Mikrobiologiska provtagningsplaner och kriterier ... - Svensk Mjölk

EN RAPPORT FRÅN SVENSK MJÖLK FORSKNING Rapport nr: 7082-P
2009-06-15
Mikrobiologiska provtagningsplaner
och kriterier - vägledning och
rekommendationer för tillämpning
Anders Christiansson

Mikrobiologiska provtagningsplaner och
kriterier - vägledning och rekommendationer
för tillämpning
Anders Christiansson
Sammanfattning
I förordning (EG) 2073/2005 om mikrobiologiska kriterier för livsmedel
föreskrivs mikrobiologiska provtagningsplaner som ska användas för att de
mikrobiologiska kriterierna ska kunna tillämpas på ett enhetligt sätt. Dessa
provtagningsplaner kan vara svåra att förstå (n, m, M och c) och därmed
försvåras deras tillämpning. I denna rapport ges en förklaring över viktiga
begrepp. Statistiken bakom provtagningsplanerna och kriterierna förklaras och
simuleringar har utförts för att illustrera analysresultat som erhålls under olika
hög kontaminationsfrekvens för mejeriprodukter.
Mejeriernas gemensamma tolkning av minimikravet för att uppfylla kriterierna
inklusive provtagningsplaner förklaras också. För att kunna tillämpa
provtagningsplanen måste storleken på ett livsmedelsparti (en batch)
definieras, d.v.s. en grupp eller samling identifierbara produkter som erhålls
från en viss process under praktiskt taget identiska förhållanden och som
framställs under en fastställd produktionsperiod. Processhygienkriterierna är
till för att långsiktigt kunna visa att processen är under kontroll. Baserat på
rapporten definieras partiet som produktionen för en given förpackningsmaskin
eller processlinje under en vecka. Ett processhygienkrav med n=5 och
c=2 enligt förordningen om mikrobiologiska kriterier har översatts till att minst
5 prover ska tas under veckan fördelat över dagarna och att 100% av veckans
proverna ska understiga M men 40% får överstiga m för en given förpackningsmaskin
eller processlinje. De provtagningsfrekvenser som anges i branchriktlinjen
är minimifrekvenser som kan tillämpas för en produktion som är under
styrning. Fler prover kan tas ut för linjer som är hårdast belastade och antalet
positiva prover uttrycks då i % av samtliga uttagna.
Fördelen med att fördela proverna över flera dagar är att en signal ges snabbare
och till lägst kostnad om processhygienen skulle försämras. Normalt sett är
sannolikheten för att få utslag med 3 eller flera prover per vecka mycket låg för
flertalet parametrar. Två eller flera fynd av återkontamination under en vecka
är ett tecken på att processhygienen försämrats och att detta bör följs upp. Det
är inte ekonomiskt rimligt att ta fem prover per maskin och dag om inte
uppenbara problem föreligger och resultatens användbarhet motsvarar inte
kostnaden. En alternativ metod med uttag av ett prov med fem delprov vid en
dag per vecka medför längre fördröjning i analyssvaren. Det är lättare att förstå
andelen prover uttryckta i % i förhållande till kriteriegränserna än som n=5,
c=2. Termerna m, M, n och c är abstrakta för produktionspersonalen.
1

Inledning
I förordning (EG) 2073/2005 om mikrobiologiska kriterier för livsmedel
föreskrivs mikrobiologiska provtagningsplaner som ska användas för att de
mikrobiologiska kriterierna ska kunna tillämpas på ett enhetligt sätt (1).
Provtagningsplanerna kan vara ganska svåra att förstå och därmed försvåras
deras tillämpning. I detta dokument ges en förklaring över viktiga begrepp som
krävs för förståelsen. Mejeriernas gemensamma tolkning av minimikravet för
att uppfylla kriterierna inklusive provtagningsplaner förklaras också.
Bedömningarna i kriterierna grundar sig inte på ett enstaka analysvärde utan
flera analyser görs för att öka säkerheten, eftersom analysvärdena varierar
mellan upprepade analyser. Två typer av provtagningsplaner används. För
livsmedelssäkerhetskriterierna används tvåklass-planer där n anger antalet
enheter av provet som ska tas ut och m anger den halt som inte får överskridas.
Ofta anges frihet i 10 eller 25 g. Antalet prover (n) är större vid allvarligare
faror. För processhygienkriterierna används treklass-planer där n anger antalet
prover som tas ut, m den halt som det är önskvärt att inte överstiga, M den halt
som inte bör överskridas och c det antal prover som får överstiga m men inte
M. För att kunna tillämpa kriterierna är det viktigt att definiera en batch (ett
parti), d.v.s. en grupp eller samling identifierbara produkter som erhålls från
en viss process under praktiskt taget identiska förhållanden och som framställs
under en fastställd produktionsperiod.
I denna rapport redovisas konsekvenser av att välja olika definitioner av en
batch ifråga om utfall av analysresultat och deras tolkning. Statistiken bakom
provtagningsplanerna och kriterierna förklaras och simuleringar har utförts för
att illustrera analysresultat som erhålls under olika hög kontaminationsfrekvens
för mejeriprodukter. Simuleringarna har utförts i @Risk för Excel, ver
5.1 (Palisade Corp., N.Y., USA.). Exempel från olika anläggningar används som
motiv för den tillämpning av provtagningsplanerna som rekommenderas i
branschriktlinjen.
Variation i analysresultat
I samband med provtagning och analys av mikroorganismer förekommer alltid
en viss variation i analysresultat vid upprepad analys av samma provtagningsobjekt.
Detta beror på flera faktorer såsom processvariationer, slumpvariation
vid provtagning (spridningen runt medelvärdet är ofta men inte alltid normalfördelad,
heterogenitet kan förekomma), slumpvariation vid plattspridning
(mikroorganismer i ett prov anses oftast vara Poissonfördelade), variation
mellan olika laboranter, pipetteringsfel m.m.
Figur 1 visar ett exempel på simulering av slumpmässig variation i analysresultat
vid upprepad provtagning från samma provkälla (medelvärdet för halt
bakterier är 100/g (log 2,0/g), standardavvikelse 0,6 logenheter för processvariation
och provuttaget och standardavvikelse 0,25 logenheter för analysvärdet.
Figuren kan representera t.ex. halten av E. coli i ost under ett år när
produktionshygienen är mycket 0tillfredställande.
2

