Så fäster embryot i livmoderslemhinnan Musslor och patogena ...

Faktorer av betydelse föratt ett embryo ska fastnaAV ANNELI STAVREUS-EVERSAndelen ofrivilligt barnlösa par uppgårtill cirka 10-15 % av befolkningen.Ofrivillig barnlöshet lederofta till en existentiell kris för dem somdrabbas. Behandlingen är ofta både psykisktoch fysiskt krävande, vilket ledertill försämrad livskvalitet och nedsatt arbetsförmåga.Detta leder till stora ekonomiskauppoffringar både för samhälletoch för de drabbade barnlösa paren.Provrörsbefruktning är den effektivastemetoden för att hjälpa dessa par, och ungefärhälften blir gravida efter behandling.För att öka antalet graviditeter efterprovrörsbefruktning behövs större kunskapdels om vilka egenskaper endometriet(livmoderslemhinnan) måste haför att kunna ta emot det befruktade ägget,och dels om själva implantationsprocessen,d.v.s. den process där detbefruktade ägget fäster och tränger in iendometriet.Vi har använt två olika tillvägagångssättför att öka kunskapen om implantationsprocessen.Det första är att odlasmå bitar av endometrium, för att kunnastudera vad som händer när man exponerarden för ett befruktat ägg. Det andraär att studera vad som händer i livmoderslemhinnannär den gör sig redo att taemot ett befruktat ägg.ImplantationsprocessenBefruktningen av ägget sker vanligtvis iäggledaren, och embryot transporterastill endometriet genom muskelkontraktioneroch med hjälp av cilier. Undertransporten genomgår det tidiga embryoten serie av förändringar fram till bildandeav en blastocyst, när embryot ärcirka en vecka gammalt. Utvecklingenav embryot måste vara synkroniseradmed utvecklingen av endometriet för atten implantation ska kunna ske.Implantationen sker i flera steg, apposition,adhesion och penetration. Underappositionen kommer blastocysten i närakontakt med endometriet, och kan signalerasin närvaro med olika tillväxtfaktoreroch cytokiner till ytepitelet. NästaAC20µm10µmFigur 1. Läkningsprocessen i det humana endometriet. A: Körtel som harskurits av med kniv. B: Körtel efter 8 timmars odling. Epitelcellerna migrerarut för att försöka täcka skadan. C: Ytepitel. Cellerna är uppradade på ytan.D: Ytepitel efter 8 timmars odling. Epitelcellerna täcker den skadade kanten.steg är adhesionsfasen när blastocystensitter tillräckligt fast i endometriet för attinte kunna spolas bort. Under detta stegökar decidualiseringen, en biokemiskoch morfologisk förändring av det underliggandestromat. Decidualiseringensfunktioner är att förse embryot mednäring och att skydda embryot från attavstötas genom en immunologisk reaktionfrån modern. Under nästa steg penetrerartrofoblasterna, (de celler somkommer att bilda en placenta), ner i endometriet.Hela embryot kommer att penetreraner i endometriet varefter en läkningsprocessstartar och ytepitelet heltkommer att täcka det invaderade embryot.Våra kunskaper om vad som sker underimplantationsprocessen är mycketBD100µm10µmbegränsade. Av självklara etiska skälkan man inte studera den humana implantationsprocessenin vivo. Dessutomskiljer sig den humana implantationsprocessenfrån alla andra arter. Det endamöjliga sättet att studera den humanaimplantationsprocessen är därför genomatt använda olika odlingsmodeller. Enmöjlig metod är att odla endometriumsom cellkultur uppbyggd i flera lager.Det undre lagret består av stromacellersom odlas i matrigel, ovanpå detta ettfilter, och överst att lager epitelceller.Detta system är användbart när man villstudera hur olika celltyper i endometrietpåverkar varandra, och har även använtsför att studera de initiala faserna av implantationsprocessen(1). Nackdelen10 LABORATORIET 1/2003

