Labrapport farmakognosi.pdf

Laboration:Isolering av kininNamn: student x & student yKurs: FAGBH0 Utförd: 090526Handledare: Patrik Holm1

InnehållsförteckningInnehållsförteckning ............................................................................................................................ 2Sammanfattning .................................................................................................................................. 3Inledning .............................................................................................................................................. 3Utförande ............................................................................................................................................ 4Material ........................................................................................................................................... 4Metod .............................................................................................................................................. 4Resultat ................................................................................................................................................ 6Diskussion: ........................................................................................................................................... 8Referenser ........................................................................................................................................... 82

SammanfattningSyftet med laborationen var att extrahera de fyra alkaloiderna kinin, kinidin, cinkonin ochcinkonidin från Rubiaceae Cinchona-bark genom Soxhletextraktion och sedan renasytterligare genom fastfasextraktion med C-18 kolonn i plastspruta. TLC användes för attutröna renhet under tre steg i extraktionsprocess och upparbetning. Utbytet blev 1,9 %. TLCvisade separation av de fyra alkaloiderna i alla tre proven, vilka identifierades mot TLC medreferenslösning. Resultat av TLC blev inte som förväntat eftersom de fyra alkaloidernauppvisade separation redan efter första extraktionen och förändrade sig inte nämnvärt underde olika reningsstegen.InledningAlkaloider är en grupp cykliska organiska ämnen som innehåller kväve och har ofta basiskaegenskaper med begränsad distribution i levande organismer men återfinns i växtriket. Deflesta alkaloider har farmakologiska effekter och används både till medicinska preparat ochinom den illegala narkotikahandeln. Exempel på de båda är morfin respektive kokain.Bark från träd som tillhör Rubiaceae Cinchona innehåller ett 25-tal alkaloider. Den viktigastealkaloiden är kinin men även dess stereoisomer kinidin. Det finns också två relateradestereoisomerer till, cinkonin och cinkonidin, som inte används medicinskt (se fig. 1).Handelsnamnet är kinabark och har använts i århundraden som malariamedel. Både kinin ochkinidin är aktiva mot malaria men kinidin används mest idag som profylax mot allvarligahjärtrytmrubbningar. 1 I Sverige finns endast kinin som ingående aktiv substans i registreratläkemedel. 3H 2 COHNR = OCH 3: Kinin och KinidinRR = H: Cinkonin och CinkonidinNFig. 1. Strukturformel för de vanligaste kinaalkaloidernaStora mängder kinin används också som smakämne i bittra läskedrycker, t.ex. ”tonic water”. 13

I den här laborationen skulle kinin isoleras ur kinabark. Renheten skulle testas med TLC vidolika stadier i extraktionskedjan och upparbetning. ”Thin layer chromatography” är enseparationsteknik, här används den för att utröna renhet. Stationära fasen består av ett tuntlager silika bestruket på plattor av aluminiumfolie. Till silikan är oftast ett fluorescerandeämne tillsatt för att man enkelt ska kunna se de olika faserna i UV-ljus. En liten droppe provappliceras på plattan ungefär en cm från basen. Plattan doppas sedan i ett lämpligtlösningsmedel varvid kapillärkrafter kommer att dra med sig lösningsmedel och provet uppåt.Innehåller provet olika komponenter kommer det att vandra olika fort på grund av skillnader ipolaritet. Rf-värde (retentionsfaktor) kan sedan beräknas genom att dividera sträckan somprovet vandrar med totala sträckan som lösningsmedlet vandrar. Värdena beror sedan avvilket lösningsmedel som använts och vilken typ av TLC-platta - inte en fysisk konstant.2UtförandeMaterialKinabarkDiklormetanNatriumhydroxidlösn. (2 %)Svavelsyra (0,2 M)Svavelsyra (0,01 M)CaOMetanolEtanolca 15 girriterande, giftigfrätandefrätandefrätande1,9 gbrandfarlig, giftigbrandfarligMetodFörberedelserKalken släcktes med 30 mL vatten och 15 mL 2 % NaOH tillsattes. Barken rördes sedan ner imixen och blandades väl. Över natt torkades allt i ett hundragradigt värmeskåp.SoxhletextraktionDen torkade kakan av kinabarkmixen maldes i en mortel och överfördes till enextraktionshylsa. 200 mL diklormetan hälldes i rundkolven. Extraktionen avbröts efter 6extraktioner. Ett par droppar sparades av extraktet för senare analys med TLC.4