Log cfu/g
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
Dålig hygien
0.00
0
-0.50
50 100 150 200
Dag nr
250 300 350 400
Figur 1 Simulerad variation i analysresultat för E. coli i ost med medelvärde 100/g inklusive
variationsorsaker i osten och variation p.g.a. analysmetoden. Övre feta linjen: M, nedre: m.
För samma osttillverkning skulle värden från < 1 cfu/g (log 0/g) upp till
5000/g (log 3.7/g) kunna erhållas, men flertalet analysresultat skulle ligga
mellan 30 och 300 cfu/g (log 1,5 – 2,5/g). Hälften av analysvärdena skulle
överstiga 100/g, vilket är det gränsvärde för E. coli i ost som det är önskvärt att
inte överskrida om processhygienen är god (m= log 2), enligt de
mikrobiologiska kriterierna i förordning (EG) 2073/2005. I kriterierna anges
också en övre gräns log 3/g (M=log 3) vilken inte bör överskridas. Det är därför
viktigt att känna till och ta hänsyn till analysvariationen när kvalitetsanalyser
används för bedömning av mikrobiologiska kriterier. För att säkert ligga under
kriteriegränserna krävs att medelvärdet på produktionen är lägre med en
tillräcklig säkerhetsmarginal. Men förordningen tar hänsyn till dessa
variationskällor förekommer genom att ange att 2 av 5 prover får överskrida m
men inte M (se nedan).
3

Log cuf/g
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
-1.00
-1.50
Bra hygien
0.00
0
-0.50
50 100 150 200 250 300 350 400
Figur 2. Variation i simulerade analysresultat för ost med medelvärde 10/g inklusive variation i osten och
variation p.g.a. analysmetoden. Övre feta linjen: M, nedre: m.
Dag
Figur 2 visar samma sak men nu med förbättrad hygien med medelvärdet 10/g
(log cfu/g =1,0), med samma standardavvikelser som i fig 1. Vid denna
hygiennivå kommer värdet m (log 2) sällan att överskridas och värdet M (log 3)
överskrids inte. Vid ytterligare hygienförbättringar sänks medelvärdet
ytterligare och risken att överskrida kriterierna elimineras då.
Exempel från ett ostmejeri:
Enterobacteriacae analyserades dagligen för färsk ost, med ett prov per
ystning. Endast ett prov under 4 månader översteg detektionsgränsen för
metoden (10-50/gram beroende på sammanslagning av vissa prover till ett
samlingsprov före analys). Värdet var 80/g. Inget värde översteg 100/g.
Eftersom E. coli ingår i gruppen Enterobacteriaceae så uppfylldes också
kriteriet för E. coli i ost enligt förordningen. Processen är under god kontroll,
och risken att något värde ska överskrida 100/g är mycket liten.
Provtagningsplaner
A. Tvåklassplaner
Vid analys av patogena bakterier är det viktigt att kunna påvisa förekomst i låga
halter i livsmedel. Chansen att hitta bakterien ökar med provets storlek.
Dessutom kan flera (del)prover av samma storlek tas ut och analyseras. För
salmonella i mjölkpulver gäller t.ex. provtagning med 5 delprover om 25 g, som
analyseras var för sig. Kravet är att Salmonella inte får påvisas i något delprov.
Detta är en s.k. tvåklassplan med n=5 (antal prover), m=0.04/g (negativt i 25
g) och c=0 (ingen förekomst i något prov). Om halten är låg så är också
sannolikheten för fynd av salmonella i det enskilda delprovet lågt (Fig. 3).
4

