Anteckningar analytisk kemi II - Öhrngren
Anteckningar analytisk kemi II - Öhrngren
Anteckningar analytisk kemi II - Öhrngren
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
ANTECKNINGAR<br />
FRÅN<br />
APOTEKARPROGRAMMET<br />
HT 2002<br />
ANALYTISK KEMI <strong>II</strong><br />
7p<br />
- 1 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
Innehåll:<br />
2 Vätske-vätskekromatografi / Vätske-fastfaskromatografi ....................................... 4<br />
2.1 Metodik och teori (LC) .........................................................................................................4<br />
2.2 Teori LLC................................................................................................................................5<br />
2.2.1 Oladdade analysobjekt ...........................................................................................................5<br />
2.2.2 Laddade ämnen .....................................................................................................................5<br />
2.3 Teori LSC................................................................................................................................5<br />
2.3.1 Oladdade substanser...............................................................................................................6<br />
2.3.2 Laddade ämnen .....................................................................................................................6<br />
2.4 Gradienteluering.....................................................................................................................7<br />
2.5 Instrumentation......................................................................................................................7<br />
2.6 Detektion.................................................................................................................................7<br />
2.7 Plus...........................................................................................................................................7<br />
3 Jonbyteskromatografi – IEC..................................................................................... 7<br />
3.1.1 Kolonnen................................................................................................................................8<br />
3.1.2 Detektion...............................................................................................................................8<br />
4 Gelfiltrering - SEC..................................................................................................... 8<br />
5 LC – MS..................................................................................................................... 9<br />
5.1 TSP...........................................................................................................................................9<br />
5.2 ESI............................................................................................................................................9<br />
5.3 APCI ........................................................................................................................................9<br />
5.4 Övrigt.......................................................................................................................................9<br />
5.5 Mikrokolonner..................................................................................................................... 10<br />
5.5.1 Deuteriumanvändning ......................................................................................................... 10<br />
5.6 Tandem-MS ......................................................................................................................... 10<br />
6 Tunnskiktskromatografi (TLC)...............................................................................10<br />
6.1 Metodbeskrivning ............................................................................................................... 10<br />
6.2 Mekanism ............................................................................................................................. 11<br />
6.3 Material................................................................................................................................. 11<br />
6.4 Användningsområden ........................................................................................................ 11<br />
7 Gas kromatografi – GC ............................................................................................11<br />
7.1 Kolonner .............................................................................................................................. 11<br />
7.1.1 Packade kolonner................................................................................................................ 11<br />
7.1.2 Kapillärkolonner................................................................................................................. 11<br />
7.1.3 Mobilfas ............................................................................................................................. 12<br />
7.2 Injektion av prov................................................................................................................. 12<br />
7.3 Detektorer............................................................................................................................ 13<br />
7.3.1 Thermal conductivity detector - TCD ................................................................................... 13<br />
7.3.2 Flame Ionisation Detector – FID........................................................................................ 13<br />
7.3.3 Kväve-fosfordetektor - NPD................................................................................................ 13<br />
7.3.4 Electron capture – ECD .................................................................................................... 14<br />
7.3.5 Fotojoniseringsdetektor – PID............................................................................................. 14<br />
7.4 Derivatisering....................................................................................................................... 14<br />
8 GC-MS......................................................................................................................15<br />
8.1 Joniseringssätt...................................................................................................................... 15<br />
8.1.1 Electron impact................................................................................................................... 15<br />
8.1.2 Positiv jon<strong>kemi</strong>sk jonisering – PICI.................................................................................... 15<br />
- 2 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
8.1.3 Negativ jon<strong>kemi</strong>sk jonsiering – NICI................................................................................. 15<br />
8.2 Detektor tillämpning .......................................................................................................... 16<br />
8.2.1 Selected ion monitoring – SIM ............................................................................................ 16<br />
9 Fältflödesfraktionering - FFF ..................................................................................16<br />
10 Överkritisk vätskekromatografi (SFC) och överkritisk vätskeextraktion (SFE).....17<br />
10.1 SFC........................................................................................................................................ 18<br />
10.1.1 Kolonner ............................................................................................................................. 18<br />
10.1.2 Detektorer........................................................................................................................... 18<br />
10.2 SFE........................................................................................................................................ 18<br />
11 Kapillärelektrofores - CE .........................................................................................18<br />
11.1 Jonmobilitet ......................................................................................................................... 18<br />
11.2 Elektroosmos....................................................................................................................... 19<br />
11.3 Bandbreddning .................................................................................................................... 19<br />
11.4 Upplösning........................................................................................................................... 20<br />
11.5 Kapillär zonelektrofores..................................................................................................... 20<br />
11.6 Micellelektrokinetik kromatografi..................................................................................... 20<br />
11.7 Isotachophoresis ................................................................................................................. 20<br />
11.8 Isoelektrisk fokusering ....................................................................................................... 21<br />
11.9 Injektionsmetoder............................................................................................................... 21<br />
11.9.1 Hydrodynamiskt ................................................................................................................. 21<br />
11.9.2 Elektrokinetisk .................................................................................................................. 21<br />
11.10 Svårigheter med metoden.............................................................................................. 21<br />
11.11 Användningsområden.................................................................................................... 21<br />
12 Kirala separationer .................................................................................................. 22<br />
12.1 Metoder för kiral separation.............................................................................................. 22<br />
12.1.1 Indirekt separatorisk metod................................................................................................. 22<br />
12.1.2 Direkt separation - Trepunktsinteraktion............................................................................ 23<br />
12.2 Tillämpningar....................................................................................................................... 23<br />
12.2.1 GC..................................................................................................................................... 23<br />
12.2.2 LC..................................................................................................................................... 23<br />
12.2.3 CE..................................................................................................................................... 23<br />
12.3 Enatiomerselektiv separation med CSP........................................................................... 23<br />
12.3.1 CBH-1............................................................................................................................... 23<br />
12.4 Enantiomerselektiv separation med CMPA.................................................................... 24<br />
13 Selected Ion monitoring.......................................................................................... 25<br />
14 Infraröd spektroskopi - IR ...................................................................................... 25<br />
14.1 Teori:..................................................................................................................................... 25<br />
15 Nära infraröd spektroskopi - NIR .......................................................................... 25<br />
16 Rahman ................................................................................................................... 25<br />
16.1 Användning:......................................................................................................................... 26<br />
17 UV ........................................................................................................................... 26<br />
17.1.1 Differentielle eller expanderad skala .................................................................................... 26<br />
17.1.2 Begränsningar ..................................................................................................................... 26<br />
17.1.3 Envägssystem mot tvåvägssystem.......................................................................................... 26<br />
17.2 Konventionell spektrofotometer ...................................................................................... 27<br />
17.3 Diode-array spektrofotometer .......................................................................................... 27<br />
17.3.1 Internal referencing .............................................................................................................. 27<br />
17.3.2 Upprepade mätningar.......................................................................................................... 27<br />
- 3 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
2 Vätske-vätskekromatografi / Vätske-fastfaskromatografi<br />
2.1 Metodik och teori (LC)<br />
Prov pumpas genom en termostaterad kolonn och retentionen beror av distributionen till<br />
stationära fasen. Tryckfallet som uppstår när en vätska rinner genom kolonnen är direkt<br />
proportionellt mot kolonnlängden och omvänt proportionellt mot partikel diametern – vilket<br />
innebär att liten partikeldiameter ger ett tryckfall och öppnar möjligheten för en kortare kolonn<br />
vilket ger högre känslighet då tiden i kolonnen blir kortare och analysobjekten mindre påverkade<br />
av upplösning. Liten diameter och kort kolonn positivt.<br />
B<br />
H = + Cm<br />
× u + Cs<br />
× u<br />
u<br />
där H = bottenhöjd, u = flödeshastighet, B = molekylära diffusionen, C = långsam jämviktsinställning<br />
B<br />
1/<br />
3<br />
h = + A×<br />
υ + C × υ<br />
υ<br />
där h= reducerad bottenhöjd, ν =reducerad flödeshastighet, A = Eddy- +radiell diffusion,<br />
B = molekylära diffusionen, C = långsam jämviktsinställning<br />
- 4 -<br />
(1:31)<br />
van<br />
Deemter<br />
ekv.<br />
(2:5)<br />
Knox<br />
ekv.<br />
Knox införde reducerade bottenhöjden h beroende av molekylär diffusion, Eddy-diffusion,<br />
radiell diffusion och långsamma jämviktsprocesser. Vid låg reducerad flödeshastighet dominerar<br />
den molekylära diffusionen medan jämvikten påverkar mer då det reducerade flödet är hög.<br />
Eddy-diffusion beror av att molekyler tar olika vägar genom kolonnen. Några väljer en kortare<br />
väg än medelvägen och andra en längre väg. Eddy-diffusionen beror av kolonnlängd och<br />
packningsmaterialets deiameter. Eddy-diffusionen minskar med minskande partikeldiameter.<br />
Den radiella diffusionen är direkt proportionell mot diametern och kolonnlängden och omvänt<br />
proportionell mot diffusionskonstanten. Liten diameter och stor diffusionskonstant minimerar<br />
den radiella difussionen.<br />
Kiseloxid används som kolonnmaterial och på detta fästes grupper för att ge rätt polaritet till den<br />
stationära fasen.<br />
Kolonnen bidrar också till bandbreddningen. Den största möjliga injicerade volymen som ger<br />
bandbreddning ökar proportionellt med retentionsvolymen och omvänt proportionellt mot<br />
effektiviteten. V i är starkt beroende av innerdiametern av kolonnen.<br />
R<br />
R<br />
S<br />
S , MAX<br />
=<br />
1+<br />
1<br />
V<br />
2<br />
× N<br />
( ) 2 2<br />
i<br />
V × K<br />
där V i = injicerad volym, V R = Retentionsvolym, K = injektorberoende konstant<br />
R<br />
(2:19)<br />
Om detektionscellen är för stor, påverkar även denna bandbreddning då de separerade<br />
analysobjekten kan komma att blandas igen. Även hastighetskonstanten hos detektorn kan<br />
påverka – detektionen skall företrädelsevis ske snabbt.