Fig. 2. Soxhletuppsättning 4UpparbetningDiklormetanlösningen från föregående extraktion extraherades med 2x15 mL 0,2 Msvavelsyra i en separationstratt (se fig. 3). Syralösningen hamnade överst. En filtreringutfördes för att få emulsionen att bryta samt bortrensning av partiklar och föroreningar.Kontroll skedde sedan med UV-ljus (366 nm) på de båda lösningarna. Om lösningeninnehåller kinin ska den lysa med ett blålila sken. Diklormetanen lös fortfarande med ettblålila sken och en extraktion med ytterligare 15 mL utfördes. Syralösningen filtreradesdärefter genom ett 0,45 μm sprutfilter. Ett par droppar sparades av extraktet för senare analysmed TLC.Fig. 3. SeparationstrattFastfasextraktionEn C-18 fastfaskolonn av plastsprutetyp med luertip-koppling (se fig. 4) förbereddes genomatt montera på en kran på kopplingen. Kolonnen konditionerades därefter med 5 mL metanol,5 mL avjoniserat vatten och slutligen 5 mL 0,01 M svavelsyra. Syraextraktet satsades i 5 mLportioner över kolonnen och eluerades sedan ut med 4 mL etanol i en förinvägd rundkolv.5

Proceduren upprepades 4 ggr. Ett par droppar sparades för senare analys med TLC och restenrullindunstades.Fig. 4. Exempel på engångskolonner i plast 5TLC utfördes i vannor med diklormetan:dietylamin 9:1 som elueringsmedel. TLC utfördesockså på referensprover av; kinin, kinidin, cinkonin och cinkonidin.ResultatInvägd mängd kinabark: 15 gExtrakt kvar efter indunstning: 0,29 gUträkning av utbytet visade att vi fick ut;0,29g100 1,9% som var en blandning av de fyra alkaloiderna kinin, kinidin, cinkonin och15gcinkonidin.TLC visade:Fig. 5: Prov 1-3 i tur och ordning från vänster.6

Fig. 6: TLC på referenslösningarna; gul = kinin, blå = kinidin,turkos = cinkonin och rosa = cinkonidin.Rf-värden:Tabell 1: Rf-värden på TLC-proverna.Färgkod: Prov 1 Prov 2 Prov 3 Ref.Turkos 0,696 0,75 0,73 0,56Blå 0,598 0,63 0,61 0,51Rosa 0,52 0,55 0,54 0,41Gul 0,37 0,42 0,40 0,26TLC efter soxhletextraktionenProv 1 sparades efter soxhletextraktionen. Redan här separeras alla fyra alkaloiderna (se prov1, fig. 5). Rf-värden se tabell 1. Ordningen framkom då vi utförde TLC på referenslösningar(se fig. 6).7

TLC efter upparbetningenEfter upparbetning fick provet något högre Rf-värden (se prov 2 fig. 5 och tabell 1) annars vardet ingen skillnad.TLC efter fastfasextraktionenEfter fastfasextraktionen var Rf-värdena lite lägre igen (se prov 3 fig. 5 och tabell 1) annarsingen skillnad i jämförelse med de andra proven.DiskussionDet som var förvånande var att redan efter soxhletextraktionen visade TLC en separation avde olika alkaloiderna. Det förväntade resultatet var att första provet skulle visa en prick somvandrat, att provet efter upparbetningen skulle separera lite och fullständig separation förstefter fastfasextraktionen.Referenser1. Samuelsson G. (2004) Drugs of Natural Origin. Swedish Pharmaceutical Press,Sweden.2. Harwood L.M. Moody C.J. Perry J.M. (1999) Experimental Organic Chemistry.Replika Press, India3. http://www.fass.se/LIF/home/index.jspReferens hämtad 2009-05-284. http://www.campbell.edu/faculty/jung/images/Soxhlet.gifReferens hämtad 2009-05-285. http://www.biotage.com/DynPage.aspx?id=36890Referens hämtad 2009-05-288