Figur 3. Sannolikheten för att godkänna ett livsmedelsparti beroende på andelen kontaminerade delprover
(proportion defective).
Beräkningarna för kurvor som i figur 3 bygger på beräkningar med
binomialfördelningen för det antal delprov (t.ex. n=5) och den andel sant
kontaminerade prover (proportion defective i figuren; pd-värde) som ska
beräknas. P acceptance (Pacc) visar sannolikheten vid uttag av 5 prov att alla
dessa är fria från kontamination. För varje pd-värde beräknas med hjälp av
binomialfördelningen sannolikheten för frånvaro av fynd i alla delproven, se
exempel i Figur 4. Pacc d.v.s. sannolikheten att få noll positiva prov är 33%.
Det framgår av figuren att med 5 delprov och med andelen kontaminerade
prover pd=0,2 så kan analysresultatet variera åtskilligt. Antalet positiva
delprover kan variera mellan 0 och 4 med olika stor sannolikhet. Det mest
sannolika utslaget är ett positivt delprov (41% sannolikhet).
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
-1
0
Binomial(5; 0.2)
1
2
3
4
5
6
67.2%
-0.700 0.500
Figur 4. Sannolikheten för olika utslag för binomialfördelningen när pd är 0,2 och n=5. Sannolikheten för att
få noll som utslag i alla delprover är 32,8 %.
Observera att hög chans för underkännande (låg Pacc) blir det först vid ganska
höga andelar kontaminerade delprover (pd> 0,4) se figur 3. Låg frekvens av
kontamination upptäcks sällan (t.ex. vid pd=0,1). En förutsättning för att
tillämpa bionomialfördelningen är att bakterierna är slumpmässigt fördelade i
provet (pd är konstant) och att fördelningen i delproverna är oberoende av
varandra.
5

Genom analys av ett ökat antal delprover kan man öka sannolikheten att finna
t.ex. Salmonella (Figur 5). Av naturliga skäl används provtagningsplaner med
utökat antal provenheter (n>5) endast när särskilda behov föreligger.
Figur 5. Sannolikheten för att upptäcka och avvisa ett livsmedelsparti beroende på den sanna andelen
kontaminerade delprover (proportion defective) och antalet analyserade delprover (n).
Vid pd=0,2 är sannolikheten att godkänna partiet 33% med 5 delprover, 11%
med 10 delprover men endast 1% vid 20 delprover. Som framgår av Figur 5
finns risken att ett parti accepteras vid låg kontaminationsfrekvens även med
utökat antal delprov. Det strängaste kravet för salmonella i mjölkpulver till
modersmjölksersättning till spädbarn i förordningen är n=30 (i 25 delprover),
c=0.
B. Treklassplaner
Treklassplaner används i situationer där bedömningen är mindre kritisk än för
patogena bakterier, t.ex. för processhygienkriterier. När processhygienen
utvärderas finns det inga krav på att återkalla produkter eller stoppa processen,
som vid hälsofara, men hygienbrister ska åtgärdas. Bedömningen i kriterierna
kan därför vara mindre sträng.
Effekten av att införa ett värde c illustreras i figur 6, som gäller för
tvåklassplaner. Ju fler prover (c) som tillåts överstiga m, desto mindre
stringent blir provtagningsplanen, d.v.s. desto större chans är det att en
livsmedelsbatch accepteras vid en given kontaminationsfrekvens. I
tvåklassplaner värderas inte hur mycket m överskrids, bara andelen prover som
överskrider m.
I treklassplaner införs ytterligare ett selektionskriterium för livsmedelspartiet,
nämligen M. Om alla analysresultat understiger m är hygienen
tillfredsställande och om något värde överstiger M betecknas hygienen som
otillfredsställande. Av n analysresultat tillåts c stycken att överstiga gränsen m
(godtagbart med anmärkning) men inte M (otillfredsställande).
6

Figur 6 OC-kurvor för olika antal delprov (n) och olika kriterier för acceptans (c) för tvåklassplaner.
Acceptanskurvor för treklassplaner är tredimensionella och bygger
multinomialfördelningen eftersom sannolikheten för acceptans bygger både på
andelen värden över M (pd, ”proportion defective”) och på andelen i intervallet
m till M (pm, ”proportion marginally defective), se figur 7. Det är vanligt att n=5
och c=2 används i provtagningsplanerna i EU-förordningen. Sannolikheten att
provet godkänns (Pacc) kan beräknas för olika värden av pm och pd med hjälp av
ICMSF’s räkneark (2) som finns tillgängligt på internet. Ytterligare information
om provtagning för mikrobiologisk analys finns i ref (3).
Figur 7 OC-kurvor för treklassplan med n=5 och c=2.
Med ICMSFs räkneark kan också Pacc beräknas för olika två- och
treklassplaner vid givet medelvärde och standardavvikelse för
livsmedelsbatchen under förutsättning att analysdata är normalfördelade.
Figur 8 visar hur P (accept) varierar i en treklassplan när den sanna halten
bakterier/g i batchen antar olika värden och när standardavvikelsen för
medelvärdet är 0.65 log-enheter. I figuren är m=log 2 cfu/g och M=log 3 cfu/g.
Med ökande halt sjunker P (accept) alltmer brant när halten M närmar sig.
7

