LABORATION 3 - Högskolan i Kalmar

LABORATION 3
STUDIER AV ETT ENZYMS AKTIVITET
Effekt av
- enzymkoncentrationen
- metalljoner
- substratkoncentrationen
Biokemi 10p
Högskolan i Kalmar
1980/AKS
Rev. -98 /Ed
Rev. 01/AKS

Studier av ett enzyms aktivitet
Läs Enzymologi i Metodikboken, kap 35 (p192-199) och kap 5.2-5.5 i Horton et al.,
Principles of Biochemistry.
Med denna laboration skall du studera ett enzyms aktivitet spektrofotometriskt med hjälp av
Hitachi U 2000 TIME SCAN program.
INTRODUKTION
Ett enzym, E, omvandlar ett substrat, S, till en produkt, P. Substratet binder till enzymet varvid
ett sk enzym-substratkomplex bildas. Ögonblickliga förändringar i detta komplex leder till att
substratet i enzymets aktiva site omvandlas till produkt. Produkten lossnar från enzymet
som härigenom återbildas för att på nytt binda in ett substrat, osv. Vi kan illustrera
processen så här:
k1 k2
E + S ES
k-1
E + P
Tiden det tar för en enzymmolekyl att omvandla ett substrat är vanligen max någon tusendel av
en sekund. Extremt snabba enzymer kan omvandla många miljoner substratmolekyler per
sekund. En enzymmolekyl av ett visst enzym omvandlar således ett visst antal
substratmolekyler till produktmolekyler per sekund. Två enzymmolekyler omvandlar dubbelt
så många substrat, osv. Mängd bildad produkt är således proportionell mot
enzymmängden. I laborationen verifierar Du detta påstående.
För att ett enzym skall fungera perfekt skall dess aktiva site ha en specifik kemi och geometri
för att affiniteten till substratet och vidare omvandling till produkt skall vara optimal. Då det
ofta finns laddade grupper i det aktiva sitet innebär detta att kemin och strukturen hos det
aktiva sitet är pH beroende. Ett visst enzym arbetar således bäst vid ett visst pH, enzymets pHoptimum.
Vidare arbetar det bäst vid en viss temperatur, enzymets temperaturoptimum.
Organiska lösningsmedel liksom metalljoner av olika slag kan förändra ett enzyms
tredimensionella struktur och därmed dess aktiva site och katalytiska förmåga. Organiska
lösningsmedel bryter olika typer av bindningar i enzymet, som därigenom helt kan förändras i
struktur. Metalljoner kan binda in till vissa laddade grupper och bryta dessas normala
interaktion med en annan laddad grupp i enzymet eller kanske bryta en viktig svavelbrygga.
2

