[PDF]ECL Select検出マニュアル

ECL Select Western Blotting
Detection System 検 出 マニュアル
1. メンブレンの 準 備
電 気 泳 動 の 後 、メンブレンへの 転 写 を 行 います。
転 写 後 のメンブレンを 保 存 する 場 合 には、PBS-T or TBS-T で 2~8℃で 保 存 します。
2. ブロッキング 以 降 の 準 備
検 出 まで 一 気 に 作 業 するため 前 もって 準 備 しておきます。
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ブロッキング 剤
ブロッキング 剤 は PBS-T or TBS-T に 溶 解 し、2~5% 濃 度 で 使 用 します。 以 下 のブロッキ
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ング 剤 を 利 用 できます。
• Amersham ECL Prime Blocking Agent(RPN418)
• Amersham ECL Blocking Agent(RPN2125)
• BSA Blocking Agent
• Non-fat dry milk
洗 浄 バッファー(PBS-T or TBS-T)の 調 製
一 次 抗 体 、HRP 標 識 二 次 抗 体
CCD イメージャー or 暗 室 の 予 約
3. ブロッキング
1. 転 写 後 のメンブレンをブロッキング 剤 に 浸 します。
2. 室 温 で 1 時 間 、もしくは 2~8℃でオーバーナイト 振 盪 します。
3. 新 しい 洗 浄 バッファーに 浸 して 2 回 すすぎます。

4. 一 次 抗 体 反 応
準 備 :
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一 次 抗 体 、 二 次 抗 体 の 希 釈
ECL Select で 推 奨 される 抗 体 濃 度 は 次 の 通 りです。1 mg/ml 濃 度 のストック 液 の 希 釈 率
の 場 合 。
一 般 的 なガイドライン
一 次 抗 体 のアフィ 二 ティーの
違 いによる 目 安
高 アフィ 二 ティー
低 アフィ 二 ティー
一 次 抗 体 1:5,000~1:30,000 1:10,000 1:5,000
二 次 抗 体 1:100,000~1:300,000 1:150,000 1:100,000
1. PBS-T or TBS-T で 希 釈 した 一 次 抗 体 にメンブレンを 浸 します。
2. 室 温 で 1 時 間 、もしくは 2~8℃でオーバーナイトで 振 盪 します。
3. メンブレンを 新 しい 洗 浄 バッファーに 浸 して 2 回 すすぎます。
4. 新 しい 洗 浄 バッファーに 浸 して 室 温 で 振 盪 して 洗 浄 します。 洗 浄 回 数 は 次 の 通 りです。
(5 分 間 ×4~6 回 )
• 洗 浄 液 はメンブレン 1 cm 2 あたり 4 ml 使 用 します。8×10 cm のメンブレンであれば 320 ml が 目 安
です。
• X 線 フィルムで 検 出 する 場 合 は 6 回 洗 浄 することで、バックグラウンドを 抑 えられます。
5. 二 次 抗 体 反 応 (HRP 標 識 二 次 抗 体 を 使 用 する 場 合 )
1. PBS-T or TBS-T で 希 釈 した HRP 標 識 二 次 抗 体 にメンブレンを 浸 します。
2. 室 温 で 1 時 間 振 盪 します。
3. メンブレンを 新 しい 洗 浄 バッファーに 浸 して 2 回 すすぎます。
4. 洗 浄 バッファーに 浸 し、 室 温 で 振 盪 して 洗 浄 します。 洗 浄 回 数 は 次 の 通 りです。
(5 分 間 ×4~6 回 )
• 洗 浄 液 はメンブレン 1 cm 2 あたり 4 ml 使 用 します。8×10 cm のメンブレンであれば 320 ml が 目 安 で
す。
• X 線 フィルムで 検 出 する 場 合 は 6 回 洗 浄 することで、バックグラウンドを 抑 えられます。
6. 二 次 抗 体 反 応 (ビオチン 化 二 次 抗 体 と HRP 標 識 ストレプトアビジンを
使 用 する 場 合 )
1. PBS-T or TBS-T で 希 釈 したビオチン 化 二 次 抗 体 にメンブレンを 浸 します。
2. 室 温 で 1 時 間 振 盪 します。
3. 新 しい 洗 浄 バッファーに 浸 して 2 回 すすぎます。
4. 洗 浄 バッファーに 浸 し、 室 温 で 振 盪 して 洗 浄 します。 洗 浄 回 数 は 次 の 通 りです。
(5 分 間 ×4~6 回 )
• 洗 浄 液 はメンブレン 1 cm 2 あたり 4 ml 使 用 します。8×10 cm のメンブレンであれば 320 ml が 目 安 で