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
N ⎛ k'<br />
2 ⎞ ⎛α −1⎞<br />
k'<br />
2<br />
R = × ⎜<br />
⎟<br />
S × ⎜ ⎟ ; α =<br />
(1:38)<br />
4 ⎝1<br />
+ k'<br />
2 ⎠ ⎝ α ⎠ k'1<br />
där Rs ≥ 1,5 visar på fullständig separation, k = separationsfaktorn, α är separationsfaktorn<br />
2.2 Teori LLC<br />
2.2.1 Oladdade analysobjekt<br />
Oladdade analysobjekt separeras i system med buffrat vatten som polär fas och en mix av opolära<br />
och polära lösningsmedel som mindre polärfas. K´ kan regleras genom polaritetsförändringar.<br />
För att separera de oladdade proverna använder man komplexbindande organsiska föreningar. K’<br />
kommer att minska vid ökad koncentration av S samt en polärare komplexbindningsagent.<br />
k<br />
'<br />
HX<br />
=<br />
V<br />
M<br />
K ×<br />
D(<br />
HX )<br />
V<br />
S<br />
K ×<br />
- 5 -<br />
HXSn<br />
×<br />
[ ] n<br />
S<br />
där V S = volym stationär fas, K D =Distributionskonstant, [S] = koncentration organisk modifierar<br />
då pH = pKa och [HK S]
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
Ämnen bundna till kiselgelerna avgör hur polär densamma blir. Polariteten hos gelen kan<br />
karaktäriseras enligt följande gruppers varande eller ickevarande: mättade kolväten < omättade<br />
eller aromatiska kolväten < halogen derivat < etrar < estrar < ketoner och aldehyder < alkoholer<br />
< syror och baser.<br />
En av de stora skillnaderna mellan LLC och LSC rör retentionskapaciteten. LLC har väldigt hög<br />
kapacitet vad gäller mängden prov som kan testas utan att förhållanden ändras. För att få en<br />
effektiv separation krävs att topparna är symmetriska och en förutsättning för detta är den att<br />
fördelningskoefficienten skall vara konstant under hela körningen. En hög adsorption är<br />
essentiellt för hög separationseffektivitet.<br />
2.3.1 Oladdade substanser<br />
k<br />
'<br />
A<br />
q × K°<br />
× K<br />
=<br />
1+<br />
K ×<br />
S<br />
[ S ]<br />
där k’ A = kapacitetsfaktor, [S] M = halt metanol, K° = kapacitet hos adsorbent i mol per gram<br />
q =W S/V M, (W S = mängd adsorbant i kolonnen och V M = volym eluent i kolonnen)<br />
- 6 -<br />
A<br />
M<br />
(2:33)<br />
Kapacitetsfaktorn ökar alltså med ökad kapacitet hos adsorbenten och minskad<br />
distributionskonstant hos det lösta ämnet. Adsorptionen av den mobila fasen motverkar<br />
adsorptionen A och effekten ökar med ökad koncentration och ökad distributionskonstanten.<br />
Oftast används en blandad mobilfas; om fallet är en opolär adsorbent är det gynnsamt att<br />
använda en vattenlösning som mobilfas och kontrollera retentionen med organiska lösningsmedel<br />
som metanol och acetonitril. Om exempelvis en fosfatbuffert används som en del i den mobila<br />
mixen minskar k’ med ökad tillsatts av acetonitril.<br />
2.3.2 Laddade ämnen<br />
LSC med en hydrofob stationär fas och en hydrofil mobil fas lämpar sig utmärkt för separation<br />
av laddade ämnen. Detta baserar sig på två principer:<br />
1. När en jon överförs till en fast fas bibehålles elektronegativiteten av en motjon.<br />
2. Jonlösningar och jondelar i eluenten konkurrerar om bindningsställen på den adsorberande<br />
ytan.<br />
k<br />
'<br />
A<br />
q × K°<br />
× K<br />
=<br />
1+<br />
K ×<br />
QX<br />
[ ]<br />
[ ] [ ] −<br />
+<br />
−<br />
HAX × X<br />
Q × X<br />
där KHAX och KQX = fastfasextraktionskonstanter för lösningen HA +, Q + = buffert co-jonen,<br />
X - = motjon<br />
k<br />
'<br />
A<br />
q × K°<br />
× K<br />
=<br />
1+<br />
K ×<br />
QB<br />
[ ]<br />
[ ] [ ] − +<br />
+<br />
QX × Q<br />
Q × B<br />
där KQB och KQX (?)= fastfasextraktionskonstanter för lösningen HB, Q + = buffert motjon,<br />
(2:34)<br />
(2:34)
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
Kapacitetsfaktorn (k’) ökar med ökad extraktionskonstant hos lösningen och ökad<br />
motjonskoncentration i den mobila fasen. Oftast används aprotiska motjoner eftersom de inte<br />
ändrar laddning beroende på pH. En lämplig extraktionskonstant kan enkelt ordnas med hjälp av<br />
lämpligt alkylval. Annars kan man ändra det polära innehållet i den mobila fasen.<br />
2.4 Gradienteluering<br />
I reversed phase görs eluenten mindre och mindre polär – tekniken används då retentionstiderna<br />
är långa mellan de ämnen som skall separeras och processen annars blir otymplig. Rena ämnen är<br />
väldigt viktigt då känsligheten hos denna metod är markant.<br />
2.5 Instrumentation<br />
Pumpen skall ha ett konstant och pulsfritt flöde på mellan 0 (meningsfullt…) och 10 ml per<br />
minut och vara resistent mot de lösningsmedel som används vid elueringarna. Valvinjektorer<br />
används allt som oftast (5-500µl). Kolonnerna är mellan 50 och 250 mm långa och de detektorer<br />
som föredras är UV (läs diode-array) och MS.<br />
2.6 Detektion<br />
De detektorer som används vid LC är<br />
• UV<br />
Med fördel Diode-array. Känslighet 5*10 -8 M.<br />
• Fluorescens<br />
Mäter exciterad fluoroscens efter belysning med UV-ljus. Mer selektiv än UV-detektor<br />
och med hög känslighet 5*10 -10 M dock med begränsningen att analyserat ämne måste ha<br />
fluoroscens (sic!).<br />
• MS<br />
Används både kvalitativt och kvantitativt. Känslighet 5*10 -8 M.<br />
2.7 Plus<br />
� Kort retentionstid<br />
� Hög effektivitet<br />
� Kontinuerlig detektion av eluerade prover.<br />
� LSC – stor adsorptionsyta.<br />
� LLC – hög kapacitet<br />
� Välutvecklad<br />
� Lätt att kombinera med datorer<br />
3 Jonbyteskromatografi – IEC<br />
(sid. 49-54)<br />
Anjonbytare: X - + R + Y - = Y - + R + X - Innehåller positivt laddade grupper.<br />
Katjonbytare: A + + R - B + = B + + R - A + Innehåller negativt laddade grupper<br />
Separation av hydrofila protolyter av bio<strong>kemi</strong>skt intresse.<br />
- 7 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
3.1.1 Kolonnen<br />
Materialet i en jonbyteskolonn skall vara olösligt och <strong>kemi</strong>skt stabilt. Att föredra är kolonner med<br />
en solid inert kärna med ett lager av jonbytesmaterial på ytan. Dessa ger hög prestanda p.g.a. kort<br />
diffusionssträcka inom jonbyteslagret. Nackdelen är att kapaciteten är ganska låg. Homolog<br />
packning och enhetlig partikelstorlek är nödvändig för att få god separation.<br />
3.1.2 Detektion<br />
Detektion görs med hjälp av konduktivitetsmätningar vid så kallad jonkromatografi.<br />
Selektiviteten för organiska joner är svår att förutsäga då de även kan interagera med matrisen.<br />
Alkohol/vatten blandningar används som lösningsmedel och retentionen kommer bero av<br />
alkoholhalten.<br />
R - M + + A + = R - A + + M + ;<br />
K<br />
- 8 -<br />
A<br />
=<br />
[ ] [ ]<br />
[ ] [ ] + +<br />
+ +<br />
Ai<br />
× M 0<br />
M × A<br />
där A + = injicerad i systemet, M + = co-jon och R - = jonen i matrisen<br />
index i = insidan och index 0 = utsidan<br />
k'<br />
A<br />
= D<br />
A<br />
V<br />
×<br />
V<br />
S<br />
M<br />
VS<br />
× K A<br />
=<br />