Exempelvis kan Cu 2+ komplexbinda med S i cystein och N i imidazolringen i histidin. Gifter
av olika slag i vår natur kan alltså förändra enzymer så att deras katalytiska förmåga
minskar eller helt inhiberas. I laborationen skall Du studera hur kopparjoner kan ha en sådan
effekt på ett enzym.
Du skall vidare studera hur en viss enzymmängd omvandlar substrat i olika koncentrationer
och hur ett sk mättnadsvärde, Vmax, erhålls för denna enzymmängd. Beroende på omgivande
antal substratmolekyler arbetar en enzymmolekyl med olika hastighet. Blir
substratkoncentrationen tillräckligt hög uppnås det tillstånd då enzymet arbetar maximalt, dvs
binder in substrat, omvandlar det till produkt, binder in ny substratmolekyl, omvandlar den, osv
utan mellanliggande "paus". Även om man i detta skede ökar substratkoncentrationen kan inte
bildningen av produkt öka, maximal hastighet, Vmax är uppnådd för enzymmängden ifråga.
Slutligen skall Du studera hur god affiniteten av substratet är till enzymet, dvs hur lätt
substratet binder in till sitt enzym genom att bestämma den sk Michaelis-Menten konstanten,
KM . Ju lägre KM är ju effektivare verkar enzymet mot substratet.
Studier av ett enzyms aktivitet
I föreliggande laboration skall du studera enzymet laktatdehydrogenas, LDH. Detta enzym
katalyserar reaktionen:
Pyruvat + NADH + H + Laktat + NAD +
Reduktionen av pyruvat till laktat med NADH som coenzym är reversibel. Hos oss går
reaktionen åt höger, dvs till laktatbildning, i ex muskelceller vid syrefattiga förhållanden,
medan den går åt vänster i våra leverceller. Det som styr åt vilket håll reaktionen går
fysiologiskt är dels tillgången på substrat och dels KM-värdet hos det katalyserande
laktatdehydrogenaset.
Varje LDH molekyl innehåller 4 subenheter, vilka är av två typer, H respektive M. I ex
hjärtmuskelcellerna dominerar H4-LDH medan levern innehåller mest M4-LDH. Medan H4 har
lägst KM för pyruvat har M4 lägst för laktat. Utöver dessa extremer finns även LDH av typen
H3M, H2M2 och HM3.
Ett enzyms aktivitet studeras genom att följa antingen bildningen av produkt eller minskningen
av substrat med någon typ av analysmetod. Om någondera av substratet eller produkten
uppvisar ett absorptionsmaximum vid en viss våglängd kan man studera enzymets aktivitet
spektrofotometriskt, eftersom absorbansen då ändras under reaktionens gång.
NADH har ett absorptionsmaximum vid 340 nm. Denna absorption orsakas av dihydropyridinringen.
NAD + däremot saknar absorbans vid 340 nm. Detta medför att när NADH omvandlas
till NAD + minskar absorbansen vid 340 nm. I laborationen studerar Du bildningen av laktat
med en viss enzymmängd men vid olika pryruvatkoncentrationer. Man kan dock inte mäta
3

puruvat eller laktat spektrofotometriskt. För varje pyruvat som omvandlas, omvandlas även en
NADH, varför det är lika relevant att studera förändringen av denna metabolit.
Michaelis-Menten kinetik, Vmax och KM.
För många enzymer, där varje katalyserande enzymmolekyl arbetar oberoende av en annan,
varierar reaktionshastigheten, v, med substratkoncentrationen, [S], vid konstant
enzymkoncentration enligt figur 1.
Vmax
Vmax/2
v
KM
Ekvationen bakom denna kurva:
Michaelis-Menten ekvationen
Figur 1. Reaktionshastigheten, v, som funktion av substratkoncentrationen, [S], för ett enzym. Detta
samband kallas Michaelis-Menten ekvationen.
Ekvationen som beskriver enzymets katalys vid olika substratkoncentrationer, figur 1, kallas
Michaelis-Menten (MM) ekvationen efter de som upptäckte hur reaktionshastigheten varierar
med substratkoncentrationen. Studerar vi figuren finner vi att hastigheten initialt ökar nästan
exponentiellt med ökning av substratkoncentrationen. Vi finner dock att när substratkoncentrationen
når ett visst värde, ökar inte hastigheten mera. Vmax är uppnått för denna
enzymmängd. Observera också att Km är den substratkoncentration som ger upphov till en
hastighet motsvarande halva Vmax. Vmax och Km kan således bestämmas genom att mäta
reaktionshastigheten vid olika substratkoncentrationer.
MM-ekvationen bakom kurvan i figur 1 kan skrivas:
Vmax[S]
v = --------
KM + [S]
[S]
4

KM värdet är som ovan angivits ett mått på enzymets affinitet för substratet och förmåga att
omvandla detta även om det finns i mycket låga halter och definieras som förhållandet mellan
hastighetskonstanter - summan av de som spjälkar ES-komplexet dividerat med den som
bildar det.
KM =(k-1 + k2)/k1
Ju lägre KM ett enzym uppvisar mot sitt substrat ju effektivare verkar det mot substratet. Du
ser ovan att ju högre affinitet som föreligger, dvs ju högre k1 är, ju lägre blir KM.
Michaelis-Menten ekvationen kan skrivas om till den sk Lineweaver-Burk ekvationen, som ger
ett linjärt samband mellan inverterad reaktionshastighet och inverterad substratkoncentration:
1/v = 1/Vmax + (KM /Vmax) 1/[S]
KM och Vmax blir härigenom betydligt lättare att bestämma jämfört med Michaelis-Mentendiagrammet.
Skärningen med abskissan ger nämligen enkelt KM och skärningen med ordinatan
ger Vmax, figur 2.
-1/KM
1/v 1/v = 1/Vmax + (KM /Vmax) 1/[S]
1/Vmax Lutningen: KM /Vmax
Figur 2. Lineweaver-Burk plot för ett enzym som uppvisar Michaelis-Menten kinetik.
1/[S]
5

