı sıra, belirgin hastalık semptomu göstermeyen kronik<br />
hastalar, etkenin sürü içinde devamlı bulunmasına ve gerek aynı sürüde ilerleyen zamanlarda hastalığın<br />
çıkışına gerekse sulama ve otlama alanlarında bir araya geldikleri diğer sürülere hastalığın bulaşmasına yol<br />
açmaktadır.<br />
Hastalığın kontrolünde en etkili yol aşılamadır. M.c.capripneumoniae’nın yurdumuzda varlığının çeşitli<br />
yayınlarla ortaya konması sonucu bu türe karşı bir aşının ülkemizde üretilmesi zorunluluğu doğmuştur.<br />
Üretilmesi planlanan saponinli inaktif aşı, kontakt yolla infeksiyona karşı en az 1 yıl süren %100 bağışıklık<br />
sağlamakta ve hastalığın bulunduğu ülkeler için de çok büyük önem taşımaktadır.<br />
Bu çalışmada keçi ciğer ağrısı hastalığı (CCPP)’na karşı etkin saponinli inaktif aşı geliştirilerek, bu<br />
hastalığın ülkemiz keçilerinde kontrol altına alınması ile keçi yetiştiriciliğinin yoğun olduğu bölgelerde bu<br />
hastalıktan ileri gelen ekonomik kayıpların önüne geçilmesi amaçlanmaktadır.<br />
Aşı üretiminin ülkemizde izole edilen ve IIB2 alt grubunda bulunduğu tespit edilen suş ile yapılması<br />
planlanmaktadır. Öncelikle suşun 15 pasajı yapılarak saflaştırılacaktır. Tekrar identifiye edilen suş ile ana<br />
tohum suşu hazırlanacak ve kontrolleri yapılacaktır. Hazırlanan suş ile aşı antijeni üretilecek ve antijen 12600<br />
g de PBS ile 3 kez yıkanarak toplanacaktır. Protein miktar tayini için örnek alınacak ve farklı miktarda<br />
protein içeren 4 ayrı aşı antijeni hazırlanacaktır. Daha sonra bu antijenlerin saponinle inaktivasyon süresi<br />
belirlenecektir. Aşının sterilite ve zararsızlık testleri yapıldıktan sonra 15 keçiden oluşan 4 grup hazırlanan<br />
aşılarla immunize edilecektir. Kontrol grubuna PBS ve saponin enjekte edilecektir. Aşılamadan sonra 14., 21.<br />
ve 28.günlerde kan alınarak cELISA ve KFT ile aşı antikorları yönünden test edilecektir. İmmunizasyondan 1<br />
ay sonra her gruptan 5 keçi kontakt yolla I.eprüvasyona tabi tutulacak, II.eprüvasyon aşılamadan 6 sonra<br />
yapılacak ve her iki eprüvasyondan sonrası <strong>hayvan</strong>lar 2 ay süre ile klinik, serolojik, bakteriyolojik yönden<br />
izlenecek ve koruma sağlayan en az protein miktarı belirlenecektir.<br />
Eprüvasyon ile serolojik testlerin paralel yürütülmesi sonucu, dört farklı antijen miktarıyla<br />
hazırlanan aşı ile aşılama sonrası elde edilen farklı titre değerleri ile eprüvasyon sonuçları karşılaştırılarak<br />
hastalığa karşı koruyan en az titre değeri tespit edilecektir. Elde edilen bu veriler aşı ticari olarak piyasaya<br />
sürüldükten sonra her seride eprüvasyon yapmadan serolojik titre değerlerinin belirlenmesi ile bağışıklık<br />
kontrolüne olanak verecektir.<br />
327
Türkiye’de koyunlarda cytochrom c oxidase subunit 1 gen analizi İle Echinococcus<br />
granulosus genotipinin belirlenmesi.<br />
Dr. Özlem BAGCI, Doç. Dr. Gülay VURAL,<br />
Dr. Aysel BACA ÜNSAL, Charles GAUCI<br />
TÜBİTAK 104V132<br />
Echinococcus granulosus yaşam döngüsünde iki konak kullanan bir sestodtur.<br />
Olgun formu köpeklerin ve diğer kanidelerin ince bağırsaklarında, larval formu<br />
(metasestod) herbivor ve omnivorların başta akciğer ve karaciğer olmak üzere çok sayıda<br />
organ ve dokularında gelişmektedir. E. granulosus’ un patojenik formu kist hidatik olarak<br />
adlandırılmaktadır ve bu nedenden dolayı hastalık hydatidosis olarak ta bilinmektedir. Bu<br />