V ×<br />
M<br />
1<br />
[ ]<br />
[ ] +<br />
+<br />
× M i<br />
M<br />
där k’ A = kapacitetsförhållandet, D A = distributionsförhållandet<br />
0<br />
0<br />
(3:1)<br />
(3:3)<br />
V = V × ( 1+<br />
k'<br />
)<br />
(3:4)<br />
R(<br />
A)<br />
M<br />
A<br />
där V R(A) = Retentionsvolym<br />
Om de fixerade grupperna på matrisen är svaga syror eller baser kan distributionsförhållandet lätt<br />
styras genom att ändra pH i eluenten.<br />
För anjon:<br />
D<br />
B<br />
− [ Bi<br />
]<br />
− [ B ] × [ HB]<br />
= = −<br />
0<br />
−<br />
K B × [ N i ] × K'<br />
HB<br />
[ N ] × ( K'<br />
+ a + )<br />
0<br />
HB<br />
där D B = Distributionsförhållandet<br />
4 Gelfiltrering - SEC<br />
(Sid. 55-58)<br />
Vätskekromatografisk metod – separation med avseende på molekylernas storlek.<br />
Används för separation av makromolekyler.<br />
Kolonn packad med poröst material.<br />
X<br />
V R Vm<br />
+ K ×<br />
S<br />
H<br />
(3:6)<br />
= V<br />
(4:1)<br />
där V R = Retentionsvolym, V m = volym mobilfas, V S = Stationära volymen och<br />
K X = fraktionen mobilfas tillgänglig för lösningen
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
K X beror av molekylvikten hos lösningen och av matrisens porstorlek. Små molekyler som passar<br />
i alla porer har K X =1 och stora molekyler som är helt utestängda från alla porer har K X =0. Om<br />
V R är större än V m + V S innebär det att interaktion mellan matrisen och provmolekylen har<br />
inträffat. För att öka separationen anpassa porstorleken till molekylstorleken i lösningen.<br />
X<br />
k2<br />
För att öka separationsfaktorn α = används kolonner packade med material med uniform<br />
X<br />
k1<br />
porositet inom ett intervall som matchar lösningens molekylstorlek det vill säga så att alla ämnen<br />
hamnar 0
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
ej bör tas hänsyn till eller snarare bör det väl tas hänsyn. Om polariteten ändras kan man även<br />
detektera negativa joner och då oftast [MH] - eller [MAc] - .<br />
Ämnen med hög molekylvikt som exempelvis. proteiner kan detekteras med hjälp av LC-MS<br />
trots att detektionsgränsen egentligen är lägre, detta p.g.a. att proteinerna är multiladdade och att<br />
M + n M + ( n + 1)<br />
man kan räkna baklänges från m/z-värden genom och<br />
n n + 1<br />
Vatten i den mobila fasen är nödvändigt för att ge utslag i LC-MS.<br />
5.5 Mikrokolonner<br />
Mikrokolonner är funktionibla inom LC-MS då ESI har möjlighet att göra droppar vid väldigt<br />
låga flödeshastigheter. Mikrokolonner är korta, har liten diameter (5-300µm), men genererar ett<br />
högt antal teoretiska bottnar (80000-100000). Flödeshastigheten är brukligt 1µl/min och<br />
metoden används företrädelsevis då ämnen är dyra eller labbet välutvecklat…<br />
5.5.1 Deuteriumanvändning<br />
En praktisk användning av deuteriumoxid synes i samband med LC-MS. Om man byter ut vatten<br />
mot deuteriumoxid kan man vid jämförelse av de två spektrumen se vilka atomer som har<br />
utbytbara väten. Alla väten bundna till heteroatomer kommer att bytas ut, även M + kommer att<br />
bytas ut. Det är relativt enkelt att se vilken molekyl det är så länge den inte innehåller fler än 35<br />
utbytbara väten.<br />
5.6 Tandem-MS<br />
Genom att koppla två Masspektrometrar efter varandra får man något man kallar tandem<br />
masspektroskopi, en form väldigt användbar i kombination med LC.<br />
Tandemmassen är uppbyggd av tre kvadrupplar, den första selekterar jonen av intresse, oftast en<br />
molekylärjon och accelererar jonen till den andra cellen – kollisionscellen. Trycket har blivit<br />
förhöjt i denna av argon eller xenon och kollisionen mellan jonen och det tunga argonet bildar<br />
fragmentationer i form av dotterjoner. Den sista delen i serien är av detektortyp. Oftast används<br />
denna typ av detektor tillsammans med ett spektrum genererat av i förväg kända molekyler.<br />
6 Tunnskiktskromatografi (TLC)<br />
6.1 Metodbeskrivning<br />
TLC är en kromatografiskmetod vilken utförs på en öppen glas-, metall- eller plastplatta. Provet<br />
appliceras på plattan och den mobila fasen rör sig genom den stationära plattan genom<br />
kapillärkrafter; i vissa exceptionella fall även av tryck eller gravitation. I HPTLC har man gjort<br />
stationära faser med mindre partiklar och smalare distribution – alltför att tillgodose marknadens<br />
krav på effektivitet… Kritiska steget i TLC är som empirismen så ofta visat –<br />
appliceringsmomentet.<br />
- 10 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
Plus:<br />
� Flera prover kan elueras samtidigt under identiska betingelser.<br />
� Lätt att använda, snabb, hög provkapacitet och relativt billig.<br />
� Eftersom man slänger plattan kan giftiga lösningsmedel och annat obehagligt användas.<br />
6.2 Mekanism<br />
Som i LC är migrationen beroende av hur länge provet befinner sig i den mobila fasen kontra<br />
stationära fasen under den kromatografiska processen. Rf –värdet mäts som provets vandring i<br />
förhållande till lösningsmedlets. Gällande bandbreddningsmekanismer kan sägas att molekylär<br />
diffusion är den viktigaste.<br />
6.3 Material<br />
Förpreparerade plattor är överlägset vanligast där TLC plattornas porer är mellan 10 och 60 µm<br />
medan de hos HPTLC är runt 5 µm stora. De flesta plattor som används är gjorda av kisel, men<br />
även cellulosa och aluminium används. Plattorna utvecklas också: nya former där proverna<br />
appliceras i mitten och sedan migrerar ut mot kanterna används då det medför att en större del av<br />
plattan används. Detektion med hjälp av UV-ljus.<br />
6.4 Användningsområden<br />
� För att screena mobila faser till andra kromatografiska system.<br />
� Preparera fram prover.<br />
� Kontrollera reaktioner etc.<br />
7 Gas kromatografi – GC<br />
(Sid. 77-88)<br />
Fördelar: stort antal detektorer kan användas med hög selektivitet och känslighet.<br />
Nackdel: Provet måste vara flyktigt och tåla upphettning.<br />
GLC och GSC<br />
7.1 Kolonner<br />
7.1.1 Packade kolonner<br />
Diameter 2-6 mm, längd 1-5 m.<br />
Finns antingen med en stationäras av vätska eller fast material. Fast material kan vara Porapak ® är<br />
tvärbundet etylvinyl och divinylbensen. Används framförallt för preparativa separationer. Kan<br />
vara ickepolära eller polära väteaccepterande.<br />
7.1.2 Kapillärkolonner<br />
Diameter 0,2-0,5 mm, längd 20-100 m.<br />
Karakteriseras av lågt motstånd vilket möjliggör dess längd. Längden medför ett stort antal<br />
teoretiska bottnar. (100 m kan ge N=100000). En 60 m kolonn ökar upplösningen 40 % mot en<br />
- 11 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
30 m kolonn men dubblar analystiden och ökar erfordrat tryck. Kolonner med diametern 0,2-<br />
0,32 mm ger högst noggrannhet emedan 0,53-0,75 mm ger högst provkapacitet.<br />
Fördelar jämfört med packade kolonner:<br />
1) Högre upplösning<br />
2) Kortare analystid<br />