MATERIAL OCH METODER
Lösningar
• 0,5 ml LDH-lösning* - på isbad
• 2 ml 4,5 mM NADH * - på isbad
• 5 ml 6 mM pyruvat* - tempererad
*) Finns färdig, görs av laboratorieassistent.
• 100 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5* -
tempererad
• 0,5 ml 0,2 M kopparsulfat*
OBS Det är mycket viktigt att dessa lösningar görs med kemikalier och avjonat vatten av högsta
kvalitet. Spår av tungmetaller eller detergent (t ex diskmedel) kommer att inhibera enzymet
och därmed förstöra experimentet. Skölj därför mycket noga alla bägare, pipetter,
magnetloppor och annan utrustning som används vid framställning, förvaring och användning
av dessa lösningar.
Materiel
• 5 ml mätpipett
• Kalibrerade automatpipetter: 100
eller 200 ìl, och 1ml.
• Spetsar
• 2 st 3 ml glaskyvetter /student
• Hitachi U-2000 spektrofotometer
• Parafilm
• Sax
• Kleenex
A. Bestämning av reaktionshastighetens beroende av koncentrationen laktatdehydrogenas
Ställ in spektrofotometern med följande parametrar:
MAIN MENU: TIME SCAN CALC TIME : 10
DATA MODE: RATE ASSAY LIST INTERVAL: 10
Våglängd: 340 nm PRINTER. ON
Wolframlampa: ON GRAPH RPINT: ON
UP SCALE: 1.0 DISPLAY FORMAT. SEQUENTIAL
LOW SCALE: 0.0
SCAN TIME: 60 (sek)
CALC DELAY: 5
6

• Matcha kyvetterna med Tris-buffert. Låt Tris-bufferten stanna kvar i referenskyvetten.
• I provkyvetten, pipetteras upp 2,575 ml 0,1 M Tris-buffert, tillsätt 300 ìl 6 mM pyruvat
och 100 ìl 4,5 mM NADH. Blanda (använd parafilm) genom att vända kyvett 3 gånger.
Kolla att absorbansen är konstant. Notera abs.värdet.
• Tag upp kyvetten och tillsätt 25 ìl LDH-lösning. Blanda snabbt 3 gånger (använd
parafilm), kontrollera att det inte finns vätska på de optiska ytorna och sätt kyvetten
omedelbart i spektrofotometern.
• Tryck direkt på START och låt körningen pågå i 60 sekunder.
Beräkna initiala reaktionshastigheten, v, (ÄA/min), genom att dra tangenten till kurvan där
denna är linjär. Jämför detta värde med det som Du finner mellan 20s och 40 sek (multiplicerat
med 3).
• Upprepa experimentet ovan men tillsätt 50 respektive 100 ìl LDH-lösning. Minska i
motsvarande mån mängden Tris-buffert så att slutvolymen i kyvetten blir 3,0 ml. Skriv
in värdena i tabell I.
Avsätt i diagram erhållen reaktionshastighet (v) som funktion av enzymkoncentrationen ( som
ìl enzym tillsatt). Förklara erhållet resultat.
• Beräkna m h a diagrammet ovan hur många U (units) LDH som finns i 100 ìl
enzymlösning. En unit är den mängd enzym (här som ìl) ovan som omvandlar 1 ìmol
substrat till produkt under en minut. Använd Lambert-Beers lag. Vid 340 nm är åNADH
= 6220 M -1 cm -1 . Skriv in erhållet värde i labrapporten.
B. Effekt av kopparjoner på LDH:s katalytiska förmåga
• Upprepa experimentet ovan med 25 ìl enzym men tillsätt 10 ìl av en 0,2 M koppar (II)
lösning innan enzym tillsätts. Minska buffertmängden med 10 ìl.
• Bestäm erhållet v. Skriv in värdet i tabell II tillsammans med värdet från A för 25 ul
enzym.
C. Bestämning av KM mot pyruvat och Vmax.
Ställ in spektrofotometern på GRAPH PRINT: OFF. Efter varje mätning skalas grafen om så att
den erhållna kurvan går från övre vänstra hörnet till nedre högra hörnet. Först därefter skrivs
grafen ut.
• Bestäm reaktionshastigheten v med 25 ìl enzym för varierande substratmängd,
nämligen: 50 ìl, 100 ìl, 200 ìl, 400 ìl, 600 ìl (dvs 5 olika mätningar).
Buffertvolymen justeras för varje mätning så att slutvolymen i kyvetten blir 3 ml. Följ
reaktionen under 1 minut , SCAN-TIME: 60 OCH CALC TIME: 50.
• Skriv in värden på substratkoncentrationen, [S], reaktionshastigheten v, 1/[S] samt 1/v i
bifogad tabell III och plotta 1/v mot 1/[S] i ett LB-diagram. Bestäm KM samt Vmax för
LDH. Skriv in dessa värden i tabell IV.
---------------
7