Större värde på c medför att fler analysresultat mellan m och M accepteras och
leder till ökad sannolikhet för acceptans. Genom denna konstruktion tas en viss
hänsyn till osäkerheten på grund av variationen i analysresultat.
Sannolikhet för acceptans
Provtagningsplan n=5 m=2 M=3, sdev = 0.65
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6
Log cfu/g
8
3-klass c=2
3-klass c=1
3-klass c=0
Figur 8. Inverkan av värdet på c med avseende på P(accept) vid ökande bakteriehalt.
Sammanställning av data om återkontamination
vid några olika mejerier
Nedanstående redovisning bygger på analysresultat (baserade på ett eller flera
prov per provtagningstillfälle) från olika mejerier med avseende på frekvensen
återkontamination av pastöriserad mjölk med Gramnegativa bakterier.
Analysmetoderna skiljer sig något åt i detaljerna men bygger på inkubering av
hela mjölkförpackningar vid 20-25°C ett dygn och sedan detektion av tillväxt av
gramnegativa bakterier genom utstryk eller spridning på VRBGA (mejeri A och
B). För en närmare beskrivning av metoden se (4). Mejeri C analyserade
Enterobacteriaceae genom plattspridning efter kylförvaring till bäst föredagen.
Alla kolonier räknades oavsett färg. Därför fångas även gramnegativa
bakterier i stort sett även med denna metod.
Tabell 1. Mejeri A. K-mjölk, Enterobacteriaceae förinkuberat prov 20°C, spridning på VRBGA
Maskin Antal Antal pos frekvens
1 167 1 0.006
2 105 0 0.000
3 61 0 0.000
4 105 10 0.095
5 238 4 0.017
6 60 0 0.000
7 122 0 0.000
8 235 0 0.000
Summa 1093 15 0.014
Tid: 4 månader, mejeriinternt kriterium mer än 90% godkända under en
månad. Slumpmässig återkontamination utan systematik förekom. Andelen
prover med återkontamination varierade från 0% och upp till 9,5% beroende

på förpackningsmaskin. Den genomsnittliga återkontaminationsfrekvensen för
alla maskiner var 1,4% av proverna.
Tabell 2. Mejeri B. K-mjölk, gramnegativa bakterier, förinkuberat prov, ytspridning på VRBGA
Maskin Frekvens
1 0.297
2 0.069
3 0.02
4 0.128
5 0.269
6 0.016
7 0.012
medel 0.116
Tid 2 månader, mejeriinternt kriterium minst 90% godkända. Maskin 1, 4 och 5
hade en högre återkontaminationsfrekvens än de övriga, som låg på samma
nivå som maskinerna vid mejeri A.
Tabell 3. Mejeri C. K-mjölk, Enterobacteriaceae efter förvaring till bäst före-dagen
Antal Antal pos. Frekvens
Bäst före-dag(mittenpaket) 156 5 0.032
1a-paket b.f.-dag 187 12 0.064
Enterobact direkt Flera månader alltid negativt res.
Tid 2 månader, prover tagna från enstaka förpackningsmaskin. Även här var
återkontaminationsfrekvensen mycket låg. En ökad känslighet erhölls genom
att analysera första paket i produktionen. Genom att studera fördelningen av
återkontaminationstillfällena i tiden kunde det konstateras att
återkontamination skedde i huvudsak omedelbart efter helgerna.
Observera att analyskänsligheten för gramnegativmetoden och
Enterobacteriaceae-metoden är mycket olika. Enterobacteriacae-metoden
enligt de mikrobiologiska kriterierna har m< 1 cfu/ml, M=5/cfu/ml, n=5 och
c=2. d.v.s. mjölken får innehålla upp till 1 cfu/ml av Enterobacteriaceae för
nyförpackad mjölk. Gramnegativmetoden har en detektionsgräns som beror på
förpackningsvolymen, ofta 1 cfu per liter. Den senare detektionsgränsen är
mycket mera relevant än den första, eftersom återkontamination av gramnegativa
bakterier (oftast Pseudomonas, som kan tillväxa under kylförvaring av
mjölken) sker med enstaka bakterier per förpackning (4). Enterobacteriaceae
tillväxer mera sällan i kyla och detektionsnivån runt 1/ml är alldeles för hög.
Detta förklarar att mejeri C vid direktanalys av Enterobacteriaceae inte gjorde
något fynd under flera månaders tid, men väl påvisade bakterier efter kylförvaring
till bäst före-dagen.
Figur 9 visar en jämförelse mellan analysresultat för k-mjölk med gramnegativmetoden
(10 förpackningar/dag) och ordinarie analys av Enterobacteriaceae
(ett prov/dag) vid ett mejeri under en period av kvalitetsproblem. Y-axelns
skala anger både antal positiva prov av 10 för gramnegativmetoden och halten
Enterobacteriaceae/ml. Figuren visar tydligt gramnegativmetodens
överlägsenhet att tidigt upptäcka förekomst återkontamination. Analysresultat
för Enterobacteriaceae översteg 1 cfu/ml endast vid 1 tillfälle och 1/ml
9

tangerades vid 4 tillfällen. För gramnegativmetoden var 4 eller flera
förpackningar positiva (>40%) vid 10 av 51 dagar med positiva delprover.
Figur 9. Jämförelse mellan analys av inkuberat prov för gramnegativa bakterier (antal positiva prover av 10)
och analysresultat för Enterobacteriaceae (cfu/ml, se staplar med pilar).
Figuren visar tydligt att bedömning av Enterobacteriaceae i nyproducerad kmjölk
enligt kriterierna i förordningen (n=5, c=2, m