3) Större selektivitet och känslighet<br />
Nackdel jämfört med packade kolonner:<br />
1) Lägre provkapacitet<br />
Tre typer av kapillärkolonner: ”Wall coated open tubular”, ”Support coated open tubular” och<br />
”Porous-layer coated open tubular”<br />
7.1.3 Mobilfas<br />
Som bärargas används inerta gaser som He, Ar, N 2, H 2. N 2 är vanligast och billigast. Syre får ej<br />
förekomma då detta ger oxidation vilket kan förstöra kolonnen. Viktigt att kontrollera läckor då<br />
80% av bekymren med GC beror av läckor. Gas påverkar kolonn, separation och detektion.<br />
7.2 Injektion av prov<br />
Injektor och detektor 50°C varmare än kolonnen.<br />
� ”Split injector”<br />
Lösningsmedel och prov förångas. 1-10% appliceras i kolonnen resten avleds s.k. outlet.<br />
Den teknik som ger högst effektivitet. Kolonndiskriminering kan förekomma om provet<br />
har en stor variation i molekylvikt. Tunga molekyler förångas långsammare och kommer<br />
att var underrepresenterade i den provvolym som når kolonnen.<br />
Fördelar med tekniken är att den är enkel och lätt att använda. Ger god reproducerbarhet<br />
av retentionstid.<br />
Nackdel är att det är svårt vid låghaltsanalyser, då injektorn bara tar tillvara på en del av<br />
injicerat prov.<br />
� ”Splitless injector”<br />
Baseras på en ”split injector” i ”non-splitting mode”. Lågt flöde bärargas. Temperatur 10-<br />
20°C lägre än kokpunkten för provet gör att det förångade provet återkondenserar i ett<br />
smalt band på kolonninloppet. Temperaturen höjs och provet kan analyseras.<br />
Fördelar med tekniken är att nästan allt injicerat material används (80-90%) vilket är att<br />
föredra vid utspädda prover. Bra vid låghaltsanalys. Den lägre injektionstemperaturen är<br />
att föredra vid värmekänsliga prov.<br />
Nackdelar är att färre lösningsmedel är användbara och livslängden på kolonnen är<br />
kortare.<br />
� Direktinjektion<br />
Viktigt att injicera långsamt för att inte få ”backflash” vilket skulle resultera i breda<br />
svansade toppar.<br />
� Kolonninjektion<br />
Används vid packade kolonner. Obra för kolonnen men bra för värmekänsliga<br />
substanser. Provet injiceras direkt till kolonninloppet. Injicera långsamt för att förhindra<br />
aerosolbildning vilket skulle medföra breda toppar och minskad effektivitet.<br />
- 12 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
SE FIGUR 7:1<br />
D<br />
g ( A)<br />
=<br />
f<br />
N<br />
a<br />
S<br />
× R × T<br />
× p<br />
A<br />
- 13 -<br />
× V<br />
där D g(A) = Distributionsförhållandet, p A = ångtryck, f A = aktivitetskonstant,<br />
N S = antal mol av stationär fas, V S = volym stationär fas<br />
7.3 Detektorer<br />
Ett stort antal detektorer kan användas. Viktiga egenskaper hos detektorn är bland annat: signaltill-brus<br />
förhållandet, minsta detekterbara mängd och linjärt område.<br />
7.3.1 Thermal conductivity detector - TCD<br />
En okänslig men ickedestruktiv (MDQ ~1 µg) metod som bygger på en så kallad Wheatstone<br />
bridge circuit med en referenscell i bärargasen och en provcell. När prov passerar kommer<br />
bryggan i obalans och utslaget registreras. Registrerar alla ämnen som har en annan konduktivitet<br />
än bärargasen.<br />
7.3.2 Flame Ionisation Detector – FID<br />
Den elektriska konduktiviteten av en gas är direkt proportionell mot koncentrationen av laddade<br />
partiklar i gasen. Utloppet från kolonnen passerar en flamma och ändrar gasens konduktivitet.<br />
Detektorsignalen är proportionell mot antalet kolatomer i molekylen. Känsligheten minskar i<br />
närvaro av käve, syre och svave. Detekterar en oorganiska ämnen.<br />
• Funktionella grupper som karbonyler, alkoholer, halogener och aminer ger få joner.<br />
Okänslig mot gaser som H 2O, CO 2, SO 2 och NO X.<br />
• Selektivt för föreningar med C-H bindningar.<br />
• Känsligt ner till 0,1-10 ng<br />
• Bärgas kväve eller helium<br />
• Temperatur 250-450°C<br />
• Nackdel är att FID förstör provet.<br />
7.3.3 Kväve-fosfordetektor - NPD<br />
Svarar på organsika föreningar med kväve eller fosfor. Rubidiumsilikat i glas eller keramikmatris<br />
värms elektriskt. Kolonnflödet kombineras med 2-6 ml H 2/min. Uppsamlingselektroden är oftast<br />
konfigurerad för att samla upp negativa joner. Det finns två teorier för uppkomsten av dessa<br />
negativa joner:<br />
1) Gasfasjonisering<br />
2) Ytjonisering<br />
Kväve och fosfor bildar Cn, PO, PO 2 etc som kan generera negativa joner.<br />
Används vid läkemedelsanalys.<br />
Fördelar:<br />
+ Hög känslighet (MDQ ~0,01ng)<br />
+ Lätthanterad<br />
+ Ingen störning från lösningsmedel<br />
S<br />
(7:1)
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
7.3.4 Electron capture – ECD<br />
Vanligtvis används 63 + -<br />
Ni som β-strålare. N2 → N2 + e<br />
Potential appliceras över elektroderna i detektorn. Elektroderna till anoden ger en konstant<br />
ström. Om provet, AB, kam ta upp elektroner minskar den registrerade strömmen. Vanligast är<br />
att variera pulsfrekvensen och att hålla strömmen konstant.. Frekvensen är proportionell mot<br />
koncentrationen eluerad substans.<br />
En stor fördelar är att metoden har hög känslighet för ämnen som innehåller elektronupptagande<br />
grupper som alkylhalider, konjugerade karbonyler, nitratestrar och organiska metaller. MDQ ~1<br />
pg. Känsligheten kan ökas genom derivatisering med elektroupptagande grupper. Metoden är<br />
dock okänslig för rena kolväten, alkoholer och estrar.<br />
• Selektivt för halogener, nitrater och konjugerade karbonyler.<br />
• Känslig ~1 pg<br />
• Bärgas kväve eller argon/metan<br />
• Temperatur 300-400°C<br />
• Vanligt använd vid kvantitativ analys av ”spårmängder” av pesticider och läkemedel.<br />
7.3.5 Fotojoniseringsdetektor – PID<br />
Högre känslighet än FID: Jonisering genom att foton med högre eller lika energiinnehåll som<br />
joniseringspotentialen träffar provet. Lampor med olika energi finns tillgängliga. Högst känslighet<br />
hos lampa med lägst energi. Vanligast är 10,2eV vilken också är den lampa som har högs<br />
känslighet.<br />
7.4 Derivatisering<br />
Orsakerna till derivatisering är att:<br />
• öka substansens flyktighet och minska polariteten<br />
• minska värmedegenerering<br />
• öka detektorsvaret<br />
• öka separation och minska svansning<br />
• öka extraktionseffektivitet från vätskefas vid provupparbetning<br />
Exempel på derivatiseringar:<br />
• Silylering<br />
Hyroxyl, karboxylsyror, aminer, tioler, fosfater<br />
Utbyte av syra-väte på provet mot alkylsilyl som SiMe 3. Derivatet är mindre polärt, har<br />
ökad flyktighet och är mer termiskt stabilt<br />
• Acylering<br />
Reducerar polariteten hos amino-, hydroxyl- och tiolgrupper. Ökar deras kromatografiska<br />
egenskaper och ger ökad stabilitet genom att skydda ostabila grupper.<br />
• Esterifiering<br />
Förstahandsval för derivatisering av syror.<br />
• Derivatiserin av primära och sekundära aminer<br />
TFA (TerrorForce Al-Quida) Trifluoroacetic acid anhydrid<br />