form dünyanın bir çok ülkesi ve bölgesinde ciddi halk <strong>sağlığı</strong> problemidir ve kontrolü hala<br />
güç, masraflı ve az etkilidir. Kontrol <strong>program</strong>ları eğitim yolu ile halkı bilgilendirmek ve<br />
son konak köpeklerin tedavisine dayanmaktadır. Güçlü kontrol <strong>program</strong>larına rağmen bir<br />
çok ülkede hastalık ciddi zoonoz olarak etkisini sürdürmektedir. Hastalığı önlemek<br />
amacıyla arakonaklarda kullanmak üzere bir aşı geliştirilmesi kontrol <strong>program</strong>larında<br />
başka bir yaklaşım olarak düşünülmektedir. Bu noktada rekombinant DNA teknolojisi<br />
konağı koruyan antijenleri içeren aşı hazırlanması ve üretilmesinde yardımcı olmaktadır.<br />
Echinococcus granulosus’un dokuz genotipi (G1-G9) bulunmaktadır. Bu genotipler<br />
farklı <strong>hayvan</strong> türü veya türlerini enfekte etmektedirler. Rekombinant EG95 aşısının<br />
geliştirildiği genotip G1 dir.<br />
Bu çalışmada Türkiye’nin farklı bölgelerinden İstanbul İSMER mezbahasına kesim<br />
için getirilen koyunlarda hangi genotiplerin bulunduğu araştırılmıştır. Bunun için toplanan<br />
örneklerin gDNA’sından cytochrom c oxidase geninin dizi analizi yapılmıştır. Öncelikle<br />
toplanan örneklerden gDNA izole edilmiş, bunun üzerinden ilgili gen bölgesi belirlenerek<br />
çoğaltılmıştır. Daha sonra dizi analizi yapılarak baz sıraları belirlenmiş ve gen<br />
bankasındaki değişik Echinococcus granulosus genotiplerine ait baz sıraları ile<br />
karşılaştırılmıştır. İşlenen 100 koyun örneğinden 98’i G1 (yaygın koyun alt türü); 2’ si G3<br />
(manda alt türü) yapısında; 12 sığır örneğinden 9’u G1, 3’ü G3 yapısında bulunmuştur.<br />
Alt tür farklılıklarının, ekinokokkosisin epidemiyolojinde, aşı hazırlanması ve buna<br />
bağlı kontrol stratejilerinin oluşturulmasında önemli rol oynayabileceği düşünülmektedir.<br />
Bu çalışmada Türkiyede ağırlıklı olarak G1 ‘in hüküm sürdüğü bu nedenle ileride<br />
hazırlanacak aşıların G1 kökenli olması yararlı görülmüştür.<br />
328
Koyun ve Keçi Vebası (Peste Des Pestits Ruminants = PPR) Hastalığına Karşı Yerel<br />
Aşı Suşu Geliştirilmesi<br />
Dr. Veli GÜLYAZ, Dr. Aysel Ünsal BACA,<br />
Dr. Selma ÖZDEMİR, Doç. Dr. Mustafa HASÖKSÜZ<br />
TUBİTAK PROJE NO: 1050411<br />
Proje Başlama Tarihi: 01.05.2006- 01.07.2009<br />
PPR virusunun 85. 93.,94. ve 95. pasajları inokule edilen koyunlarda vücut ısılarında<br />
artış oluşmadığı, yüksek titrede antikor oluşturduğu, klinik olarak PPR hastalığının<br />
meydana gelmediği, iç organlarda PPR hastalığına özgü lezyonların oluşmadığı<br />
saptanmıştır. PPR virusu verilen koyunlardan kontak temasta bırakılan kontrol koyunlara<br />
PPR virusunun geçmediği saptanmıştır. Elde edilen bu verilerden, virusun attenüe olduğu<br />
ve virus verilen <strong>hayvan</strong>lardan virus saçımı oluşmadığı saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar<br />
ışığında 93. pasaj seviyesindeki virusun master seed virusu, 94. pasaj seviyesindeki<br />
virusun working seed virusu ve 95 pasaj seviyesindeki virusun aşı virusu olarak<br />
seçilmesine karar verilmiştir. Ayrıca proje kapsamında olmamasına rağmen bazı ek<br />
çalışmaların yapılmasına ihtiyaç duyulmuştur. Bu amaçla 20 adet 3 aylık gebe koyuna PPR<br />
(P)V93 virusundan DKID50 10 3 /ml titrede ( OIE standartlarında verilmesi gereken PPR aşı<br />
virusu dozu) deri altı yolla verilmiştir. 30 günlük gözlemler sonucu koyunlarda vucut<br />
ısılarının artmadığı ve gebe koyunlarda yavru atma olayı olmadığı dolayısıyla aşı<br />