Figur 10. Förekomst av återkontamination (1) under 60 dagar för en väl fungerande förpackningsmaskin
Återkontamination
1
0
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61
Dag nr
Genomsnittlig halt återkontaminanter i mjölken: 0,027 per förpackning (oftast
en liter) (beräknat som MPN (mest sannolika antal) med hjälp av samtliga
positiva/negativa förpackningar under perioden). Vid en av dagarna med fynd
var mjölken från en produkttank kontaminerad. 5 av 6 paket var då positiva. I
de två övriga fallen rörde det sig om 1 positivt prov bland 6 paket. Den
slumpmässigt förekommande återkontaminationsfrekvensen ligger på nivån
1/0,03 d.v.s. cirka 1 per 33 förpackningar.
Antag att man följer en provtagningsplan enligt Enterobacteriaceae-kriterierna
för k-mjölk (n=5, c=2, m=1/ml, M=5/ml där delprov om 1 ml prov tas ut från 5
förpackningar dagligen, och att den genomsnittliga halten är
0,027/förpackning (p d). Chansen för fynd vid en delprovsvolym om 1 ml är
närmast obefintlig. Antag i stället att gramnegativa bakterier används som
(företagsinternt) mikrobiologiskt kriterium för k-mjölk med n=5 mjölkpaket
och c=2 och att positivt fynd avser växt i ett k-mjölkspaket. Detta motsvarar ett
krav att max 40% (2 av 5 paket) får innehålla gramnegativa bakterier.
Beräkningarna nedan är allmängiltiga och kan också tillämpas på alla
treklassplaner även där m och M anges som bakteriehalt. I vårt fall är m=0
positiva förpackningar och M=3 eller flera positiva förpackningar.
Antag att gramnegativmetoden används med n=5 och provvolymen är 1 l.
Sannolikheten att hitta ett prov där 3 eller flera av 5 delprover blir positiva vid
p d = 0,027 kan beräknas med binomialfördelningen till 0,02%, d.v.s.
provtagning med 5 delprover per dag är meningslös ur resurssynpunkt vid låg
återkontaminationsfrekvens även med gramnegativmetoden. Den enstaka
dagen när 5 av 6 paket var kontaminerade hade kunnat identifieras, men detta
förändrar inte bilden av att produktionen ur övergripande synpunkt var under
kontroll och då är inte 5 prover per dag motiverat av kostnadsskäl.
Exempel 2 (se Figur 11, sidan 12)
Förpackningsmaskin med relativt hög återkontaminationsfrekvens (36% av
förpackningarna enligt gramnegativmetoden). Antal analyserade paket per dag
11

var oftast 8-12, undantagsvis 5 eller max 13. Fynd gjordes av en eller flera
positiva förpackningar vid 43 av 50 testdagar.
Figur 11. Förekomst av återkontaminerade förpackningar (1) under 60 dagar för en förpackningsmaskin
som fungerar otillfredsställande.
Återkontamination
1
0
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61
Dag nr
Genomsnittlig halt återkontaminanter: 0,43 per förpackning (MPN, oftast per
liter). Observera den mycket låga genomsnittliga återkontaminationsgraden
(mindre än 1 cfu/förpackning). Provtagningsplan enligt Enterobacteriacaekriterierna
(3 eller flera prover om 1 ml positiva med < 5/ml och inget delprov
med>5/ml) skulle även i detta fall ha för låg känslighet.
Vilken återkontaminationsfrekvens krävs för att
få tre eller flera positiva prover av fem?
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
-1
0
Binomial(5; 0.36)
1
2
3
4
5
6
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-1
0
Binomial(5; 0.89)
1
2
3
4
12
5
6
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-0.2
0.0
Binomial(5; 0.03)
40.9%
1.4000
25.1%
1.1%
2.500
98.9%
5.600
85.9% 13.3% >
0.800 1.100 Figur
12. Sannolikheten att finna 0-5 positiva prover när 36, 89 respektive 3% av proverna är kontaminerade.
Sannolikheten för att finna 3 eller flera positiva prover av 5 (om positivt avser
t.ex. fynd av gramnegativa bakterier i en förpackning) med pd= 0,36 (andel
kontaminerade förpackningar) kan beräknas ur binomialfördelningen till 25%
(Figur 12). Figuren till vänster visar sannolikheten för olika antal positiva
prover när pd är 0,36 och 5 prover tas. Vid det enskilda tillfället kan allt mellan
0 och 5 positiva prover erhållas beroende på slumpen. Men chansen att inte
hitta något positivt prov är bara 10%. Om pd=0,89 så är chansen att finna 3
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2

eller flera positiva delprover 98,9%. Vid pd =0,03 och 5 delprov så är chansen
att inte få något positivt prov 85,9%, chansen att få ett positivt delprov 13,9 %
och chansen att få 2 positiva delprover 0,8% (jämför resonemanget ovan om
maskinen i figur 10, exempel 1). Figur 13 visar en jämförelse mellan
sannolikheten att få mer än två positiva delprover av fem och sannolikheten att
få positivt värde vid uttag av ett enda prov vid olika värden för pd. Chansen att
få utslag med 5 provsmetoden blir större än med ett prov när pd överstiger 0,5,
men skillnaden är inte dramatisk.
Figur 13 Sannolikhet att få 2 eller flera positiva delprover av fem, jämfört med sannolikheten att få positivt
utslag vid uttag av ett prov
Simulering av utfall vid varierande
återkontaminationsfrekvens
Resonemanget i figur 12 gäller om man anser att pd är konstant under hela
provtiden. Figur 9 och 14 visar att så inte är fallet. Data från mejerilinjerna
ovan tyder på antingen att ett eller flera slumpmässigt förhöjda värden
observeras vid enstaka dagar (figur 10) eller att långsamt stigande värden
uppträder i en trend över en längre tid som i figur 9 och 14. Enstaka
slumpmässigt höjda värden är inte möjliga att upptäcka och är inte heller
intressanta, såvida de inte överstiger M. De kan bero på tillfällig kontamination
eller på höga värden på grund av slumpen. Ökande värden i en trend är det
däremot önskvärt att upptäcka.
13