HFB (Hunted of Fucking Bush) Hepta fluorobutyric acid anhydrid<br />
PFP (Partnership For Peace) Penta fluoropropionic acid anhydrid<br />
- 14 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
8 GC-MS<br />
(Sid 89-95)<br />
Joner produceras oftast genom elektronbombardemang av neutrala molekyler i tryckfasen i GC,<br />
av till exempelvis en upphettad tråd. Jonerna separeras sedan med hjälp av antingen<br />
� ett pålagt magnetfält kombinerat med ett elektrostatiskt fält, eller genom användandet av<br />
� kvadrupla massfilter (vanligast). Dessa är mindre otympliga och mer ekonomiska än de<br />
förstnämnda. De har även lägre scanningstid. Fyra parallella metallrör påläggs med en<br />
potential och varierad frekvens. De flesta joner kommer att oscillera och träffa en av<br />
metallbitarna, stora joner kommer dock att passera genom kvadrupeln och detekteras.<br />
Genom att scanna frekvenserna eller potentialen kan ett masspektrum upprättas.<br />
Det går även att använda ”ion trap analyzers”. Dessa fungerar enligt samma princip som<br />
föregående filter. Skillnaden är en central hyperbol ring som bildar ett kvadrupelt fält. Fördelarna<br />
med den sistnämnda är hög säkerhet, känslighet och enkelhet.<br />
GC-MS är ett kraftfullt <strong>analytisk</strong>t hjälpmedel då enheter för separation och analys är<br />
kombinerade. En enkel väg för provapplicering ger ett snyggt och rent spektrum.<br />
Viktiga parametrar som kan styra en lyckad/misslyckad GC-MS: *kolonnen *hastigheten<br />
8.1 Joniseringssätt<br />
8.1.1 Electron impact<br />
Elektronbombardemang ger ett mycket komplicerat spektrum med låg halt M + .<br />
8.1.2 Positiv jon<strong>kemi</strong>sk jonisering – PICI<br />
Jonisering av gas som joniserar provet. Metan eller ammonium vanligast.<br />
CH4 + e - →<br />
+ -<br />
CH4 +e<br />
CH2 + H2 + e -<br />
+ -<br />
+ H* + e<br />
CH 3<br />
+ +<br />
CH4 + CH4 → CH5 + CH3<br />
+ +<br />
CH3 + CH4 → C2H5 + H2<br />
M: + CH5+ → MH + + CH4 Då mindre energi överförs till provet är detta en ”mjukare” metod och mindre fragmentering<br />
kommer att ske.<br />
8.1.3 Negativ jon<strong>kemi</strong>sk jonsiering – NICI<br />
Joniering genom att elektorner absorberas till provet AB+ e - → AB -<br />
Har högre känslighet än PICI.<br />
- 15 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
8.2 Detektor tillämpning<br />
8.2.1 Selected ion monitoring – SIM<br />
Mäter en begränsat antal joner i MS. Isotopmärkta analoger som 2 H, 13 C, 15 N. Duterium vanligast.<br />
Byt minst tre atomer för att inte påverkas av naturligt förekommande isotoper. Placera 2 H i<br />
stabila positioner!<br />
9 Fältflödesfraktionering - FFF<br />
(Sid. 97-102)<br />
Separation genom skillnader i storlek eller densitet. Kan separera makromolekyler, kolloider<br />
och partiklar. Liten molekyl / partikel först ut.<br />
Fördelar Nackdelar (jmf SEC)<br />
Lätt att utveckla Lägre topp kapacitet<br />
Snabb separation Ej preparativ teknik<br />
Ingen stationär fas utan endast en mobil fas som transporterar provet genom FFF-kanalen.<br />
Figur 9:1 s 97<br />
Kanalens längd är 10-30 cm, bredd 1-2 cm och höjd 75-250 µm.<br />
Separation uppkommer genom interaktion mellan det axiella flödet (i kolonnens längdriktning)<br />
och den yttre kraft som är pålagd. Provet kommer att tryckas mot nedre väggen (accumulation<br />
wall). Beroende av avståndet från ackumulationsväggen transporteras komponenterna i provet<br />
med en specifik hastighet längs kanalen.<br />
Den yttre kraften som påverkar provet kan vara av olika slag:<br />
• Sedimentation<br />
Sepatartion efter densitet eller massa >10nm<br />
• Värmegradient (varm vägg/kall vägg)<br />
>1nm<br />
• Flödes fältflödesfraktionering<br />
Separerar strikt efter storlek. >1nm<br />
• Elektriskt fält.<br />
>10nm<br />
F<br />
U = ; f = 6π<br />
× η × a<br />
f<br />
där U = ”velocity”, F = kraft, f = Friktionskoefficient, η =viskositetskoefficienten för mobila fasen,<br />
a = hydrodynamiska radien av molekyl/partikel i provet<br />
- 16 -<br />
(9:1)<br />
(9:2)
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
När provmolekylerna samlas vid ackumulationsväggen skapas en koncentrationsgradient som<br />
inducerar diffusion i motsatt riktning mot den yttre kraften. Diffusionskoefficienten beror av<br />
molekylstorleken. Jämvikt mellan diffusionen och yttre kraften nås på karakteristiskt avstånd från<br />
väggen:<br />
D<br />
l = ;<br />
U<br />
k × T<br />
D = ;<br />
f<br />
- 17 -<br />
λ =<br />
där l = (absolut) avstånd från väggen, D = diffusionskoefficienten, U = yttre kraft,<br />
k = Boltzmanns konstant, T = Temperatur<br />
λ = reducerad distans, w = kanalens tjocklek<br />
0<br />
t<br />
R = = 6λ<br />
;<br />
t t<br />
R<br />
tR 0<br />
l<br />
w<br />
w×<br />
U w×<br />
U × π × a<br />
= =<br />
6×<br />
D k × T<br />
där R = Retentionförhållandet, t 0 = mobilfastiden, t R = retentionstiden<br />
(9:3)<br />
(9:6)<br />
(9:4)<br />
(9:5)<br />
(9:7)<br />
Retentionen beror av den fältinducerade ”velocity”. Beroende av vilken typ av fält som appliceras<br />
kommer U variera.<br />
Se Fig. 9:3<br />
10 Överkritisk vätskekromatografi (SFC) och överkritisk<br />
vätskeextraktion (SFE)<br />
(Sid. 103-114)<br />
SFC är en bra teknik för att karaktärisera mellan- till högmolekylära polymerer. Har inget krav på<br />
varken termostabilitet eller UV-respons.<br />
Kritisk punkt är den punkt där gas och vätska av ett ämne kan samexistera. Ovanför punkten,<br />
definierad av den kritiska temperaturen (T C) och det kritiska trycket (P C), är det bara en fas,<br />
överkritisk vätska. (Se figur 10:1) Exempelvis för CO 2 är T C=31°C och P C=73atm.<br />
Ju högre densitet den överkritiska vätskan har desto kortare retentionstid hos analyten. Om vid<br />
konstant tryck densiteten minskas, genom att minska temperaturen, ökar kapacitetsfaktorn först<br />
för att därefter minska och processen blir mer GC-lik. Nära den kritiska temperaturen ger en liten<br />
temperaturändring stora ändringar i densitet.<br />
CO 2 är den vanligaste vätskan för SFC då CO 2 har en överkomlig kritisk punkt, är inert, är lätt att<br />
handa och finns tillänglig i god renhet (pro analysis). NO 2 har intressanta egenskaper men är inte<br />
inert.<br />
Se Fig. 10:1
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
10.1 SFC<br />
10.1.1 Kolonner<br />
SFC kräver en pulsfri försörjning av mobilfas. Då dimensionerna är små ställs höga krav på<br />
injektion för att inte tappa effektivitet i systemet.<br />
Kapillärkolonnerna är lika de i GC med en stationär fas av polysiloxan med rikligt med<br />
tvärbindningar. Kolonnen är 10-20 m lång och har en innerdiameter av 50-100 µm. Den ringa<br />
innerdiametern ger många teoretiska bottnar men ett stort tryckfall. Stora fördelen med en<br />
kapillärkolonn tillsammans med en FID-detektor är att termolabila ämnen med varierande UVaborbans<br />