A B CD E FFigur 2. Förändringar av ytepitelet under sekretionsfas. A: Två dagar efterLH-toppen. De cilierade cellerna ser ut som små buskar. De mikrovillibekläddacellerna är lite rundade. B: Fem dagar efter LH-toppen ser man hur de mikrovillibekläddacellerna börjar växa uppåt. C: Sex dagar efter LH-toppen, ochman ser hur de mikrovillibeklädda cellerna är ytterligare större. Mikrovillin börjarförsvinna. D: Sju dagar efter LH-toppen har de mikrovillibärande cellernafullt utvecklade pinopoder som är nästan helt släta på ytan. E: Åtta dagar efterLH. Pinopoderna börjar minska i storlek. F: Nio dagar efter LH-toppen.De mikrovillibärande cellerna har nu återtagit sin ursprungliga storlek.med den här typen av cellodlingssystemär att det saknas flera celltyper som t.ex.NK-celler. Dessutom saknas också fleraviktiga strukturer som t.ex. körtlar ochspiralartärer. Dessa celler är viktiga fören fungerande implantationsprocess.Vi har därför valt att odla endometrietsom en vävnadskultur, med alla celleroch strukturer intakta. Denna modell harvisat sig fungera så bra att det har varitmöjligt att få en implantation av ettmänskligt embryo in vitro (2). Detta varemellertid svårt att upprepa, så vi hardärför optimerat odlingsmetodiken. Syrekoncentrationenär låg i livmodern sådet är bättre att odla endometriet i 5 %syrgas i stället för 20 % som är meravanligt. Det är också viktigt att man intetar endometriebiopsin sent i cykeln.Om det inte sker någon implantationkommer livmoderslemhinnan att brytasner och försvinna i nästa menstruation.Detta inträffar också när livmoderslemhinnanska odlas. Dessutom är det braatt använda ett medium rikt på näringsämnenoch att odla biopsin påMatrigel för att vävnaden ska må bra(3).Hormonellaförändringar undermenstruationscykelnMenstruationscykeln kan delas in i proliferationsfasoch sekretionsfas. Underproliferationsfasen bryts livmoderslemhinnanförst ner genom apoptos ochnekros under menstruationen, för att sedanbyggas upp igen. Denna läkningsprocess,som sker utan ärrbildning,kan även studeras i vävnadskultur(Figur 1) (3). Proliferationsfasen, somvarar från menstruationens första dagtill ägglossning, karaktäriseras avtillväxt av livmoderslemhinnan genomhypertrofi, ökad DNA syntes och mitoser.Sekretionsfasen sträcker sig underfjorton dagar efter ägglossning. Implantationsfönstret,den korta tid ett embryokan fästa vid livmoderslemhinnan, inträffarcirka sju dagar efter ägglossning.Sekretionsfasen domineras av progesteron,som är helt nödvändigt för att endometrietska utvecklas och kunna taemot ett embryo.Morfologiskaförändringar underimplantationsfönstretVid tiden för implantation sker storamorfologiska förändringar på endometrietsyta. Ytepitelet består av cilieradeceller och mikrovillibärande celler.Funktionen hos de cilierade cellerna ärsom hos alla slemhinnor att förflytta sådantsom kan finnas på ytan. De mikrovillibärandecellerna bildar pinopoder,(svampliknande ytstrukturer), på endometrietsyta under implantationsfönstret.Det är inte känt vilken funktion dessapinopoder har, men det finns indikationeratt de dels är involverade i kommunikationenmellan embryo och endometrium,dels underlättar vidhäftning avembryot till livmoderslemhinnan ochdärmed underlättar den fortsatta implantationsprocessen.Dessutom är de storanog för att täcka cilierna och därmedhindra dessa från att förflytta substanseröver ytan.Under ytepitelet finns huvudsakligenstroma och körtelepitel. Dessutom finnsolika typer av immunkompetenta cellerLABORATORIET 1/2003 11