Figur 14. Variation i andelen kontaminerade förpackningar (P d) i en förpackningsmaskin över tiden under en
period med hygienproblem.
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
Andel kontaminerade förpackningar maskin 3
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47
Dag
14
prop defekta
Figur 14 visar att andelen positiva förpackningar vid en förpackningsmaskin
med hygienproblem varierade mellan 0-100% för olika dagar. Under dag 27-33
var andelen kontaminerade förpackningar 0,7-1,0.
Hur ofta är det rimligt att provta en förpackningsmaskin? Exemplen i figur 12
ovan visar att provtagning varje dag med minst 5 prover inte är meningsfull vid
låg återkontaminationsfrekvens medan vid mycket hög frekvens så fångas
återkontaminationen nästan alltid. Svaret måste bli en optimering mellan
kostnad och nytta. Figur 14 visar att andelen kontaminerade förpackningar kan
stiga från 0,6 till 1,0 på en 5-dagarsperiod, d.v.s. relativt snabbt.
Figur 15 visar utfallet av olika provtagningsstrategier under 30-dagarsperioder
genom simulering i @Risk. Simuleringarna baseras på varierande dagliga pdvärden
(andel återkontaminerade förpackningar) med periodvisa stigningar
med liknande hastighet som i figur 14. Figuren visar exempel på sex olika
upprepningar (iterationer) av simuleringsförloppet. Tre olika provtagningsstrategier
har prövats:
a) provtagning med 5 prover varje dag,
b) uttag av 5 prover under endast en dag per vecka (5-dagarsperiod) och
c) uttag av ett prov per dag under alla dagar i 5-dagarsperioden.
Antalet positiva analyser per dag har simulerats med binomialfördelningen
med aktuellt pd-värde och n=5 för alternativ a) och b). Vid alternativ c) har
dagligt pd-värde och n=1 simulerats med bionomialfördelningen och bedömts i
en provtagningsplan med n=5, c=2 efter 5 dygn. Önskvärt utslag är att oavsett
provtagningsstrategi så ska antalet positiva prover vara tre eller flera vid en
kontaminationsgrad (pd-värde) som överstiger 0,4, samt att antalet positiva
prover ska vara två eller färre vi pd

det beskrivna scenariot ger fem prov varje dag (strategi a) inte en bättre bild av
kontaminationsläget än fem prov en dag per vecka (strategi b). Daglig
provtagning med 5 prover innebär mycket slumpbrus. Fem prover tagna med
ett per dag ger en något sämre prediktion än ett prov om fem taget vid samma
dag, men skillnaden är inte stor.
Figur 15. Simulering av 30 analysdagar med olika provtagningsvarianter av treklassplan med n=5 och c=2.
En konstant återkontaminationsprofil (skalan till höger och svart heldragen linje) användes. 6 olika
upprepningar av samma scenario visas.
15

För att undersöka effekten av de olika provtagningsalternativen har 1000
iterationer av 30 dagars simulering genomförts med en och samma
(ovanstående) kontaminationsprofil. För varje iteration har enligt de olika
strategierna den ”sanna” återkontaminationsfrekvensen Pd jämförts med i vad
mån simuleringsutfallet i de olika provtagningsplanerna ger ”rätt signal” (mer
än 2 positiva delprover av 5) när Pd-värdet överstiger 0,4 (motsvarar högsta
tillåtna andelen prover mellan m och M enligt kriterierna i förordningen).
Utvärderingen har skett per 30-dagarsperiod. Detta innebär 30
bedömningstillfällen vid analys enligt alternativ a) och sex tillfällen vid
alternativ b) och c). Figur 16 visar den procentuella fördelningen av antalet
”korrekta” signaler med de olika provtagningsplanerna räknat per 30 dagar i
1000 iterationer. Prover med återkontaminationsfrekvens > 0,4 förekom under
drygt 3 perioder om 5 dagar.
16