virusunun gebe koyunlar için zararsız olduğu saptanmıştır.<br />
Bir Sonraki Dönemde Yapılması Planlanan Çalışmalar : Master seed virusu olarak<br />
seçilen 93. pasaj seviyesindeki PPR (P)V93 virusunun koyunlarda doz tayini ve Zarasızlık<br />
testleri yapılacaktır. Ayrıca projede yer almamasına karşılık aşağıda yer alan çalışmalar ek<br />
olarak yapılacaktır.<br />
A- PPR (P)V93 virusunun 5 ‘er ml lik aşı şişelerinde aşı olarak liyofilizasyonu yapılacak<br />
ve liyofilize edilen aşının raf ömrü saptanacaktır.<br />
B- PPR (P)V93 virusu ile aşılanan 20 adet gebe koyundan doğan kuzularda antikor<br />
titrelerinin saptanması hedeflenmiştir.<br />
Türkiye’de Mavidil virus moleküler epidemiyolojisi ve profilaktik yaklaşımlar<br />
Prof. Dr. Aykut Özkul, Prof. Dr. Faruk BOZOĞLU, Dr. Arife ERTÜRK,<br />
Mitchel HALLORAN, Elvin GÜNGÖR<br />
TOVAG 105O241<br />
01.09. 2005-01.09.2007 (Ek süre alınmıştır)<br />
Önerilen araştırma, halen Türkiye ve Akdeniz havzasında yerleşik bulunan tüm Avrupa ve<br />
bazı Kuzey Afrika ülkelerinde zaman zaman epidemiler şeklinde karşılaşılan Mavidil<br />
enfeksiyonunun serotip bazında filogenetik kökenini ve olası yurtiçi sirkülasyonunu ortaya<br />
koymak ve ayrıca bu hastalığa karşı profilaktik amaçla kullanılabilecek inaktif virus<br />
serotiplerinin elde edilmesini kapsamaktadır. Bu genel özellikler hedefinde, araştırmada<br />
temel moleküler virolojik uygulamalar, fiziko-kimyasal muameleler ve profilaktik deneme<br />
basamakları yer almaktadır..<br />
329
Attenüe Denizli koyun çiçek aşısının koyun ve kuzularda bağışıklık süresi ve raf<br />
Ömrünün saptanması.<br />
Dr. Veli GÜLYAZ, Dr. Selma ÖZDEMİR, Züleyha PESTİL APUHAN<br />
TUBİTAK PROJE NO: 107O058 ;<br />
Proje Başlama Tarihi: 01.07.2007- 01.07.2009<br />
Denizli koyun çiçek aşısının koyunlarda bağışıklık süresinin tespiti :<br />
Denemeler öncesi koyunların kanları alındı, kan serumları ayrılarak SN testi ile<br />
koyun çiçek hastalığı yönünden antikor titrelerine bakıldı. Kan serumlarında koyun<br />
çiçeğine karşı antikor titreleri saptanamadı.<br />
Koyunların aşılanması; Vero hücre kültüründe hazırlanan l m. Liyofilize<br />
(SP(D)V55) Denizli koyun-keçi çicek aşı peledi 100 ml. sulandırma sıvısı ile sulandırıldı ve<br />
36 adet koyunun koltuk derisi altına l ml. olarak enjekte edildi. 18 adet koyun ise<br />
eprüvasyon çalışmalarında kontrol olarak kullanılmak amacıyla farklı bir barınakta<br />
muhafaza edildi.<br />
Denizli koyun çiçek aşısının kuzularda kolostrum yoluyla geçen bağışıklık süresinin<br />
tespiti :<br />
Gebe koyunların aşılanması : Koyun çiçeği virusuna karşı antikor taşımayan 12<br />
adet koyun Denizli koyun çiçek aşısı ile DKID50 10 3.0 /ml dozunda aşılandı. Aşılamadan 21<br />
gün sonra kan serumlarında koyun çiçeğine karşı antikor titreleri 5 koyunda 10 1.25 ve 7<br />
koyunda 10 1.5 /0.1 ml olarak saptandı. Altı adet gebe koyun aşısız kontrol kuzular elde<br />
edilmesi amacıyla muhafaza edildi (21,22,26,43).<br />
Denizli koyun çiçek aşısının Raf ömrünün saptanması :<br />
Koyun – keçi çiçek aşılarının +4 / +8 o C de muhafaza edilmesi : Liyofilize edilen<br />
Denizli koyun keçi çiçek aşılarından 100 adet çalışma amacıyla +4 / +8 o C de soğuk odaya<br />
konuldu. Aşılar 24 ay süreyle +4 / +8 o C de muhafaza edilecektir. Muhafaza süresinin 1.<br />
ayında 10 adet aşının titreleri DKID50 10 6 /ml olarak saptandı.<br />
330
Change language