kan analyseras. Det är dock ibland nödvändigt att maskera polära grupper för att öka<br />
lösligheten.<br />
Packade kolonner för SFC är identiska med dito för LC. De erbjuder både ökad analyshastighet<br />
och högre provkapacitet jmf med kapillärkolonner. Tekniken används för renhetskontroll av LM.<br />
Kolonner kan kopplas i serie för att öka det antalet teoretiska bottnar. Metanol tillsätts mobila<br />
fasen som modifierare. Vanligtvis 10 %.<br />
10.1.2 Detektorer<br />
FID – SFCs arbetshäst. Ett litet bekymmer vid packade kolonner är att det höga flödet tenderar<br />
att släcka lågan.<br />
MS – Används för strukturbestämningar och sällan vid kvantifieringar.<br />
UV – Används framförallt vid packade kolonner.<br />
m.fl.<br />
10.2 SFE<br />
Extraktionsteknik som kan ersätta tidskrävande tekniker som exempelvis Soxhlet. Utrustningen<br />
är en pump, en termostaterad extraktionscell, en ”restirktor” och en uppsamlare. SFE används<br />
preparativt exempelvis för att extrahera koffein ur kaffebönor.<br />
11 Kapillärelektrofores - CE<br />
(Sid. 115-157)<br />
11.1 Jonmobilitet<br />
� Om man lägger ett konstant elektriskt fält över en elektrolytlösning börjar joner att<br />
accelereras i takt med det pålagda fältet och den egna laddningen. Genast (eller efter 10 -13 s)<br />
läggs en lika stor friktionskraft till soppan.<br />
� H 3O + och OH - har överlägset högst mobilitet.<br />
� Den elektroforetiska förflyttningen av joner i lösningar ger upphov till konduktivitet.<br />
� Vid ökad temperatur minskar viskositeten hos lösningar och när viskositeten minskar ökar<br />
mobiliteten.<br />
� Mobilitet i elektriska fält sker endast då molekylerna är laddade vilket betyder att mobiliteten<br />
är pH-beroende.<br />
- 18 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
�<br />
�<br />
K HA<br />
α 1 =<br />
(SYROR)<br />
K + a<br />
HA<br />
a<br />
+<br />
H<br />
+<br />
H α 1 =<br />
(BASER)<br />
K + + a +<br />
HB H<br />
� Lagavulin är mäkta gott.<br />
11.2 Elektroosmos<br />
� Rörelsen hos en oladdad vätska relativt en stationär laddad yta p.g.a. en pålagd gradient.<br />
� Kiselgrupperna på CE-gelen har pKa-värden mellan 2 och 10.<br />
� När en elektrolyt kommer i kontakt med en laddad yta i närvaro av pålagd ström uppkommer<br />
fenomenet (samma som punkt ett…)<br />
� Två lager av joner kommer att bildas enligt teoremet om Sterns dubbellager.<br />
� Rörelsen av katjoner mot katoden kommer att spridas i hela bulken av elektrolyter och allt<br />
kommer att röra sig i samma riktning.<br />
� Den elektroniska mobiliteten är direkt proportionell till Z-potentialen (potentialen i<br />
dubbellagret) och dielektricitetskonstanten hos bakgrundselektrolyterna och omvänt<br />
proportionell mot viskositeten hos mediet.<br />
� Neutrala delar av en lösning kommer att röra sig med µ eo.<br />
� µ eo är ofta, om än vid pH > 4 starkare än den elektroforiska mobiliteten.<br />
� µ eo är direkt proportionell till fältstyrkan.<br />
� Man kan kontrollera µ eo med hjälp av följande parametrar:<br />
1. Det elektriska fältet – effektivitet och upplösning kan minska vid sänkning av densamma.<br />
2. Buffertens pH – mest praktisk att ta till.<br />
3. Jonstyrka eller buffertkoncentration - Kan förändra toppar om konduktiviteten varierar<br />
från ämnets kond. Kan ge joulevärme. Ökad jonstyrka sänker µ eo.<br />
4. Temperaturen – enkel att kontrollera<br />
5. Organiska modifierare – komplexa förändringar.<br />
11.3 Bandbreddning<br />
• Effektiviteten ökar med minskad diff. koefficient d.v.s. ju större molekyler desto bättre. Ökad<br />
kapillärlängd, högre fältstyrka och minskad elektroforisk mobilitet ökar också effektiviteten.<br />
• N är direkt proportionellt mot laddningen hos molekylen.<br />
• N minskar med ökad temperatur.<br />
• Saker som påverkar bandbreddningen åt breddhåll är diffusion, längd på den injicerade<br />
pluggen, Jouluppvärmning, adsorption till kapillärytan och detektorn.<br />
• Låg injicerad volym positivt om man vill ha smala band.<br />
• Jouluppvärmning har, sin bandbreddning till trots, en viktig uppgift i att skapa en<br />
koncentration gradient i kapillären.<br />
• Skillnad i konduktivitet mellan provet och bufferten kan ge bandbreddning. Om de båda<br />
zonerna har samma konduktivitet ges en symmetrisk topp, om provet har högre ger det en<br />
”frontad” topp.<br />
2<br />
L<br />
N =<br />
σ<br />
D<br />
2<br />
µ e × E × L<br />
=<br />
2×<br />
D<br />
där L D = kapillärlängden till detektorn, D = diffusionkoefficienten<br />
- 19 -<br />
D<br />
(11:20)
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
11.4 Upplösning<br />
R<br />
S<br />
N × Δµ<br />
=<br />
4×<br />
µ<br />
där µ m = medelvärdet av mobiliteterna<br />
m<br />
- 20 -<br />
(11:31)<br />
11.5 Kapillär zonelektrofores<br />
Buffertvalet bestämmer separationen; zwitterjoniska buffertar fördelaktiga då dessa ger låg<br />
konduktivitet även vid hög jonstyrka, vilket möjliggör att ha högt E vilket i sin tur ger en kort<br />
analystid utan sänkt upplösning. Om ej zwitterjoner gäller det att ha en låg jonstyrka för att<br />
minimera Joulvärmen. För separation krävs skillnad i förhållandet laddning/storlek. Om så inte är<br />
fallet tillsätt additiv.<br />
11.6 Micellelektrokinetik kromatografi<br />
Neutrala partiklar distribueras i miceller av ex. natriumdodekansulfat (SDS) och får<br />
elektroforetisk mobilitet. Separation erhålles då partiklarna har olika grad av micelldistribuering.<br />
De molekyler som har lägst micelldistribuering kommer att nå katoden först. Man konditionerar<br />
så att elektroosmosen är större än micellmigreringen i motsatt riktning, annars kan en del ämnen<br />
bli odetekterade.<br />
k’ kan räknas ut enligt:<br />
k'<br />
=<br />
( 1−<br />
t )<br />
t<br />
t<br />
r<br />
mc<br />
− t<br />
r<br />
0<br />
× t<br />
där o står för osmostiden och mc följaktligen för micellernas migrationstid<br />
0<br />
(11:34)<br />
Om micellernas migrationstid blir för lång bildar micellerna en egen stationärfas och systemet blir<br />
normalkromatografiskt. Det går även att separera laddade molekyler med MEKC i detta fall<br />
räknar man med att endast den neutrala formen av ämnet inkorporeras i micellen<br />
mobilitetsordningen blir µ eo > µ mc > µ A-.<br />
11.7 Isotachophoresis<br />
Provet injiceras i en kapillär bestående av en elektrolyt där buffertjonen har samma laddning som<br />
analyten men har en högre mobilitet än den analyt i provet som har den högsta mobiliteten. I<br />
elektrolyten finns också en co-jon som har lägre mobilitet än den analyt i provet som har den<br />
lägsta mobiliteten. Motjonen i både den ledande och den terminerande elektrolyten är oftast<br />
samma. När en spänning påläggs migrerar de olika delarna i lösningen med de olika analyterna<br />
och elektrolytzonerna tätt tillsammans. När jämvikt uppnåtts rör sig de olika zonerna med samma<br />
hastighet och koncentrationen av de olika elektrolyterna fås av Kohlrach ekvationen (11:41).