Figur 16. Simulering av antalet "korrekta" varningssignaler (>2 positiva prover av 5 vid sann frekvens
kontamination >0.4) när olika provtagningsstrategier används över en 30-dagarsperiod baserat på
kontaminationsprofilen i figur 15. Figurerna visar den procentuella fördelningen av erhållna utslag baserat
på 1000 iterationer.
A B
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
Distribution for Signal:5 per dag/J34
Mean=9.857
0.000
4 8 12 16
5% 90% 5%
7 13
Jämförelse: kontaminationsfrekvens varje dag Jämförelse: medelkontaminationsfrekvens per vecka
Antal analyser per 30 dagar 150 Antal analyser per 30 dagar 30
Medeleffektivitet per 5 dagar 1.7 Medeleffektivitet 1.8
0.450
Distribution for Signal: 1 per vecka (5
prover)/L34
1.4
0.400
0.350
0.300
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
Mean=2.748
0.000
-1 0 1 2 3 4
7.8% 29.1% 63.1%
1.4 2.6
17
Distribution for Signal: 5*1 per dag/K34
0.500
1.4
0.450
0.400
0.350
0.300
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
Mean=1.776
0.000
-1 0 1 2 3 4
35.4% 46.4% 18.2%
1.4 2.5
0.450
Distribution for Signal: 1 per vecka (5
prover)/L34
1.4
0.400
0.350
0.300
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
Mean=2.272
0.000
-1 0 1 2 3 4
14.4% 42.9% 42.7%
1.4 2.6
Jämförelse: kontminationsgrad vid aktuell provdag Jämförelse: medelkontaminationsfrekvens per vecka
Antal analyser per 30 dagar 30 Antal analyser per 30 dagar 30
Medeleffektivitet 2.7 Medeleffektivitet 2.3
C1 C2
När provtagning görs varje dag med 5 prover per dag (alt. a) erhölls mellan 4
och 15 korrekta signaler per 30 dagar, med medelvärde 10. Detta provtagningsförfarande
ger det högsta antalet korrekta analyssvar. Men kostnaden per 30
dagar är hög, hela 150 analyser. För att kunna jämföra kostnadseffektiviteten
för alternativ a) med övriga alternativ dividerades det genomsnittliga antalet
positiva delprov per månad (10) med 6. Medeleffektiviteten (antal korrekta
signaler av samtliga räknat på en 5-dagarsperiod) blev då 1,7 korrekta signaler.
Simulering av provtagning med ett prov per dag och bedömning av 5 prov (alt.
b) gav i genomsnitt 1.8 korrekta signaler, med minimum noll och maximum 3
signaler under en 30-dagarsperiod. Genomsnittet är praktiskt taget identiskt
med antalet signaler räknat per 5-dagarsperiod för alternativ a), men
kostnaden är endast 30 analyser mot 150. Vid provtagning med 5 prover en dag
av fem dagar (alternativ c) blev genomsnittet 2,7 signaler per 30-dagarsperiod
med minimum noll och maximum 4 signaler (baserat på värdet av Pd aktuell
provtagningsdag) eller 2,3 signaler om medelvärdet av Pd-värdet per vecka
används) med minimum 0 och maximum3 korrekta signaler. Rullande
bedömning av 5*1 prover var sämre än fem prov varje dag (medelvärde per 5
dagar 1,2; data ej redovisade).

Vilken är den mest kostnadseffektiva
provtagningsstrategin?
Figur 16 visar att kostnaden att analysera 5 prover varje dag per
förpackningsmaskin (fem gånger högre än de andra alternativen) inte ger
tillräckligt högt informationsvärde jämfört med analys med ett prov per 5 dagar
eller 5 prover tagna under en dag av fem. Den sistnämnda metoden är den som
ger störst andel korrekta signaler i förhållande till antalet gjorda analyser
(medelvärde 2,3 -2,7 per 30-dagarsperiod med den givna kontaminationsprofilen).
En nackdel med metoden är att en stigning i återkontaminationsfrekvensen
kan ske snabbt under perioden mellan två provtagningar utan att
detta noteras förrän efter 5 dagar. Genom att ta ett prov per dag minimeras
denna risk. Visserligen erhålls något färre korrekta signaler med ovanstående
kontaminationsprofil, men återkoppling vid stigande värden kan erhållas
snabbare om kontaminationsnivån stiger. Detta illustreras i figur 17, där
provtagning under 30 dagar simulerats med konstant pd-värde på olika nivåer.
5000 iterationer har utförts och för varje iteration om 30 dagar har det
noterats antalet 5-dagarsperioder där 3 eller flera kontaminerade paket
upptäcks inom dag 3 till 4 (alternativ c med daglig kontroll) jämfört med dag 5
för analys med 5 prover en gång per vecka (alternativ b). Figur 17 visar det
genomsnittliga antalet 5-dagarsperioder där alternativ c) med daglig kontroll
ger signal snabbare än alternativ b) vid olika återkontaminationsnivåer.
Figur 17. Jämförelse mellan det genomsnittliga antalet korrekta signaler (3 eller flera positiva delprov) av 6
möjliga under en 5-veckorsperiod som uppnås tidigare vid analys av 5*1 prover med daglig kontroll jämfört
med 1*5 per vecka vid simulering av olika återkontaminationsfrekvenser.
Trots något sämre effektivitet vid provtagning med ett prov varje dag i fem
dagar och utvärdering efter 5 dagar (Figur 16) så medger daglig provtagning
med ett prov en snabbare möjlighet att reagera på en stegrad
18

