In vitro-studier av axonal degenerering i humana ...

In vitro-studier av axonal degenerering i humana neuroblastomaceller
Fil.dr. Anna Forsby
Marika Nordin-Andersson
Institutionen för Neurokemi och Neurotoxikologi,
Stockholms Universitet,
106 91 Stockholm
Projekt: 16/98
Nyckelord: In vitro modell, cellinje, axonal degenerering, axonopati, akrylamid, mekanismer, toxikologi,
neuroblastoma, neurotoxicitet
Syftet med projektet är att studera mekanismer som kan ligga bakom akrylamid (ACR)-inducerad
axonopati. ACR är en substans som används i stora kvantiteter pga de goda stabiliserande
egenskaper som uppkommer då den låtits polymerisera. Polyakrylamid fungerar som bindemedel i
bl.a. byggnadsmaterial, färg och hudvårdsprodukter. Polyakrylamid anses som ofarlig, medan det är
känt sedan 40 år att monomeren är mycket neurotoxisk. ACR har därför i dessa studier använts som
en modellsubstans för att undersöka hur neuritdegeneration kan uppstå.
Vi har tidigare sett att ACR inducerar neuritdegeneration i differentierade humana neuroblastomaceller
(SH-SY5Y). Vi har även sett att ACR genererar en förhöjd cytoplasmatisk Ca 2+ koncentration, [Ca 2+ ]i
samt inhibition av proteinsyntesen vid icke-cytotoxiska koncentrationer (Forsby et al., 1995).
Effekterna visade sig vara reversibla efter avbruten exponering (Nordin-Andersson et al., 2000a),
vilket även har visats in vivo. Det är vår teori att främst Ca 2+ är orsaken till neuritdegenerationen. För
att undersöka om Ca 2+ -aktiverade proteaser, sk. calpainer, orsakar degereringen tillsattes
calpaininhibitorn calpeptin under ACR-exponeringen. Neuritdegenerationen kvantifierades genom att
vi tog kort på cellerna under mikroskop och sedan räknade antalet neuriter/cellkropp. Degeneration
fastställdes om mängden neuriter/cell minskade i förhållande till kontrollceller (Nordin-Andersson et
al., 1998). Undersökningarna visade att en daglig tillsats av calpeptin (1 µM /dag) under ACRexponeringen
förhindrade neuritdegenerationen markant (Nordin-Andersson et al., 2000b). Vi kunde
även visa att calpeptin förhindrade minskningen av fodrin som är ett calpainsubstrat. Det är därför vår
teori att calpainer medverkar till nedbrytningen av neuriter som orsakas av ACR-inducerad förhöjning
av den intracellulära Ca 2+ -koncentrationen.
Vi har även under projekttiden undersökt hur olika neurofilament påverkas av ACR genom att använda
ELISA-teknik. Resultaten visade att halterna av NF-H och NF-M minskade vid lägre koncentration av
ACR än den som gav effekt på den totala proteinmängden (cytotoxicitet) och att dessa filament därför
kan ses som markörer för neuritdegeneration (Nordin-Andersson et al., 2000a; Wenehed, 1999). Dock
visade det sig att metoden inte är lämpad för generell detektion av neuritdegenerering, eftersom den
var både dyr, tidskrävande och svår att få reproducerbar. Vi kvarstår därmed vid manuell kvantifiering
av antalet neuriter/cell på avbildning (foto) av celler under mikroskopet.
Projektet kan medverka till etablering av en cell-metod för studier av neuritdegenerering och
axonopati. Dessa förlopp inträffar efter såväl kemisk exponering som vid sjukdomstillstånd. De
vanligaste modellerna för studier av axonopati är baserade på djur. Det kvarstår dock ett omfattande
valideringsarbete innan cell-metoden kan rekommenderas som standard. Vi har dock kommit en bit på
vägen beträffande ACR-inducerad neuritdegeneration och detta uteslutande med hjälp av celler i
kultur.

Referenser
Forsby A., Pilli F., Bianchi V. and Walum E.(1995). Determinations of critical cellular neurotoxic
concentrations in human neuroblastoma (SH-SY5Y) cell cultures. ATLA 23, 800-811.
Nordin Andersson M., Forsby A., Heldring N., DeJongh J., Kjellstrand P. and Walum E. (1998) Neurite
degeneration in differentiated human neuroblastoma cells. Toxicology in Vitro, 12, 557-560.
Nordin Andersson M., Walum E., Kjellstrand P. and Forsby A. (2000a) Acrylamide- induced effects on
general and neurospecific cellular functions during exposure and recovery. Submitted.
Nordin-Andersson M., Wenehed V., Walum E., and Forsby A. (2000b). The role of proteases in
acrylamide-induced neurite degeneration. Manuscript.
Wenehed V. (1999). Effects of acrylamide on neurites of SH-SY5Y cells as determined with ELISA
and morphological evaluations. Examensarbete Stockholms Universitet.
Handledare: Anna Forsby.
Övriga publikationer och relaterade aktiviteter under projekttiden:
Forsby A. (1998). Cell cycle and cell death. Report of the second session at the 5th CFN symposium
on ”Effects of toxicants on gene expression and intracellular signalling.” Toxicol. in Vitro, 12, 533-537.
Forsby A. (1998). Rapport från avsnittet om cellcykel och celldöd på CFN:s femte symposium, 1997
om ”Toxiska ämnens effekter på genexpression och intracellulär signalering”. CFN:s skriftserie nr. 34,
pp 51–53.
Blaauboer BJ., DeJongh J., Forsby A., Heldring N., Nordin Andersson M., Guillouzo A., Houston BJ.,
Witherow L., Odland L., Beckman M., Walum E., Combes R. and Clothier R. (1998). An integrated
approach to the prediction of systemic toxicity using computer-based biokinetic models and biological
in vitro test methods: A prevalidation study based on the ECITTS project. Report for the Environment
Institute Joint Research Center at Ispra.
DeJongh J., Nordin Andersson M., Ploeger B.A. and Forsby A. (1999). Estimation of systemic toxicity
of acrylamide by integration of in vitro toxicity data with kinetic simulations. Toxicology and Applied
Toxicology, 13, 261–268.
DeJongh J., Forsby A., Houston B.J., Beckman M., Combes R. and Blaauboer BJ. (1999) An
integrated approach to the prediction of systemic toxicity using computer-based biokinetic models and
biological in vitro test methods: overview of a prevalidation study based on the ECITTS project.
Toxicology in Vitro, 13, 549-554.
Nordin-Andersson M., Forsby A., Heldring N., DeJongh J., Walum E. and Blaauboer B. (1998). In vitro
neurotoxicity of six ECITTS compounds. The INVITOX-98 meeting in Winchester, UK. Abstract,
Poster.
Forsby A., Nordin-Andersson M., Heldring N. and DeJongh J. (1999). The cellular neurotoxicity test
battery used in the ERGATT/CFN integrated toxicity test scheme (ECITTS). The Toxicologist, 48, no
1–S, 1376. Abstract SOT-99, Poster. Även visad vid Svensk Förening för Toxikologi, 1999.
DeJongh J., Blaauboer B. and Forsby A. (1999). An integrated approach to the prediction of systemic
toxicity using computer-based biokinetic models and biological in vitro test methods. Overview of a
prevalidation study based on the ECITTS project. Poster. SOT-99, New Orleans (USA)