LIF-receptorHB-EGFFöre pinopoder Pinopoder Efter pinopoderFigur 3. Med immunhistokemi kan man se hur både LIF receptorn och HB-EGF ökar när pinopoderfinns utvecklade på endometriets yta. Den bruna färgen visar att proteinet finns närvarande.och en kärlstruktur. Alla dessa genomgårstora morfologiska förändringar undercykeln.Med hjälp av svepelektronmikroskopikan man se hur pinopoderna bildas påendometriets yta (Figur 2). Genom attfölja förändringar i endometriet undercykeln, kan man se när implantationsfönstretinträffar. Pinopoderna bildasnär progesteronnivåerna i serum ärsom högst under cykeln (4), vilket hosde flesta kvinnor inträffar 7 dagar efteratt hypofysen har signalerat med LH(Luteinizing hormone) om att en ägglossningska inträffa. Pinopoder bildasäven om ingen befruktning av ägget harskett. Pinopoderna är möjliga att se ocksåi vanligt ljusmikroskop, förutsatt attendometriet är snittat vinkelrätt mot endometrietsyta, men det krävs svepelektronmikroskopiför att datera endometrietmed hjälp av ytstrukturen.Biokemiskaförändringar underimplantationsfönstretDet befruktade ägget och livmoderslemhinnanmåste kunna kommunicera medvarandra. Den första signalen från embryotär human chorionic gonadotropin(hCG). Denna signal ändrar cyklisitetentill ett kontinuerligt förlopp. Det är troligtatt embryot påverkar utvecklingenav livmoderslemhinnan.Leukemia inhibitory factor (LIF) ären cytokin som behövs för en fungerandeimplantation. Detta visades först iknockout möss med genen för LIF utslagen.I dessa mushonor implanteradeinte musembryot, även om dessa komfrån en normal mus (5). Det är också troligtatt LIF har betydelse för den humanaimplantationsprocessen (6). LIF ökartydligast i endometriets körtelepitelsamtidigt som LIF-receptorn ökar i endometrietsytepitel vid tiden för implantation(Figur 3) (7). Det är därför troligtatt LIF är viktigt både vid signaleringenProgesteronLIFLIF-receptorLIFTrxROS?GrxErbB4HB-EGFIntegrin v3Figur 4. Förenklad schematisk bildöver den initiala fasen av den humanaimplantationsprocessen. Progesteronär viktigt för att endometrietska utvecklas och bli mottagligt förett embryo. Leukemia inhibitory factor(LIF) syntetiseras både av embryotoch endometriet, och antalet LIFreceptorerökar i ytepitelet vid tidenför implantation. Embryot syntetiserarfria radikaler, och det spekuleras i attdetta skulle kunna vara en signal tillendometriet. Glutaredoxin (Grx) ökari pinopoderna vid tiden för implantationmedan thioredoxin (Trx) finnsnärvarande i endometriet under helacykeln. Grx och Trx har troligen ocksåtill uppgift att ta hand om fria radikalersom bildas under implantationsprocessen.Heparin binding epidermalgrowth factor-like growth factor(HB-EGF) finns i ytepitelet i ökadmängd under implantationsfönstret.HB-EGF syntetiseras av endometrietoch binder till receptorer på blastocystensyta. HB-EGF kan också finnaspå pinopodernas yta, och kantillsammans med integrinavb3 bildaett komplex som kan främja adhesionav blastocysten.12 LABORATORIET 1/2003

mellan blastocysten och endometrietoch också under senare skeden av implantationsprocessen(Figur 4).HB-EGF (heparin-binding epidermalgrowth factor-like growth factor) är entillväxtfaktor, som dels kan finnas bundenpå cellytan eller dels som obundentillväxtfaktor som signalsubstans mellanceller (8). Vi har använt både vanligimmunhistokemi och konfokalmikroskopiför att visa att HB-EGF ökar iendometriet när pinopoderna finns närvarande,och finns både cytosolärt ochsom en faktor bunden på pinopodernasyta (Figur 3 och 5) (9). Detta pekar motatt HB-EGF har flera olika funktionerunder implantationsprocessen: delssom kommunikationssubstans mellandet befruktade ägget och livmoderslemhinnan,och dels som en faktor som underlättarvidhäftningen av det befruktadeägget till livmoderslemhinnan(Figur 3).Vid biokemiska processer bildas friaradikaler (reaktiva ämnen) som kroppenmåste försvara sig emot. Glutaredoxinär ett ämne som används av kroppensom skydd mot fria radikaler. Detta ämnefinns