LABORATION 3 Namn: ........................................................
STUDIER AV ETT ENZYMS AKTIVITET Datum:........................................................
Labhandledare: ..........................................
A. Reaktionshastighetens beroende av koncentrationen laktatdehydrogenas.
Tabell I. Reaktionshastigheten (v), vid olika relativa
koncentrationer av LDH
25
50
100
ìl LDH-lösning
v (ÄA/min)
Antalet Units (U), LDH som finns i 50 ìl beräknas till ..........................................................
Bilaga 1. Diagram för erhållen reaktionshastighet (ÄA /min) som funktion av enzymkoncentrationen
(ìl enzym).
Förklaring till erhållet resultat i bilaga 1:
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
Jämförelse av manuellt beräknade aktiviteter (tangent) med aktiviteter erhållna från spektro-
fotometern:
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
8

B. Effekt av kopparjoner på LDH:s katalytiska förmåga
Förklaring till erhållet resultat:
Tabell II. Effekten av 0.66 mM Cu 2+ på LDH:s förmåga
att omvandla pyruvat till laktat under oxidation av NADH
till NAD +
Koppar
-
+
v (ÄA/min)
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
C. Bestämning av KM mot pyruvat och Vmax
Tabell III. Data från mätning av reaktionshastigheten vid olika koncentrationer av pyruvat
och mättad (> 10KM) koncentration av NADH (________mM) i kyvetten.
Pyruvat (ìl) [S] (M) v (ÄA/min) 1/[S] (M -1 ) 1/v (min/ ÄA)
Bifoga följande bilagor:
Bilaga 2. Lineweaver-Burk diagram för LDH med pyruvat som substrat.
Bilaga 3: Samtliga skrivarkurvor för samtliga aktivitetsmätningar (försök A-C) monterade i
ordningsföljd och 2 st per A4-sida (4 per blad) med kort legend till varje skrivarkurva.
9

Tabell IV. Vmax och KM från Lineweaver-Burk diagram för LDH med pyruvat som substrat.
Mättande NADH koncentration (_________ mM).
1/Vmax= ___________ min, Vmax= _____________ min -1
-1/KM= ___________ M -1 KM = _____________ M
Kommentar:
........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
Besvara kortfattat följande frågor
1. Vad innebär turn over talet för ett enzym? ...........................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
2. Hur definieras 1 U? ...............................................................................................................
........................................................................................................................................................
3. Hur definieras KM? ...............................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
4. Hur bestämmer man KM för ett enzym? ...............................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
4. Varför sker en enzymatisk katalys bäst vid ett visst pH?......................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
10