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
Tekniken är användbar för att separera grumliga lösningar med fungerar sämre om analyterna<br />
endast finns representerade i små mängder.<br />
11.8 Isoelektrisk fokusering<br />
Separationen är baserad på skillnader i isoelektriska punkter och innefattar en pH-gradient.<br />
Metoden används ofta på stora biomolekyler.<br />
Kapillären fylls med prov och flera amfolyter. Buffertlösningen på katodsidan är alikalisk emedan<br />
den på anodsidan är sur. När spänningen slås på migrerar prpoven beroende på laddning. pHgradient<br />
bildas då amfolyterna migrerar snabbt till respektive isoelektriska punkt<br />
(nettoladdning=0). För att detektera appliceras ett hyrdrodynamiskt tyck alternativt så ändras pH<br />
gradienten så att båda buffertarna är syra eller basiska. Tappar dock i upplösning i<br />
”elueringssteget”.<br />
11.9 Injektionsmetoder<br />
11.9.1 Hydrodynamiskt<br />
Med applicerat tryck på injektionssidan eller vakuum på detektorsidan.<br />
Fördelar: Alla substanser i provet introduceras i representativ mängd.<br />
Nackdel: Problem med selektivitet om provet är komplext.<br />
11.9.2 Elektrokinetisk<br />
Genom att applicera en spänning, positiv eller negativ beroende på analysobjektens karaktär, över<br />
provet i direktkontakt med separationskapillären.<br />
Fördel: Selektiv provintroduktion vid komplexa prover<br />
Nackdel: Diskriminerande; prover med hög mobilitet introduceras i högre mängd än de med låg<br />
mobilitet.<br />
Fördel om lösningen har lägre jonstyrka än bakgrundselektrolyten. Provet har lägre konduktivitet<br />
→ högre fältstyrka när spänningen slås på. Analytens joner migrerar snabbare i provet jmf med<br />
elektrolyten och kommer koncentreras i området mellan de två faserna innan separationen säger<br />
rum STACKING.<br />
11.10 Svårigheter med metoden<br />
• Temperaturkänslig – termostaterade kolonner ett måste.<br />
• Substanser kan ibland adsorbera till kolonnen under körning och ändra µeo – genomsköljning<br />
därför viktig.<br />
• Bufferten kan ändras mellan försöken p.g.a. elektrolys och evaporation – byt denna ofta,<br />
ibland så ofta som efter varje körning.<br />
• Eftersom viskositeten påverkas av temperaturändringar skall proverna som injiceras vara<br />
tempererade.<br />
• IS ökar metodens tillförlitlighet.<br />
11.11 Användningsområden<br />
• Renhetstester av läkemedel.<br />
• Peptidseparering.<br />
• Kirala separationer.<br />
- 21 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
• Analys av biologiska material.<br />
12 Kirala separationer<br />
(sid. 159-184)<br />
För att särskilja två enantiomerer måste de interagera med en asymmetrisk (kiral) omgivning som<br />
planpolariserat ljus eller en kiral molekyl. Genom att skapa diastereomerer gör man det möjligt att<br />
separera sökta ämnen på en akiral kolonn då diastereomerer har skilda fysikalisk-<strong>kemi</strong>ska<br />
egenskaper.<br />
12.1 Metoder för kiral separation<br />
För att särskilja enantiomerer kan flera metoder användas:<br />
• Selektiv kristallisation av diastermoeriskt salt.<br />
• Enzymatisk reaktion – Ett enzym bryter endast ner den ena enantiomeren.<br />
• Kinetisk upplösning – Reagerar med olika hastighet med en annan enantiomer<br />
• Spektroskopiska metoder<br />
Nackdelar är att det krävs stor mängd prov, ställs höga krav på optisk renhet och att<br />
metoderna är tämligen okänsliga<br />
o NMR<br />
o Polarimetri<br />
• Separatoriska metoder<br />
o Indirekta metoder<br />
Indirekta metoder kan användas på GC, HPLC, TLC, SFC<br />
o Direkta metoder<br />
� Kirala stationära faser<br />
Kan användas vid GC, HPLC, TLC, SFC<br />
� Kirala additiv<br />
Kan användas vid HPLC, TLC, SFC, CE<br />
12.1.1 Indirekt separatorisk metod<br />
Proverna reagerar med en annan enantiomer och bildar derivat. Kan öka känsligheten<br />
med hjälp av att reagensen exempelvis innehåller fluor för tydlig UV-detektion. Reagenset<br />
måste vara absolut rent. Exempelvis kan R-form racemiseras med tiden på labbänken.<br />
Med hjälp av kirala reagens kan även akirala molekyler separeras med CS.<br />
Fördelar med indirekta metoder är att det<br />
- är lätt att hitta ett reagens<br />
- metoden är snabb<br />
- man kan lätt öka känsligheten.<br />
- 22 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
12.1.2 Direkt separation - Trepunktsinteraktion<br />
För att kunna få kiral separation måste man vid direkt separation ha en trepunktsinteraktion<br />
mellan selektor och den ena enantiomeren. Behöver ej vara bindande utan kan lika gärna vara<br />
repellerande. Interaktionerna måste definieras i rymdstrukturen (X, Y, Z). Svårt att förutsäga<br />
interaktionerna även med datorhjälp.<br />
De tre interaktionerna måste inte vara mellan den kirala selektorn och ämnet utan kan innebära<br />
två interaktioner mellan selektor och ämne och en tredje med en yta.<br />
12.2 Tillämpningar<br />
12.2.1 GC<br />
Fördelar med GC är kort retentionstid, hög effektivitet och selektivitet. GC möjliggör detektion<br />
av enantiomera orenheter på 0,1 %.<br />
GC har som vanligt nackdelarna att man ofta behöver derivatisera innan injektion vilket medför<br />
risk för konfigurationsförändring och det är obra. De höga temperaturerna är också obra.<br />
12.2.2 LC<br />
Som kirala strukturer kan användas:<br />
• Triacetylcellulosa<br />
• Polyaminer och polyestrar<br />
• ”imprinted phases”<br />
- Har nackdelarna att de medför långa analystider, är svårtillverkad och mindre generell.<br />
• Proteiner:<br />
Exempelvis CBH1 vilken är bra på att separera β-bockare. Finns även baserat på albumin<br />
12.2.3 CE<br />
Extremt hög effektivitet och små volymer talar till CEs fördel. Vanligtvis tillsätts kiral selektor till<br />
bakgrundselektrolyten. Indirekt separation som diastereomeriska derivat. Optimering med hjälp<br />
av pH, buffertjoner, organiska modifierare, temperatur och viktigast koncentration kiral slektor.<br />
12.3 Enatiomerselektiv separation med CSP<br />
Vid separation med en kiral stationär fas (CSP) är det vanligt att använda proteiner, exempelvis<br />
CHIRAL-AGP (α 1-syra glykoprotein), CBH-1 (cellbiohyrdolas), BSA (bovin serumalbumin),<br />
HSA (humant serumalbumin).<br />
12.3.1 CBH-1<br />
Uppvisar stor selektivitet för β-bockare. Kiral igenkänning för CBH-1 beror av elektrostatiska<br />
interaktioner vilka är känsliga till steriska faktorer som avstånd mellan funktionella grupper i<br />
molekylen. Joniska interaktioner kan styras med pH.<br />
De grundläggande parametrarna för att kontrollera retentionen och enantiomerselektiviteten är<br />
pH, buffertkoncentration, laddade och oladdade modifierare i mobila fasen. Högre<br />
buffertjonkoncentration ökar enantiomerselektiviteten och minskar analystiden för aminer men<br />
har ingen signifikant effekt på andra ämnen.<br />
- 23 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
Tillsats av 2-propanol kan användas för att ändra resolution och retentionstid. Förbättring av<br />
effektivitet och toppsymmetri efter tillsats av 2-propanol till bufferten vid CE visar på vikten av<br />
hydrofoba interaktioner när enantiomerer binder till cellulas. CHB-1 visar tempteraturberoende<br />
både med avseende på retention och på enationmerselektivitet.<br />
12.4 Enantiomerselektiv separation med CMPA<br />
Kirala mobilfastillsatser (CMPA) ändrar derivatens löslighet i mobila fasen.<br />
A. Stereoselektiv jonparsbindning<br />
0%
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
13 Selected Ion monitoring<br />