rikligt representerat i pinopoderna(10), och fungerar troligen som ettskydd både för embryot och för livmoderslemhinnanunder implantationsprocessen.Det är också tänkbart att blastocystensignalerar med hjälp av fria radikaler(Figur 4).Klinisk relevansSom en fortsättning på projektet ska vistudera livmoderslemhinnan från kvinnorsom inte kan bli gravida. Det ger enmöjlighet att kunna hitta skillnader mellanfertila och icke fertila kvinnor, vilketkan skapa förutsättningar att utveckla enny typ av behandling vid provrörsbefruktning.Genom att ta biopsier frånkvinnor som går igenom provrörsbefruktning,kan man avgöra om livmoderslemhinnanmognar på rätt sätt, ochman kan därmed avgöra när man ska göraembryotransfer, och om man i sådanafall behöver ge kvinnorna extra progesteron.Det finns kvinnor som trots återinföringav normala embryon inte blir gravidautan att det går att hitta en orsak tillinfertiliteten. Det finns då skäl att misstänkaatt livmoderslemhinnan är defektoch därför inte blir mottaglig för ett embryo.Vi har idag inga diagnostiska markörerför att upptäcka onormala egenskaperhos livmoderslemhinnan. Vårastudier kan bidra till att hitta sådanamarkörerEn onormal implantationsprocess kanleda till preeclapsi (havandeskapsförgiftning).Med en ökad kunskap om implantationsprocessenskulle man eventuelltkunna förhindra att dessa fall inträffari framtiden.En ökad kunskap om implantationsprocessenskulle också på sikt ocksåkunna leda till att nya typer av preventivmedelutvecklas.Referenser1. Bentin-Ley U., Horn T., Sjögren A., SorensenS., Falck-Larsen J., Hamberger L.Ultrastructure of human blastocystendometrialinteractions in vitro.J Reprod Fertil 120, 337-350 (2000)2. Landgren B-M., Johannisson E.,Stavreus-Evers A., Hamberger L.,Eriksson H. A new method to study theprocess of implantation of a humanblastocyst in vitro.Fertil Steril 65, 1067-1069 (1996)3. Stavreus-Evers A., Hovatta O., ErikssonH., Landgren B-M. Development andcharacterization of an endometrial tissueculture system. Manuscript (2003)4. Stavreus-Evers A., Nikas G., Sahlin L.,Eriksson H., Landgren B-M. Formation ofpinopodes in human endometrium isassociated with the concentrations ofprogesterone and progesterone receptors.Fertil Steril 76, 782-791 (2001).5. Stewart C.L., Kaspar P., Brunel L.J.,Bhatt H., Gadi I., Kotgen F. Blastocystimplantation depends on maternalexpression of leukemia inhibitory factor.Nature 359, 76-79 (1992)6. Tsai H-D., Chang C-C., Hsieh Y-Y., LoH-Y. Leukemia inhibitory factor expressionin different endometrial locationsbetween fertile and infertile womenthroughout different menstrual phases.J Ass Reprod Fertil 17, 415-418 (2000)7. Aghajanova L., Stavreus-Evers A.,Nikas Y., Hovatta O., Landgren B-M.Co expression of pinopodes andleukemia inhibitory factor, as well as itsreceptor in human endometrium.Fertil Steril in press 20038. Raab G., Klagsbrun M. Heparin bindingEGF-like growth factor. Biochim BiophysActa 1333, F179-F200 (1997)9. Stavreus-Evers A., Aghajanova L.,Brismar H., Eriksson H., Landgren B-M.,Hovatta O. Coexistence of heparinbindingepidermal growth factor-likegrowth factor and pinopodes in thehuman endometrium at the time ofimplantation.Mol Hum Reprod 8, 765-769 (2002a)10.Stavreus-Evers A., Masironi B., LandgrenB-M., Holmgren A., Eriksson H., Sahlin L.Immunohistochemical localization ofglutaredoxin and thioredoxin in humanendometrium: a possible association withpinopodes.Mol Hum Reprod 8, 546-551 (2002b)Artikeln beskriver det forskningsområdesom Anneli Stavreus-Evers disputeradepå hösten 2002. Hon är presenteradi Laboratoriet 6/2002.Figur 5. Konfokalmikroskopisk bild som visar att HB-EGF finns i cytoplasman,men också på ytan av pinopoderna.LABORATORIET 1/2003 13