återkontaminationsgrad jämfört med provtagning vid en dag med 5 prover.
Detta ökar i realiteten effektiviteten hos metoden med ett prov per dag. Jämför
den låga återkontaminationsfrekvensen för k-mjölk eller ost vid några mejerier
ovan. Normalt ligger pd-värdet långt under o,2 vilket innebär att det inte någon
av provtagningsmetoderna finns chans att finna återkontamination. Om 2 eller
flera prover visar på återkontamination under en femdagarsperiod för en
förpackningsmaskin så är detta en indikation på att en kraftig ökning skett som
det bör ageras på.
Mejeriföretagens tolkning av minimikraven
avseende provtagningsplaner för att uppfylla de
mikrobiologiska kriterierna
För att kunna tillämpas enhetligt innehåller de mikrobiologiska kriterierna (1)
följande specifikationer: Livsmedel, mikroorganism som ska analyseras,
referensmetod för analys, provtagningspunkt, provtagningsplan, steg i
livsmedelskedjan där kriteriet gäller, samt åtgärder som ska om gränsvärdena i
kriterierna överskrids. Syftet med processhygienkriterierna är att verifiera
processhygienen. För att kunna tillämpa provtagningsplanen måste storleken
på ett parti (en batch) definieras. Partiavgränsningen i mejeriproduktionen kan
vara svår att avgöra på grund av att mjölk kan tas från olika silotankar till
samma produkt och produktionen från en silo kan sträcka sig över mer än en
dag. Mjölkprocessning är en kontinuerlig process. En vecka är en lämplig
period för att ge en översiktsbild över produktionshygienen. Därför definieras
en batch i branschriktlinjer för hygienisk mjölkproduktion (5) som produktionen
för en given förpackningsmaskin eller processlinje under en vecka.
Processhygienkriterierna är till för att långsiktigt kunna visa att processen är
under kontroll. Ett enstaka prov med fem delprover från samma
produktionsdag kan användas för att kontrollera hygienen vid just den
produktionsdagen, men vid en process under styrning är det viktigare att se
långsiktiga trender. Förordningen reglerar inte provtagningsfrekvenser, utan
detta bestämmer företagaren inom ramen för sin riskvärdering, men
företagaren måste visa att kriterierna i förordningen uppfylls. Däremot anges i
provtagningsplanen enligt förordningen antalet prover per batch som ska tas ut
(n), m, M och c. Ett processhygienkrav med n=5 och c=2 har då översatts till att
minst 5 prover ska tas under veckan fördelat över dagarna och att 100% av
veckans proverna ska understiga M men 40% får överstiga m för en given
förpackningsmaskin eller processlinje. De provtagningsfrekvenser som anges i
branchriktlinjen är minimifrekvenser som kan tillämpas för en produktion som
är under styrning. Detta kan visas med historiska data. Om andelen prover som
överskrider gränsvärdena ökar bör åtgärder enligt plan (5) inledas för att
bedöma problemets omfattning, samtidigt som felsökning inleds.
För väl fungerande processer är chansen till återkontaminationsfynd mycket
liten även om 5 delprover tas ut samtidigt (k-mjölk och ost). Prevalensen
gramnegativa bakterier i k-mjölk kan vara så låg som 1-2 % av proverna. I
förordningen rekommenderas att göra trendanalyser för hygienparametrar för
att tidigt upptäcka tendenser till bristande styrning av processen. Det är då
rimligt, för att ur ett veckoperspektiv kunna erhålla ett representativt stickprov,
19

att som minimum ta ut 5 prover per vecka och förpackningsmaskin eller
processlinje fördelade över dagarna. Fördelen med att fördela proverna över
flera dagar är att en signal ges snabbare och till lägst kostnad om
processhygienen skulle försämras. Två eller flera fynd av återkontamination
under en vecka är ett tecken på att processhygienen försämrats och att detta
bör undersökas. Det är inte ekonomiskt rimligt att ta fem prover per maskin
och dag om inte uppenbara problem föreligger. Ett prov med fem delprov vid
en dag per vecka medför längre fördröjning i analyssvaren.
Men olika maskiner kan vara olika hårt belastade. Det kan vara lämpligt att ta
ut prov med hänsyn till belastning snarare än att hålla sig till fem prover. Men
med minst 5 prover uppnås syftet i förordningen. T.ex. om kriteriekraven är
m=log 2, M=log 3, n=5 och c=2, så motsvarar detta att 100% av produktionen
för en given förpackningsmaskin eller processlinje ska understiga log 3/ml och
minst 60% ska ligga under log 2/ml under en vecka. Uttag av fler prover än fem
ökar chansen för fynd över gräns om halten är måttlig och vissa prover ligger
mellan m och M. Det ger dessutom flexibilitet att inte behöva hålla reda på
separata 5-proversgrupper. Det är lättare att förstå andelen prover i % i
förhållande till kriteriegränserna. Termerna m, M, n och c är abstrakta för
produktionspersonalen.
Oftast har mejerierna interna krav som t.ex. 90% av produktionen ska klara
mejeriets interna gränsvärde, vilket är betydligt strängare än EU-kriterierna. I
sådana fall uppfylls processhygienkriterierna med råge. Här förekommer redan
processmål uttryckta i procent, varför det blir naturligt att även uttrycka även
myndigheternas processhygienkrav på samma sätt.
Referenser
1. Kommissionens förordning (EG) 2073/2005 om mikrobiologiska kriterier
för livsmedel. http://www.slv.se/upload/dokument/lagstiftning/2005-
2006/F%202073-2005%20om%20mikrobiologiska%20kriterier.pdf
2. International Committee on Microbial Specifications of Food.
http://www.icmsf.iit.edu/main/software_downloads.html
3. Microorganisms in Foods 2: Sampling for Microbiological Analysis:
Principles and Specific Applications. ICMSF 2nd ed. (1986). Toronto:
University of Toronto Press.
4. Analys av gramnegativa bakterier med inkuberat prov som alternativ till
direktanalys av Enterobacteriaceae i k-mjölk. Christiansson, A. Svensk
Mjölk Forskning (2008) rapport nr 7075-I..
5. Branschriktlinjer för hygienisk produktion av mjölkprodukter. Reviderad
2009, Svensk Mjölk.
20

SVENSK MJÖLK FORSKNING
Telefon: 0771 191900
E-post: fornamn.efternamn@svenskmjolk.se