Kombineras med GC, men även med LC. En känslig metod som baseras på att man mäter ett<br />
begränsat antal m/z:a värden, att den är känsligare beror på att mindre tid spenderas på att söka<br />
de specifika jonerna, vilket är fallet i multijonsökning.<br />
Två ämnen kan också mätas utan att vara helt kromatografiskt separerade. Man radiomärker<br />
atomer i de olika molekylerna och mäter specifika m/z och får fram skillnaden trots ofullständig<br />
separation. Mätningar med stabila isotoper av exempelvis deuterium går också att göra och på så<br />
sätt spåra delar av läkemedel som försvinner under upparbetningen.<br />
14 Infraröd spektroskopi - IR<br />
Används främst för att identifiera organiska molekyler/molekyldelar vars ”fingerprint” är tydligt.<br />
Används även kvalitativt för att detektera föroreningar i luften p.g.a. av den höga selektiviteten<br />
hos metoden.<br />
14.1 Teori:<br />
För att ge IR:utslag krävs en dipolförändring hos molekylen p.g.a. vibration eller rotation. Genom<br />
antingen stretching, scissoring, twisting, bending, wagging eller rocking (vibrations- eller<br />
rotationsenergier).<br />
För att få fram rörelsen hos molekylen måste tas hänsyn till 1, Rörelsen för hela molekylen i<br />
rymden. 2, Rotationsmomentet runt det egna gravitationscentrumet 3, Atomrörelserna relativt<br />
omgivande atomer. Kan noteras att endast asymmetriska molekyler ger upphov till dipolmoment.<br />
15 Nära infraröd spektroskopi - NIR<br />
En stavrackare skickas ner i byttan med pulver och spektrum tas enligt IR-metodiken.<br />
16 Rahman<br />
C.V. Raman var en käck <strong>kemi</strong>st som kom på Rahmantekniken och fick nobelpris 1930.<br />
IR och Rahman liknar varandra till spektrumformen, men Rahman går att använda när det finns<br />
vatten i provet. Teknikerna ger liknande resultat, men fungerar bra komplementärt då de ger svar<br />
på något olika frågor.<br />
Spektrumen i Rahmanspektroskopi tas upp efter att kraftiga laserstrålar belyst provet inom<br />
visuella- och IR-våglängder och det är ”scattered radiation” som mäts vid en viss vinkel (oftast 90<br />
°). The scattered radiation kan vara av tre typer 1) Stokes 2) antistokes<br />
3) Rayleigh, varav den sista är klart starkast och har samma våglängd som excitationskällan.<br />
Stokes och antistokes topparna är lika många till antalet och belägna på vardera sidan om<br />
Rayleightoppen.<br />
- 25 -
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
16.1 Användning:<br />
Oorganiskt: Rahman är överlägsen IR vad gäller oorganiska system då dessa ofta innehåller vatten.<br />
Halogener och metalloxider ger fina Rahmanspektrum.<br />
Organiskt: Här är systemen bättre tillsammans då de båda kan bidra till speciell information vad<br />
gäller molekylerna, men båda undanhåller även lite info. (Jag skulle använda IR före Rahman).<br />
Biologiskt: Positivt vad gäller Rahman i biologiska system är små prover, icke vattenkänslig,<br />
detaljerat spektrum, skonsam mot miljön…<br />
17 UV<br />
UV/Vis används:<br />
• För direkt mätning av lösning<br />
- Spektra<br />
- Haltbestämning<br />
• Som HPLC-detektor<br />
- Haltbestämning<br />
- Renhetsbestämning<br />
- Föroreningskaraktärisering<br />
A = ε × b × c<br />
där ε =mobila absorbansen, b = kyvettlängden i cm, c = koncentration i mol/liter<br />
- 26 -<br />
Beers<br />
lag<br />
Varje spektrofotometer har en max absorbans för vilken Beer lag gäller. Efter denna absorbans<br />
planar kurvan ut till följd av påverkan av ströljus. Mätresultatets riktighet avtar också vid mycket<br />
svaga koncentrationer på grund av störningar från brus.<br />
17.1.1 Differentielle eller expanderad skala<br />
Används vid mycket låga koncentrationer och ökar precisionen. Om normalskalan går från 0-100<br />
sätter man exempelvis 35 som övre gräns vilket innebär att 0-35 blir ny 0-100 för maskinen och<br />
noggrannheten ökar sålunda.<br />
17.1.2 Begränsningar<br />
Vi höga absorbanser begränsas mätningen av störljus och vid låga koncentrationer av<br />
bakgrundsbrus. Minskas ströljuset med x10 ökar användbart område med 45 %, minskas<br />
bakgrundsbruset med x10 ökar användbart område med x10.<br />
17.1.3 Envägssystem mot tvåvägssystem<br />
Nackdelen med konventionella system med en ljusväg är att lampdrift kan uppkomma under de<br />
långa analystider som krävs (flera minuter vid mätningar av spektrumen). För att kompensera för<br />
detta används två ljusvägar, en genom referens och en genom prov, och en ”chopper” placerad
Sammanfattning av kurskompendium Analytisk <strong>kemi</strong> <strong>II</strong> kap 2-13 2002-10-14<br />
Apotekarprogrammet, A7 Magnus Anderson<br />
Uppsala universitet Per <strong>Öhrngren</strong><br />
nära ljuskällan. ”Chopper” roterar så att alternerande mätningar av referens och prov sker flera<br />
gånger per sekund vilket kompenserar variationer i lampans intensitet.<br />
17.2 Konventionell spektrofotometer<br />
En- eller tvåvägssystem. Vid envägsstystem (ljuset har bara en väg att gå) används en<br />
polykromatisk ljusskälla som fokuseras i en monokromator vilket enbart låter en viss våglängd gå<br />
vidare. Denna våglängd passerar sedan genom provet och till en detektor. Provets absorbans<br />
bestäms genom att jämföra med en blank.<br />
Denna typ av mätning passar för mätningar av absorbans vid en punkt i ett spektrum. Nackdel är<br />
att monokromatorn måste vara rörlig för att kunna mäta på olika våglängder vilket ger systemet<br />
en mekanisk komplexitet. Genom att monokromatorn måste ändra inställningar tar det lång tid<br />
att ”stanna” spektrum.<br />
17.3 Diode-array spektrofotometer<br />
En diode-array består av en serie av dioder sida vid sida på en kiselkristall. I en diode-array<br />
uppsättning passerar ljuset först provet därefter en polykromator innan det träffar dioderna.<br />
Polykromatorn och diode-array är fasta installationer och systemet har färre rörliga delar än den<br />
konventionella UV-spektrofotometern. Upplösningen för en diode-array är beroende av antalet<br />
fotodioder per ”spektralt avstånd”. Idag vanligtvis 1 nm el 2 nm/diod.<br />
Fördelar med en diode-array är:<br />
• att den gör mätningar mycket snabbt då den kan läsa alla våglängder samtidigt.<br />
• att den har en utmärkt reproducerbarhet.<br />
• att systemet är pålitligt.<br />
• att systemet har samma känslighet vid alla våglängder.<br />
17.3.1 Internal referencing<br />
Ännu en fördel med att kunna mäta flera våglängder samtidigt är att man kan använda sig av<br />
”internal referencing”. Detta innebär att man mäter två våglängder samtidigt där provet vid den<br />
ena har hög absorption emedan den vid den andra inte har någon absorption. Våglängderna bör<br />
dessutom ligga så nära varandra som möjligt. IR omvandlar en envägsspektrofotometer till en<br />
pseudo-tvåvägs utan de nackdelar som tvåvägsdesignen medför. Mätningar med ”internal<br />
referencing” kan bara utföras med diode-array då man med konventionell teknik inte kan mäta<br />
två våglängder samtidigt.<br />
17.3.2 Upprepade mätningar<br />
Genom den korta analystiden för en diode-array är det lättare att göra en serie upprepade<br />
mätningar för att förbättra noggrannheten. Om man kör upprepade mätningar på samma prov<br />
med en diode-array kan man statistiskt eliminera inverkan av elektroniskt brus. Denna teknik<br />
möjliggör att mäta ytterst små koncentrationer. Exempelvis för att få en relativ känslighet om 16<br />
krävde en konventionell UV 2 h 14 min 18 s och en diode-array 25,6 s.<br />
- 27 -