す。
• X 線 フィルムで 検 出 する 場 合 は 6 回 洗 浄 することで、バックグラウンドを 抑 えられます。
5. PBS-T or TBS-T で 希 釈 した HRP 標 識 ストレプトアビジン(RPN1231-2ML)にメンブレン
を 浸 します。
6. 室 温 で 45 分 間 振 盪 します。
7. 新 しい 洗 浄 バッファーに 浸 して 2 回 すすぎます。
8. 洗 浄 バッファーに 浸 し、 室 温 で 振 盪 して 洗 浄 します。 洗 浄 回 数 は 次 の 通 りです。
(5 分 間 ×4~6 回 )
• 洗 浄 液 はメンブレン 1 cm 2 あたり 4 ml 使 用 します。8×10 cm のメンブレンであれば 320 ml が 目 安 で
す
• X 線 フィルムで 検 出 する 場 合 は 6 回 洗 浄 することで、バックグラウンドを 抑 えられます。
7. 検 出
準 備 :
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検 出 試 薬 の 調 製
1. ECL Select の Solution A、Solution B を 室 温 に 戻 します。
2. Solution A : Solution B = 1 : 1 の 割 合 で 混 合 します。
• メンブレン 1 cm2 あたり 0.1 ml の 検 出 試 薬 が 必 要 です。8×10 cm のメンブレンの 場 合 は 4 ml
Solution A、4 ml Solution B を 目 安 に 混 合 します。
• 試 薬 は 使 用 直 前 に 混 合 します。やむを 得 ずしばらく 置 く 場 合 はホイルで 包 むか 暗 所 に 保 存 しま
す。
1. メンブレン 上 の 水 気 を 切 ります。
• 余 分 な 洗 浄 バッファーが 残 っているとムラの 原 因 になります。
2. ラップ 上 にブロット 面 が 上 になるようにメンブレンを 置 き、 全 体 を 覆 うように 検 出 試
薬 をかけます。
3. 5 分 間 、 室 温 で 静 置 します。
4. メンブレンをピンセットでやさしくつまみ 上 げ、 端 を 紙 製 のウエスにつけて 余 分 な 検
出 試 薬 を 取 り 除 きます。
• 余 分 な 検 出 試 薬 が 残 っているとバックグラウンドの 原 因 になります。
5. 新 しいラップや OHP シートでメンブレンを 包 み、ブロット 面 が 上 になるように 設 置 し
ます。
• 気 泡 が 入 ったり、 皺 がよらないようにしてください。

8. CCD イメージャーでの 検 出 (ImageQuant LAS 4000 シリーズの 場 合 )
1. EPI トレイを ImageQuant LAS 4000 本 体 にいれ、 扉 を 閉 じます。
2. メソッドで Chemiluminescence( 化 学 発 光 )を 選 択 し、その 他 トレイ 位 置 、 感 度 ・ 解 像
度 、 露 出 方 法 や 時 間 を 実 験 の 目 的 やサンプルにあわせて 調 整 します。
• 条 件 検 討 開 始 の 推 奨 露 出 時 間 は 60 秒 です。
• 8×10 cm のメンブレンの 場 合 、トレイ 位 置 は 2 段 目 を 設 定 します。
• X 線 フィルムと 同 等 の 感 度 で 撮 影 したい 場 合 には、 感 度 を High に 設 定 します。
• 適 切 な 露 出 時 間 が 分 からない 場 合 には、 露 出 方 法 で Increment( 逐 次 撮 影 )を 用 います。
3. ヒストグラムを 参 考 に、 適 切 な 露 出 が 得 られた 画 像 を 保 存 します。
• 全 体 にバックグラウンドがみられる 場 合 は、メンブレンを PBS-T or TBS-T で 10 分 間 2 回 洗 浄 した 後 、
再 度 7. 検 出 の 1 からくり 返 します。
9. X 線 フィルムでの 検 出
1. フィルムカセットにメンブレンをブロット 面 を 上 (X 線 フィルム 側 )にして 置 きます。
その 上 に X 線 フィルムをのせてカセットを 閉 じます。
• 赤 色 安 全 光 の 下 で 作 業 してください。
• フィルムカセット 内 に 検 出 試 薬 がつかないように 注 意 します。
• X 線 フィルムの 右 端 を 折 るなどして 上 下 、 裏 表 の 目 印 とします。
2. 30 秒 ~ 数 分 間 露 出 します。
• 目 的 タンパク 質 の 量 が 微 量 である、シグナルが 弱 い 場 合 は、 露 光 時 間 を 長 くします。5 分 間 以 上 が 目
安 です。
3. X 線 フィルムを 現 像 します。
• 検 出 後 のメンブレンは PBS-T or TBS-T ですすいだ 後 、ラップに 包 んで 2~8℃で 1 週 間 保 存 できます。
• 全 体 にバックグラウンドが 見 られる 場 合 は、メンブレンを PBS-T or TBS-T で 10 分 間 2 回 洗 浄 した 後 、
再 度 7. 検 出 の 1 からくり 返 します。
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